Способ регуляторного воздействия на первичные механизмы основных защитных реакций организма в норме и патологии: иммунной реакции, воспалительной реакции, свободнорадикального процесса, - с помощью вещества гамма- глутамилгистамин

 

Изобретение относится к медицине, в частности к области фармакологии, к лекарственным веществам, применяемым для профилактики и лечения заболеваний, в механизмах патогенеза которых первичными биохимическими звеньями являются выброс из депо гистамина и/или гиперактивация свободнорадикального процесса. Для этого используют гамма-глутамилгистамин в дозах 0,01-250 мг/кг веса тела в сутки. Заявляемый способ по сравнению с известными позволяет сочетать иммунокорригирующее, антиаллергическое, ранозаживляющее, противовоспалительное и антиоксидантное воздействие на организм. Предлагаемое средство нетоксично, при минимальных дозах обладает значительной широтой терапевтического действия. 4 з.п.ф-лы, 15 ил., 7 табл.

Изобретение относится к области фармакологии. Сущность изобретения - способ регулировки активности первичных биохимических защитных систем организма в норме и патологии с помощью вещества гамма-глутамилгистамин. В частности, регулирование интенсивности иммунной реакции, воспалительного процесса, свободнорадикального процесса, с помощью гамма-глутамилгистамина, без влияния последнего на рецепторные системы, на сердечно-сосудистую систему, без системных осложнений и токсических эффектов.

Нарушения механизмов регуляции иммунного ответа приводят к развитию аллергических заболеваний, которыми страдает 25% населения; наблюдается тенденция к усилению степени их тяжести и увеличению частоты встречаемости, в особенности пищевыми аллергиями [1, 2, 3]. Воспалительный процесс является ведущим звеном в патогенезе многих заболеваний и первичным звеном в патогенезе посттравматических и послеоперационных состояний. Выход из-под контроля организма свободнорадикального процесса является ключевым звеном в механизмах патогенеза радиационных и химических поражений, эндо- и экзогенных интоксикаций, в патогенезе раннего увядания кожи; свободнорадикальный процесс принимает также участие в патогенезе основных заболеваний человека [4, 5].

Клиническими аналогами заявляемого способа являются способы медикаментозной профилактики и лечения указанных групп заболеваний. В этих способах используют химические вещества, относящиеся к различным классам химических соединений. Общность между этими способами состоит: в их воздействии на вторичные, отсроченные этапы в механизмах развития патологических состояний; в однонаправленном характере их воздействия на защитные реакции, что приводит, например, к подавлению как деструктивной, так и конструктивной фаз воспалительной реакции; в использовании в качестве действующих веществ ксенобиотиков, активирующих свободнорадикальные реакции, обладающих достаточно высокой токсичностью, ярко выраженными побочными эффектами, в том числе инициирующих язвообразование в желудочно-кишечном тракте, имеющими широкий круг противопоказаний, проявляющих фармакологические эффекты, как правило, в относительно высоких дозах и обладающих невысоким терапевтическим диапазоном.

Отличие заявляемого способа от существующих способов состоит в том, что в заявляемом способе: воздействие оказывается на ключевые, первичные этапы в механизмах запуска патологических реакций, воздействие носит регуляторный характер, то есть усиливается конструктивная фаза и ослабляется деструктивная фаза защитной реакции, используемое нексенобиотическое вещество препятствует гиперактивации свободнорадикального процесса, проявляет фармакологическую активность в низких дозах и не проявляет токсические эффекты в физически осуществимых максимальных дозах, не обладает выявленными противопоказаниями, защищает от химического язвообразования желудочно-кишечного тракта.

При аллергических заболеваниях применяют конкурентные ингибиторы Н1-рецепторов гистамина. Фармакологический эффект проявляется при условии блокировки достаточно большого числа рецепторов от связывания с гистамином, выбрасываемым из депо. Примеры препаратов: вещество хлорпирамина гидрохлорид (препарат "Супрастин"), его побочное действие - седативный эффект, противопоказания - осуществление деятельности требующей повышенного внимания.

Для лечения воспалительных заболеваний применяют стероидные и нестероидные препараты. Стероидные препараты вызывают тяжелые нарушения гормональной регуляции и в данном сравнении не используются. Примеры нестероидных препаратов: вещество ибупрофен (препараты "Ибупрофен", "Ламидон"), вещество диклофенак натрия (препараты "Диклофенак", "Диклофенак натрия", "Ортофен", "Вольтарен"). Побочные действия - аллергические реакции, повышение артериального давления, головокружение, нарушение функционирования желудочно-кишечного тракта. Противопоказания - язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки и др.

Для лечения ран применяют две основных группы препаратов. С одной стороны, это - препараты, стимулирующие собственно заживление ран, как правило, сложные препараты биологического происхождения, например "Солкосерил". И с другой стороны, препараты и средства, предназначенные для очистки ран от дебриса и серозного выпота, а также антимикробные препараты.

Для профилактики и лечения заболеваний и поражений, в механизмах патогенеза которых ведущую роль играет гиперактивация свободнорадикального процесса: радиационные поражения, раннее увядание кожи и др. - используют так называемые "ловушки", "чистильщики", "уборщики" (scavenger) уже образованных свободных радикалов: антиоксиданты с полиненасыщенными связями, например витамин Е, или хелатные соединения ионов металлов с переменной валентностью [4, 5].

Вещество гамма-глутамилгистамин было обнаружено ранее в организмах млекопитающих и беспозвоночных животных [6, 7, 8, 9].

Биологическая роль вещества гамма-глутамилгистамин и возможность его фармакологического применения неизвестны.

Автор настоящего изобретения постулировал и экспериментально подтвердил регуляторное воздействие вещества гамма-глутамилгистамин на первичные звенья биохимических механизмов основных защитных реакций организма иммунной реакции, воспалительной реакции, свободнорадикального процесса.

Вещество гамма-глутамилгистамин и его дихлоридная соль, по заказу автора, синтезированы группой члена-корреспондента АН СССР Евстигнеевой Р.П. методом химического пептидного синтеза [10, 11, 12] с некоторыми модификациями. По заказу и под руководством автора выполнены исследования индивидуальности и чистоты партии вещества гамма-глутамилгистамин, переданной на фармакологические испытания. Индивидуальность препарата установлена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (см. фиг. 1 и 2) и методом тонкослойной хроматографии с регистрацией результатов на компьютерном денситографе CDS-200 фирмы Beckman /США/. Методом атомно-эмиссионной спектрометрии на приборе GI-70 фирмы Glben-Ivon /Франция/ установлено, что содержание тяжелых металлов и токсичных элементов в весовых процентах (%) составляет кальций - 0,1, свинец, бор, медь, серебро, цинк, мышьяк, алюминий - не более 0,01, марганец, стронций, хром, кадмий, кобальт, магний, железо, никель - не более 0,001.

ПРИМЕРЫ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ ЗАЩИТНЫХ СИСТЕМ С ПОМОЩЬЮ ВЕЩЕСТВА ГАММА-ГЛУТАМИЛГИСТАМИН 1. Регуляторное воздействие вещества гамма-глутамилгистамин на первичные звенья биохимических механизмов инициации/сдерживания защитных реакций.

1.1. Подавление накопления в депо и выброса из депо гистамина - первичного биохимического медиатора иммунологической и воспалительной реакций.

Исследования выполнены на крысах Вистар массой 150-200 грамм и морских свинках-самцах массой 250-300 грамм. Использованы куриный овальбумин производства Олайненского НПО "Биохимреактив", однократно перекристаллизованный нами, и ампульный препарат "Супрастин" производства фирмы "Reanal" /ВНР/.

Влияние гамма-глутамилгистамина in vivo на содержание гистамина в тучных клетках и в базофилах и на способность тучных клеток отвечать аллерген-стимулированной секрецией гистамина при их контакте с аллергеном изучена на крысах, сенсибилизированных к овальбумину по методу Gushchin I.S. et al. [13] . На одиннадцатый, двенадцатый и тринадцатый дни эксперимента животным вводили внутрибрюшинно раствор гамма-глутамилгистамина в дозах 50 мкг/кг или "Супрастин" по 1000 мкг/кг или плацебо. На 14-й день сенсибилизации по методу Fredholm В.В. et al. [14] выделяли взвесь тучных клеток из перитонеальной жидкости и индуцировали выделение гистамина, воздействуя на клетки веществом "48/80". Для индуцирования секреции гистамина аллергеном, 1000000-2000000 тучных клеток в 2 мл инкубировали с овальбумином (200 мкг/мл).

Влияние гамма-глутамилгистамина in vivo на содержание гистамина в базофилах крови изучено на морских свинках, сенсибилизированных к овальбумину по методу Шатерникова В. А. и соавт. [15]. На 14-й день сенсибилизации раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг за 1 час до забора крови. 1 мл крови из сердца брали в гепарин, центрифугировали. К осадку клеток приливали 9 мл дистиллированной воды и через 20 секунд - 1 мл 10-кратного раствора Хенкса. Суспензию фильтровали через хлопковую вату, трижды отмывали в среде Игла и затем - в трис-буфере.

