Способ получения иммуноглобулинового препарата

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактерийных и вирусных инфекций. Спиртовой осадок Б плазмы крови человека разводят в 15-20 объемах 0,005-0,01 М раствора хлорида натрия при рН 5,3-5,6, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13-17% при температуре от 0 до -4^o С, отделяют осадок, устанавливают рН 6,8-7,2, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 24-26%, отделяют осадок центрифугированием, разводят в 10-15 объемах 0,005-0,01 М хлорида натрия при рН 5,3-5,6, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13-17%, отделяют балластный осадок центрифугированием; устанавливают рН центрифугата 6,9±0,1, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 24-26% при температуре от -4 до -10^oС, осадок целевого продукта выделяют центрифугированием, разводят водой, проводят стерилизующую фильтрацию, выдерживают раствор в течение 1 недели - 1 месяца при температуре от 1 до 15^oС, удаляют осадок стерилизующей фильтрацией и низкомолекулярные примеси ультрафильтрацией. Технический результат - способ обеспечивает повышение степени чистоты целевого продукта.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний.

Известен способ получения иммуноглобулинового препарата из осадка Б (III фракция Кона) (Патент RU 2060034, кл. А 61 К 39/395, опубликован 06.09.91).

Способ предусматривает солевую экстракцию спиртового осадка Б сыворотки крови (III фракция Кона) в 0,9% растворе хлорида натрия. Очистку от липопротеидов экстракта осадка Б ведут хлороформом (10% по объему) с последующим осаждением иммуноглобулиновой фракции в присутствии 12% полиэтиленгликоля. Полученный осадок иммуноглобулинов разводят в 0,9% растворе хлорида натрия, центрифугируют для удаления нерастворимых примесей. К раствору после центрифугирования добавляют глюкозу до конечной концентрации 2% и подвергают стерилизующей фильтрации.

Недостатком способа является то, что он предусматривает получение препарата, предназначенного лишь для перорального применения. Данный препарат не может быть введен внутримышечно или внутривенно ввиду наличия большого количества иммуноглобулинов классов А и М, а также реактогенных примесей, содержащихся в исходном сырье - спиртовом осадке Б сыворотки крови (III фракции Кона).

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигнутому результату является способ получения иммуноглобулинового препарата, описанный в статье Наумовой Ю.К., Пряжникова Г.В. и Тараевой Г.А. "Дополнительное извлечение иммуноглобулина спиртово-риванольным методом из осадков "Б" в условиях производства", опубликованной в сборнике "Иммуноглобулины и другие препараты крови", изд. Ленинград, 1976, с. 15-21.

Способ предусматривает разведение спиртового осадка Б плазмы крови человека в 15-кратном объеме 0,075 М раствора хлорида натрия при рН раствора 4,8±0,1, температуре 0^oС. Экстракцию белков проводят в течение 3,5 часов. Балластный осадок отделяют центрифугированием, устанавливают рН центрифугата 5,6±0,1 и добавляют хлороформ до конечной концентрации 0,5%. Смесь перемешивают в течение 2 часов и выстаивают 1 час. Сформировавшийся балластный осадок отделяют центрифугированием. Устанавливают рН центрифугата 7,5 и добавляют 0,3% раствор риванола из расчета 0,5:1 объема центрифугата при температуре 2-4^oС при непрерывном перемешивании. Сформировавшийся балластный осадок отделяют центрифугированием. К полученному центрифугату добавляют активированный уголь из расчета 2,5 г на 1 литр, смесь перемешивают в течение 3 часов при температуре +2^oС. Балластный осадок отделяют фильтрацией. Добавляют в фильтрат этиловый спирта до конечной концентрации 26% при температуре -10^oС. Образовавшийся осадок целевого продукта отделяют центрифугированием; разводят в физиологическом растворе и проводят стерилизующую фильтрацию.

Недостатком способа является то, что полученный препарат содержит не менее 5% примесей белков неиммуноглобулиновой природы. Наличие в препарате остаточных количеств активированного угля, не удаляющихся при фильтрации, обуславливает формирование коллоидного осадка, отрицательно влияя на стабильность препарата при хранении.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением, - совершенствование способа получения иммуноглобулинового препарата из спиртового осадка Б плазмы крови.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении качества целевого продукта за счет повышения степени очистки препарата.

Указанный результат достигается тем, что спиртовый осадок Б плазмы крови человека разводят в 15-20 объемах 0,005-0,01 М раствора хлорида натрия при рН 5,3-5,6, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13-17% при температуре 0- (-4)^oС, отделяют балластный осадок центрифугированием, устанавливают рН центрифугата 6,8-7,2, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 24-26% при температуре (-4) -(-10)^oС, отделяют полученный осадок центрифугированием, разводят осадок в 10-15 объемах 0,005-0,01 М хлорида натрия при рН 5,3-5,6, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13-17% при температуре 0-(-4)^oС, отделяют балластный осадок центрифугированием, устанавливают рН центрифугата 6,9±0,1, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 24-26% при температуре (-4)-(-10)^oС, отделяют осадок целевого продукта центрифугированием, разводят в 5-10 объемах воды, проводят стерилизующую фильтрацию, выдерживают раствор в течение 1 недели - 1 месяца при температуре 1-15^oС, удаляют сформировавшийся осадок стерилизующей фильтрацией; удаляют низкомолекулярные примеси ультрафильтрацией, проводят стерилизующую фильтрацию.

