Способ определения необходимости и эффективности иммунокоррекции т-звена иммунной системы

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии. Способ обеспечивает повышение точности диагностической информативности способа и эффективности лечения. Оценивают функциональное состояние Т-лимфоцитов периферической крови в тесте миграции лейкоцитов в присутствии 5 мкг азатиоприна при дозе клеток (5-6)•10⁵ и при значении индекса угнетения миграции лейкоцитов выше 50% определяют нормальное состояние Т-иммунитета и отсутствие показаний к его коррекции, а при значении ниже 50% определяют наличие иммунодефицита и показание к иммунокоррекции. При этом эффективность иммунокоррекции оценивают по индексу угнетения миграции лейкоцитов. 1 з.п.ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологии, конкретнее - к направлению, связанному с иммунокоррекцией, восстановлением иммунной системы и оптимизацией лечения иммунодефицитных состояний, в частности при нарушении функций тимуса, угнетении Т-звена иммунитета, функциональной активности Т-лимфоцитов как при первичных, так и при вторичных иммунодефицитных состояниях (ИДС) Способ можно использовать для оценки ИДС, для определения показаний к иммунокоррекции, оценки эффективности иммунокоррекции, т.е. восстановления иммунной системы после лечения, для определения in vitro индивидуальной чувствительности к иммунотропным препаратам, в частности иммуномодуляторам корригирующего действия, с целью доклинического индивидуального подбора препарата и достижения максимального терапевтического эффекта. Способ можно использовать и для оценки активности иммунотропных препаратов в отношении Т-звена иммунитета.

В связи с неуклонным ростом частоты возникновения и развития вторичных ИДС, с появлением все новых иммунотропных препаратов и развитием направления - иммунокоррекция, в клинической практике целесообразно проводить оценку необходимости и эффективности иммунокоррекции, чтобы назначать иммунокорригирующие препараты строго по показаниям, а также проводить подбор in vitro наиболее эффективных препаратов, т.е. определять индивидуальную чувствительность к конкретному препарату с целью достижения максимальной эффективности лечения.

Существует целый ряд подходов, направленных на решение поставленной задачи в той или иной мере.

Известен способ оценки эффективности иммунокоррекции при нарушении Т-звена иммунитета, заключающийся в том, что до и после иммунокоррекции определяют количество субпопуляций Т-лимфоцитов, а именно стабильных Е-РОК и активных Е-РОК, образующих розетки с эритроцитами барана, рассчитывают индекс иммунокоррекции для Т-звена иммунитета по формуле ИИМ=A/A_исх+В/В_исх+С/С_исх, где А, В, и С - относительное количество Е-РОК общих, относительное количество стабильных Е-РОК и относительное количество активных Е-РОК соответственно после иммунокоррекции, а А_исх, В_исх и С_исх - те же показатели до иммунокоррекции При значениях ИИМ от 10 и выше оценивают иммунокоррекцию как эффективную, а при ИИМ от 1 до 9 проводят повторный курс иммунокоррекции. Данный способ позволяет оценивать эффективность проведенной иммунотерапии по изменению показателей функциональной активности Т-лимфоцитов периферической крови человека. Однако этот подход не позволяет проводить оценку необходимости иммунокоррекции до лечения и определять in vitro до лечения чувствительность к иммуномодуляторам с целью выбора наиболее эффективного лечения. Кроме того, этот способ, как и все способы, использующие тест розеткообразования с эритроцитами барана, имеет ряд недостатков, влияющих на его информативность, диагностическую ценность. Недостатки связаны с самим тестом розеткообразования: для постановки теста требуются эритроциты барана, которые не являются стандартным диагиостнкумом, так как их качество и состояние зависят от многих факторов (состояния здоровья самого животного, условий его содержания, питания, времени хранения эритроцитов после взятия крови - хранятся в консерванте и используются в течение 2-3 недель, после чего становятся непригодными). Оценка результатов существенно зависит oт субъективного момента, что определяет недостаточную точность и надежность метода. Ошибка в подсчете числа розеток, Е-РОК разных классов и тотальных розеток зависит от глаза экспериментатора, наличия ложных и нестабильных розеток, которые трудно отличить от истинных. Способ подсчета розеткообразующих клеток является утомительным и трудоемким.