Содержание гистамина измеряли спектрофлуориметрическим методом в реакции с ортофталевым альдегидом [16]. Секрецию гистамина оценивали с учетом величины спонтанной секреции, которая составляла 2-9%.

Статистическая обработка результатов выполнена с использованием критерия Стьюдента.

Результаты отражены на фиг. 3. Установлено, что гамма-глутамилгистамин статистически достоверно снижает аллерген-индуцированную секрецию гистамина из тучных клеток в 3,65 раза (0,318 мкг гистамина на 1000000 клеток против 1,161 мкг в контроле, Р<0,01) и препарат сравнения "Супрастин" - в 1,74 раза (0,666 мкг гистамина на 1000000 клеток против 1,161 мкг в контроле, Р<0,05). Установлено, что гамма-глутамилгистамин статистически достоверно снижает содержание гистамина в 1,36 раза в тучных клетках (1,79 мкг гистамина на 100000 клеток против 2,435 мкг в контроле, Р<0,05) и в 1,5 раза - в базофилах (0,695 мкг гистамина на 1 мл клеточной суспензии против 1,04 мкг/мл в контроле, Р<0,01), "Супрастин" снижает содержание гистамина в 1,48 раза в тучных клетках (1,645 мкг гистамина на 100000 клеток против 2,435 мкг в контроле, Р<0,05).

Влияние гамма-глутамилгистамина и "Супрастина" in vivo на состояние системы цитохромов Р450 изучали на морских свинках с массой тела 250-300 г. Гамма-глутамилгистамин и "Супрастин" вводили внутрибрюшинно в дозах 50 и 1000 мкг/кг, соответственно. Активность микросомальной системы печени оценивали по длительности гексеналового сна. Гексенал вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе в дозе 30 мг/кг. Активность цитохромов измеряли по методу Omuro N., Sato R. [17] в микросомальной фракции, выделенной методом дифференциального центрифугирования. Фракционное содержание водорастворимых и липидорастворимых цитохромов определяли по методу Изотова М.В. и соавт. [18] . Содержание микросомального белка определяли модифицированным методом Лоури [19]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев Мана-Уитни и углового преобразования Фишера [20] .

Результаты отражены на фиг. 4. Установлено, что гамма-глутамилгистамин статистически достоверно повышает удельную активность цитохрома Р450 в 1,53 раза (Р<0,01), удельную активность цитохрома b5 - в 1,64 раза (Р<0,01), удельную активность водорастворимой фракции цитохрома Р450 в 1,67 раза (Р<0,01), соотношение водорастворимой и липидорасторимой фракций цитохрома Р450 в 1,7 раза (Р<0,01). Установлено, что гамма-глутамилгистамин статистически достоверно снижает длительность гексеналового сна в 1,75 раза (Р<0,01).

Эксперимент выполнен на крысах с массой тела 200 г. Очаг хронического воспаления формировали, путем внутримышечного введения в левую лапку культуры золотистого стафилококка (штамм "375") в количестве 5000000000000 бактериальных тел в объеме 0,5 мл. В мышцу другой лапки вводили раствор солянокислой соли гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе. На девятый день животных забивали, получали сыворотку крови. В сыворотке крови определяли содержание малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой. К 0,2 мл сыворотки прибавляли 1,5 мл 8,1% раствора додецилсульфата натрия, 3,5 мл 30% раствора уксусной кислоты (рН 3,0), 1,5 мл 0,8% раствора тиобарбитуровой кислоты, приготовленного на 30% растворе уксусной кислоты. Смесь инкубировали 60 минут при 96 градусах Цельсия, охлаждали при комнатной температуре, центрифугировали 5 минут при 1000 оборотах в минуту. Спектрофотометрию супернатанта осуществляли при 535 нанометрах и при 560 нанометрах. Пробу, содержащую биологический материал, фотометрировали против пробы, не содержащей биологического материала. Содержание малонового диальдегида выражали в условных единицах (Е_535нм-Е_560нм) х 100.

Результаты отражены на фиг. 15. Установлено, что инфицирование приводит к двукратному статистически достоверному повышению количества малонового диальдегида. Солянокислая соль гамма-глутамилгистамина в диапазоне доз 12,60-22,07 мкг/кг приводит к снижению количества диальдегида в 1,42 - 6,99 раз. Установленный факт хорошо согласуется с представленным выше повышением активности системы противорадикальной защиты - цитохромов Р450 под влиянием гамма-глутамилгистамина.

3. Регуляторный характер влияния вещества гамма-глутамилгистамин на активность иммунной системы в норме и патологии.

3.1. Активация веществом гамма-глутамилгистамин первичного иммунного ответа интактного организма на гетерогенные антигены.

3.1.1. Активация В-клеточно-опосредованного гуморального ответа немедленного типа.

Исследования выполнены на половозрелых мышах-самках линии BALB с массой тела 18-20 г, выращенных в питомнике "Столбовая" АМН СССР. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно субоптимальной дозой (50000000) эритроцитов барана (ЭБ). Затем перорально вводили контрольным животным - физиологический раствор (n= 10), а опытным животным - раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе (n=10). На пятый день эксперимента животных забивали цервикальным смещением позвонка. Из крови получали сыворотку Селезенку гомогенизировали в охлажденной среде "Хенкса". В экспериментах использовали индивидуальные клеточные суспензии спленоцитов с жизнеспособностью не менее 85-90% по тесту с 0,1% раствором красителя трипановый синий.

Влияние гамма-глутамилгистамина на количество антигенсвязывающих клеток оценивали по тесту розеткообразования. 500000 спленоцитов в 0,5 мл суспензии прибавляли к равному объему суспензии ЭБ (50000000 ЭБ). Смесь инкубировали 18 часов при 4 градусах Цельсия. Затем подсчитывали число розеткообразующих клеток с пятью или более эритроцитами в препаратах раздавленной капли с помощью микроскопа "Дженавел" при увеличении 25 х 0,50. В каждом исследуемом образце подсчитывали также число ядросодержащих клеток, с целью исключения неспецифической оценки состояния клеток.

Влияние гамма-глутамилгистамина на количество антителообразующих клеток оценивали по тесту локального гемолиза ЭБ в геле агарозы. Суспензию спленоцитов (1000000 клеток /мл) смешивали с суспензией ЭБ (0,5%), распределяли тонким слоем на чашках Петри диаметром 100 мм, инкубировали 90 минут при 37 градусах Цельсия, добавляли комплемент и инкубировали при 37 градусах Цельсия не менее часа. Подсчет числа зон гемолиза проводили с помощью лупы "МБС-9".

Влияние гамма-глутамилгистамина на количество синтезированных антител-гемагглютининов оценивали методом титрации. Сыворотку крови декомплементировали, последовательно двукратно разводили с помощью микротитратора "Такачи". Разведения смешивали в лунках планшета с 0,9 процентной суспензией ЭБ. Агглютинацию учитывали визуально через 24 часа. За титр исследуемой сыворотки принимали наибольшее разведение, при котором наблюдалась агглютинация, и выражали величиной двоичного логарифма.

Вариационно-статистический анализ выполнен с использованием критерия достоверности по Стьюденту.

Результаты отражены на фиг. 5. Установлено, что гамма-глутамилгистамин в дозах 25 мкг/кг веса тела и 250 мкг/кг повышает число антителообразующих клеток в 2,7 раза (Р<0,02) и в 2,2 раза (Р<0,05), соответственно, и повышает титр гемагглютининов в 1,3 раза (Р<0,01) и в 1,2 раза (Р<0,05), соответственно, не влияя при этом на численность антигенсвязывающих клеток и ядросодержащих клеток.

3.1.2. Активация веществом гамма-глутамилгистамин Т-клеточно-опосредованного клеточного ответа замедленного типа у интактного организма.

Исследования выполнены на беспородных мышах и мышах линии BALB весом 18-20 г. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно субоптимальной дозой специфического антигена - 5000000 ЭБ. Затем перорально или внутрибрюшинно вводили раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе или физиологический раствор. На пятый день эксперимента в подушечки задних лап вводили разрешающую дозу (100000000) ЭБ в 50 мкл физиологического раствора. Через 24 часа интенсивность гиперчувствительности замедленного типа оценивали по степени увеличения объема подушечек с помощью микрометра "МК-0-25". Численность групп - по 10 животных. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента.

Результаты представлены на фиг. 6. Как видно, у интактных, практически здоровых животных гамма-глутамилгистамин при обоих способах введения статистически достоверно повышает гиперчувствительность замедленного типа к гетерогенным антигенам, в частности при оральном введении дозы 25 мкг/кг - в 2,2 раза (Р<0,01), дозы 250 мкг/кг - в 2,5 раза (Р<0,01), при внутрибрюшинном введении дозы 250 мкг/кг - в 2,1 раза (Р<0,02). У мышей линии BALB при оральном введении дозы 250 мкг/кг - в 2,5 раза (Р<0,02), при внутрибрюшинном введении дозы 250 мкг/кг - в 2,1 раза (Р<0,01).

3.2.1. Подавление веществом гамма-глутамилгистамин аллергических реакций немедленного типа.

