Штамм бактерий burkholderia caryophylli jap-3 для окисления поликонденсированных ароматических углеводородов

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов. Предлагается штамм бактерий Burkholderia caryophylli Jap-3, обладающий высокой нефтеокисляющей активностью в отношении поликонденсированных ароматических углеводородов. Штамм депонирован в коллекции ВИЗР под 151. Штамм бактерий Burkholderia caryophylli Jap-3 может быть выращен промышленным способом с использованием стандартного оборудования с применением доступного сырья. Штамм может служить основой для получения биопрепаратов для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, содержащих высокие концентрации поликонденсированных ароматических углеводородов. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов и может быть использовано для получения биопрепаратов для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, содержащих высокие концентрации поликонденсированных ароматических углеводородов.

Известны нефтеокисляющие штаммы бактерий Acenitobacter, см. патент РФ 2053204 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г., и Mycobacterium, см. патент РФ 2053206 по кл. С 02 F 3/34 от 29.09.94 г., применяемые для биодеструкции углеводородов нефтепродуктов в окружающей среде. Однако эти штаммы недостаточно эффективны.

Известны также штаммы Pseudomonas putida ПИ К₀-1, Pseudomonas fluorescens П-896 и Micrococcus ПИ К_у-1, которые используются в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий для создания биопрепарата для очистки от нефти и нефтепродуктов. Штаммы имеют достаточную активность при рН от 4,5 до 8,5, см. патент РФ 2122980 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г.

Известен штамм бактерий Bacillus cereus В 36б, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов при рН от 3,0 до 8,5, см. RU 2157843 от 31.05.1999.

Данное техническое решение принято в качестве прототипа настоящего изобретения.

Недостатком прототипа является относительно низкая нефтеокисляющая активность при высоких концентрациях поликонденсированных ароматических углеводородов.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, обладающих высокой нефтеокисляющей активностью в условиях загрязнения объектов окружающей среды поликонденсированными ароматическими углеводородами.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Burkholderia caryophylli Jap-3, обладающий высокой нефтеокисляющей активностью в отношении поликонденсированных ароматических углеводородов.

Штамм бактерий Burkholderia caryophylli Jap-3 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ГКМ ВИЗР) под номером 151 от 18.06.2001. Идентификация штамма проведена по "Определителю микроорганизмов" Берги (1997 г. ).

Штамм бактерий Burkholderia caryophylli Jap-3 выделен из загрязненной поликонденсированными ароматическими углеводородами почвы в префектуре г. Токио, Япония.

Штамм выделен на селективной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника питания поликонденсированные ароматические углеводороды.

Штамм отселектирован и стабилизирован по признаку высокой углеводородокисляющей активности в отношении поликонденсированных ароматических углеводородов.

Культурально-морфологические признаки штамма: подвижные прямые палочки размером 0,8-0,9х0,9-2; 1,5х1,5 мкм, расположенные одиночно и скоплениями. На стандартных питательных средах (МПА, BBL, Becton Dickinson) образует круглые колонии 2 мм в диаметре, выпуклые, гладкие, блестящие, слизистые, края ровные, белые, непрозрачные. Окраска по Граму и реакция по Граму методом Gregensen (1978) - грамотрицательные.

Биохимические признаки штамма. Аэроб. Хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Не образует флуоресцирующий пигмент. Не растет при +4^oС. Растет при +41^oС. Обладает способностью к денитрификации с образованием N₂. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, этанол, сукцинат, ксилозу, маннит. Использует в качестве источника роста углеводороды.

Штамм хранят на косяках МПА при (2-5)^oС или в лиофилизированном виде в ампулах.

Для выращивания штамма и получения биопрепарата использовали посевную и ферментационную питательные среду следующего состава: КН₂РO₄ - 2 г/л Na₂HPO₄ - 3 г/л MgSO₄•7H₂O - 0,5 г/л FeС1₃•6H₂O - 0,05 г/л СаС1₂•2Н₂O - 0,01 г/л (NH₄)₂SO₄ - 2 г/л Соевая мука - - 5 г/л Меласса - 20 г/л Вода - До 1 л
Посевной материал выращивали в колбах, а процесс культивирования проводили в ферментерах V= 100 л при Т=28^oС, рН=6,8-7,2 в течение 72 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,01% сырую нефть. Затем глубинную культуру микроорганизма (10%) вносили в стерильный торф одновременно с минеральными добавками и проводили доращивание при Т=3^oС в течение 120 часов.

В качестве минеральных добавок использовали:
Карбамид - 0,6 мас.%;
Двойной суперфосфат - 0,3 мас.%;
Сульфат калия - 1,5 мас.%
Титр полученного биопрепарата - 1•10¹² КОЕ/г.

Нефтеокисляющую активность штамма оценивали ИК-спектрометрически с использованием прибора АН-2 по снижению концентрации углеводородов нефтепродуктов в образцах почвы, содержащих высокие концентрации подвижных форм солей тяжелых металлов. Изменение концентрации поликонденсированных ароматических углеводородов изучали на хромато-масс-спектрометре фирмы "Hewlett-Packard", в состав которого входит газовый хроматограф HP-5890, масс-селективный детектор HP-5972 и рабочая станция Vectra 5/100 с программным обеспечением для обработки данных и базами масс-спектральной информации WILEY138. L и NBS75K.L. Для обнаружения в исследуемых пробах индивидуальных соединений полученные хроматограммы по полному ионному току реконструировали по нескольким массовым числам ионов, наиболее характерных для данных соединений. Приведенные в примерах данные по химическому составу соединений получены как непосредственно, так и путем поиска конкретных соединений. Расчеты произведены методом внутренней нормализации по одному наиболее характерному массовому числу анализируемого компонента с учетом коэффициента пересчета интенсивности выбранной линии на суммарную интенсивность полного масс-спектра.

Пример 1
Биопрепарат на основе штамма бактерий Burkholderia caryophylli Jap-3 вносили в керамические сосуды, наполненные грунтом с содержанием нефтепродуктов 30,8 до 39,0 г/кг. Суммарное количество ароматических соединений в почве - 15,9 мас. %, содержание производных бензопирена и изомеров - 0,58 мас. %. Количество внесенного биопрепарата - 1 г на 1 кг почвы. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры от 3 до 45^oС в течение 90 суток. Содержание углеводородов в почве контролировали 1 раз в 30 дней. Опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2
Во втором примере биопрепарат на основе штамма бактерий Burkholderia caryophylli Jap-3 был внесен в стеклянные сосуды, наполненные почвой с содержанием нефтепродуктов 40,8-59,5 г/кг. Суммарное количество ароматических соединений в почве - 18,9 мас.%, содержание производных антрацена и фенантрена - 1,98 мас. %. Опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 2.

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую деструктивную активность препарата на основе заявленного штамма (до 90%), в том числе и при высоком содержании поликонденсированных ароматических углеводоодов. При этом штамм эффективен в широком диапазоне температур (Т=3-45^oС).

Штамм бактерий Burkholderia caryophylli Jap-3 может быть выращен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых материалов.

Формула изобретения

Штамм бактерий Burkholderia caryophylli Jap-3 (депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ВИЗР под 151) для окисления поликонденсированных ароматических углеводородов нефтепродуктов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2