Известен способ определения состояния Т-звена иммунитета, нарушения иммунологического статуса больных, заключающийся в том, что определяют состояние Т-лимфоцитов периферической крови больных путем инкубации лимфоцитов с пирантелем и без него, подсчитывают количество розеткообразующих клеток (Е-РОК), вычисляют разность, определяют нарушение иммунного статуса человека по положительному значению разности, но при отрицательном значении этого показателя днагносцируют отсутствие нарушений в иммунной системе [2]. Данный способ можно использовать для определения нарушений Т-звена иммунитета и оценки показаний к иммунокоррекции, по-видимому, и для оценки эффективности проведенной терапии иммунокорригирующими препаратами. Однако не указаны возможности и условия его использования для подбора in vitro иммуномодуляторов. Этому способу также присущи изложенные выше недостатки, характерные для теста розеткообразования с эритроцитами барана.

Известен способ оценки эффективности иммунотропного препарата левамизола при иммунодефицитных состояниях, позволяющий in vitro осуществлять индивидуальное прогнозирование терапевтического эффекта левамизола и заключающийся в том, что проводят исследование периферической крови человека, определяют уровень общих и активных Т-лимфоцитов, образующих розетки с эритроцитами барана (Е-РОК общие и Е-РОК активные), до и после воздействия левамизолом и при изменении этих показателей оценивают эффективность левамизола, т.е. прогнозируют in vitro его клинический эффект. Данный способ позволяет проводить оценку состояния Т-звена иммунитета, оценивать необходимость и эффективность иммунокоррекции и одновременно проводить индивидуальное прогнозирование in vitro терапевтического эффекта левамизола. При наличии у больного иммунодефицита и при положительном эффекте левамизола этот препарат включают в комплекс лечения по принятой схеме. Данный способ взят нами за прототип, поскольку в нем сделана попытка оценить эффективность иммунокорригирующего препарата до его применения, т.е. in vitro.

Однако этот способ, как и предыдущие аналоги, имеет тот же ряд недостатков, связанных с тестом розеткообразования, влияющих на его информативность и диагностическую ценность. Недостатки перечислены выше при анализе и критике первого аналога. Способ предполагает также предварительное фракционирование крови с целью выделения лимфоцитов в составе фракции мононуклеаров из общего пула лейкоцитов, а также постановку двух самостоятельных тестов методом розеткообразовання - на общие и на активные Е-РОК, требующие различающихся условий инкубации лимфоцитов с эритроцитами барана. Данный способ, выбранный нами в качестве прототипа, хотя и направлен на решение поставленной задачи, но является недостаточно объективным и достоверным, а следовательно, не вполне удобным для клинической диагностики.

Целью данного изобретения является упрощение, объективизация, повышение диагностической информативности способа и обеспечение эффективности лечения. Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа берут пробы суспензии лейкоцитов и исследуют миграционную активность лейкоцитов в присутствии 5 мкг азатиоприна на 5•10⁵-6•10⁵ клеток по индексу угнетения миграции лейкоцитов (ИИМ) и при значениях, равных или выше 50%, констатируют нормальное состояние Т-звена иммунитета и отсутствие показаний к иммунокоррекции, при значениях ИИМ ниже 50% констатируют наличие иммунодефицита и показания к иммунокоррекции, а прогнозируемую эффективность иммунокоррекции оценивают по увеличению иммунотропным препаратом пониженного ИИМ в присутствии азатиоприна при наличии иммунодефицита в том же тесте. Выбор теста миграции лейкоцитов позволяет отказаться от использования эритроцитов барана в качестве диагностикума. Вместо нестандартного биологического диагностикума - эритроцитов барана - в предлагаемом способе используется химически однородное вещество с известной молекулярной массой, получаемое путем химического синтеза, являющееся аналогом пуриновых оснований нуклеиновых кислот. Выбор дозы азатиоприна 5 мкг обусловлен оптимальным эффектом этой дозы в реакции миграции лейкоцитов, при котором наиболее удобно оценивать модулирующее действие иммунотропных препаратов in vitro, как усиление эффекта угнетения, так и его снижение. Выбор дозы лейкоцитов на одну лунку - (5-6)•10⁶ клеток обеспечивает размеры и плотность зон, достаточные для удобства оценки результатов. А при более высоких дозах имеет место нерациональный расход клеток и снижается число проб лейкоцитов, а следовательно, и число препаратов, исследуемых с целью подбора иммуномодуляторов. При более низких дозах повышается ошибка определения размеров зон миграции.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Приготовление агаровых блоков.

