Способ выделения бактерий рода lactobacillus из клинического материала

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для селективного выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого). Способ включает приготовление серии 10-кратных разведений исследуемого материала в жидкой селективной питательной среде обогащения при 39°С, высев из разведений на поверхность плотной селективной питательной среды, культивирование посевов в течение 24 - 48 ч при повышенном содержании углекислого газа (5%) и пониженной концентрации кислорода (16%) в атмосфере культивирования, при этом жидкая селективная питательная среда обогащения имеет состав, г/л: гидролизат обезжиренного молока жидкий 225,0±25,0, аутолизат дрожжей концентрированный 110,0±10,0, агар 0,8, вода дистиллированная до 1 л, раствор едкого натра 20% до рН среды 5,4±0,1, а затем проводят выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде состава, г/л: гидролизат обезжиренного молока жидкий 225,0±25,0, аутолизат дрожжей концентрированный 110,0±10,0, агар 22,5±2,5, вода дистиллированная до 1 л, раствор едкого натра 20% до рН среды 5,4±0,1. Способ позволяет улучшить диагностику гинекологических заболеваний. 8 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для селективного выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого).

Бактерии рода Lactobacillus широко распространены в природе. Они являются типичными представителями нормальной микрофлоры организма человека и животных, содержатся во многих пищевых продуктах (молочных, мясных, растительных).

Известно, что бактерии рода Lactobacillus являются доминирующей флорой влагалища человека. Существует тесная взаимосвязь между состоянием микрофлоры родовых путей беременных и формированием эубиотической микрофлоры кишечника ребенка в неонатальном периоде. При возникновении ряда акушерско-гинекологических заболеваний как инфекционной, так и не инфекционной природы, формируются выраженные нарушения резидентной вагинальной микрофлоры. Бактериальный вагиноз, сопровождающийся резкими изменениями лактофлоры, в настоящее время рассматривается как дисбактериоз влагалища. В диагностике дисбактериоза кишечника и влагалища одним из критериев дисбактериоза служит содержание бактерий рода Lactobacillus. При проведении бактериотерапии дисбактериозов содержание бактерий рода Lactobacillus служит показателем нормализации микрофлоры.

В связи с тем, что перед проведением антибиотикотерапии лечащий врач должен знать, влияет ли выбранный для лечения препарат на состояние индигенной лактофлоры пациента, необходимо определение чувствительности к антибиотикам индигенных бактерий рода Lactobacillus, а для этого нужен способ выделения их из клинического материала.

Кроме того, в тех случаях, когда содержание индигенных бактерий рода Lactobacillus у пациента ниже нормы (Дисбактериоз кишечника и методы его лабораторной диагностики. - Метод. рекомендации. - Хабаровск. - 1987), ему проводят заместительную бактериотерапию эубиотическими штаммами бактерий рода Lactobacillus. Однако применение эубиотических штаммов не всегда бывает эффективным. Известно, что экзогенные бактерии рода Lactobacillus не всегда приживаются в организме хозяина. Это связано с тем, что среди бактерий рода Lactobacillus широко распространен межвидовой и даже внутривидовой антагонизм, они могут оказывать повреждающее действие на индигенную микрофлору, или наоборот, аутофлора может подавлять развитие эубиотика, что снижает его лечебный эффект (Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника. //Вестн. Рос. АМН. - 1996. - N 2. - С. 60 - 65). В связи с этим, необходимо каждому пациенту до начала бактериотерапии определять биосовместимость эубиотических бактерий рода Lactobacillus с аутолактофлорой, а для этого необходим простой и доступный для осуществления в бактериологических лабораториях способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала.

Выделение чистой культуры бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого) необходимо и для получения аутоштамма, на основе которого затем изготавливают бактерийный препарат для восстановления индигенной лактофлоры конкретного пациента. Считают, что применение аутоштаммов является наиболее оптимальным способом восстановления индигенной микрофлоры после антибиотикотерапии.