Способ осуществляют следующим образом. Разведение спиртового осадка Б плазмы крови человека проводят с использованием раствора хлорида натрия с ионной силой 0,005-0,01 М, 15-20 объемов по отношению к весу осадка Б, при рН 5,3-5,6. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку при уменьшении объема раствора затрудняется разведение осадка, а его увеличение является технологически нецелесообразным. Уменьшение концентрации соли ухудшает разведение осадка, а увеличение ведет к появлению в целевом продукте нежелательных примесей иммуноглобулинов А и М. При снижении рН раствора ниже 5,3 происходит увеличение содержания в целевом продукте нежелательных примесей иммуноглобулинов А и М, а повышение больше 5,6 ведет к потере целевого продукта. К полученному раствору добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13-17% при температуре 0-(-4)^oС. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку при уменьшении концентрации этилового спирта повышается содержание примесей в целевом продукте, а увеличение концентрации спирта более 17% является технологически нецелесообразным; повышение температуры более 0^oС ведет к денатурации белков, а при температуре ниже -4^oС происходит замерзание реакционной смеси. Образовавшийся осадок балластных белков отделяют центрифугированием, он может быть использован для получения препарата фибринолизина. Устанавливают рН полученного центрифугата 6,8-7,2, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 24-26% при температуре (-4)-(-10)^oС.

Указанные параметры являются оптимальными, поскольку при уменьшении рН происходит загрязнение целевого продукта нежелательными примесями иммуноглобулинов классов А и М, а увеличение рН более 7,2 ведет к денатурации белков. Снижение концентрации этилового спирта ведет к снижению выхода целевого продукта; а превышение указанной концентрации является технологически нецелесообразным. При увеличении температуры выше -4^oС происходит денатурация белков, а при снижении температуры ниже -10^oС - замерзание реакционной смеси. Образующийся осадок целевого продукта отделяют центрифугированием и подвергают повторному осаждению примесей с целью увеличения степени очистки. Для этого осадок целевого продукта повторно разводят с использованием раствора хлорида натрия с ионной силой 0,005-0,01 М, 10-15 объемов по отношению к весу осадка, при рН 5,3-5,6. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку при уменьшении объема раствора затрудняется разведение осадка, а его увеличение является технологически нецелесообразным. Уменьшение концентрации соли ухудшает разведение осадка, а увеличение ведет к снижению выхода целевого продукта. При снижении рН раствора ниже 5,3 происходит увеличение содержания в целевом продукте нежелательных примесей иммуноглобулинов А и М, а повышение более 5,6 ведет к потере целевого продукта. К полученному раствору добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13-17% при температуре 0-(-4)^oС.

Указанные параметры являются оптимальными, поскольку при уменьшении концентрации этилового спирта повышается содержание примесей в целевом продукте, а увеличение концентрации спирта более 17% является технологически нецелесообразным; повышение температуры более 0^oС ведет к денатурации белков, а при температуре ниже -4^oС происходит замерзание реакционной смеси. Образовавшийся осадок балластных белков отделяют центрифугированием. Устанавливают рН полученного центрифугата 6,9±0,1; добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 24-26% при температуре (-4)-(-6)^oС. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку снижение рН ведет к потере целевого продукта, а увеличение - к денатурации белков. Снижение концентрации этилового спирта ведет к уменьшению выхода целевого продукта; а превышение указанной концентрации является технологически нецелесообразным. При увеличении температуры выше -4^oС происходит денатурация белков, а при снижении температуры ниже -6^oС - замерзание реакционной смеси. Образующийся осадок целевого продукта отделяют центрифугированием и разводят в 5-10 объемах воды по отношению к весу осадка. При уменьшении указанного объема воды отмечается плохая растворимость осадка, увеличение указанного объема является технологически нецелесообразным. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации и выдерживают в течение 1 недели - 1 месяца при температуре 0-15^oС, предпочтительно 4^oС. При уменьшении указанного срока не происходит полного формирования осадка нестабильных примесей, а увеличение указанного срока является технологически нецелесообразным. При уменьшении указанной температуры происходит замерзание белкового раствора, при увеличении - не формируется осадок нестабильных примесей. По истечении указанного срока инкубации удаляют сформировавшиеся примеси стерилизующей фильтрацией; удаляют низкомолекулярные примеси и повышают концентрацию белка в растворе ультрафильтрацией; проводят стерилизующую фильтрацию.