Навеску агара "Дифко" 0,45 г смешивают с 15 мл 0,05 М Трис-НСl буферного раствора, содержащего 0,9% хлористый натрий, рН 7,3. Смесь выдерживают 15 мин при комнатной температуре, а затем нагревают на водяной бане до образования светлого прозрачного раствора и после этого выдерживают в кипящей бане еще 15 мин. Готовый 3%-й aгap охлаждают до 50-55^oС. Одновременно с этим готовят разбавляющий раствор. Смешивают 29,5 мл 199 среды с 0,45 - 0,50 мл сыворотки IV-й группы крови человека (или эмбриональной сыворотки теленка, или же сыворотки крупного рогатого скота), добавляют 50 мкл раствора мономицина с исходной концентрацией 0,1 г на 1 мл или же используют смесь антибиотиков: 2,7 мг пенициллина и 4,5 мг стрептомицина. Полученный разбавляющий раствор объемом 30 мл нагревают до 50-55^oС и смешивают с 15 мл приготовленного 3%-го раствора агара, перемешивают и разливают по 3,5 мл в пластиковые чашки диаметром 3,3 см или по 4,0 мл - в чашки диаметром 3,6 см, чтобы толщина слоя агара была 4 мм. Чашки накрывают крышками После застывания агара при комнатной температуре агаровые блоки (чашки с агаром) помещают в эксикатор, на дне которого имеется небольшое количество воды (около 100 мл) для поддержания высокой влажности. Чашки располагают вверх дном. Для достижения 5%-го содержания CO₂ в камере зажигают свечу, эксикатор помешают в холодильник и выдерживают при 4-6^oС не менее двух часов перед использованием агаровых блоков.

2. Приготовление суспензии лейкоцитов.

Кровь берут из вены, в качестве антикоагулянта используют 2,7% раствор натриевой соли EDTA (трилон Б), рН 7,3 в соотношении 1 мл на 10 мл крови. Выдерживают пробирку с кровью при комнатной температуре 30-40 минут, чтобы произошло оседание эритроцитов. Плазму, обогащенную лейкоцитами, отбирают и центрифугируют при 1200 оборотах в минуту в течение 5 мин. Осадок, содержащий лейкоциты, ресуспендируют в 10 мл раствора Хенкса, не содержащего ионов Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, те в неполном растворе Хенкса, лейкоциты переосаждают путем центрифугирования при тех же условиях. Осадок лейкоцитов вновь ресуспендтруют в точном объеме неполного раствора Хенкса, в зависимости от величины осадка клеток для удобства подсчета клеток в камере Горяева подбирают нужный объем суспензии. Подсчитывают количество лейкоцитов в 1 мл суспензии и общее содержание лейкоцитов в конечном объеме суспензии Суспензию вновь центрифугируют в 199 среде таким образом, чтобы конечная концентрация клеток в ней была 5•10⁷ в мл. Конечный объем суспензии рассчитывают по формуле: V=N/С, где N - общее число выделенных лейкоцитов, С - заданная конечная концентрация лейкоцитов в конечном объеме суспензии 3. Постановка реакции миграции лейкоцитов.

