Нитроэфиры кортикоидных соединений

 

Изобретение относится к новым кортикоидным соединениям, именно к нитроэфирам кортикоидных соединений формулы B-X₁-NO₂, где В - остаток формулы I, где Z - H или F; R"- OH или в 16, 17 положениях находится группа штриховая линия в положении 1, 2 означает возможную двойную связь. Соединения обладают противовоспалительной, иммунодепрессивной и ангиостатической активностями, не имея при этом побочных эффектов. 7 з.п.ф-лы, 10 табл.

Изобретение относится к получению новых кортикоидных соединений.

В частности, оно относится к соединениям со стероидной структурой, имеющим противовоспалительную, иммунодепрессивную и ангиостатическую активности (так называемые стероидные противовоспалительные лекарственные препараты).

Эти соединения согласно настоящему изобретению терапевтически пригодны для лечения патологических состояний, для которых, в основном, применяются кортикостероидные препараты (кортикоиды), причем с большей пользой.

Эти представители обладают неожиданным преимуществом перед известными кортикоидными продуктами. Фактически, принимая во внимание различные определенные терапевтические применения специфического продукта, для новых продуктов настоящего изобретения всегда можно обнаружить лучшее сочетание результатов по сравнению с известными кортикоидами. В противоположность каким-либо ожиданиям, продукты настоящего изобретения характеризуются тем, что они показывают улучшенный терапевтический профиль: высокая активность сочетается с низкими побочными эффектами.

Кортикоиды хорошо известны как в первую очередь выбираемые меры для лечения воспалительного заболевания. Лекарственные препараты такой категории, которые включают, например, гидрокортизон, кортизон, преднизолон, преднизон, фторгидрокортизон, дезоксикортикостерон, метилпреднизолон, триамцинолон, параметазон, бетаметазон, дексаметазон, триамцинолона ацетамид, флюоцинолона ацетонид, беклометазон, ацетоксипрегнелон и другие, оказывают фармакотоксикологическое воздействие на различные органы. По этой причине их клиническое использование и прерванное использование вызывают серию побочных эффектов, некоторые из них очень серьезные. В качестве примера смотри Goodman & Gilman. "The Pharmaceutical Basis of Therapeutics", 9^th Ed., pp.1459-1456.

Эти токсические воздействия включают: - воздействие на кости, которое приводит к изменению клеточного метаболизма и высокой частоте возникновения остеопороза; - воздействие на сердечно-сосудистую систему, которое вызывает гипертензивные реакции; - воздействие на желудочно-кишечный тракт, которое вызывает повреждение желудка.

В качестве примера смотри Martindale "The Extrapharmacopoeia", 30^th Ed., pp.712-723, 1993.

В соответствии с вышеупомянутым уровнем техники, по-видимому, почти невозможен случай, в котором терапевтическая активность отделялась бы от побочных эффектов, смотри вышеупомянутого Goodman et al., стр.1474.

Для уровня техники в данной области известны нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты с или без кислотного конца, смотри патенты WO 94/04484, WO 94/12463, WO 95/09831, WO 95/30641 для лекарств с некислотными концами и патенты, упомянутые там, для лекарств с кислотными концами.

DE-A-2222491 (1) описывает производные прегнана, имеющие в положении 21 группу Говорят, что вышеупомянутые соединения наделены противовоспалительной, противоаллергической и кардиотропной активностями. Отдельные соединения являются вазодилататорами.

US-A-3494941 (2) описывает стероидные производные эстран-3-ола или эстр-4-ен-3-она, применяемые как вазодилататоры при лечении сердечных состояний, таких как коронарная недостаточность и стенокардия. Вышеупомянутые соединения имеют в положении 17 эфирный линкер, связанный с нитратным радикалом. Нитратные группы могут также находиться в положениях 3 и 16 стероидного кольца.

Arzneimittel Forschung, vol. 19, п. 4, 1969, pp.584-685 (3), описывает 3- и 17-нитроэфиры производных андростана, 3,17-динитропроизводные андростена, 17-нитроэфиры производных тестостерона и 21-нитроэфиры производных дезоксикортизона, кортизона и преднизона. В этой статье утверждается, что нитрат дезоксикортикостерона способствует белковому анаболизму в различных органах.

WO-A-97/34871 (4) описывает (i) соединения, содержащие стероид, β-агонист, антихолинергическое средство, стабилизатор тучных клеток или ингибитор ФДЭ (фосфодиэстеразы), к которому напрямую или не напрямую присоединена, по крайней мере, одна NO или NО₂-группа или группа, которая стимулирует эндогенное производство NO или EDRF (эндотелийпроизводный расслабляющий фактор) in vivo, при это вышеупомянутая группа связана через участки, такие как кислород, сера, углерод и азот; (ii) композиции, содержащие терапевтически эффективное количество стероида, β-агониста, антихолинергического средства, стабилизатора тучных клеток или ингибитора ФДЭ, необязательно замещенного, по крайней мере, одной NO или NO₂ частью или группой, которая стимулирует эндогенное производство NO или EDRF in vivo, в сочетании с соединением, которое дает, переносит или высвобождает окись азота и/или соединением, которое стимулирует эндогенное производство NO или EDRF in vivo.

Однако следует заметить, что стероидные соединения совершенно отличаются от нестероидных соединений химически, фармакологически и биохимически, поскольку фармако-токсикологический механизм действия нестероидных продуктов основан на ингибировании одной или более циклооксигеназ (СОХ), тогда как стероидные продукты не содержат ничего для воздействия на СОХ и имеют более сложные фармако-токсикологические механизмы действия, которые пока еще полностью не выяснены.

Хорошо известно, что эти две группы соединений приведены в совершенно отдельных категориях в международных фармакопеях.