Исследования выполнены на крысах Вистар массой 150-200 г и на морских свинках массой 250-300 г. Сенсибилизацию крыс осуществляли куриным овальбумином [13]. На первый и пятый дни эксперимента в область шеи подкожно вводили 20 мкг овальбумина в 0,5 мл физиологического раствора, содержавшего также 200000 микробных тел коклюшной вакцины. На пятнадцатый день вызывали активный анафилактический шок путем внутривенного введения 20 мг овальбумина в 0,5 мл физиологического раствора.

Сенсибилизацию морских свинок осуществляли овальбумином или цельным пастеризованным коровьим молоком. Овальбумин вводили перорально в течение первых трех дней эксперимента в дозах по 50 мкг/кг, на пятнадцатый день вводили внутривенно разрешающую дозу овальбумина (7 мг в 0,5 мл физиологического раствора). Молоко вводили перорально в течение трех дней по 3,6 мл. Для получения разрешающей дозы молоко центрифугировали и использовали фракцию, свободную от липидов и клеточных элементов, дозу 0,5 мл (7 мг белка) вводили внутривенно на пятнадцатый день. Тяжесть активного анафилактического шока оценивали по уровню летальности, количеству судорожных проявлений (или состоянию прострации у крыс) и по величине анафилактического индекса [21].

У морских свинок, сенсибилизированных овальбумином и получавших гамма-глутамилгистамин в течение трех дней до введения разрешающей дозы аллергена, непосредственно перед разрешающим введением аллергена получали кровь. Из последней получали сыворотку. В сыворотке твердофазным иммуноферментным методом определяли содержание Ig G к овальбумину. К адсорбированному в лунках микроплат овальбумину добавляли исследуемые сыворотки, отмывали, вносили конъюгированные с пероксидазой хрена кроличьи антитела против Ig G морской свинки, инкубировали, отмывали. Активность пероксидазы определяли в реакции с о-фенилендиамином (0,04% о-фенилендиамина, 0,04% перекиси водорода, цитратный буфер с рН 5,9), через 20 минут реакцию останавливали пятинормальной серной кислотой и измеряли оптическую плотность при 492 нм. Стандартную кривую получали с помощью разведений гипериммунной антисыворотки морской свинки, иммунизированной овальбумином.

Количество животных в группах, способы введения и дозы лекарственных препаратов приведены в подрисуночных подписях. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев Мана-Уитни и углового преобразования Фишера [20].

Результаты исследования представлены на фиг. 7.1-7.5. Установлено, что гамма-глутамилгистамин начинает проявлять антианафилактическую активность в дозе 5 мкг/кг. На обоих видах животных, при обоих аллергенах, при различных способах введения, в том числе при профилактических и лечебных схемах введения, дозы 50 мкг/кг приводят, статистически достоверно, к подавлению летальности в 0,6-4,0 раза, к уменьшению частоты судорог в 1,75-2,4 раза, к уменьшению анафилактического индекса в 1,6-2,3 раза. При этом препарат сравнения Супрастин (H1-блокатор) проявляет существенно меньшую защитную активность (см. фиг. 7.1-7.5).

Кроме того, гамма-глутамилгистамин (50 мкг/кг • 3 раза, внутрибрюшинно) вызывает статистически достоверное (Р<0,05) снижение содержания Ig G к аллергену - овальбумину (lg [С]: 2,88±0,19 /n=30/ в опыте против 3,19±0,14 в контроле /n=28/). Супрастин (1 мг/кг • 3 раза, через рот) вызывает снижение lg [С] от 3,21±0,10 в контроле /n=43/ до 2,92±0,06 в опыте /n=30/, (Р<0,05). При других условиях эксперимента снижения содержания Ig G не наблюдается гамма-глутамилгистамин (5 мкг/кг • 3 раза, внутрибрюшинно) - 3,16±0,09 в опыте /n= 30/ и 3,19±0,14 в контроле /n=28/, супрастин (1 мг/кг • 3 раза, внутрибрюшинно) - 3,12±0,18 в опыте /n=30/ и 3,19±0,14 в контроле /n=28/, гамма-глутамилгистамин (50 мкг/кг • 3 раза, через рот) - 3,15±0,11 в опыте /n=33/ и 3,21±0,10 в контроле/n=43/.

3.2.2. Влияние вещества гамма-глутамилгистамин на хроническую воспалительную реакцию, вызванную гиперчувствительностью замедленного типа.

Исследования выполнены на белых инбредных крысах-самцах массой 140-160 г. Для воспроизведения адъювантного артрита полный адъювант Фрейнда (5 мг БЦЖ/мл препарата) в дозах по 0,1 мл вводили внутрикожно в основание хвоста в течение 22 дней. Суставы подвергали онкометрии. Тяжесть артрита выражали через показатель артритного индекса - прироста объема пораженных суставов по отношению к исходному в процентах. Функцию суставов проверяли по способности крыс удерживаться на наклонной металлической решетке. Гамма-глутамилгистамин вводили в дозах 50 мкг/кг внутримышечно ежедневно. Противовоспалительный препарат Ибупрофен вводили в дозах 30 мг/кг внутрижелудочно ежедневно. Растворитель лекарственных препаратов - физиологический раствор - вводили контрольным животным ежедневно. В группах было по 10 животных.

Установлено, что на пике развития адъювантной болезни (22-й день) артритный индекс составляет (М±m): в контроле - 166,2±3,9%, в опыте у животных, получавших гамма-глутамилгистамин - 139,8±6,4%, в опыте у животных, получавших Ибупрофен - 126,6±5,8%. То есть степень снижения составила 26,4% и 39,6% соответственно. Таким образом, гамма-глутамилгистамин проявляет антиартритную активность, но несколько меньшую, чем препарат сравнения Ибупрофен.

4. Регуляторный характер влияния вещества гамма-глутамилгистамин на острую воспалительную реакцию.

Исследования, в основном, выполнены согласно "Методическим рекомендациям" Фармакологического Комитета МЗ СССР, 1986 [22].

4.1. Снижение активности острого экссудативного процесса химического генеза на моделях отека подкожной клетчатки и асептического перитонита.

Острое экссудативное воспаление лапки крыс вызывали путем субплантарного введения белым беспородным интактным или адренал-эктомированным крысам (180-200 г) по 0,1 мл 1% раствора каррагенина, или 2% раствора формалина, или 0,1% раствора гистамина. Адреналэктомию осуществляли за три дня до начала эксперимента. Раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе или физиологический раствор вводили за 4 часа до введения флогогенного агента с целью выявления профилактического эффекта или ежедневно в течение пяти дней с целью выявления лечебного эффекта. Объем лапки измеряли онкометрически на плетизмографе "Ugo Basil" /Италия/. Активность фармакологического препарата выражали в процентах уменьшения отека по сравнению с контролем, принятым за 100%. В каждой группе было не менее 10 животных.

Модель асептического перитонита воспроизведена на беспородных белых мышах (20-22 г) и крысах (200-240 г), которым вводили внутрибрюшинно по 0,1 мл 0,2% раствора нитрата серебра и через 6 часов измеряли количество асцитической жидкости. Раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе или физиологический раствор вводили за 40 минут до инокуляции нитрата серебра.

Установлено, что гамма-глутамилгистамин уменьшает количество асцитической жидкости в 4 раза у мышей и в 3 раза у крыс (см. фиг. 8.1 и 8.2). Гамма-глутамилгистамин в дозах 15-50 мкг/кг и при разных способах введения уменьшает отек лапки крыс на 50-80% (см. фиг. 9). Антиэкссудативная активность гамма-глутамилгистамина проявляется и у адреналэктомированных животных. Следовательно, эта активность развивается через механизмы, не затрагивающие известные механизмы подавления воспалительной реакции стероидными гормонами. Эффективность гамма-глутамилгистамина в дозах до 50 мкг/кг сравнима с таковой для препарата Ортофен, примененного в дозе 8 мг/кг.

4.2. Уменьшение объема альтерации тканей химического генеза на модели цистеаминовой язвы желудка и двенадцатиперстной кишки.

Животных содержали в индивидуальных клетках с проволочным полом. За сутки до эксперимента животных лишали пищи, сохраняя доступ к воде. Модель острой химической язвы желудка и двенадцатиперстной кишки воспроизводили у белых беспородных самок крыс с массой тела 170-245 г путем трехкратного (в 10, в 14 и в 18 часов суток) внутрижелудочного введения раствора цистеамина в дозе 300 мкг/кг. За 1 час до каждого введения цистеамина животным опытной группы внутрижелудочно вводили раствор гамма-глутамилгистамина (20 мкг/кг • 3 раза) на физиологическом растворе, а животным контрольной группы - физиологический раствор. Забой животных осуществляли через 48 часов после первого введения цистеамина. Раскрытые по большой кривизне препараты желудков с прилегающими сегментами двенадцатиперстной кишки фиксировали в течение 10 минут в 2% растворе формалина. Длину язвенных повреждений измеряли с помощью бинокулярной лупы при 8-кратном увеличении.

