Фотохимиотерапевтические композиции

 

Изобретение относится к фармакологии и касается фармацевтической композиции. Композиция включает предшественник протопорфиринового фотохимиотерапевтического агента вместе с локализующимися в сосудистой строме фотосенсибилизаторами, необязательно с по меньшей мере одним веществом, способствующим проникновению через поверхность, и необязательно с одним или более хелатирующим соединением, и применение их при лечении заболеваний или аномалий, реагирующих на РDT, предпочтительно проявляющие синергически усиливаемую терапию; наборы, включающие их, и способы лечения и диагностики. Изобретение обеспечивает усиление фотохимиотерапевтического эффекта, приводит к усиленному торможению роста опухоли по сравнению с ожидаемым суммарным действием одних агентов. 5 с. и 15 з.п. ф-лы, 8 ил.

Изобретение относится к фармацевтическим композициям для использования при лечении заболеваний или аномалий кожи и других поверхностей тела фотохимиотерапией.

Аномалии или заболевания, такие как новообразования или псориазные бляшки кожи или других эпителиальных, например слизистых, органов, обычно лечат хирургическим путем, радиотерапией, криотерапией или химиотерапией. Однако эти виды лечения часто имеют важные и серьезные недостатки, такие как токсичность, канцерогенность и другие нежелательные побочные эффекты или общее недомогание, в результате лечения.

Фотохимиотерапия, или также известная как фотодинамическая терапия (PDT), является недавно появившимся методом лечения различных аномалий или заболеваний кожи и других эпителиальных органов, особенно рака или предраковых повреждений, а также незлокачественных повреждений, например кожных заболеваний, таких как псориаз. Фотохимиотерапия включает нанесение фотосенсибилизирующих (фотохимиотерапевтических) агентов на пораженный участок тела или системное введение с последующим воздействием фотоактивирующего света для активирования фотосенсибилизирующих агентов и превращения их в цитотоксическую форму, посредством чего пораженные клетки погибают или снижается их пролиферативный потенциал.

Известен ряд фотосенсибилизирующих агентов, особенно включая псоралены, порфирины, хлорины и фталоцианины. Эти препараты становятся токсичными при воздействии света.

Фотосенсибилизирующие агенты могут проявлять их действие с помощью различных механизмов, прямо или опосредованно. Так, например, некоторые фотосенсибилизаторы непосредственно становятся токсичными при активировании светом, в то время как другие действуют через образование токсичных соединений, например окисляющих соединений, таких как атомарный кислород и другие свободные радикалы, производные кислорода, которые являются чрезвычайно разрушительными для клеточного материала и биомолекул, таких как липиды, белки и нуклеиновые кислоты. Псоралены являются примером непосредственно действующих фотосенсибилизаторов; при воздействии света они образуют аддукты и перекрестные сшивки между двумя нитями молекул ДНК, посредством чего ингибируется синтез ДНК. Неблагоприятным риском от этой терапии является то, что могут проявиться нежелательные мутагенный и канцерогенный побочные эффекты.

Этого недостатка можно избежать при выборе фотосенсибилизаторов с альтернативным, опосредованным механизмом действия. Например, порфирины, которые действуют опосредованно через образование токсичных кислородсодержащих соединений, не обладают мутагенным побочным действием и представляют собой более подходящие кандидаты для фотохимиотерапии. Порфирины являются естественными предшественниками в синтезе гема. В частности, гем образуется, когда железо (Fe³⁺) включается в протопорфирин IX (Рр) при действии фермента феррохелатазы. Рр является очень сильным фотосенсибилизатором, в то время как гем не обладает фотосенсибилизирующим действием.

Один подобный препарат на основе порфирина, фотофрин^® (Gomer and Dougherty, Cancer Research, 39, р.146-151, 1979; первоначально названный фотофрином II), недавно был одобрен в качестве фотосенсибилизатора для лечения некоторых видов рака. Фотофрин^® состоит из крупных олигомеров порфирина и он с трудом проникает через кожу при местном применении и по этой причине его следует назначать системно. Таким образом, его основным недостатком является то, что, поскольку его необходимо назначать парентерально, обычно внутривенно, он вызывает фотосенсибилизацию кожи, которая может продолжаться в течение нескольких недель после внутривенной инъекции. Подобные проблемы существуют и в отношении других фотосенсибилизаторов на основе порфирина, таких как так называемые "производные гематопорфирина" (Hpd) (Lipson et al., J. Natl. Cancer. Ins., 60, p.1-10, 1961), о котором также сообщалось, что он используется для фотохимиотерапии рака (смотри, например, S. Dougherty, J. Natl. Cancer. Ins., 52, р. 1333, 1974; Kelly and Snell, J. Urol., 115, р.150, 1976). Hpd является сложной смесью, полученной при обработке гематопорфирина уксусной и серной кислотами, после чего ацетилированный продукт растворяют в щелочи. Безусловно, что при использовании смеси неопределенного состава в качестве лекарственного препарата имеются недостатки. Более того, поскольку Hpd необходимо также вводить инъекционно, он обладает тем же нежелательным фотосенсибилизирующим недостатком, что и фотофрин^®.