Заявитель с удивлением и неожиданно обнаружил кортикостероиды (кортикоиды), которые являются очень эффективными, даже гораздо более эффективными по сравнению с известными из уровня техники и в то же время обладают более высокой толерантностью, чем известные кортикоиды, поскольку, что неожиданно, они не вызывают вышеуказанных побочных эффектов, а если вызывают, то в более низкой степени.

Объектом настоящего изобретения являются кортикостероиды и их применение в качестве противовоспалительных, иммунодепресивных и ангиостатических агентов, имеющие общую формулу B-X₁-N0₂, или их сложные эфиры или соли, где
В имеет следующую структуру:

где на месте водорода Н в СН-группе или двух водородов Н₂ в СН₂-группе, показанных в общей формуле, могут находиться следующие заместители:
в положении 1-2 может находиться двойная связь;
в положении 2-3 может находиться следующий заместитель:

в положении 2 может находиться С1, Вr;
в положении 3 может находиться СО, -0-СН₂-СН₂-С1, ОН;
в положении 4-5 может находиться двойная связь;
в положении 5-6 может находиться двойная связь;
в положении 6 может находиться Cl, F, СН₃, -СНО;
в положении 7 может находиться Cl;
в положении 9 может находиться Cl, F;
в положении 11 может находиться ОН, СО, Cl;
в положении 16 может находиться СН₃, ОН, =СН₂;
в положении 17 может находиться ОН, СН₃, ОСО(О)_uа(СН₂)_vаСН₃ или

где uа означает целое число от 0 до 1, va означает целое число от 0 до 4;
в положении 16-17 могут находиться следующие группы:

R и R' равны или отличны друг от друга и могут являться водородом или линейными или разветвленными алкилами, имеющими от 1 до 4 углеродных атомов, предпочтительно R=R'=СН₃;
когда в положении 9 находится F, в положении 11 находится ОН, в положениях 1-2 и положениях 4-5 находятся две двойные связи, в положении 3 и 20 две группы СО, в положениях 16 и 17 не может быть группы

В является кортикостероидным остатком;
R" означает -(СО-L)_t-(Х)_t1-
где t и t1 являются целыми числами, равными 1;
бивалентная мостиковая группа L выбрана из:

где nа, n'а и n"а равны или отличны друг от друга и являются целыми числами от 0 до 6, предпочтительно от 1 до 3; nb, n'b, n"b и n'"b равны или отличны друг от друга и являются целыми числами от 0 до 1; R₄ и R₅ равны или отличны друг от друга и выбраны из водорода, линейного или разветвленного алкила, имеющего от 1 до 5 углеродных атомов, предпочтительно от 1 до 3;
Х равен Х₀= 0, NH, NR_1c, где R_1c является линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 10 углеродных атомов;
X₁ является бивалентным связывающим мостиком, выбранным из:
-YO,
где Y означает линейный или по возможности разветвленный C₁-C₂₀ алкилен, предпочтительно имеющим от 2 до 5 углеродных атомов, или необязательно замещенный циклоалкилен, имеющий от 5 до 7 углеродных атомов;
Y₁ выбран из

где n₃ является целым числом от 0 до 3;


где nf' является целым числом от 1 до 6, предпочтительно от 2 до 4;

где R_1f=H, СН₃ и nf означает целое число от 1 до 6, предпочтительно от 2 до 4.

Ниже приведены соединения, которые могут быть упомянуты и которые являются предпочтительными, в этих соединениях В может быть получен в соответствии с методами, известными из уровня техники.

Например, в качестве предшественников и родственных методов могут быть упомянуты предшественники и родственные методы, описанные в The Merck Index, 12^th Ed. , 1996, приведенном здесь в качестве ссылки. Среди этих предшественников (в соответствии с номенклатурой Merck) есть соединения, в которых Н₂, Н, R, R', R" имеют значения, представленные в соединениях, приведенных ниже: будезонид, гидрокортизон, алклометазон, альгестон, беклометазон, бетаметазон, хлоропреднизон, клобетазол, клобетазон, клокортолон, клопреднол, кортизон, кортикостерон, дефлазакорт, дезонид, дезоксиметазон, дексаметазон, дифлоразон, дифлукортолон, дифлупреднат, флуазакорт, флуклоронид, флуметазон, флунизолид, ацетонид флуокинолона, флуокинонид, флуокортинбутил, флуокортолон, флуорометолон, ацетат флуперолона, ацетат флупреднидена, флупреднизолон, флурандренолид, формокортал, хальцинонид, пропионат галобетазола, галометазон, ацетат галопредона, гидрокортамат, этабонат лотепреднола, медризон, мепреднизон, метилпреднизолон, фуроат мометазона, параметазон, предникарбат, преднизолон, 25-диэтиламиноацетат преднизолона, натрия фосфат преднизолона, преднизон, преднивал, преднилиден, римексолон, триамцинолон, 21-ацетоксипрегненолон, кортивазол, амцинонид, пропионат флутиказона, мазипредон, тиксокортол, гексацетонид триамцинолона.

Как упомянуто выше, связывающие мостики X₁ получают, используя известные в уровне техники методы, как указано выше, или путем модификации известных методов при введении мостиков X₁, которые отличаются от связывающих мостиков, описанных в перечисленных патентах, используя методы, известные в уровне техники в данной области. В основном связь между В и ₁ является связью сложноэфирного или амидного типа (NH или NR_1c, как определено в X). Может быть использован любой хорошо известный синтетический путь образования таких связей для получения данной связи.

В случае сложных эфиров наиболее прямой синтетический путь включает:
реакцию ацилхлоридов В-СО-С1 с галогеноспиртами типа HO-Y_a-Cl, HO-Y_a-Br, HO-Y_a-I, в которых Y_a равен Y или Y₁ без атома кислорода, в опытных условиях, известных из уровня техники.