В охлажденных агаровых блоках при помощи пробойника диаметром 3-4 мм делают лунки: по 9 лунок в каждой чашке - 3 лунки для контроля без азатиоприна и иммуномодуляторов (для оценки спонтанной миграции лейкоцитов), остальные - для испытания с азатиоприном в концентрации 0,5 мг в 1 мл и с рядом иммунотропных препаратов (каждым в отдельности) совместно с азатиоприном. В каждую лунку вносят по 10 мкл суспензии лейкоцитов, т.е. по 5•10⁵ клеток. В контрольные лунки добавляют по 20 мкл среды 199, а в опытные - по 10 мкл иммунотропных препаратов (отдельно в каждую лунку) в оптимальной концентрации и по 10 мкл раствора азатиоприна 5 мкг на лунку. В этих лунках оценивают влияние иммунотропных препаратов на ответ к азатиоприну. В 2-3 лунки вместо испытуемых препаратов вносят по 10 мкл среды 199, а затем по 10 мкл раствора азатиоприна, в них оценивают ответ на азатиоприн - миграцию лейкоцитов под влиянием только азатиопрнна как показатель ИДС и необходимости, а также эффективности иммунотерапии после ее проведения в клинике у конкретного больного. Чашки накрывают крышками, помещают в теплый эксикатор и инкубируют во влажной атмосфере с 5% содержанием СО₂ в герметически закрытом эксикаторе в течение 18-20 часов в термостате при 37^oС.

4. Оценка результатов реакции миграции лейкоцитов.

Реакцию останавливают добавлением в каждую чашку по 2 мл 10% раствора формальдегида (формалин в разведении в 4 раза дистиллированной водой) и выдерживают в течение 1 часа. После фиксации лейкоцитов формалин сливают, агар подсушивают в потоке воздуха (под тягой) до исчезновения следов влаги в лунках и удаляют агар при помощи скальпеля. Определяют среднюю ширину зон миграции лейкоцитов в контрольных лунках L_к, среднюю ширину зон миграции в лунках для каждого отдельного иммунотропного препарата L_аип совместно с азатиоприном, а также в лунках только с азатиоприном - L_а как расстояние от границы лунки до границы зоны миграции. Оценку размеров зон миграции лейкоцитов проводят при помощи бинокуляра со встроенной в окуляр микрометрической шкалой. Результаты выражают в величине, называемой ИИМ - индекс угнетения миграции. Для расчета ИИМ используют формулы: ИИМ_а=100%-[L_а/L_к]•100%, а также ИИМ_аип=100%-[L_аип/L_к]•100%, где ИИМ, индекс угнетения миграции лейкоцитов под влиянием только азатиоприна, а ИИМ_аип индекс угнетения миграции лейкоцитов под влиянием азатиоприна в присутствии иммунотропного препарата. Для каждого иммунотропного препарата ИИМ_аип определяют отдельно. ИИМ_а ниже 50% указывает на необходимость проведения иммунокоррекции. При ИИМ_а, равном или более 50%, констатируют отсутствие иммунодефицита Т-звена иммунитета и показаний к иммунокоррекцин. Эффективность иммунокоррекции in vitro (чувствительность к препарату и выбор иммуномодулятора) оценивают в том же тесте в присутствии различных иммуномодуляторов. При значениях ИИМ_аип выше значения ИИМ_а, если ИИМ_а ниже 50%, подтверждают необходимость проведения иммунокоррекции, констатируют чувствительность к конкретному иммуномодулятору и прогнозируют эффективность его применения при лечении конкретного больного.

Таким способом было обследовано 46 больных, в том числе 6 из них - до и после лечения с учетом показаний к иммунокоррекции конкретным иммунопрепаратом, определенных предложенным способом. Были испытаны следующие иммунотропные препараты: тактивин, тимоген, миелопид, интерферон, полудан и даларгин.

На фиг.1 представлены результаты обследования предлагаемым способом больных с послеоперационными осложнениями (нагноениями) до иммунотерапии. ИИМ_а в данной группе больных варьирует в диапазоне 12-46%, представлен незаштриховаиными столбиками. Значения ИИМ_а и ответ на азатиоприн ниже 50% указывают на необходимость иммунокоррекции. Данная группа больных была исследована на чувствительность к испытуемой группе препаратов. По результатам теста был выбран тактивин. Чувствительность к тактивину показана в виде заштрихованных столбиков на фиг.1: ИИМ_аип - в диапазоне 35-70%. Тактивин, как показано на фиг. 1, увеличивает у всех больных индекс угнетения миграции лейкоцитов, что является показателем к его применению с целью иммунокоррекции в данной группе больных. Аналогичные результаты получены и на других больных с иммунодефицитными состояниями.