Острую резерпиновую язву желудка крыс воспроизводили на инбредных белых крысах-самках с массой тела 115-170 г. Резерпин вводили внутрибрюшинно в дозе 8 мг/кг. Гамма-глутамилгистамин (20 мкг/кг • 2 раза) в физиологическом растворе вводили внутрижелудочно дважды за 5 часов до введения резерпина и одновременно с введением резерпина. Забой животных осуществляли через 18 часов после введения резерпина.

Хроническую ацетатную язву крыс воспроизводили у беспородных белых крысах-самок с массой тела 135-195 г. 50 мкл ледяной уксусной кислоты через пропиленовую трубку диаметром 6 мм апплицировали в течение 30 секунд на передневерхнюю часть железистой области желудка. Со второго дня эксперимента ежедневно в течение десяти дней по два раза в день (в 9 и в 16 часов) внутрижелудочно вводили контрольным животным - физиологический раствор (5 мл/кг) и опытным животным - гамма-глутамилгистамин (20 мкг/кг) в адекватном количестве физиологического раствора. На двенадцатый день эксперимента животных забивали.

Секреторную активность изучали на инбредных белых крысах-самках с массой тела 195-255 г. Привратник желудка перевязывали под легким эфирным наркозом. Сразу после перевязки внутридуоденально вводили контрольным животным - физиологический раствор (5 мл/кг) и опытным животным - гамма-глутамилгистамин (100 мкг/кг) в аналогичном объеме физиологического раствора. Через 4 часа осуществляли забой животных. Содержимое желудка центрифугировали (4000 об/мин, 20 мин). Объем содержимого желудка измеряли в градуированных центрифужных пробирках. Кислотность содержимого измеряли путем титрования 1 мл образца раствором 0,2 N NaOH до рН 7,0 на ионометре "ЭВ-74".

Установлено, что на модели цистеаминовой язвы применение гамма-глутамилгистамина приводит к четырехкратному снижению количества животных, пораженных язвами, и к девятикратному уменьшению длины образованных язв 0,31±0,28 мм против 2,81±0,90 мм в контроле /Р<0,02/ (см. фиг. 10.1, 10.2).

В то же время, гамма-глутамилгистамин не влияет на развитие язв желудка и двенадцатиперстной кишки как на модели острой резерпиновой язвы желудка у крыс: длина язв составляет 19,6±1,9 мм в опыте и 20,4±3,7 мм в контроле, тяжесть повреждений по трехбалльной шкале 2,10±0,23 в опыте (n=10) и 1,80±0,33 в контроле (n=10), - так и на модели хронической ацетатной язвы у крыс площадь повреждений в миллиметрах квадратных составляет 32,1±8,2 в опыте (n=6) и 43,1±13,4 в контроле (n=6).

Гамма-глутамилгистамин не влияет также на секреторную активность желудочно-кишечного тракта крыс: показатели скорости секреции желудочного содержимого /мкл/ч/ равняются 480±53 в опыте и 581±51 в контроле, кислотность /мэкв/мл/ равняется 81,1±5,7 в опыте и 89,9±4,3 в контроле, скорость секреции Н /мкэкв/ч/ равняется 42,5±8,0 в опыте и 52,5±5,2 в контроле.

Таким образом, защита от цистеаминовой язвы объясняется, по-видимому, не противоязвенным действием как таковым, но антирадикальным действием гамма-глутамилгистамина через систему цитохромов.

4.3. Уменьшение интенсивности болевого синдрома на модели химического ожога брюшной полости.

Болевую реакцию "корчи" у белых беспородных мышей-самцов (20-22 г) вызывали внутрибрюшинным введением 2% раствора уксусной кислоты. Гамма-глутамилгистамин на физиологическом растворе или физиологический раствор вводили за 30 минут до введения кислоты. Численность групп - по 10 животных. Выраженность защитного эффекта препарата оценивали по уменьшению числа "корчей" (в процентах к контролю) в течение 20 минут наблюдения.

Установлено, что гамма-глутамилгистамин уменьшает количество "корчей" на 70% при внутрибрюшинном введении дозы 20 мкг/кг, на 50% при внутрижелудочном введении дозы 20 мкг/кг, на 35% при внутримышечном ведении дозы 50 мкг/кг. Препарат сравнения Вольтарен уменьшает количество "корчей" на 50% при внутрижелудочном введении дозы 25 мг/кг. В связи с тем что гамма-глутамилгистамин не влияет на нейротрансмиттерные системы (см. раздел 6.4), эффект обезболивания на модели "корчей" объясняется, возможно, его противорадикальной активностью.

4.4. Увеличение под влиянием гамма-глутамилгистамина активности лизосомальных ферментов в тканях, окружающих зону альтерации на модели инфаркта миокарда.

Инфаркт миокарда воспроизводили у белых беспородных крыс с массой тела 250-300 г. Перевязывали нисходящую ветвь левой коронарной артерии в участке сердца, находящемся в 2-3 мм выше границы ушка левого желудочка. Операция выполнялась под эфирным наркозом. Смертность животных после создания ишемического некроза составляла около 50%. Гамма-глутамилгистамин вводили внутривенно ежедневно в дозах по 100 мкг/кг в течение 2 недель (5 крыс). В контроле было также 5 крыс.

Через указанные сроки на холоду извлекали миокард. Его отмывали, очищали от соединительных тканей, удаляли предсердия, выделяли участки, окружающие зону некроза, из левого желудочка и участки из правого желудочка, взвешивали, измельчали ножницами и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейма с тефлоновым пестиком (зазор 0,21 мм) в течение 180 секунд при 40 оборотах в минуту в ледяном буферном растворе 0,6 М KCl (х. ч.), 0,25 М сахароза (х. ч.), 10 мМ имидазол ("Серва", ФРГ), 1мМ ЭДТА ("Серва", ФРГ), рН 7,25. Соотношение масс ткани и среды в гомогенате составляло 1:10.

На ультрацентрифуге "Beckman" /США/ гомогенат подвергали дифференциальному центрифугированию. В супернатанте (цитозоле) определяли активность растворившихся лизосомальных ферментов. Фракцию осадка ресуспендировали 1:1 в буферном растворе (0,7 М сахароза, 1 мМ ЭДТА, рН 7,0) и разделяли ее на две части, в одной из них определяли доступную для субстрата активность ферментов неразрушенных лизосом, другую часть подвергали замораживанию-оттаиванию в жидком азоте с целью разрушения лизосом и определяли в ней общую активность лизосомальных ферментов.

Определение активности N-ацетил-β-D-глюкозаминидазы проводили с субстратом 4-нитрофенил-М-ацетил-β-D-глюкозаминид (5 мМ) в 0,2 М ацетатном буфере, 0,7 М сахароза, рН 5,5. К 100 мкл инкубационной смеси добавляли 20 мкл исследуемого материала, инкубировали 20 минут при 37 градусах Цельсия. Реакцию останавливали 0,5 мл 0,5 М раствора NaOH. Фотоколориметрию выполняли на спектрофотометре "DH-8B"/"Beckman", США/ при длине волны 405 нм. Удельную активность фермента выражали в наномолях освобожденного за 1 минуту 4-нитрофенола на 1 мг белка. Белок определяли по методу Лоури.

Результаты представлены на фиг. 11. Установлено, что гамма-глутамилгистамин статистически достоверно повышает активность фермента в лизосомах. В периинфарктной зоне активность во фракции разрушенных лизосом составляет в опыте 2,64±0,08 Ед. (диапазон разброса 2,26-2,87 Ед.) против 1,4±0,01 Ед. (1,38-1,42 Ед. ) в контроле, то есть активность увеличилась на 89%. На 45% увеличилась активность во фракции цитозоля: 1,13±0,06 Ед. (0,94-1,23 Ед.) против 0,78±0,02 Ед. (0,73-0,83 Ед.). На 22% увеличилась активность в тесте на проницаемость мембран для субстрата 1,11±0,05 Ед. (0,98-1,24 Ед.) против 0,91+0,05 Ед. (0,77-1,04 Ед.).

В правом желудочке также наблюдается изменение активности фермента. Во фракции дезинтегрированных лизосом - повышение на 28%: 2,43 ± 0,20 Ед. (2,07-3,08 Ед.) против 1,9±0,05 Ед. (1,78-2,06 Ед.) в контроле. Несмотря на это повышение, активность растворимого фермента в опытной группе /0,70±0,04 Ед. (0,62-0,82 Ед. )/ практически одинакова уровню такового в контрольной группе /0,72±0,03 Ед. (0,63-0,79 Ед.)/. А проницаемость мембран лизосом для субстрата уменьшилась на 39%: 0,52±0,06 Ед. (0,36-0,65 Ед.) против 0,84±0,05 Ед. (0,72-0,96 Ед.).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о системном воздействии гамма-глутамилгистамина на лизосомальный аппарат, выражающемся, с одной стороны, в повышении мощности лизосомального гидролитического аппарата и, с другой стороны, в усилении контроля над этим аппаратом со стороны лизосомальных мембран.

4.5. Уменьшение под влиянием гамма-глутамилгистамина смертности животных, площади ран, подавление серозного выпота, ускорение самоочистки ран от дебриса на модели химического ожога кожи.