Известен способ выделения бактерий рода Lactobacillus, который предусматривает посев клинического материала на поверхность плотной среды Рогоза следующего состава (в граммах на 1 литр): 25,0 дрожжевого аутолизата обыкновенного; 20,0 агар-агара; 10,0 пептона; 20,0 глюкозы; 1,0 Твин-80; 6,0 KH₂PO₄; 25,0 ацетата натрия; 2,0 цитрата аммония; 0,575 MgSO₄; 0,12 MnSO₄·2H₂O; 0,034 FeSO₄·7H₂O; 1,32 уксусной кислоты ледяной; воды дистиллированной до 1 л; pH среды 5,4±0,1; с последующей инкубацией посевов при температуре 37^oC в заполненном углекислым газом анаэростате в течение 4 суток (Ленцнер А. А., Тоом М.А., Воронина М.Н., Микельсаар М.Э. К методике выделения отдельных видов лактобацилл микрофлоры человека. //Лабораторное дело. - 1967. - N 5. - С. - 301 - 302).

Недостатком этого способа является многокомпонентность состава питательной среды, что делает процесс ее изготовления трудоемким и длительным, а также то, что для создания селективности в отношении бактерий рода Lactobacillus и подавления нежелательной микрофлоры, используется ацетат натрия в высокой концентрацией (25 г/л). Вместе с тем, известно, что введение химических селективных факторов, наряду с торможением развития посторонней микрофлоры, может ингибировать рост лактобацилл. Так, при посеве фекалий, желудочного сока и вагинального отделяемого на среду Рогоза было обнаружено, что разные виды лактобацилл обладали различной всхожестью. Это объясняется различной чувствительностью отдельных штаммов лактобацилл к концентрации ацетата натрия (25 г/л) в среде Рогоза. Кроме того, культивирование посевов по этому способу осуществляют в заполненных углекислым газом анаэростатах в отсутствие кислорода, в течение 4 - 5 суток, затем колонии лактобацилл отсевают на полужидкую среду МРС-2, инкубируют при 37^oC в течение 2 - 4 суток, затем делают высев на плотную среду Рогоза, инкубируют в заполненном углекислым газом анаэростате при 37^oC в течение 4 - 5 суток. Для получения чистых культур выделенные штаммы лактобацилл рассевают на плотную среду Рогоза по меньшей мере 6 раз. К недостатку указанного способа относится еще и длительность процесса выделения чистой культуры бактерий рода Lactobacillus из клинического материала.

Известен способ выделения микроорганизмов рода Lactobacillus из клинического материала с использованием плотной среды МРС-4, содержащей (в граммах на 1 литр): 50,0 (или 5,0 сухого) дрожжевого аутолизата обыкновенного; 500,0 гидролизата обезжиренного молока жидкого; 20,0 агар-агара; 10,0 пептона; 20,0 глюкозы; 1,0 Твина-80; 2,0 K₂HPO₄; 5,0 ацетата натрия; 2,0 цитрата аммония; 0,2 MgSO₄·7H₂O; 0,05 MnSO₄·4H₂O; 0,2 цистеина; 100,0 печеночного экстракта; 0,04 сорбиновой кислоты; воды дистиллированной до 1 литра; 10% раствора лимонной кислоты до pH среды 5,0 - 5,1. Культивирование посевов по этому способу осуществляют в заполненных углекислым газом анаэростатах в отсутствие кислорода, в течение 4 - 5 суток, затем колонии лактобацилл отсевают на полужидкую среду МРС-2, инкубируют при 37^oC в течение 2 - 4 суток, затем делают высев на плотную среду MРC-4, инкубируют в заполненном углекислым газом анаэростате при 37^oC в течение 4 - 5 суток. Для получения чистых культур выделенные штаммы лактобацилл рассевают на плотную среду МРС-4 по меньшей мере 6 раз (Ленцнер А.А., Тоом М.А., Воронина М.Н., Микельсаар М.Э. К методике выделения отдельных видов лактобацилл микрофлоры человека. //Лабораторное дело. - 1967. - N 5. - С. - 301 - 302).