На фиг. 2 представлены результаты обследования больных без клинических признаков иммунодефицита и практически здоровых людей. Значения ИИМ_а в диапазоне 50-70%, ИИМ_аип с тактивином - в диапазоне 50-70%. Результаты указывают на отсутствие необходимости иммунокоррекции. Незаштрихованные столбики - ИИМ_а, заштрихованные столбики - ИИМ_аип.

Как сказано нами раньше, 6 больных были обследованы до и после лечения с учетом показаний к иммунокоррекции, определенных данным способом.

Пример 1. Венозную кровь от больного С. с диагнозом воспаление после аутопластики взяли в объеме 5 мл с консервантом (2,7% раствором трилона Б. 0,5 мл) и выдержали при комнатной температуре 40 минут. После оседания эритроцитов плазму, обогащенную лейкоцитами, отобрали и отцентрифугировали при 1200 оборотах в минуту в течение 5 минут. Далее все процедуры выполнили изложенным выше способом. Определили ИИМ_а - ответ на азатиоприн и ИИМ_аип, - ответ на азатиоприн в присутствии препаратов тактивин, тимоген, миелопид, полудан, даларгин и интерферон, ИИМ_а= 22%, ИИМ_аип для гактивина=53%, для гимогена= 57,5%, для миелопида=54%, для даларгнна=55%, для полудана=50%, для интерферона=30%.

ИИМ_а ниже 50%, что позволило сделать вывод о наличии ИДС и показаний к иммунокоррекции. Полученные результаты при исследовании влияния иммунотропных препаратов позволили сделать вывод о показании к назначению конкретных препаратов из числа испытанных, а именно, больному показаны тактивин, тимоген, миелопид, даларгин и полудан. Больному был включен в курс лечения по принятой схеме тимоген.

Пример 2. У этого же больного через 5 недель после первого обследования провели дальнейшую оценку необходимости и эффективности иммунокоррекции. Больному в соответствии с показаниями был проведен курс иммунокоррекции тимогеном. Все процедуры выполняли, как в примере 1. Определили ИИМ_а и ИИМ_аип: ИИМ_а для азатиоприна=52%, ИИМ_аип для тактивина=55%, для тимогена= 54%, для миелопида=56%, для полудана=52%, для даларгина=54%. После проведенного лечения и обследования сделали вывод об отсутствии ИДС на данном этапе и отсутствии показаний к иммунокоррекции на данном этапе, об эффективности проведенной иммунотерапии тимогеном. Клинически отмечено значительное улучшение состояния больного.

Таким образом, представленные результаты показывают эффективность предлагаемого способа оценки необходимости и эффективности иммунокоррекции Т-звена иммунитета.

Источники информации 1. Патент РФ 2014607 С1, G 01 N 33/53, 15.06.94 г., БИ 11.

2. Авторское свидетельство СССР 1820330 А1, G 01 N 33/53, 07.06.93 г., БИ 21.

3. Авторское свидетельство СССР 1378817 A1, A 61 В 10/00, 07.08.88 г.

Формула изобретения

1. Способ определения показаний к иммунокоррекции Т-звена иммунной системы путем оценки функционального состояния Т-лимфоцитов периферической крови, отличающийся тем, что оценку функционального состояния Т-лимфоцитов осуществляют в тесте миграции лейкоцитов в присутствии 5 мкг азатиоприна при дозе клеток (5-6)•10⁵ и при значении индекса угнетения миграции лейкоцитов выше 50% определяют нормальное состояние Т-иммунитета и отсутствие показаний к его коррекции, а при значении ниже 50% определяют наличие иммунодефицита и показание к иммунокоррекции.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что эффективность иммунокоррекции оценивают по индексу угнетения миграции лейкоцитов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2