Исследования, в целом, выполнены согласно "Методическим рекомендациям по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических веществ (Официальное издание)"/. В кн. "Руководящие материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств (Официальное издание)", Часть 6, стр. 51-62 / МЗ СССР, Управление по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники, Фармакологический комитет / М., 1986.

Модель химического ожога кожи воспроизводили на белых инбредных мышах-самцах с массой тела 26-28 г. Подкожно вводили 0,4 мл 3% или 2,3% раствора уксусной кислоты. За 1 час до этого вводили внутрибрюшинно физиологический раствор 0,2 мл или солянокислую соль гамма-глутамилгистамина (19 мкг/кг) в 0,2 мл физиологического раствора. Через сутки учитывали число выживших животных, площадь раны, наличие некротических масс. В опыте первом с 3% раствором кислоты использовано по 14 животных в экспериментальной и контрольной группах. В опыте втором с 2,3% раствором кислоты использовано по 16 животных.

Результаты отражены на фиг. 12.1 - 12.3. В контрольных группах погибли в первом опыте - 8 животных из 14, во втором опыте - 3 животных из 16. В обоих опытах выжили все животные, получившие гамма-глутамилгистамин. У животных, получивших гамма-глутамингистамин, средняя площадь ран уменьшилась по сравнению с таковою для выживших контрольных животных в 2,4 раза в первом опыте и примерно в 10 раз во втором опыте. При этом во втором опыте, фактически, из 16 экспериментальных животных рана образовалась только у 1 животного, хотя и сравнимая по размерам с ранами у контрольных животных.

Принципиально важно, что в обоих опытах у животных, получивших гамма-глутамилгистамин, уже через 8 часов после кислотного ожога (срок первого наблюдения) поверхность ран не имеет некротических масс и фибринного налета; она чистая, розовая, глянцевая на вид. И такая картина сохраняется до полного заживления ран. У животных, не получивших гамма-глутамилгистамил, раны имеют классический вид - они покрыты корками некротических масс, пропитанными фибрином.

4.6. Активация нарастания грануляционной ткани в ране под влиянием гамма-глутамилгистамина.

Модель "ватной гранулемы" воспроизводили на белых инбредных крысах-самцах. Простерилизованные в спирте ватные шарики весом 15 мг имплантировали подкожно. На восьмые сутки гранулемы извлекали, взвешивали, высушивали до постоянной массы при 55 градусах Цельсия и взвешивали. Массу образовавшейся грануляционно-фиброзной ткани определяли по разнице между массами высушенной гранулемы и имплантированного ватного шарика.

Результаты представлены на фиг. 13. Установлено, что гамма-глутамилгистамин в дозах 50 мкг/кг и 100 мкг/кг увеличивает нарастание гранулематозной ткани на 94% и 74% соответственно, а препарат сравнения Ортофен (5 мг/кг), напротив, уменьшает нарастание ткани на 41%.

4.7. Ускорение скорости заживления ран слизистой полости рта крыс под влиянием гамма-глутамилгистамина.

Белым беспородным крысам массой 200-220 г наносили механическое повреждение на слизистую ротовой полости. Лечение проводили ежедневно путем орошения раны раствором гамма-глутамилгистамина на дистиллированной воде (1 мг/мл), контрольным животным рану орошали дистиллированной водой. В группах было по 10 животных. Заживление раны оценивали визуально по наличию гиперемии и затягиванию ран эпителием.

Результаты представлены на фиг. 14. Установлено, что исчезновение гиперемии и эпителизация ранки ротовой полости у леченых животных наступает на третьи-пятые сутки, у нелеченых животных - на 7-8 сутки.

4.8. Выводы: подавление эксквизитной (избыточной, чрезмерной) части в деконструктивной (разрушительной) фазе воспалительной реакции и активация конструктивной (восстановительной) фазы воспалительной реакции под влиянием гамма-глутамилгистамина.

Таким образом, выполненные эксперименты по изучению влияния гамма-глутамилгистамина на деконструктивную фазу воспалительной реакции показали, что данное вещество уменьшает интенсивность как отдельных элементов деконструктивной фазы, так и деконструктивной фазы, в целом: уменьшение острого экссудативного процесса при химической альтерации тканей,
уменьшение язвообразования при химической альтерации слизистой желудка,
уменьшение числа "корчей" при химической альтерации тканей брюшной полости,
уменьшение смертности животных и величины ран при химической альтерации кожи.

Не исключено, что в качестве механизмов, участвующих в уменьшении интенсивности деструктивной реакции под воздействием гамма-глутамилгистамина, можно рассматривать установленные в вышеизложенных исследованиях факты:
уменьшение спровоцированного выброса гистамина - первичного биохимического медиатора воспалительной реакции,
повышение активности ферментов Р450 - системы защиты от свободнорадикального процесса,
повышение прочности лизосомальных мембран, что должно приводить к уменьшению вторичных повреждений здоровых тканей от высвобожденных лизосомальных ферментов.

В то же время, проведенные эксперименты показали, что вещество гамма-глутамилгистамин приводит к увеличению интенсивности восстановительной фазы воспалительной реакции:
резкое ускорение процесса самоочистки ран от нежизнеспособных клеток и фибрина, по-видимому, в силу увеличения удельной активности внутрилизосомальных гидролаз,
ускорение процесса нарастания грануляционной ткани в очищенной ране,
увеличение скорости заживления раны.

5. Гепатозащитная активность вещества гамма-глутамилгистамин.

Острое токсическое поражение печени мышей вызывали однократным внутрибрюшинным введением тетрахлорметана в дозе 2ДЛ₅₀. Раствор гамма-глутамилгистамина (50 мкг/кг) вводили за 1 час до затравки и затем через 24 часа. Защитный эффект оценивали по индексу выживаемости в течение 4 суток. Препаратом сравнения служил Эссенциале /ФРГ/.

Хроническое поражение печени крыс вызывали путем ежедневного в течение 4 суток введения тетрахлорметана в разовых дозах 0,4 мл/100 г массы тела в виде 50 процентного раствора на вазелиновом масле. Гамма-глутамилгистамин (50 мкг/кг) или Эссенциале (50 мг/кг) вводили внутримышечно ежедневно в течение 10 суток. На следующие сутки животных забивали. Исследовали активность ферментов в сыворотке крови спектрофотометрическими методами. Липидный состав печени изучали методом тонкослойной хроматографии в системе гексан:диэтиловый эфир: ледяная уксусная кислота - 80:20:2, хроматограммы оценивали спектрофотометрически после элюирования пятен липидов, проявленных фосфорно-молибденовой кислотой, результаты выражали в виде процентного распределения фракций. Выполнено также гистологическое исследование тканей печени, результаты выражены в виде индекса поражения в баллах.

Установлено, что в острых опытах гамма-глутамилгистамин по сравнению с Эссенциале повышал выживаемость на 17-20% и при внутрижелудочном, и при внутримышечном введении.

В хроническом эксперименте в тканях печени наблюдаются выраженные дистрофические изменения центролобулярная вакуольнокапельная жировая дистрофия с потерей балочной структуры, с явлениями кариолизиса гепетоцитов, с мелкоочаговыми воспалительными инфильтратами, состоящими из лимфоцитов, расширение центральных вен и синусоидов.

Применение Эссенциале оказывает положительный защитный эффект. Однако сохраняются участки паренхимы с центролобулярной вакуольнокапельной дистрофией, расширение синусоидов.

У животных, леченных гамма-глутамилгистамином, отмечено снижение степени выраженности жировой дистрофии по сравнению с нелечеными животными. У трех животных наблюдалась умеренно выраженная жировая дистрофия с нарушением балочной структуры, с явлениями пинноза и кариолизиса отдельных гепатоцитов. У четырех животных - жировая капельная дистрофия отдельных гепатоцитов, балочная структура сохранна, близка к норме, воспалительные инфильтраты отсутствуют, синусоиды почти в норме. Индекс поражения печени в баллах: интактные животные - 0, затравленные тетрахлорметаном - 1,4, затравленные + Эссенциале - 0,9, затравленные + гамма-глутамилгистамин - 0,9.

Таким образом, гамма-глутамилгистамин проявляет гепатозащитную активность, равную таковой для Эссенциале. Но осуществляется эта активность, по-видимому, через другие механизмы действия, отличающиеся от таковых для использованного препарата сравнения. Об этом свидетельствуют результаты изучения биохимических показателей крови и печени (см. таблицу 7).

6. Фармакологическая безопасность вещества гамма-глутамилгистамин.

6.1. Испытания острой токсичности гамма-глутамилгистамина.

Проведены следующие эксперименты: один эксперимент - на морских свинках и три эксперимента на белых беспородных мышах-самцах.

Морским свинкам (n=5) с массой тела 700±10 г гамма-глутамилгистамин на физиологическом растворе был введен в дозе 814 мкг/кг внутрибрюшинно. В ближайшие часы после введения и далее в течение двух недель каких-либо изменений в состоянии или поведении животных не наблюдалось. Таким образом, максимальная доза превысила терапевтические дозы в 16-33 раза.