Недостатком этого способа является многокомпонентность состава питательной среды, что делает процесс ее изготовления трудоемким и длительным, а также то, что для создания селективности в отношении бактерий рода Lactobacillus используется сорбиновая кислота, которая способна ингибировать рост некоторых штаммов лактобацилл. Исключение сорбиновой кислоты снижает селективные свойства среды, что затрудняет выделение чистой культуры бактерий рода Lactobacillus из клинического материала. Между тем отмечено, что в среде МРС без сорбиновой кислоты хорошо растут все виды лактобацилл. К недостатку указанного способа относится также длительность процесса выделения чистой культуры бактерий рода Lactobacillus из клинического материала.

Наиболее близким к заявляемому является способ накопления биомассы бактерий рода Lactobacillus на молочно-дрожжевой среде, состоящей из 500,0 г гидролизата обезжиренного молока жидкого (содержание аминного азота 200 - 250 мг%), 50,0 г дрожжевого аутолизата обыкновенного (содержание аминного азота 140 - 150 мг%), 2,0 г глюкозы, воды дистиллированной до 1 литра, pH среды 6,2, температура инкубации посевов 37 - 38^oC. Молочно-дрожжевая среда применяется только для накопления биомассы бактерий рода Lactobacillus при изготовлении закваски из чистых культур (Инструкция по приготовлению кисломолочного бифилакта на молочных кухнях N 11 - 14/6-33. - Утв. 27.03.87. МЗ СССР. - М., 1987. - С. 6).

Недостатком этого способа является то, что используемая питательная среда совершенно не обладает способностью подавлять рост сопутствующей бактериальной флоры. При посеве в эту среду клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого) и культивировании посевов при 37^oC происходит обильное размножение сопутствующей аэробной и факультативно-анаэробной микрофлоры, что приводит к угнетению роста бактерий рода Lactobacillus, делает невозможным накопление их в питательной среде, а при высеве со среды накопления на плотную селективную питательную среду колонии бактерий рода Lactobacillus не вырастают.

Задача изобретения - создание более простого и эффективного способа выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого).

Поставленная задача достигается тем, что осуществляют накопление бактерий рода Lactobacillus из клинического материала при 39^oC на жидкой селективной питательной среде обогащения состава, г/л, представленного в табл. 1, а затем проводят выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде состава, г/л, представленного в табл. 2, а культивирование посевов осуществляют при температуре 39^oC.

Новизна заявляемого способа состоит в том, что выделение бактерий рода Lactobacillus производят в два этапа при сочетании нескольких факторов: низкого значения pH среды (5,3 - 5,5), оптимального соотношения компонентов питательной среды, повышенной температуре инкубации (39^oC), культивировании посевов в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода, обеспечивающих ускоренный рост бактерий рода Lactobacillus, обитающих в организме человека, и одновременно ингибирующих развитие сопутствующей микрофлоры, адаптированной к нейтральному значению pH (7,0), температуре 37^oC и аэробным условиям. Развитие сопутствующей облигатной анаэробной микрофлоры в таких условиях невозможно (см. табл. 2, 3, 4).

Сущность способа заключается в следующем.

Выделение бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого) осуществляют в два этапа. Первый этап заключается в приготовлении серии 10-ти кратных разведений исследуемого материала в жидкой селективной питательной среде обогащения для накопления лактобацилл состава, приведенного в табл. 3.

