Электрофоретический способ изучения проницаемости гистологических образований и устройство для его осуществления

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к изучению проницаемости гистологических образований. Способ основан на способности к миграции макромолекул под влиянием электрического поля в элюционной камере, при этом используют две элюционные камеры, в одной из которых между слоями крупнопористого геля на пути электромиграции макромолекул в ее полости расположена гистологическая пленка, а проницаемость гистологических образований определяют по разности концентраций биомакромолекулярных соединений, накопленных в полостях элюционных камер. Электрофоретическое устройство состоит из электродных емкостей, при этом верхняя электродная емкость расположена внутри нижней, а элюционные камеры образованы в трубках, стенки которых имеют многослойное строение из полиакриламидного геля разной концентрации и целлофана. В одной из камер верхняя стенка содержит гистологическую пленку, расположенную между слоями крупнопористого полиакриламидного геля. Это позволяет изучать проницаемость гистологических образований в виде пленок. Кроме этого, устройство обеспечивает дозированный объем в камерах, не меняющийся на протяжении электрофореза, с герметизацией стенок, исключающих утечку макромолекулярных соединений. 2 с.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно для изучения проницаемости гистологических образований.

Существуют электромиграционные методы зонального электрофореза белков, гликопротеинов, нуклеиновых кислот и прочих соединений на способность к перемещению молекул названных соединений под влиянием электрического поля в поддерживающей среде. Скорость продвижения макромолекул зависит от свойств поддерживающей среды (бумага, ацетат целлюлозы, агарозные и полиакриламидные гели и др.), а также от суммарного заряда и массы молекул. В результате неодинаковой скорости движения макромолекулярных соединений они начинают "делиться" в зональных носителях на фракции. Таким образом, электрофоретическое разделение сложной смеси биоорганических соединений позволяет изучить ее состав (аналитический электрофорез) или получить отдельные соединения в чистом виде (препаротивный электрофорез) [1, 2, 3, 4].

Близким по технической сущности является метод препаротивного электрофореза, в котором получение биомакромолекулярных соединений в чистом виде достигается с помощью элюционных камер в геле [1]. В современных электрофоретических камерах для препаротивного электрофореза используется полиакриламидный гель, обладающий эффектом молекулярного сита, что позволяет получить в чистом виде органические соединения.

Выбранный в качестве прототипа прибор Пайдака [1] имеет трубку, заполненную полиакриламидным гелем, ниже которого находится элюционная камера в виде полости, ограниченной снизу диализной мембраной, закрывающей нижнее отверстие трубки и являющееся ее дном. В процессе электрофореза периодически из элюционной камеры удаляется раствор с белком отдельных фракций.

Однако препаротивный электрофорез не может использоваться для изучения проницаемости гистологических образований, поскольку осуществляет разделение сложной смеси биоорганических соединений на отдельные соединения за счет молекулярно-ситевого эффекта полиакриламидного геля.

Конструкция прибора Пайдака не пригодна для изучения проницаемости гистологических образований, т. к. предназначена для получения белков в чистом виде. Элюционная камера в приборе-прототипе не имеет дозированного объема, что не позволяет измерить концентрацию белка в ее растворе после завершения электрофореза, объем элюционной камеры меняется во время работы прибора из-за деформации и пролабирования полиакриламидного геля в полость пространства элюционной камеры, что уменьшает ее объем. Полиакриламидный гель над элюционной камерой затрудняет электромиграционные процессы белковых молекул. Прибор Пайдака имеет разный уровень буферного раствора в верхней и нижней электродных емкостях, что создает гидростатическое давление сверху на все элементы элюционной камеры и может привести не только к разгерметизации, но и к изменению ее объема.

Ставилась задача разработать способ по изучению проницаемости гистологических образований в виде пленок и конструкцию устройства для его осуществления с элюционными камерами, имеющими дозированный объем, не меняющийся на протяжении электрофореза, с герметизацией стенок, исключающих утечку макромолекулярных соединений.