Реакционные продукты формулы B-CO-0-Y-C1 (Вr, I) могут быть получены реакцией калиевых или натриевых солей кислот формулы В-СО-ОН с дигалогеновыми производными общей формулы _aCl₂, Y_aBr₂ или Y_aI₂, ClY_aBr, ClY_aI, BrY_aI.

Реакционные продукты превращают в конечные продукты реакцией с AgNO₃ в ацетонитриле в соответствии с методами, известными из литературы.

Общая схема следующая:
В-СО-С1+HO-Y_a-Br-->B-CO-O-Y_a-Br+AgNO₃-->B-X₁NO₂, где X₁=Y_aO.

Общая схема может быть также следующей:
B-CO-ONa+Br₂Y_a-->B-CO-O-Y_a-Br+AgNO₃-->B-X₁NO₂,
где X₁=Y_aO.

В случае амидной связи синтетическая последовательность включает реакцию таких же ацилхлоридов ВСОС1 с аминоспиртами общей формулы NH₂-Y_a-ОН, NHR_1c-OH для получения амидов общей формулы
B-CO-NH-Y_a-OH и B-CO-NR_1c-Y_a-OH,
осуществляемую известными способами.

Реакция таких амидов с галогенирующими агентами, такими как, например, РС1₅, РВr₃, SOC1₂ и т.д., дает галогенопроизводные общей формулы
B-CO-NH-Y_a-Br(Cl) и B-CO-NR_1c-Y_a-Br(Cl).

Последние при реакции с AgNO₃ в ацетонитриле в соответствии с известными способами из литературы дают конечные продукты BX₁NO₂.

Эта последовательность может быть представлена следующим образом:
РС1₅
В-СО-Сl+NHR_1c-Y_a-OH-->B-CO-NR_1c-Y_a-OH-->B-CO-NR_1c-Y_a-Br+AgNO₃-->B-CO-NR_1c-Y_a-ONO₂
где Y_aO означает X₁.

Альтернативный путь получения сложного эфира представляет собой реакцию натриевых или калиевых солей кислот с нитроэфирами галогеноспиртов общей формулы
NO₂-O-Y_a-Cl(Br, I)
для прямого получения продуктов изобретения.

Реакционная схема является следующей:
B-CO-ONa+Br-Y_a-ONO₂-->B-CO-O-Y_a-ONO₂,
где Y_аO означает X₁.

В других синтетических путях, похожих на описанные выше, дигалогеновое производное Br₂Y_a реагирует с энолатами. Реакционные продукты затем реагируют с AgNO₃ в ацетонитриле в соответствии с упомянутой реакцией. Общая схема, показанная для -ОН в группе В типа -СН₂-ОН, =СН-ОН, является следующей:
AgNO₃
-ONa+Br₂-Y_a-->0-Y_a-Br-->O-Ya-ONO₂.

Способы получения этих связывающих групп X₁ описаны в патентной заявке W095/30641, приведенной здесь в качестве ссылки.

Как упоминалось выше, соединения настоящего изобретения с формулой В-X₁-NO₂ или их фармацевтические композиции применяются для лечения заболеваний, для лечения которых используются хорошо известные кортикоидные продукты.

В частности, особенно может быть упомянуто использование при респираторных нарушениях, например противоасматическое, использование в качестве противоартритного, противозудного, антипсориатического, противоэкземного средств; использование при сосудистых нарушениях, например, в качестве ангиостатического средства, использование при иммунологических нарушениях, например, в качестве иммуносупрессивного средства.

Соединения или их композиции настоящего изобретения могут быть введены, например, оральным, ректальным (кишечные нарушения), парентеральным путем или локальным применением (дермальным, местным, трансдермальным, глазным, ингаляторным способами).

Следующие примеры представлены для иллюстративных целей для объяснения, но они не являются ограничивающими для данного изобретения.

ПРИМЕР 1.

Химический синтез: получение нитропроизводного гидрокортизона (ГКН)

ПРИМЕР 1А.

Получение (4-хлор)бутаноата гидрокортизона

4 порции 4-хлорбутаноилхлорида (0,32 мл x 4) и триэтиламина (0,3 г x 4) добавляют в течение 24 часов к раствору гидрокортизона (1 г) в СНСl₃, высушенном над Р₂О₅, и перемешивают в течение 3 дней. Раствор обрабатывают водой, органическую фазу отделяют, высушивают (Na₂SO₄) и удаляют растворитель при пониженном давлении. Сырой остаток обрабатывают гексаном и CH₂Cl₂, получая белое твердое вещество с 53% выхода по весу, которое имеет точку плавления (т.пл.) 155^oС.

Продукт охарактеризовывают масс-спектрометрией: М⁺493.

¹Н-ЯМР (300 МГц, CDCl₃): 0,95 (3Н, с, СН₃), 1,45 (3Н, с, СН₃), 2,12 (2Н, т, СН₂ в 2), 2,6 (2Н, т, СН₂СОО), 3,65 (2Н, т, CH₂Cl), 4,45 4,35 и 5,05 (2Н, 2д, СОСН₂O), 5,70 (1Н, с, Н олефина).

Получение (4-нитрокси)бутаноата гидрокортизона.

AgNO₃ (0,2 г) добавляют к раствору 4-хлорбутаноата гидрокортизона (0,23 г), полученного, как указано выше, в ацетонитриле (70 мл) и нагревают с обратным холодильником в течение 16 часов. Из раствора удаляют растворитель при пониженном давлении и хроматографируют на силикагеле, используя раствор этилацетата и СН₂С1₂ (3:7) в качестве элюента.