Разведения делают в пробирках, содержащих по 4,5 мл жидкой селективной питательной среды обогащения при помощи автоматического дозатора со съемными наконечниками, путем перенесения из пробирки в пробирку по 0,5 мл. Титрование по 0,5 мл производят до 10^-8 - 10^-10. После титрования посевы инкубируют в течение 24 часов при повышенном содержании углекислого газа (5%) и пониженной концентрации кислорода (16%) в атмосфере культивирования при температуре 39^oC. Результат учитывают визуально, по наличию общего помутнения среды или росту изолированных колоний. Затем из пробирок с наличием роста готовят мазки, окрашивают по Граму. Отмечают последнее разведение, где был обнаружен рост характерных по морфологии грамположительных палочек. Титр лактобацилл (количество бактерий рода Lactobacillus в 1 г клинического материала) определяют по максимальному разведению, в котором обнаружены типичные грамположительные палочки. Отмечают пробирки с разведениями клинического материала, в которых обнаружен обильный рост бактерий рода Lactobacillus.

Затем проводят второй этап - выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде. Для этого из пробирок с разведениями клинического материала, в которых обнаружен обильный рост бактерий рода Lactobacillus, осуществляют посев бактериологической петлей на поверхность плотной селективной питательной среды для получения изолированных колоний. Плотная селективная питательная среда имеет состав, г/л, представленный в табл. 4.

Культивирование посевов осуществляют при 39^oC в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода, в течение 24 - 48 часов.

В условиях первого этапа культивирования на жидкой селективной среде происходит накопление бактерий рода Lactobacillus за счет их ускоренного роста и ингибирования роста сопутствующей микрофлоры при культивировании в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода в течение 24 часов при температуре 39^oC. Лактобациллы, обитающие в организме человека в составе индигенной микрофлоры, являются термофильными и хорошо растут при 39^oC. Бактерии рода Lactobacillus являются факультативными анаэробами, поэтому растут в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода. Для получения атмосферы культивирования, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, посевы помещают в герметически закрывающуюся емкость (анаэростат, эксикатор), зажигают свечу и плотно закрывают.

Гидролизат молока жидкий (содержание аминного азота 200 - 250 мг%) в количестве 200,0 - 250,0 г/л обеспечивает подавление сопутствующей микрофлоры за счет присутствия уксусной кислоты. При замене жидкого гидролизата молока на сухой (содержание аминного азота 1485 мг%), установили, что 27,0 - 33,0 г сухого гидролизата молока и 3,3 - 3,5 г ледяной уксусной кислоты равноценны вышеуказанному количеству жидкого.

Дрожжевой аутолизат концентрированный (содержание аминного азота 580 - 600 мг%) в количестве 100,0 - 120,0 г на 1 литр среды служит стимулятором роста и источником пластических веществ, способствующих регенерации лактобацилл, поврежденных действием селективных факторов (pH 5,4±0,1, уксусная кислота).

Указанные количества гидролизата молока и дрожжевого аутолизата позволяют получить концентрацию аминного азота в питательной среде от 100 до 130 мг%, что обеспечивает чувствительность (всхожесть) среды.

Использование в заявляемом способе 0,8 г/л агара повышает вязкость среды, что позволяет получить рост изолированных колоний бактерий рода Lactobacillus в столбике среды, а также уменьшает растворимость кислорода в толще среды. В тоже время, 0,8 г/л агара в питательной среде не затрудняет приготовление разведений.

Установление значения pH среды в пределах 5,3 - 5,5 в сочетании с заявляемым составом обеспечивает подавление сопутствующей микрофлоры, не угнетая при этом роста засеянных лактобацилл. Культивирование посевов при 39^oC в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода обеспечивает ускорение роста колоний лактобацилл, одновременно задерживая рост сопутствующей микрофлоры при исследовании клинического материала. Атмосфера такого газового состава может быть получена при помощи анаэростата и свечи. Сопутствующая индигенная анаэробная микрофлора в таких условиях не растет, из представителей аэробной микрофлоры, в указанных условиях возможен рост энтерококков и грибов рода Candida.

Введение в состав среды 20,0 - 25,0 г агара на 1 литр позволяет получить плотную селективную питательную среду для выделения изолированных колоний лактобацилл, что дает возможность выделения чистой культуры бактерий рода Lactobacillus для дальнейшего изучения.