Для преодоления этих проблем оценивали предшественники Рр на фотохимиотерапевтическое действие. В частности, в качестве фотохимиотерапевтического агента при некоторых видах рака кожи исследовали предшественник Рр 5-аминолевулиновую кислоту (ALA). ALA, которая образуется из сукцинил-СоА и глицина на первой стадии синтеза гема, до ограниченной степени способна проникать через кожу и приводит к локализированному образованию Рр; поскольку действие феррохелатазы (металлирующий фермент) является лимитирующей по скорости стадией в синтезе гема, избыток ALA приводит к накоплению Рр, фотосенсибилизирующего агента. Таким образом, нанеся ALA местно на опухоли кожи и затем через несколько часов подвергнув опухоли воздействию света, можно получить полезный фотохимиотерапевтический эффект (смотри, например, WO 91/01727). Поскольку ALA лучше проникает через кожу, покрывающую базально-клеточные и чешуйчатые карциномы, чем через здоровую кожу, и поскольку концентрация феррохелатазы в кожных опухолях является низкой, было установлено, что местное применение ALA приводит к избирательно повышенному образованию Рр в опухолях.

Однако несмотря на то что использование ALA представляет собой значительный прогресс в этой области, фотохимиотерапия ALA не всегда является полностью удовлетворительной. ALA не способна с достаточной эффективностью проникать через все опухоли и другие ткани для создания возможности лечения широкого ряда опухолей и других заболеваний, а также ALA имеет тенденцию быть нестабильной в фармацевтических лекарственных формах. Некоторые из этих проблем можно преодолеть при использовании производных ALA, например сложных эфиров, таких как метиловый эфир ALA, этиловый эфир ALA, пропиловый эфир ALA, гексиловый эфир ALA, гептиловый эфир ALA и октиловый эфир ALA и их солей, как описано в нашей совместно рассматриваемой заявке WO 96/28412.

Подобно ALA, сложноэфирные производные проявляют их действие путем усиления образования Рр; после доставки в желаемое место действия гидролитические ферменты, такие как эстеразы, присутствующие в клетках-мишенях, расщепляют сложные эфиры до исходной ALA, которая вступает на путь синтеза гема и приводит к образованию Рр. Однако сложные эфиры имеют ряд преимуществ по сравнению с самой ALA. Первое, они являются более липофильными и в большей степени способны проникать через кожу и другие ткани по сравнению с ALA; проникновение является как более глубоким, так и более быстрым. Это представляет важное преимущество, особенно при местном назначении. Второе, сложные эфиры являются лучшими усилителями образования Рр, чем ALA; уровни увеличения образование Рр после введения эфиров ALA выше, чем с самой ALA. Третье, сложные эфиры ALA показывают улучшенную избирательность для тканей-мишеней, которые подлежат лечению, а именно усиливающее образование Рр действие локализуется в желаемом мишеневом участке поражения и не распространяется на окружающие ткани. Это особенно очевидно с опухолями. Наконец, сложные эфиры лучше локализуются в ткани-мишени после введения. Это может быть особенно важным при системном применении, поскольку это означает, что можно уменьшить или вовсе избежать нежелательных эффектов фотосенсибилизации, имеющихся, как сообщается в литературе, для других фотосенсибилизаторов на основе порфирина.

Несмотря на то что сложные эфиры ALA представляют значительный прогресс в области фотохимиотерапии, не все аномалии и заболевания поддаются лечению PDT при использовании известных способов для предотвращения роста опухоли, и, таким образом, по-прежнему сохраняется необходимость в лучших и альтернативных фотохимиотерапевтических агентах для торможения или предупреждения роста опухолей. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение фотохимиотерапевтических композиций, которые имеют усиленный фотохимиотерапевтический эффект по сравнению с предшествующим уровнем.

Исследования, проведенные авторами, показали, что для эффективного радикального лечения опухолей путем PDT необходима деструкция как клеточных компонентов, так и сосудистой стромы опухолей (Peng & Moan, Br. J. Cancer, 72, р.565-574, 1995; Peng et al., Cancer Res., 55, p.2620-2626, 1995 и Peng et al., Ultrastructural Pathology, 20, p.109-129, 1996). Была доказана полезность ALA при лечении опухолей, и эндогенно синтезированный Рр IX из ALA локализуется внутри опухолевых клеток. Кроме того, использованная местно ALA не вызывает сенсибилизации кожи и не обладает мутагенным действием в отношении ДНК-клеток. Введенная системно ALA не проявляет сенсибилизации в течение 24 часов после назначения. Однако, как упоминалось ранее, ALA не способна проникать во все опухоли и только было установлено, что она имеет хорошую эффективность для лечения поверхностных повреждений кожи глубиной менее 2-3 мм. Не было получено хороших клинических результатов при местном или системном назначении ALA-PDT на более глубокие повреждения кожи и более глубокие участки поражения дыхательного и пищеварительного тракта или другие внутренние полые органы. Известно, что фотофрин^®, в основном, распределяется в сосудистой стреме опухолей, но, как упоминалось выше, он связан с риском длительного проявления фотосенсибилизации кожи.