4-Нитроксибутаноат кортизона получают из головных фракций.

Продукт характеризуют ¹Н-ЯМР (300 МГц, CDCl₃):
0,95 (3Н, с, СН₃), 1,45 (3Н, с, СН₃), 2,12 (2Н, т, СН₂ в 2), 2,6 (2Н, т, СН₂СОО), 4,45 4,45 (2Н, т, CH₂O-NO₂), 4,35 и 5,05 (2Н, 2д, СОСН₂O), 5,68 (1Н, с, Н олефина).

ПРИМЕР 1В.

Продукт из Примера 1А получают так же, используя другой синтетический путь.

Получение 4-бромбутаноата гидрокортизона

Пять порций 4-бромбутаноилхлорида (0,35 мл x 5) и карбоната калия (0,4 г x 5) добавляют в течение 24 часов к раствору гидрокортизона (1 г) в СНСl₃, высушенном над Р₂O₅, и перемешивают в течение 5 дней. Раствор обрабатывают водой, органическую фазу отделяют, высушивают (Na₂SO₄) и удаляют растворитель при пониженном давлении.

Получение 4-нитроксибутаноата гидрокортизона (ГКН).

AgNO₃ (0,2 г) добавляют к раствору 4-бромбутаноата гидрокортизона (0,23 г), полученного, как указано выше, в ацетонитриле (70 мл) и перемешивают в течение 48 часов при комнатной температуре.

Из раствора удаляют растворитель при пониженном давлении и хроматографируют на силикагеле, используя раствор этилацетата и СН₂Сl₂ (3:7) в качестве элюента.

4-Нитроксибутаноат кортизона получают из головных фракций и характеризуют масс-спектрометрией: M⁺493. Спектр получается такой же, как представленный в Примере 1А.

ПРИМЕР 2.

Оценка безопасности и активности.

Продукты вводились в 2% по весу карбоксиметилцеллюлозной суспензии при проведении тестов in vivo, тогда как для опытов in vitro использовалась 0,1% по весу диметилсульфоксидная суспензия.

Опытные группы всегда включали 8 образцов (исключая случаи, где в примерах указано другое значение) для адекватной статистической оценки, которая, при необходимости, проводилась в соответствии с общеизвестными статистическими процедурами.

ПРИМЕР 2А.

Изучение острой токсичности.

Острая токсичность продукта из Примера 1А приблизительно оценивалась оральным введением единичной дозы вещества группе из 10 мышей линии Swiss.

Смертельные случаи и проявление токсических симптомов исследовались в течение 14 дней после введения соединения.

Животные не проявляли признаков видимой токсичности даже после введения дозы 50 мг/кг.

ПРИМЕР 2В.

Изучение противоартритной активности.

Адъювантный артрит вызывали в самцах крыс линии Lewis, весящих 170±15 г, путем внитрихвостовой инъекции 0,6 мг Mycobacterium butyricum (Difco), суспендированных в 0,1 мл минерального масла. Животных обрабатывали внутрибрюшинно (i. p. ) растворителем, представляющим собой 2% по весу карбоксиметилцеллюлозную суспензию в воде, также внутрибрюшинно гидрокортизоном или ГКН (в суспензии, указанной выше) при дозах 5 мг/кг или дозах 10 мг/кг, начиная с первого дня после инокуляции микобактерий.

Развитие артрита оценивали через 21 день. Условные единицы для оценки артритных поражений выбирались в соответствии со следующей шкалой:
- задние конечности: от 0 до 7 для каждой (0 при отсутствии поражений и 7 для наиболее сильных поражений);
- передние конечности: от 0 до 4,5 для каждой (0 при отсутствии поражений и 4,5 для наиболее сильных поражений);
- хвост: от 0 до 5 (0 при отсутствии поражений и 5 для наиболее сильных поражений);
- уши: от 0 до 2 для каждого (0 при отсутствии поражений и 2 для наиболее сильных поражений);
- нос и глаза: от 0 до 1 для каждого (0 при отсутствии поражений и 1 для наиболее сильных поражений).

Результаты выражались в процентах ингибирования при сравнении со значениями, полученными в контрольной группе (животные, обработанные только растворителем).

Результаты представлены в Таблице 1.

Как видно из результатов Таблицы 1, протестированные продукты могут похожим образом ингибировать развитие артритного процесса, вызванного микобактериями. Однако, поскольку толерабильность ГКН более высокая, чем у гидрокортизона (смотри Пример 2С ниже), результаты с точки зрения активности более положительные в случае ГКН (сравни 40% противоартритной активности, полученной при 5 мг/кг гидрокортизона, с 62%, полученными для 10 мг/кг ГКН).

ПРИМЕР 2С.

Изучение желудочной толерабильности (безопасности).

Самцы крыс Sprague-Dawley, голодавшие в течение 24 часов, обрабатывались внутрибрюшинно дозами 5 и 10 мг/кг гидрокортизона или ГКН.

Двадцать четыре часа спустя животных умервщляли, удаляли желудок и его ткани приблизительно оценивали на наличие поражений, как описано Del Soldato и соавт. "Влияние голодания и циметидина на взаимосвязь между ульцерогенными и противовоспалительными свойствами циметидина". Вr. J. Pharmacol. 67, 33-37, 1979. Степень тяжести заболевания оценивалась в соответствии с известными методами и выражалась в условных единицах. Результаты представлены в Таблице 2.

Как показано в Таблице 2, у крыс, обработанных гидрокортизоном, заметно проявлялись поражения желудочно-кишечного тракта, варьируя по тяжести от эрозии слизистой до язвы, включающей мышечный слой, адгезии стенок, асцитов, перитонитов. В других группах, обработанных одним растворителем или ГКН, повреждение было намного меньше или даже отсутствовало.