Полученный указанным способом иммуноглобулиновый препарат характеризуется низким содержанием примесей - не более 3%, сохраняет свои свойства при хранении в течение 2,5 лет: в процессе хранения не отмечается образования осадка нестабильных белков и изменения цветности и прозрачности раствора препарата.

Пример 1. К 60 кг спиртового осадка Б плазмы крови человека добавляют 900 л 0,005 М раствора хлорида натрия при рН 5,3. К полученному раствору добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 17%, поддерживая температуру раствора 0^oС. Образовавшийся осадок балластных белков отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Устанавливают рН полученного центрифугата 6,8, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 24% при температуре -4^oС. Образующийся осадок целевого продукта отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Полученный осадок массой 7,0 кг разводят в 70 л 0,005 М раствора хлорида натрия, рН 5,3. К полученному раствору добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 17% при температуре 0^oС. Образовавшийся осадок балластных белков отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Устанавливают рН полученного центрифугата 6,8, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 24% при температуре -4^oС. Образующийся осадок целевого продукта отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Полученный осадок массой 5 кг разводят в 25 л воды. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации с использованием глубинных целлюлозных фильтров "Cuno-60" и "Cuno-90" и выдерживают в течение 1 месяца при температуре +1^oС. По истечении указанного срока инкубации удаляют сформировавшиеся примеси стерилизующей фильтрацией с использованием глубинных целлюлозных фильтров "Cuno-60" и "Cuno-90". Проводят ультрафильтрацию полученного раствора и стерилизующую фильтрацию.

Анализ состава полученного препарата методом электрофореза на мембранах из ацетилцеллюлозы показал наличие в препарате не более 1,9% примесей. Определение прозрачности и цветности препарата с помощью спектрофотометрических методов не выявило изменения параметров в процессе хранения в течение 2 лет.

Пример 2. К 50 кг спиртового осадка Б плазмы крови человека добавляют 1000 л 0,005 М раствора хлорида натрия при рН 5,6. К полученному раствору добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13%, поддерживая температуру раствора -4^oС. Образовавшийся осадок балластных белков отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Устанавливают рН полученного центрифугата 7,2, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 26% при температуре -10^oС. Образующийся осадок целевого продукта отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Полученный осадок массой 5,5 кг разводят в 82,5 л 0,01 М раствора хлорида натрия, рН 5,6. К полученному раствору добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13% при температуре -4^oС. Образовавшийся осадок балластных белков отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Устанавливают рН полученного центрифугата 7,0, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 26% при температуре -10^oС. Образующийся осадок целевого продукта отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Полученный осадок массой 4 кг разводят в 40 л воды. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации с использованием глубинных целлюлозных фильтров "Cuno-60" и "Cuno-90" и выдерживают в течение 1 месяца при температуре +15^oС. По истечении указанного срока инкубации удаляют сформировавшиеся примеси стерилизующей фильтрацией с использованием глубинных целлюлозных фильтров "Cuno-60" и "Cuno-90". Проводят ультрафильтрацию полученного раствора и стерилизующую фильтрацию.

Анализ состава полученного препарата методом электрофореза на мембранах из ацетилцеллюлозы показал наличие в препарате не более 2,1% примесей. Определение прозрачности и цветности препарата с помощью спектрофотометрических методов не выявило изменения параметров в процессе хранения в течение 2 лет.

Таким образом, предложенный способ получения иммуноглобулинового препарата позволяет повысить качество целевого продукта за счет снижения содержания примесей.

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулинового препарата из крови человека путем разведения спиртовой фракции плазмы крови человека в растворе хлорида натрия, отделения балластного осадка центрифугированием, осаждения примесей хлороформом, отделения примесей центрифугированием, отделения балластного осадка фильтрацией, осаждения целевого продукта этиловым спиртом, отделения осадка целевого продукта центрифугированием, разведения и стерилизующей фильтрации, отличающийся тем, что спиртовой осадок Б плазмы крови человека разводят в 15-20 объемах 0,005-0,01 М раствора хлорида натрия при рН 5,3-5,6, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13-17% при температуре от 0 до 4^o С, отделяют балластный осадок центрифугированием, устанавливают рН центрифугата 6,8-7,2, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 24-26% при температуре от -4 до -10^oС, отделяют полученный осадок центрифугированием, разводят осадок в 10-15 объемах 0,005-0,01 М хлорида натрия при рН 5,3-5,6, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13-17% при температуре от 0 до -4^oС, отделяют балластный осадок центрифугированием; устанавливают рН центрифугата 6,9±0,1, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 24-26% при температуре от -4 до -10^oС, отделяют осадок целевого продукта центрифугированием, разводят в 5-10 объемах воды, проводят стерилизующую фильтрацию, выдерживают раствор в течение 1 недели - 1 месяца при температуре от 1 до 15^oС, удаляют сформировавшийся осадок стерилизующей фильтрацией, удаляют низкомолекулярные примеси ультрафильтрацией.

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 21.07.2007

Извещение опубликовано: 27.02.2009        БИ: 06/2009

---