Мышам с массой тела 25 ± 1,5 г внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл физиологического раствора с гамма-глутамилгистамином, дозы которого составляли 100 мкг/кг (n= 9), 1000 мкг/кг (n=9), 10000 мкг/кг (n=5), 20000 мкг/кг (n= 10). Ни в ближайшие часы, ни в течение двух недель каких-либо изменений в состоянии или поведении животных не наблюдалось. Таким образом, максимальные дозы превысили терапевтические в 400-800 раз.

Мышам с массой тела 20±1 г вводили однократно внутрибрюшинно раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе с максимальной концентрацией гамма-глутамилгистамина 60 мг/мл. Объемы вводимого раствора составляли 1 мл, а максимальные объемы - 1,2 мл и, соответственно, максимальные дозы - 3,2 г/кг (n=10). При введении максимальных доз не отмечено выраженных внешних признаков интоксикации. В течение первых 30- 40 минут после введения наблюдались признаки беспокойства, характерные для данных объемов внутрибрюшинного введения. При последующих осмотрах в течение 14 дней каких-либо отклонений не отмечено. Таким образом, максимальные дозы превысили терапевтические дозы в 64000-128000 раз.

Мышам с массой тела 20±1 г вводили внутрижелудочно зондом раствор гамма-глутамилгистамина в концентрации 200 мг/мл на физиологическом растворе в два приема по 0,5 мл с интервалом 40 минут. Максимальная доза гамма-глутамилгистамина составила 10 г/кг (n=10). В течение первого часа после введения наблюдались связанные с реакцией животных на введение в желудок большого объема жидкости признаки некоторого возбуждения: груминг, вертикальное положение. Далее в течение 14 дней какого-либо отклонения в состоянии животных не наблюдалось. Таким образом, максимальная доза превысила терапевтические дозы в 200000-400000 раз.

Следовательно, вещество гамма-глутамилгистамин может быть отнесено к препаратам V класса токсичности - практически нетоксичным веществам (по четвертой группе экспериментов), или к препаратам VI группы токсичности - относительно безвредным веществам (по третьей группе экспериментов). Учитывая величину предполагаемой терапевтической дозы 5-50 мкг на кг массы тела, можно прогнозировать большую широту терапевтического действия вещества гамма-глутамилгистамин.

6.2. Иммунологическая безопасность гамма-глутамилгистамина.

Исследования, в целом, выполнены согласно "Методическим рекомендациям по оценке аллергенных свойств фармакологических средств" Фармакологического комитета МЗ СССР, 1988 [23].

6.2.1. Отсутствие сенсибилизирующей активности гамма-глутамилгистамина по отношению к интактному организму в реакции гиперчувствительности замедленного типа /ГЗТ/.

Эксперименты выполнены на мышах. Гамма-глутамилгистамин в дозах 25 мкг/кг или 250 мкг/кг в составе водорастворимой эмульсии (1:1) с неполным адъювантом Фрейнда в объеме 60 мкл вводили в основание хвоста. На пятый день после сенсибилизации в подушечку задней лапы вводили разрешающую дозу гамма-глутамилгистамина 25 или 250 мкг/кг в объеме 40 мкл на физиологическом растворе. Контрольным животным вводили адекватное количество неполного адъюванта Фрейнда с физиологическим раствором (1:1) и разрешающую дозу гамма-глутамилгистамина. Выраженность реакции ГЗТ учитывали через 24 часа по разнице между толщиной лапки контрольных и опытных животных. Численность групп - по 10 животных.

Установлено, что онкометрические показатели (/М±m/ в миллиметрах) составляют в контроле - 0,15+0,02 (диапазон разброса данных от 0,11 до 0,19), на дозе 25 мкг/кг - 0,18±0,03 (от 0,16 до 0,24), на дозе 250 мкг/кг - 0,21±0,02 (от 0,12 до 0,24). Разница между показателями статистически недостоверна.

6.2.2. Отсутствие сенсибилизирующей активности гамма-глутамилгистамина по отношению к интактному организму в реакции гиперчувствительности немедленного типа /ГНТ/.

Эксперименты выполнены на инбредных морских свинках. Численность групп - по 10 животных. Сенсибилизацию гамма-глутамилгистамином проводили дважды с интервалом в неделю в разовых дозах по 5 мкг в первой группе и по 50 мкг во второй группе. Гамма-глутамилгистамин вводили под кожу правого бока. Непосредственно перед первой инъекцией гамма-глутамилгистамина вводили эмульсию неполного адъюванта Фрейнда с физиологическим раствором (1:1) в подушечки задних лап. Контрольным животным в те же сроки вводили только неполный адъювант Фрейнда (1:1) и растворитель. Разрешающую дозу гамма-глутамилгистамина (50 мкг) вводили внутрисердечно на двадцать первый день после реиммунизации.

Установлено, что введение разрешающей дозы не приводит к существенным изменениям в состоянии сенсибилизированных и контрольных животных.

6.2.3. Гамма-глутамилгистамин не усиливает процесс сенсибилизации интактного организма к гетерогенному белковому антигену.

Исследования выполнены на морских свинках (весом 300 г) на модели анафилактического шока. Животных сенсибилизировали однократно лошадиным Ig G (100 мкг внутримышечно). Дополнительно в подушечки задних лап вводили контрольным животным 0,2 мл смеси неполного адъюванта Фрейнда с физиологическим раствором (1: 1) и опытным животным 50 мкг гамма-глутамилгистамина в 0,2 мл смеси неполного адъюванта Фрейнда с физиологическим раствором (1:1). На четырнадцатый день эксперимента осуществляли разрешающую инъекцию антигеном (Ig G 0,6 мг внутрисердечно). Степень выраженности аллергизации к белковому антигену оценивали по формуле Уэйгла.

Установлено, что гамма-глутамилгистамин в диапазоне доз 200-250 мкг/кг не оказывает влияния на процесс аллергизации, индуцированной лошадиным Ig G: контроль - 3,5 единиц, опыт - 3,5 единиц.

6.3. Гамма-глутамилгистамин не оказывает кардиотоксического действия.

В экспериментах использованы кролики породы "шиншилла" массой 2,5-3 кг и беспородные белые крысы массой 250-300 г.

Опыты по изучению центральной и периферической гемодинамики осуществляли под местной анестезией 0,5% раствором новокаина. Электроманометрически определяли максимальное и минимальное артериальное давление в центральном конце общей сонной артерии. Затем под гексеналовым наркозом инвазивным методом определяли сократительную функцию желудочков сердца. На открытом сердце в полости правого и левого желудочков вводили канюли и регистрировали электроманометрически реальное внутрижелудочковое давление. Затем определяли максимальное давление, развиваемое желудочками в условиях изометрического сокращения и характеризующее потенциальную работоспособность миокарда. Для этого измеряли внутрижелудочковое давление при пятиминутной окклюзии восходящей аорты для левого желудочка и легочной артерии для правого желудочка ЭКГ записывали в стандартном отведении и вычисляли продолжительность фаз систолы и диастолы. Изопротенероловое поражение миокарда воспроизводили путем внутривенного введения изопротенерола в дозе 15 мг/кг и через 5-6 минут вводили раствор гамма-глутамилгистамина.

Ишемический инфаркт миокарда создавали у крыс путем перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии в участке сердца, находящемся в 2-3 мм выше границы ушка левого желудочка. Смертность животных после создания ишемического некроза составляла около 50%. Гамма-глутамилгистамин вводили внутривенно на физиологическом растворе.

Ткани инфарктного миокарда отбирались для биохимического изучения (см. раздел 4.4) и для электронно-микроскопического исследования. В последнем случае сердца перфузировали 2,5% раствором глютарового диальдегида под давлением 80-120 мм ртутного столба в течение 8-10 минут, с последующим иссечением участков в инфарктной и периинфарктной зонах. Фиксацию этих участков проводили в 2,5% растворе глютарового диальдегида и дофиксацию - в 1% забуференном растворе четырехокиси осмия. Затем материал заливали в аралдит и исследовали с помощью электронного микроскопа "Tesla BS-540".

Влияние гамма-глутамилгистамина на возбудимость кардиомиоцита изучали на препарате изолированного сердца лягушки. Исходная масса животных равнялась 40 г. Сердце содержали в ванночке с раствором Рингера рН 7,2-7,4 при комнатной температуре. При необходимости в ванночки добавляли гамма-глутамилгистамин. Микроэлектроды с сопротивлением 5-15 МОм заполняли раствором 3-молярного хлористого калия и вводили в вентрикулярные волокна.

Установлено, что у кроликов интактных или страдающих острым или хроническим изопротенероловым миокардитом и у крыс интактных или страдающих инфарктом миокарда гамма-глутамилгистамин при остром или хроническом введении не вызывает достоверных изменений как периферической, так и внутрисердечной гемодинамики (см. таблицы 1-3).

Элетронно-микроскопические картины инфарктной и периинфарктной зон у животных, получавших гамма-глутамилгистамин в течение двух недель, практически не отличаются от таковых у животных, не получавших данное вещество. Так, при двухнедельном наблюдении в инфарктных зонах опытных и контрольных животных выявлены обширные зоны миолиза, выраженный внутри- и внеклеточный отек, гомогенизация и вымывание митохондриального матрикса, в периинфарктных зонах выявлены мозаичные картины: чередование участков выраженных деструктивных изменений с сохранными участками.