Поставленная задача осуществляется с помощью электрофоретического устройства, состоящего из двух электродных емкостей, причем верхняя емкость расположена в нижней электродной емкости, что обеспечивает в них одинаковый уровень буферного раствора. Гистологические пленки в элюционных камерах размещаются на пути миграции молекул перед полостью элюционной камеры. Постоянство объема раствора в элюционной камере достигается с помощью стенок, имеющих многослойное строение из полиакриламидного геля разной концентрации и слоев целлофана, а также гистологических пленок. Такое многослойное строение стенок элюционных камер придает им необходимую жесткость и предупреждает изменение объема полости элюционной камеры в процессе электрофореза. Верхняя стенка, имеющая гистологическую пленку, содержит слои крупнопористого полиакриламидного геля, не препятствующие электромиграционным процессам через гистологические пленки. В процессе электрофореза макромолекулярные соединения накапливаются в дозированном объеме раствора, заполняющего полость элюционных камер, где и определяется их концентрация, по которой оценивается проницаемость гистологических образований.

Изобретение поясняется чертежом.

Электрофоретическая камера состоит из верхней 1 и нижней 2 электродных емкостей. В дно 3 емкости 1 через резиновые пробки 4 вставлены трубки 5, внутри которых осуществляется монтаж элюционных камер. Благодаря отверстию 6 емкости 1 и 2 сообщаются между собой, что обеспечивает в них одинаковый уровень буферного раствора. Элюционные камеры трубок 5 А и Б имеют полости 7, заполненные буферным раствором на сахарозе. Снизу полости 7 ограничены слоем целлофана 8, закрепленным снаружи трубок 5 резиновыми кольцами 9, дальше располагается мелкопористый полиакриламидный гель 10, крупнопористый полиакриламидный гель 11 и слой целлофана 12, являющийся дном полости 7. Боковыми внутренними стенками полости 7 является внутренняя поверхность стеклянной втулки 13, которая снизу и снаружи обернута целлофаном 12. Кольцо из силиконовой резины 14 герметизирует щелевое пространство, содержащее целлофан 12 между наружными стенками втулки 13 и внутренней поверхностью трубки 5. Верхние стенки элюционных камер состоят из слоя крупнопористого геля 15, нейлоной сетки 16 (трубка А) или гистологической пленки 17 (трубка Б), которыми обернуты снизу и снаружи втулки 18. Резиновые кольца 19 герметизируют щелевое пространство с нейлоновой сеткой 16 (трубка А) и гистологической пленкой 17 (трубка Б) между наружной поверхностью втулки 18 и внутренней поверхностью втулки 18 и внутренней поверхностью стеклянной трубки 5. В полости втулки 18 и выше резинового кольца 19 находится крупнопористый гель 20, являющийся вторым слоем верхней стенки элюционной камеры.

Осуществление способа по изучению проницаемости гистологических образований различных органов и тканей базируется на технических приемах, позволяющих осуществить монтаж элюционных камер. Необходимо поэтапно сформировать вначале нижние стенки, затем боковые и в последнюю очередь верхние стенки элюционных камер. Предварительно нижнее отверстие трубки 5 герметизируется резиновой пленкой, которая перед работой заменяется на целлофановую пленку 8. После закрепления резиновой пленки с помощью резинового кольца 9 в полость трубки 5 заливается раствор мелкопористого полиакриламидного геля 10 (пропись химических ингредиентов см. в табл.), сверху на него осторожно наслаивается вода, от чего поверхность геля 10 после полимеризации будет ровной. Затем вода удаляется с поверхности геля и заливается раствор крупнопористого геля 11 и также осторожно наслаивается вода. После полимеризации слоя 11 трубка 5 заполняется до краев дистиллированной водой и в ее просвет осторожно опускается втулка 13, обернутая снизу и снаружи целлофаном 12, так, чтобы поверхность целлофана 12 пришла в плотное соприкосновение с поверхностью слоя геля 11. Резиновым кольцом 14 герметизируется щель между наружными стенками втулки 13 и внутренней поверхностью стеклянной трубки 5. После удаления воды из трубки 5 и тщательного осушения внутренней поверхности трубки 5, кольца 14 и внутренней поверхности втулки 13 в полость 7 втулки 13 заливается строго дозированный объем раствора буфера на сахарозе, которая придает раствору большую плотность. Затем на поверхность плотного раствора буфера на сахарозе наслаивается крупнопористый раствор полиакриламидного геля 15 с последующим наслаиванием воды. После полимеризации на слой 15 при заполненной водой до краев трубки 5 опускается стеклянная втулка 18, обернутая нейлоновой сеткой 16 (трубка А) и гистологической пленкой 17 (трубка Б). Щелевое пространство между стенками втулки 18 и трубки 5 герметизируется с помощью кольца 19. Удалив воду из трубки 15 в полость втулки 18 заливается раствор крупнопористого геля 20 и также наслаивается дистиллированная вода для создания ровной поверхности геля. После завершения монтажа элюционных камер трубки 5 вставляются в резиновые пробки 4 дна 3 верхней электродной емкости 1 и заменяются резиновые пленки 8, закрывавшие нижние отверстия трубок 5 на целлофановые (обозначения одинаковые с резиновыми пленками 8). Когда емкости 1 и 2 будут заполнены буферным раствором и его уровень выравняется, в них через отверстие 6 наносится на поверхность слоя геля 20 раствор макромолекулярных соединений необходимой концентрации 21, которые вносятся дозаторами.