Пример 1 Выделение бактерий рода Lactobacillus из фекалий с предварительным накоплением на жидкой селективной питательной среде обогащения.

В колбу вместимостью 1 литр помещают 200,0 г гидролизата обезжиренного молока жидкого (содержание аминного азота 215 мг%), 100,0 г дрожжевого аутолизата концентрированного (содержание аминного азота 583 мг%), 0,8 г агара, 2 мл 20%-ного раствора едкого натра, воды дистиллированной до 1 литра, нагревают до расплавления агара, контролируют pH при помощи pH-метра (в данном примере pH 5,3), стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среду быстро охлаждают, поместив колбу в водяную баню с температурой 15 - 20^oC, периодически перемешивают для ускорения охлаждения и равномерного распределения агара в объеме среды. После стерилизации среду можно хранить в холодильнике до 2-х месяцев.

Жидкую селективную питательную среду обогащения в асептических условиях разливают в пробирки по 4,5 мл. Пробирки можно хранить в холодильнике до 4 недель, поместив в герметичный пластиковый пакет для предотвращения высыхания. Перед использованием пробирки необходимо подогреть в термостате или на водяной бане до 37 - 39^oC.

Из основного разведения фекалий 10^-1 (в стерильном физиологическом растворе) при помощи дозатора готовят ряд 10-ти кратных последовательных разведений в 4,5 мл жидкой селективной питательной среды обогащения (титрование по 0,5 мл, до 10^-10). Посевы инкубируют при 39^oC в течение 24 часов в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода. Результат учитывают визуально, по наличию общего помутнения среды или росту изолированных колоний. Затем из пробирок с наличием роста готовят мазки, окрашивают по Граму. Отмечают последнее разведение, где был обнаружен рост характерных по морфологии грамположительных палочек. Титр (количество бактерий рода Lactobacillus в 1 г фекалий) определяют по максимальному разведению, в котором обнаружены типичные грамположительные палочки. В посевах фекалий, кроме лактобацилл, в указанных условиях могут расти энтерококки, которые легко отличимы по морфологии в мазках по Граму. Отмечают пробирки с разведениями фекалий, в которых обнаружен обильный рост бактерий рода Lactobacillus без энтерококков, или с минимальным присутствием энтерококков, а затем из этих пробирок бактериологической петлей делают высев на поверхность плотной селективной питательной среды для получения изолированных колоний.

Плотную селективную питательную среду готовят следующим образом.

В колбу вместимостью 1 литр помещают 225,0 г гидролизата обезжиренного молока жидкого (содержание аминного азота 215 мг%), 110,0 г дрожжевого аутолизата концентрированного (содержание аминного азота 583 мг%), 25,0 г агара, 2,1 мл 20%-ного раствора едкого натра, воды дистиллированной до 1 литра, нагревают до расплавления агара, контролируют pH при помощи pH-метра (в данном примере pH 5,4), стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)^oC в течение 15 минут. Среду охлаждают до температуры 45 - 50^oC, разливают в асептических условиях по 20 мл в стерильные чашки Петри, перед посевом чашки подсушивают в термостате при 37 - 39^oC до исчезновения капель конденсата на поверхности среды.

Инкубацию посевов на плотной селективной питательной среде проводят в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, крышкой вниз, при 39^oC в течение 24 - 48 часов.

Колонии бактерий рода Lactobacillus вырастают разной величины, от точечных (росинки), до 2 - 3 мм в диаметре, чаще плоские, шероховатые, слегка опалесцирующие, прозрачные, иногда с возвышением в центре и валиком по краю, редко белого цвета. В мазке по Граму - грамположительные мелкие или крупные, без капсулы, неспорообразующие палочки, расположенные отдельно или цепочками. При посеве фекалий, наряду с колониями бактерий рода Lactobacillus, обнаруживают колонии энтерококков. Колонии энтерококков белые, круглые, выпуклые, блестящие, гладкие, редко шероховатые. От бактерий рода Lactobacillus их дифференцируют в мазках по Граму.