ПРИМЕР 2D.

Изучение нитроксисинтетазной активности.

Ингибирование нитроксисинтетазной активности, вызванной липополисахаридом (ЛПС), определялась в нейтрофилах и желудке крыс после введения одного из тестируемых соединений и сравнивалась с активностью, полученной после обработки только суспендирующим растворителем. Крысы линии Wistar, голодавшие в течение 24 часов перед обработкой, получали одно из тестируемых соединений внутрибрюшинно (10 мг/кг) и ЛПС внутривенно (хвостовая вена) (5 мг/кг). Через четыре часа животных умервщляли. Брали кровь для выделения нейтрофилов и желудок.

Ферментную активность определяли в соответствии с методом, описанным Assreuy и соавт. "Негативный контроль с обратной связью окисью азота активности синтетазы окиси азота". Br. J. Pharmacol. 108, 833-7, 1993. Результаты представлены в Таблице 3.

Как показано в Таблице 3, оба тестируемых продукта, как оказалось, являются очень эффективными в ингибировании нитроксисинтетазы при сравнении с группой, обработанной только растворителем.

ПРИМЕР 2Е.

Изучение костной токсичности.

Использовали костные ткани (теменная кость из плода крысы), выращенные in vitro согласно методу, описанному Doherty и соавт. "Влияние глюкокортикоидов на функцию остеобластов. Влияние кортикостерона на остеобласты, экспрессию бета-I интегринов". Journal of Bone and Joint Surgery, Series A77/3, 396-404,1995. Их инкубировали с гидрокортизоном или ГКН, или растворителем с концентрацией 100 нмоль.

Через 90 часов измеряли содержание кальция и сухой вес кости.

Результаты представлены в Таблице 4.

Как показано в Таблице 4, обнаруживалось значительное увеличение сухого веса ткани после инкубации с растворителем или ГКН. После инкубации с гидрокортизоном содержание кальция уменьшалось и не увеличивался сухой вес костной ткани. Это показывает, что обработка гидрокортизоном неблагоприятно влияет на рост ткани.

ПРИМЕР 2F.

Изучение некоторых сердечно-сосудистых параметров.

Воздействие тестируемых продуктов на некоторые сердечно-сосудистые параметры изучалось на находящихся в сознании крысах Long Evans (350-450 г), которые соответствующим образом контролировались, как описано Gardiner и соавт. "Влияние дексаметазона на местные гемодинамические ответы на липосахариды в крысах, находящихся в сознании: влияние неселективного эндотелиального антагониста: SB 209670". Вr. J. Pharmacology, 117, 49 Р, 1996. Животных обрабатывали растворителем (физиологический солевой раствор, хлорид натрия 0,9%, подкожно), гидрокортизоном или ГКН (10 мг/кг) подкожно. Частоту сердечных сокращений и кровяное давление измеряли через 4 часа после обработки.

В Таблице 5 представлены полученные данные в виде процентного изменения по сравнению с контрольными величинами.

Результаты, представленные в Таблице 5, показывают, что продукт настоящего изобретения, ГКН, не влияет на измеренные сердечно-сосудистые параметры. Напротив, гидрокортизон, используемый в этой области техники, вызывает повышение давления, а также сердечные изменения.

ПРИМЕР 2G.

Изучение ангиостатической активности у крыс
Самцов крыс линии Wistar, весивших от 180 до 200 г, использовали согласно методике, описанной Andrade и соавт. "Количественные исследования in vivo ангиогенезиса на модели крысы с губкой". Brit. J. Exp. Pathol. 68, 755-766,1987. Неоваскуляризацию оценивали по отношению к току крови путем имплантирования небольшой губки в подкожную ткань в течение 14 дней и определяли ¹³³Хе выведение. Кратко, количество ¹³³Хе, равное 10 мкл, инжектировали в губку, используя небольшую полиэтиленовую канюлю. Используя детектор гамма-лучей, остаточную радиоактивность в имплантанте и ¹³³Хе выведение измеряли через 6 минут как процент начального значения. Обоснованность такого метода для измерения неоваскуляризации недавно была продемонстрирована Hu и соавт. "Корреляция выведения ¹³³Хе, тока крови и гистологии для модели крысы с губкой для ангиогенезиса. Дальнейшие исследования с ангиогенными модификаторами". Lab. Invest. 72, 601-610, 1995.

Тестируемые соединения вводили подкожно дозой 10 мг/кг с 1 по 13 день после имплантации. ¹³³Хе измеряли на 14 день после подкожной имплантации, затем животных умервщляли и регистрировали вес тимуса и селезенки.

В Таблице 6 представлены полученные данные, касающиеся воздействия тестируемых продуктов на неоваскуляризацию и на вес селезенки и тимуса.

Очевидно, ГКН, по-видимому, способен вызывать заметный ангиостатический эффект без изменения веса селезенки или тимуса в отличие от сравниваемого продукта.

Из всех данных, представленных в Таблицах 1-6, ясно, что фармакодинамическая активность - противоартритная, иммунодепрессивная и ангиогенная активности - и толерабильность этого нитропроизводного гораздо выше, чем у кортикоида, известного из уровня техники.

ПРИМЕР 3.

Дексаметазон 21-(4-бромбутират) [II]
Дексаметазон [I] 3,5 г (8,9 ммоль);
4-Бромбутирилхлорид 4,06 мл (35 ммоль);
Карбонат калия 4,9 г (35 ммоль);
Тетрагидрофуран 70 мл.