Гистологические образования, изучаемые на проницаемость, должны отвечать следующим требованиям: должны иметь вид пленок одинаковой толщины и их механическая прочность при формировании элюционных камер должна быть достаточной, чтобы предупредить их повреждение; гистологические образования должны иметь вид пленок (фасции, плевра легких, брюшина и т.д.), в некоторых случаях пленки могут быть приготовлены микротомированием, т.е. получением тонких срезов одинаковой толцины из паренхиматозных органов человека и животных.

На чертеже электрофоретической камеры представлены две трубки А и Б с одинаковыми элюционными камерами, которые отличаются друг от друга наличием в верхней стенке нейлоновой сетки 16(А) или гистологической пленкой 17 (Б). В элюционной камере трубки А концентрация биомакромолекулярных соединений, накопившихся в процессе электрофореза, соответствует 100%, т.к. электромиграционным процессам никакие элементы верхней стенки не оказывают существенного препятствия. В трубке Б гистологические образования могут "затормозить" электромиграционные процессы и тогда в элюционной камере концентрация биомакромолекулярных соединений будет меньше. Разность концентрации соединений в элюционных камерах трубок А и Б в процентном выражении характеризует проницаемость гистологических образований.

В таблице приводятся основные данные о химических ингредиентах, из которых состоят отдельные слои полиакриламидного геля верхней и нижней стенок элюционных камер А и Б, раствора элюционной камеры полости 7. Отмечена и высота слоев полиакриламидного геля в мм. Внутренний диаметр трубок, в которых осуществляется монтаж элюционных камер А и Б, должен быть одинаковым (12 - 13 мм).

Источники информации 1. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М., 1982, с.11-15, 74-100, 117-123.

2. Скоупс Р. Методы очистки белков. М., 1985, с.213-223.

3. Ларский Э.Г. Методы зонального электрофореза. М., 1971, с.41-45.

4. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. М., 1971, с.13-39, 129-132.

Формула изобретения

1. Электрофоретический способ изучения проницаемости гистологических образований, основанный на способности к миграции макромолекул под влиянием электрического поля в элюционной камере, отличающийся тем, что используют две элюционные камеры, в одной из которых между слоями крупнопористого геля на пути электромиграции макромолекул в ее полости располагают гистологическую пленку, а проницаемость гистологических образований определяют по разности концентраций биомакромолекулярных соединений, накопленных в полостях элюционных камер.

2. Электрофоретическое устройство для изучения проницаемости гистологических образований, состоящее из электродных емкостей, отличающееся тем, что верхняя электродная емкость расположена внутри нижней, а элюционные камеры образованы в трубках, стенки которых имеют многослойное строение из полиакриламидного геля разной концентрации и целлофана, при этом в одной из камер верхняя стенка содержит гистологическую пленку, расположенную между слоями крупнопористого полиакриламидного геля.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2