Для накопления чистой культуры бактерий рода Lactobacillus, после микроскопии производят посев остатков колонии в 5 мл молочно-дрожжевой жидкой среды накопления. Инкубацию посевов на среде накопления проводят при 39^oC в течение 16 - 20 часов, проверяют чистоту культуры и используют для дальнейшего изучения (определения биосовместимости с эубиотическими штаммами бактерий рода Lactobacillus, приготовления лактобактерина на основе аутоштамма бактерий рода Lactobacillus, определения чувствительности аутоштамма бактерий рода Laclobacillus к антибиотикам).

Для обоснования принадлежности выделенных бактерий к роду Lactobacillus используют следующие признаки. Сам факт развития культуры на селективной питательной среде в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, позволяет предположить развитие культуры лактобацилл. Дополнительно проводят морфологические исследования: палочковидная форма и положительная окраска по Граму, а также выявление метахроматических включений при окраске метиленовым синим, отсутствие способности к споро - и капсулообразованию. Подтверждением принадлежности культуры к роду лактобацилл служит отсутствие подвижности (особенно из жидкой среды) при фазово-контрастной микроскопии, неспособность к редукции нитратов и метиленовой сини, отрицательная оксидазная и каталазная пробы, отсутствие пигментообразования. На принадлежность культуры к группе анаэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов указывает неспособность к росту на неселективной плотной среде для культивирования лактобацилл при 39^oC в аэробных условиях, отсутствие роста при 39^oC на простом arape в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода.

Пример 2 Выделение бактерий рода Lactobacillus из вагинального отделяемого с предварительным накоплением на жидкой селективной питательной среде обогащения.

В колбу вместимостью 1 литр помещают 120,0 г дрожжевого аутолизата концентрированного (содержание аминного азота 583 мг%), 33,0 г гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного (содержание аминного азота 1485 мг%), 0,8 г агара, 3,5 г ледяной уксусной кислоты, воды дистиллированной до 1 литра, 2,5 мл 20%-ного раствора едкого натра до pH 5,5, нагревают до расплавления агара, стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)^oC в течение 15 минут. Среду быстро охлаждают, поместив колбу в водяную баню с температурой 15 - 20^oC, периодически перемешивают для ускорения охлаждения и равномерного распределения агара в объеме среды. После стерилизации среду можно хранить в холодильнике до 2-х месяцев.

Жидкую селективную питательную среду обогащения в асептических условиях разливают в пробирки по 4,5 мл. Пробирки можно хранить в холодильнике до 4 недель, поместив в герметичный пластиковый пакет для предотвращения высыхания. Перед использованием пробирки необходимо подогреть в термостате или на водяной бане до 37 - 39^oC.

Из исследуемого материала готовят серию 10-ти кратных разведений в пробирках, содержащих по 4,5 мл жидкой селективной питательной среды обогащения, начиная от 10^-2 до разведения 10^-10. Посевы инкубируют при 39^oC в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, в течение 24 - 48 часов. Результат учитывают визуально, по наличию общего помутнения среды или росту изолированных колоний. Затем из пробирок с наличием роста готовят мазки, окрашивают по Граму. Отмечают последнее разведение, где был обнаружен рост характерных по морфологии грамположительных палочек. Титр лактобацилл (количество бактерий рода Lactobacillus в 1 г вагинального отделяемого) определяют по максимальному разведению, в котором обнаружены типичные грамположительные палочки. В посевах вагинального отделяемого, кроме лактобацилл, в указанных условиях могут расти дрожжеподобные грибы, которые легко отличимы по морфологии в мазках по Граму. Отмечают пробирки с разведениями, в которых обнаружен рост бактерий рода Lactobacillus без дрожжеподобных грибов, или с минимальным их присутствием, а затем из этих пробирок бактериологической петлей делают высев для получения изолированных колоний на поверхности плотной селективной питательной среды, которую готовят следующим образом: в колбу вместимостью 1 литр помещают 100,0 г дрожжевого аутолизата концентрированного (содержание аминного азота 583 мг%), 27,0 г гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного (содержание аминного азота 1485 мг%), 20,0 г агара, 3,3 г ледяной уксусной кислоты, воды дистиллированной до 1 литра, 2,5 мл 20%-ного раствора едкого натра до pH 5,5, нагревают до расплавления агара, стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)^oC в течение 15 минут. Среду охлаждают до температуры 45 - 50^oC, разливают в асептических условиях по 20 мл в стерильные чашки Петри, перед посевом чашки подсушивают в термостате при 37 - 39^oC до исчезновения капель конденсата на поверхности среды.