Раствор соединения I в тетрагидрофуране порционно обрабатывают 4-бромбутирилхлоридом (0,81 мл х 5) и карбонатом калия (0,98 г х 5) в течение 7 часов. Смесь перемешивают ночь, растворитель выпаривают под вакуумом и остаток обрабатывают этиловым эфиром и водой. Органический слой отделяют, промывают водой и высушивают безводным сульфатом натрия. После выпаривания растворителя остаток очищают на силикагеле колоночной флэш-хроматографией, используя в качестве элюента трет-бутилметилэфир/гексан 1/1, получая:
- менее полярное соединений 1,0 г;
- производное II 1,5 г (т. пл. 184-187^oС; выход 31%)
ТСХ: трет-бутилметилэфир/гексан 2/1.

Дексаметазон 21-(4-нитрооксибутират) [III] (соединение DXN)
Соединение II 1,5 г (2,7 ммоль);
Нитрат серебра 2,4 г (14,1 ммоль);
Ацетонитрил 250 мл.

Смесь соединения II и нитрата серебра в ацетонитриле нагревают с обратным холодильником в течение 7 часов. После фильтрации неорганических солей растворитель выпаривают под вакуумом и остаток обрабатывают этиловым эфиром. Органический слой дважды промывают водой, высушивают безводным сульфатом натрия и выпаривают под вакуумом. Остаток выливают в этиловый эфир и фильтруют, получая 1,27 г чистого соединения III в виде белого твердого вещества (т. пл. 183-185^oС; выход 90%).

ТСХ: трет-бутилметилэфир/гексан 2/1.

Прилагаются следующие формы:
- схема синтеза;
- NCX 1005 загрузка 1;
- NCX 1005/1 анализ.

ПРИМЕР 4.

Изучение активности на накоплении лейкоцитов.

Самцы мышей-альбиносов линии Swiss (27-33 г) выдерживались на стандартной chow pellet диете с использованием водопроводной воды с добавлением либитума. Эксперимент проводили в соответствии с Perretti и соавт. (Perretti М., Solito Е. , Parente L. "Доказательство того, что эндогенный интерлейкин-1 включается в миграцию нейтрофилов при экспериментальном остром воспалении у крыс и мышей", Agents Actions, 35, 71, 1992). Животных предварительно внутрибрюшинно обрабатывали зимозаном (1 мг/0,5 мл), принимая это время за 0 (время 0). Через два часа вводили внутривенно дексаметазон (1 мг/кг) (Пример 3-I), DXN (Пример 3-III) (1 мг/кг) или фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Животных умервщляли через 4 и 24 часа со времени 0, собирали промывную жидкость и проводили подсчет различных клеток с последующим окрашиванием по методу Turk.

В Таблице 7 представлены полученные результаты по ингибирующему воздействию тестируемых соединений на вызванную зимозаном миграцию лейкоцитов у мышей. Очевидно, что стероидное нитропроизводное гораздо более активно, чем дексаметазон.

ПРИМЕР 5.

Изучение антипролиферативной активности в клетках гладких мышц дыхательных путей человека.

Клетки гладких мышц дыхательных путей человека культивировались обычными методами для эксплантатов. Ткани отбирали в стерильные сосуды, содержащие PBS, пенициллин и стрептомицин. В стерильных условиях для тканевых культур ткани нарезали на маленькие кусочки (весом приблизительно 1 мг) и помещали в стандартную среду, содержащую 20% сыворотки плода коровы (FCS) на несколько дней (среду меняли каждые 2-4 дня). ³Н-тимидин измеряли для ДНК-фракции клеток, культивированных в 48-луночных планшетах. Клетки культивировали до слияния в среде, содержащей 10% FCS. Клетки лишали сыворотки в течение 24 часов перед добавлением 10% FCS с различными концентрациями стероидов. Через 24 часа ³Н-тимидин добавляли к клеткам в течение 4 часов. Клетки промывали фосфатно-солевым буфером и этанолом. ДНК экстрагировали раствором гидроксида натрия и ³H-материал подсчитывали сцинтилляцией. Данные настоящих исследований были получены в лунках, каждая из которых была представлена в трех экземплярах, для культивированной ткани гладких мышц, взятой из одного здорового легкого донора. В Таблице 8 приведены результаты, полученные по ингибирующему воздействию тестируемых соединений на пролиферацию клеток гладких мышц дыхательных путей человека. Очевидно, что стероидное нитропроизводное гораздо более активно, чем дексаметазон.

Синтез 1.

Синтез преднизолона 21-[(4'-нитрооксиметил)бензоат) (NO-преднизолон)

А) Преднизолон 21-[(4'-хлорметил)бензоат].

К раствору преднизолона в тетрагидрофуране (230 мл) добавляли триэтиламин (4,64 мл) и 4-(хлорметил)бензоилхлорид (6,29 г). Раствор размешивали при комнатной температуре и через день добавили триэтиламин (4,64 мл) и 4-(хлорметил)бензолхлорид (6,29 г). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Раствор выпаривали в вакууме и полученный сырой остаток обрабатывали этилацетатом и водой.

Нерастворимый остаток фильтровался, промывался этилацетатом и просушивался в вакууме. Органические слои обрабатывали сульфатом натрия и концентрировали при уменьшенном давлении. Остаток очищали методом кварцево-гельной хроматографии, элюент метиленхлорид и метиленхлорид/ацетон 8/2. Продукт (16,53 г) получали в виде белого твердого вещества.

В) Преднизолон 21-[(4'-нитрооксиметил) бензоат].

Раствор преднизолона 21-[(4'-хлорметил)бензоат] и нитрата серебра в ацетонитриле (100 мл) и тетрагидрофуране (200 мл) переливали в обратном потоке в темноте в течение 35 часов. Осадок (соли серебра) фильтровался и раствор затем выпаривали в вакууме. Остаток очищали методом кварцево-гельной хроматографии, элюент хлороформ/ацетон/тетрагидрофуран 4/1/1 и тетрагидрофуран. Продукт (13,3 г) кристаллизовался из тетрагидрофурана (450 мл)/н-гексана (250 мл), чтобы получить 10,34 г белого твердого вещества. Точка плавления 232,5^oС по DSC.