Результаты исследования возбудимости кардиомиоцита отражены в таблице 4, где вещество гамма-глутамилгистамин обозначено как вещество Х. Показано, что гамма-глутамилгистамин в дозе 100 мкг/кг не влияет на показатели возбудимости. Изменения возбудимости наблюдаются в дозах 300 мкг/кг и 700 мкг/кг, т. е. в дозах, в 6-28 раз превышающих эффективные терапевтические дозы для млекопитающих. При этом отсутствие изменения крутизны нарастания восходящей фазы потенциала действия указывает на то, что гамма-глутамилгистамин не влияет на плотность быстрого, направленного внутрь клетки тока ионов натрия и не изменяет скорости деполяризации мембран. Возможно, зарегистрированное увеличение амплитуды спайка и овершута происходит благодаря усилению быстрого входящего тока ионов кальция (в конце фазы 0). Удлинение плато потенциала действия при действии больших доз свидетельствует о потенцировании медленных кальциевых каналов и об увеличении плотности направленного внутрь потока ионизированного кальция, а уменьшение крутизны нисходящей фазы потенциала действия - фазы реполяризации - об ослаблении выходящих калиевых потоков. В то же время, отсутствие снижения в уровне потенциала покоя может свидетельствовать об отсутствии мембраноповреждающих свойств у вещества гамма-глутамилгистамин.

6.4. Отсутствие влияния вещества гамма-глутамилгистамин на рецепторные системы.

6.4.1. Тесты на кожную болевую чувствительность.

Выполнено три теста: сдавливание воспаленной лапки крысы, "горячая пластина", сфокусированный световой пучок. Статистическая обработка результатов проведена с помощью критерия Стьюдента.

У половозрелых белых крыс отек лапки вызывали субплантарным введением 0,1 мл 1% раствора каррагенина /n=10/. Исследование выполнено на анальгезиметре "Ugo Basil" /Италия/. Установлено, что гамма-глутамилгистамин (50-100 мкг/кг, внутримышечно) не влияет на порог болевой чувствительности (см. таблицу 5).

В тесте "горячая пластина" (55 градусов Цельсия) у половозрелых белых крыс на аппарате "Ugo Basil" продолжительность латентного периода болевой реакции (облизывание лап, прыжки) не менялась в течение 90 минут после внутримышечного введения раствора гамма-глутамилгистамина в дозах 50 и 100 мкг/кг (см. таблицу 5).

Антиноцицептивные свойства исследованы на мышах-самцах линии BALB с массой тела 18-22 г с помощью анальгезиметра "812" фирмы "Hugo Sachs Electronic KG" /ФРГ/. В качестве термического раздражителя использовали сфокусированный пучок тепловых лучей продолжительностью не более 7 секунд при исходной реакции 2-4 секунды. Эксперименты проведены на одной серии животных в течение одной недели в период суток 11-14 часов пополудни.

Результаты изучения антиноцицептивных свойств представлены в таблице 6. Как видно из представленных данных, периферическое введение гамма-глутамилгистамина в дозах 0,0001 - 10,0 мг/кг не влияет на латентный период ноцицептивной реакции.

6.4.2. Отсутствие влияния на сократимость гладких мышц изолированных органов.

Эксперименты выполнены по руководству Блаттер М. и соавт. [24]. Использованы органы половозрелых инбредных животных. За сутки до опыта животных лишали корма. Морских свинок-самцов умерщвляли смещением шейных позвонков, самцов и самок крыс - ударом по голове и проводили кровопускание. Вещество гамма-глутамилгистамин и вещества сравнения растворяли в дистиллированной воде. Использованы следующие нейромедиаторы и их аналоги: серотонин, гистамин, брадикинин, окситоцин, карбахолин - агонист м- и н-холинорецепторов, пириламин - антагонист H1-рецепторов, циметидин - антагонист Н-рецепторов, ципрогептадин - блокатор серотониновых рецепторов, опиоидный пептид даларгин, блокирующий высвобождение ацетилхолина из пресинаптических нервных окончаний, мезатон, изадрин.

6.4.2.1. Подвздошная кишка морской свинки в условиях изотонической регистрации сократительной активности.

Сегмент подвздошной кишки длиной около 1 см помещали в постоянно аэрируемые в стеклянной ячейке 10 мл гипокальциевого (0,9 ммоль хлористого кальция) раствора Тироде, рН 7,2-7,4, с температурой 35 градусов по Цельсию. Сегмент фиксировали к дну ячейки и к датчику регистрации изотонических сокращений типа В (Hugo Sach Elektronik /ФРГ/, далее HSE). Сигнал через мостовой усилитель "301" HSE выводили на регистратор "R-64" ("Rikadenki Kooyo" /Япония/). Начальное растяжение сегмента составляло 0,5 см. После периода уравновешивания (30-40 минут) в ячейку вносили водные растворы исследуемых веществ в объемах 5-25 мкл. Каждое последующее введение производили после 3-4-кратного отмывания органа в течение 6-9 минут. Количественные изменения активности выражали в виде средних величин изменений амплитуды сокращений по отношению к максимальному ответу на соответствующий нейромедиатор.

При количественной оценке установлено, что амплитуда сокращений на карбахолин (3/100000000 моль/л) составляет 50±6% от максимального ответа и практически не изменяется на фоне предварительно (за две минуты) добавленного гамма-глутамилгистамина в концентрациях 1/1000000000 моль/л и 1/100000 моль/л: 52±8% и 48±8% соответственно. Ответ на гистамин (3/10000000 моль/л) составляет 51±9% от максимального и не изменяется на фоне действия гамма-глутамилгистамина в концентрациях 1/1000000000 моль/л и 1/100000 моль/л: 48±9% и 54±7% соответственно. Ответ на серотонин (1/1000000 моль/л) составляет 55±7% от максимального и практически не изменяется на фоне действия гамма-глутамилгистамина в концентрациях 1/1000000000 моль/л и 1/100000 моль/л: 43±6% и 46±7% соответственно.

6.4.2.2. Подвздошная кишка морской свинки в условиях изометрической регистрации сократительной активности.

Сегмент подвздошной кишки помещали в условия, аналогичные вышеописанным, за следующими исключениями: модифицированный раствор Кребса, датчик изометрической регистрации "К 30" HSE, начальное натяжение органа равнялось 1 г. Электрическую стимуляцию сегмента осуществляли с помощью пластинчатых электродов "F 2H" HSE и стимулятора "215" HSE одиночными прямоугольными импульсами длительностью 1 мс, частотой 0,1 Гц при напряжении 80 В. Изменения амплитуды сокращений выражали в процентах к исходному уровню, принятому за 100%. Изменение амплитуды сокращений характеризует прямое или косвенное влияние веществ на высвобождение ацетилхолина из пресинаптических нервных окончаний или на блокирование холинорецепторов постсинаптической локализации.

При количественной оценке установлено, что амплитуда сокращений на карбахолин (3/100000000 моль/л) составляет 50±6% от максимального ответа и практически не изменяется на фоне предварительно (за две минуты) добавленного гамма-лутамилгистамина в концентрациях 1/1000000000 моль/л и 1/100000 моль/л: 52±8% и 48±8% соответственно. Ответ на гистамин (3/10000000 моль/л) составляет 51±9% от максимального и не изменяется на фоне действия гамма-глутамилгистамина в концентрациях 1/1000000000 моль/л и 1/100000 моль/л: 48±9% и 54±7% соответственно. Ответ на серотонин (1/1000000 моль/л) составляет 55±7% от максимального и не изменяется на фоне действия гамма-глутамилгистамина в концентрациях 1/1000000000 моль/л и 1/100000 моль/л: 43±6% и 46±1% соответственно.

6.4.2.3. Двенадцатиперстная кишка морской свинки в условиях изометрической регистрации сократительной активности.

0,5 см кишки помещали в модифицированный раствор Кребса при начальном натяжении 0,5 г. Показано, что гамма-глутамлгистамин в диапазоне концентраций 1/1000000000000 - 1/10000000 моль/л не влияет на сократимость органа, в том числе на сократимость, стимулированную гистамином.

6.4.2.4. Рог матки крысы в условиях изометрической регистрации сократительной активности.

1 см рога матки помещали в гипокальциевый (0,18 ммоль хлористого кальция) раствор Тироде или в модифицированный раствор Кребса с нормальным содержанием кальция. Исходное натяжение - 1 г.

Показано, что орган не реагирует на гамма-глутамилгистамин (1/10000000 - 1/1000000 моль/л). Амплитуда ответов на серотонин (3/1000000 моль/л) составляет 72±9% и не изменяется на фоне гамма-глутамилгисамина в концентрациях 1/1000000 моль/л и 1/100000 моль/л 73±8% и 71±10% соответственно. Ответы на брадикинин (1/100000000 моль/л) составляют 60±14% и не изменяются на фоне гамма-глутамилгистамина в концентрации 1/1000000 моль/л 58±9%. Ответы на окситоцин (0,75 мкМЕ) составляют 62±9% от максимума и не изменяются на фоне гамма-глутамилгистамина в концентрациях 1/1000000 моль/л и 1/100000 моль/л 60±10% и 63±11% соответственно.