Инкубацию посевов на плотной селективной питательной среде проводят в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, крышкой вниз, при 39^oC в течение 24 - 48 часов.

Колонии лактобацилл вырастают разной величины, от точечных (росинки), до 2 - 3 мм в диаметре, чаще плоские, шероховатые, слегка опалесцирующие, прозрачные, иногда с возвышением в центре и валиком по краю, редко белого цвета. В мазке по Граму - грамположительные мелкие или крупные, без капсулы, неспорообразующие палочки, расположенные отдельно или цепочками. Для накопления чистой культуры бактерий рода Lactobacillus, после микроскопии производят посев остатков колонии в 5 мл молочно- дрожжевой жидкой среды накопления. Инкубацию посевов на среде накопления проводят при 39^oC в течение 16 - 20 часов, проверяют чистоту культуры и используют для дальнейшего изучения (определения биосовместимости с эубиотическими штаммами бактерий рода Lactobacillus, приготовления лактобактерина на основе аутоштамма бактерий рода Lactobacillus, определения чувствительности аутоштамма бактерий рода Lactobacillus к антибиотикам). Результаты определения представлены в табл. 5. При обследовании 68 больных женщин и 46 здоровых было обнаружено достоверное различие в количественном содержании вагинальных лактобацилл. У здоровых женщин обнаружено содержание лактобацилл в пределах 5,5 - 7,0 Lg КОЕ/мл, а у больных 3,3 - 4,7 Lg КОЕ/мл.

Таким образом, полученные результаты доказывают, что заявляемый способ выделения бактерий рода Lactobacillus из вагинального отделяемого позволяет не только значительно улучшить диагностику гинекологических заболеваний, но и значительно повысить качество бактериотерапии и антибиотикотерапии.

Формула изобретения

Способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого), заключающийся в приготовлении серии 10-кратных разведений исследуемого материала в жидкой селективной питательной среде обогащения, высеве из разведений на поверхность плотной селективной питательной среды, культивировании посевов в течение 24 - 48 ч при повышенном содержании углекислого газа (5%) и пониженной концентрации кислорода (16%) в атмосфере культивирования, отличающийся тем, что осуществляют накопление бактерий рода Lactobacillus из клинического материала при 39^oC на жидкой селективной питательной среде обогащения при следующем соотношении компонентов среды, г/л: Гидролизат обезжиренного молока жидкий - 225,0 ± 25,0 Аутолизат дрожжей концентрированный - 110,0 ± 10,0 Агар - 0,8 Вода дистиллированная - До 1 л
Раствор едкого натра 20% до рН среды - 5,4 ± 0,1
а затем проводят выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде при следующем соотношении компонентов среды, г/л:
Гидролизат обезжиренного молока жидкий - 225,0 ± 25,0
Аутолизат дрожжей концентрированный - 110,0 ± 10,0
Агар - 22,5 ± 2,5
Вода дистиллированная - До 1 л
Раствор едкого натра 20% до рН среды - 5,4 ± 0,1

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7