¹Н-NMR (200 MHz, DMSO, ppm): 8,15(2H, d); 7,75 (2H, d); 7,45 (1H, d); 6,28 (1H, dd); 6,04 (1H, s); 5,80 (2H, s); 5,46 (1H, d); 5,16 (1H, d); 4,43 (1H, m); 2,63-1,06 (13H, m).

¹³C-NMR (200 MHz, DMSO, ppm): 205, 298; 185, 594, 171, 023; 164, 962; 157, 118; 138, 099; 129, 759; 129, 126; 127, 023; 121, 580; 88, 725; 74, 096; 68, 362; 55, 443; 51, 168; 47, 265; 43, 916; 33, 992; 33, 146; 31, 453; 30, 955; 23, 554; 20, 878; 16, 560.

Синтез 2.

Синтез будезонида 21-[(4'-нитрооксиметил)бензоат] (NO-будезонид).

А) Будезонид 21-[(4'-хлорметил)бензоат]
К раствору будезонида в тетрагидрофуране (100 мл) добавляли триэтиламин (1,62 мл), 4-(хлорметил)бензоилхлорид (2,19 г). Раствор перемешивали при комнатной температуре и через 4 часа добавляли триэтиламин (1,62 мл) и 4-(хлорметил)бензоилхлорид (2,19 г). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Раствор выпаривали в вакууме.

Сырой остаток обрабатывали этилацетатом и водой.

Органические слои обрабатывали сульфатом натрия, концентрировали при уменьшенном давлении. Остаток очищали методом кварцево-гельной хроматографии, элюент - метиленхлорид/ацетон 10/1. Продукт (6,53 г) получен в виде белого твердого вещества. Точка плавления 106-110^oС.

В. Будезонид 21-[(4'-нитрооксиметил)бензоат]
Раствор будезонида 21-[(4'-хлорметил)бензоат] и нитрата серебра в ацетонитриле (100 мл) перемешивали в обратном потоке в темноте в течение 25 часов. Осадок (соли серебра) фильтровали и раствор выпаривали в вакууме. Остаток очищали методом кварцево-гельной хроматографии, элюент - н-гексан/этилацетат 6/4. Продукт (4,65 г) получали в виде белого твердого вещества. Точка плавления 96^oС (DSC).

¹Н-NMR (300 MHz, DMSO, ppm): 8,05 (2H, d); 7,63 (2H, d); 7,32 (1H, m); 6,17 (1H, d); 5,91 (1H, s); 5,67 (2H, d); 5,31-5,00 (2H, ш); 4,75-4,72 (1H, m); 4,34 (1H, m); 2,51(2H, m); 2,26(2H, m); 1,98-1,94 (4H, m); 1,59-1,54 (4Н, m); 1,39-1,35 (5Н, m); 0,96-0,85 (7H, m).

Синтез 3.

Синтез дексаметазона 21-[(4'-нитрооксиметил)бензоат]

А. Дексаметазон 21-[(4'-хлорметил)бензоат]
К раствору дексаметазона в тетрагидрофуране (100 мл) добавляли триэтиламин (1,77 мл) и 4-(хлорметил)бензоилхлорид (2,4 г). Раствор перемешивали при комнатной температуре и через 24 часа добавляли триэтиламин (1,77 мл) и 4-(хлорметил)бензоилхлорид (2,4 г). Раствор перемешивали в течение 24 часов. Затем раствор выпаривали в вакууме. Сырой остаток обрабатывали этилацетатом и водой. Органические слои обрабатывали сульфатом натрия, концентрировали при уменьшенном давлении. Остаток очищали методом кварцево-гельной хроматографии, элюент - метиленхлорид/ацетон 9/1. Продукт (6,19 г) получали в виде белого твердого вещества.

В. Дексаметазон 21-[(4'-нитрооксиметил)бензоат]
Раствор дексаметазона 21-[(4'-хлорметил)бензоат] и нитрата серебра в ацетонитриле (100 мл) нагревали до 40^oС в течение 190 часов в темноте.

Осадок фильтровали и раствор выпаривали в вакууме. Остаток очищали методом кварцево-гельной хроматографии, элюент н-гексан/этилацетат 6/4. Продукт кристаллизовали из тетрагидрофуран/этилэфира. Продукт (4,22 г) получали в виде белого твердого вещества. Точка плавления 176,8^oС.

¹Н-NMR (300 MHz, DMSO, ppm): 8,05(2H, d); 7,69 (2H, d); 7,32 (1H, d); 6,21 (1H, d); 6,11 (1H, s); 5,79 (2H, d); 5,52(1H, d); 5,43-5,11 (3H, m); 4,34 (1H, m); 2,91 (1H, m); 2,80-2,24 (5H, m); 1,95-0,98 (14Н, m).

Синтез 4.

Синтез гидрокортизона 21-[(4'-нитрооксиметил)бензоата]

А. Гидрокортизон 21-[(4'-хлорметил)бензоат]
К раствору гидрокортизона в тетрагидрофуране (20 мл) добавляли триэтиламин (0,192 мл) и 4-(хлорметил)бензоилхлорид (0,26 г). Раствор перемешивали при комнатной температуре и через день добавляли триэтиламин (0,192 мл) и 4-(хлорметил)бензоилхлорид (0,26 г). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Раствор выпаривали в вакууме. Сырой остаток обрабатывали этилацетатом и водой.

Органические слои обрабатывали сульфатом натрия, концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали методом кварцево-гельной хроматографии, элюент - метиленхлорид/ацетон 9/1. Продукт (0,6 г) получали в виде твердого вещества.