В условиях высокого содержания кальция, когда миометрий сохраняет способность к спонтанным ритмическим сокращениям, гамма-глутамилгистамин в концентрациях до 1/1000000 моль/л не влияет на частоту и амплитуду сокращений, а также на тонус миометрия. На фоне действия окситоцина (0,025 ME) гамма-глутамилгистамин в концентрации 1/100000 моль/л вызывает снижение тонуса миометрия без существенного влияния на его ритмическую активность.

6.4.2.5. Кольцо трахеи крысы
Сегмент трахеи крысы длиной около 0,5 см помещали в модифицированный раствор Кребса Регистрацию сокращений осуществляли в изометрическом режиме Начальное натяжение - 1 г
Показано, что препарат не реагирует на гамма-глутамилгистамин в концентрациях 1/1000000000000 - 1/100000 или на гистамин в концентрациях 1/1000000 - 1/100000 Карбахолин отчетливо тонизирует трахею
6.4.2.6. Кольцо аорты крысы
Сегмент грудной части аорты крысы помещали в модифицированный раствор Кребса. Сократительную активность оценивали в изометрическом режиме. Начальное натяжение - 1 г.

Показано, что препарат нечувствителен к гамма-глутамилгистамину в диапазоне концентраций 1/100000000000 - 1/100000 моль/л, в том числе на фоне тонизирующего действия Мезатона (1/1000000 моль/л). Изадрин в этих условиях оказывает расслабляющее действие.

6.4.2.7. Предсердие крысы.

Предсердие без участка водителя ритма помещали в модифицированный раствор Кребса и стимулировали одиночными прямоугольными импульсами длительностью 1 мс, частотой 1 Гц при напряжении 80 вольт в изометрическом режиме.

Показано, что препарат нечувствителен к гамма-глутамилгистамину в концентрациях 1/1000000000000 - 1/100000 моль/л Карбахолин (1/100000 моль/л) вызывает угнетение амплитуды сокращений органа.

6.4.2.8. Полоска желудка крысы.

Полоску дна желудка шириной 3 мм и длиной 10 мм помещали в модифицированный раствор Кребса и регистрировали сокращения в изометрическом режиме. Начальное натяжение - 1 г.

Показано, что препарат нечувствителен к гамма-глутамилгистамину в диапазоне концентраций 1/1000000000000 - 1/100000 моль/л. Гамма-глутамилгистамин (1/100000 моль/л) не влияет также на сократительные ответы, вызванные гистамином (1/100000 моль/л). Блокатор H1-рецепторов - Пириламин - устраняет действие гистамина.

6.4.2.9. Семявыносящий проток крысы.

1 см семявыносящего протока помещали в модифицированный раствор Кребса. Сокращения регистрировали в изометрическом режиме или на фоне электрической стимуляции (1 мс, 0,1 Гц), или без электрической стимуляции, при которой сокращения обусловливаются высвобождением эндогенного норадреналина. Исходное натяжение - 0,5 г.

Показано, что гамма-глутамилгистамин в концентрациях 1/1000000000000 - 1/100000 моль/л не влияет на амплитуду сократительных ответов органа, а также не изменяет влияния мезатона на тонус протока как при электрической стимуляции, так и без нее.

Таким образом, гамма-глутамилгистамин не влияет на нейротрансмиттерные системы, если системы находятся в "нормальных" условиях как в тестах in vivo, так и в тестах in vitro. В частности, в тестах in vitro, если органы находятся в нормо- или в гипокальциевой среде и базальный тонус или инициированная сократимость находятся под контролем интернальных или экстернальных нейромедиаторов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Маслинский Ц. / Патогенез аллергических процессов в клинике и эксперименте. // М.: Медицина, 1979, стр. 132-140.

2. Лопаткин Н.А., Лопухин Ю.М. / Эфферентные методы в медицине. // М.: Медицина, 1988, стр. 6-21.

3. Покровский А.А. / Метаболические аспекты фармакологии и токсикологии пищи. // М.: Медицина, 1979, стр. 183.

4. Feher J., Csomos G., Vereckei A. / Free radical reactions in medicine. // Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag, 1987.

5. Sorenson J.R.J., Soderberg L.S.F., Chang L.W. / Radiation protection and radiation recovery with essentiol metalloelevent chelates. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1995, v. 210, N 3, p. 191-207.

6. Konishi H., Kakimoto Y. / Formation of γ-glutamylhistamine from histamine in rat drain. // J. Neurochemistry, 1976, v. 27, p. 1461-1463.

7. Tsuji M. , Matsuoka Y. , Nakajima Т. / Studies of formation of γ-glutamines in rat brain and synthetic and catabolic enzymes. // J. Neurochemistry, 1977, v. 29, p. 633-638.

8. Weinreich D. / γ-Glutamylhistamine: a major prodact of histamine metabolism in ganglia of marine mollusk Aplasia californica. // J. Neurochemistry, 1979, v. 32, p. 363-369.

9. Stein С. Weinreich D. / An in vitro characterisation of γ-glutamylhistamine synthetase: a novel enzyme catalyzing histamine metabolism in the central nervous system of the marine mollusk Aplasia californica. // J. Neurochemistry, 1982, v. 38, p. 202-214.

10. Шредер Э., Любке К. / Пептиды. // М.: Мир, 1967, стр. 249, 252.

11. Позднев В.Ф. / Активация карбоновых кислот пирокарбонатами. Синтез сложных эфиров из N-ациламинокислот и вторичных спиртов с использованием системы ди-трет-бутилпирокарбонат-пиридин в качестве конденсирующего реагента. // Биоорганическая химия, 1985, т. 11, 6, стр. 725-732.

12. Гросс Э. , Майенхофер И. - ред. / Пептиды. Основные методы образования пептидных связей. // М.: Мир, 1983, стр. 148.

13. Gushchin I.S., Voitenko V.G., Sviridov В.D. et al. / A polifunctional molecul produced by the conjugation of synthetic polyionimmunostimulant with specific antigen and an inhibitor of mast cell activation. Effects of histamine release. // Agents and Actions, 1989, v. 27, 1/2, p. 75-78.

14. Fredholm В.В., Gushchin I.S., Flwin К. et al. / Cyclic AMP-independent inhibition by papaverine of histamine release induced by compound 48/80. // Biochem. pharmacol., 1976, v. 25, p. 1583-1588.

15. Шатерников В. А., Марокко И.Н., Пятницкий Н.Н. и соавт. / Экспериментальное воспроизведение пищевой анафилаксии у морских свинок. // Вопросы питания, 1982, 2, стр. 27-31.

16. Shor P.A., Burkhalter A., Cohn V.N. / A method for fluorymetric assay of histamine in tissues. // J. Pharmacol. and Experimental Therapeuty, 1959, v. 27, p. 182-186.

17. Omuro Т. , Sato R. / The carbon monooxid binding pigment of liver microsomes. Solubillization, purificaion and properties. // J. Biol. Chem., 1964, v. 239, p. 2379-2385.

18. Изотов М.В., Щербаков В.М., Девиченский В.М. и соавт. / Способ определения содержания изоферментов цитохрома Р-450 в микросомах печени. // Авторское свидетельство 1488738, Бюллетень информации, 1989, 23, 26.06.09, МКИ 01 N 33/15, N 33/48.

19. Hartree E. / Dertermination of protein: a modificathion of the Lowry method, that gives a linear photometric response. // Anal. Biochem., 1972, v. 48, p. 422-427.

20. Гублер Е.В. / Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. // М.: Наука, 1978.

21. Weigle W., Cochrane С., Cohn V.N. / Anaphylactogenic properties of soluble antigen-antibody complexes in the guinea-pig and rabbits. // J. Immunol., I960, v. 85, p. 469-477.

22. Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических веществ. (Издание официальное.) /В кн. Руководящие материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств. (Издание официальное.). Часть 6, стр. 51-62/ МЗ СССР, Управление по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники, Фармакологический комитет. // М., 1986.

23. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств. / Фармакологический комитет МЗ СССР, 1988.

24. Блаттер М., Класеен X., Денерт X., Деринг X. / Эксперименты на изолированных препаратах гладких мышц. // М.: Мир, 1983.

Формула изобретения

1. Способ регуляции активности защитных систем организма: иммунной, воспалительной, свободнорадикальной реакций, путем введения гамма-глутамилгистамина.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гамма-глутамилгистамин вводят в дозах 0,01-250 мкг на кг веса тела в сутки.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что гамма-глутамилгистамин вводят через рот, парентерально, аппликационно, путем водных или липсомально-эмульсионных орошений.

4. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что гамма-глутамилгистамин вводят в состав таблеток, капсул, драже, пищевых добавок, водных амиулированных растворов, липосомально-эмульсионных суспензий.

5. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что гамма-глутамилгистамин вводят в виде его фармакологически приемлемых солей.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31