В. Гидрокортизон 21-[(4'-нитрооксиметил)бензоат]
Раствор гидрокортизона 21-[(4'-хлорметил)бензоат] и нитрата серебра (2,39 г) в ацетонитриле (90 мл) и тетрагидрофуране (70 мл) нагревали до 40^oС в темноте. Нитрат серебра (0,77 г) добавляли один раз в день и течение пяти дней. Осадок (соли серебра) фильтровали и раствор выпаривали в вакууме. Остаток очищали методом кварцево-гельной хроматографии, элюент н-гексан/этилацетат 6/4. Продукт (2 г) получали в виде белого твердого вещества. Точка плавления 209^oС (DSC).

¹Н-NMR (200 MHz, DMSO, ppm): 8,09(2H, d); 7,69 (2H, d); 5,74 (2H, s); 5,62 (1H, s); 5,54 (1H, s); 5,45-5,05 (2H, dd); 4,42 (1H, m); 4,35 (1H, m); 2,60-0,9 (23H, m).

Фармакологические эксперименты.

Фармакологический эксперимент 1.

Противовоспалительный эффект преднизолона 21-[(4'-нитрооксиметил)бензоата] (NО-преднизолон) и преднизолона в модели хронического воспаления; вызвано хроническое воспаление у мыши кротоновым маслом в форме хронического воздушного мешка.

Группы из 8 мышей (женские особи, швейцарская Альбина) получали легкую анестезию галотаном и 3 мл воздуха, вводимого подкожно в дорсальную зону (день 1). В день 0 вводили 0,5 мл Freud's с добавленным дополнительно 0,1%, кротоновым маслом в этот образовавшийся воздушный мешок. Мышам вводили i.p. ежедневно NO - преднизолон (13,9 μ mol/кг), преднизолон (13,9 μ mol/кг), растворенный в арахисовом масле или связующее вещество со 2 по 14 день. Контрольная группа получала только арахисовое масло, i.p.

Отдельные группы животных были умерщвлены на 3, 7 и 14 день. Трупы охлаждали в течение 24 часов и затем рассекались на гранулы и просушивались при температуре 56^oС. После просушивания гранулированные ткани взвешивали.

Результаты приведены в таблице 9 и представлены как % от формации гранулированных тканей по сравнению с контрольной группой, замеренная величина в контрольной группе является базовой величиной (100).

Результаты показывают, что NО-преднизолон был более эффективен чем преднизолон в пониженной формации гранулированных тканей.

Фармакологический эксперимент 2.

Эффект будезонида 21-[(4'-нитрооксиметил)бензоат] (NO-будезонид) и будезонида на хистамин при вызванном сужении бронхов у гвинейских свиней.

Мужская особь гвинейских свиней весом 250-300 г была тренирована для акклиматизации, чтобы быть более устойчивыми, и как полнокровные тела в течение нескольких дней до начала эксперимента.

Хистамин (3 mм растворены в 0,9% залина) вводили в нос только 20 г с выдержкой 24 часа и 15 минут после выдержки соответственно, для тестирования соединений и функционирование прохождения воздуха измеряли предварительно и с интервалами через 10 минут после выдержки с хистамином.

Животные выдерживались с тестовыми соединениями: NO-будезонид (635 μg/ml) и будезонид (448 μg/ml), растворенными в смеси (DMSO 20%, этанол 10%, залин 70%) или растворитель (DMSO 20%, этанол 10%, залин 70%), представленных как аэрозоли и использованных с воздухом под давлением 20 lb. psi со скоростью 0,5 ml/мин в запечатанной квадратной комнате в течение 15 минут.

Все тело здоровых гвинейских свиней использовалось для наблюдения за функционированием воздуха и регистрировалось как специфическая проводимость воздуха (SG_aw). Животное располагалось в вытянутом положении и обеспечивалось маской. Животное запускали в запечатанную комнату и респираторный поток воздуха замеряли пнеомотахографией и преобразователем давления. Давление в комнате также измерялось. Падение в (SG_aw) показывает сужение бронхов и специфическую проводимость воздуха (SG_aw), выражалось как % изменений от базовой величины, полученной непосредственно перед выдержкой.

Данные, представленные в таблице 10, показывают, что NO-будезонид, задержанный при 100% хистамина, препятствует сужению бронхов и что будезонид при эквивалентной молярной дозе по отношению к известному соединению наоборот ускоряет сужение бронхов, препятствуемое хистамином.

Формула изобретения

1. Нитроэфиры кортикоидных соединений общей формулы
B-X₁-NO₂,
где В имеет следующую структуру:

где Z - водород или F;
в положении 17 может находиться группа ОН или в положении 16, 17 может находиться группа

штриховая линия в положении 1, 2 означает возможную двойную связь, причем в случае, когда в положении 9 находится F, в положении 1, 2 находится двойная связь, в положении 20 - группа СО, то в положениях 16, 17 не может быть группы

R" является группой

Х₁ является бивалентным связывающим мостиком, выбранным из YO, где Y - линейный С₂-С₅ алкилен или Y₁, где Y₁

2. Соединения по п.1, в которых В представлен структурой преднизолона, будезонида, дексаметазона или гидрокортизона.

3. Соединения по п.1, предназначенные для использования как медикаменты.

4. Соединения по п.2, предназначенные для получения медикаментов, таких, как кортикоидные.

5. Соединения по п.4, предназначенные для получения противоартритных медикаментов.

6. Соединения по п.4, предназначенные для получения иммунодепрессивных медикаментов.

7. Соединения по п.4, предназначенные для получения ангиостатических медикаментов.

8. Соединения по п.4, предназначенные для получения противоастматических медикаментов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11