Однако сейчас с удивлением было установлено, что использование локализующегося в сосудистой строме фотосенсибилизатора, например фотофрина^®, тетра(мезо-гидроксифенил)хлорина (m-THPC), хлорина е6, фталоцианина алюминия дисульфоната или фталоцианина алюминия тетра-сульфоната в комбинации с предшественником протопорфиринового фотохимиотерапевтического агента, например ALA или ее метиловым или бутиловым эфирами, усиливает эффективность PDT по сравнению с использованием только одних агентов. Наблюдающийся синергический эффект между локализирующимся в сосудистой строме фотосенсибилизатором и предшественником протопорфиринового фотохимиотерапевтического агента приводит к усиленному торможению роста опухолей по сравнению с ожидаемым суммарным действием одних агентов. С удивлением наблюдали этот полезный синергический эффект даже при использовании локализующегося в сосудистом строме агента в дозе, меньшей, чем терапевтическая (субтерапевтическая), которая, хотя и неэффективна для торможения роста опухолей, снижает или устраняет риск проявления фоточувствительности кожи. Например, было установлено, что рост леченных таким образом опухолей тормозится при использовании ALA в терапевтической дозе и фотофрина^® (или m-THPC) в низкой нетерапевтической дозе. Ингибирование роста было значительно выше по сравнению с суммарным действием по результатам, полученным при использовании ALA в терапевтической дозе или фотофрина^® (или m-THPC) в терапевтической дозе. Это предполагает наличие неизвестного до настоящего времени синергического эффекта между этими различными типами фотохимиотерапевтических агентов даже в нетерапевтических дозах.

Синергический эффект, даже в субтерапевтических дозах, имеет большое клиническое значение. Первое, достигается улучшенная PDT, которая не ограничивается поверхностными участками поражения кожи, но может также использоваться для лечения глубоких очагов поражения кожи и поверхностных участков поражения внутренних полых органов, и второе, если локализующийся в сосудистой стреме фотосенсибилизатор используется в субтерапевтических дозах, можно избежать проявления кожной фототоксичности, связанной с этими агентами.

В одном аспекте настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает фармацевтическую композицию для лечения заболеваний и аномалий наружных и внутренних поверхностей тела, которые реагируют на фотохимиотерапию, включающую предшественник протопорфиринового фотохимиотерапевтического агента вместе с локализующимся в сосудистой строеме фотосенсибилизатором, необязательно вместе с по меньшей мере одним веществом, способствующим проникновению через поверхность и необязательно с одним или более хелатирующим соединением. В частности, усиливается терапевтическая эффективность фотохимиотерапевтических агентов, т.е. усиливается PDT по сравнению с использованием одного из агентов в отдельности. Конкретнее, терапевтическая эффективность усиливается синергически. В предпочтительном аспекте изобретения локализующийся в сосудистой строме фотосенсибилизатор обеспечен в субтерапевтической дозе.

С другой точки зрения, можно увидеть, что изобретение обеспечивает применение предшественника протопорфиринового фотохимиотерапевтического агента вместе с локализующимся в сосудистой строме фотосенсибилизатором, необязательно вместе с по меньшей мере одним веществом, способствующим проникновению через поверхность, и необязательно с одним или более хелатирующим соединением при приготовлении композиции для лечения заболеваний или аномалий наружных или внутренних поверхностей тела, которые реагируют на фотохимиотерапию.

Изобретение также распространяется на новые композиции предшественника протопорфириновых фотохимиотерапевтических агентов и локализующихся в сосудистой строме фотосенсибилизаторов, необязательно вместе с по меньшей мере одним веществом, способствующим проникновению через поверхность, и необязательно с одним или более хелатирующим соединением.

Понятно, что определенные локализующиеся в сосудистой строме фотосенсибилизаторы, например фотофрин^®, нельзя назначать местно и, таким образом, несмотря на то, что оба фотохимиотерапевтических агента вводят парентерально, назначение проводят при использовании либо отдельных препаратов, либо вводят одновременно, либо один за другим.

Таким образом, с точки зрения дополнительного аспекта, изобретение обеспечивает продукт, включающий предшественник протопорфиринового фотохимиотерапевтического агента и локализующийся в сосудистой строме фотосенсибилизатор, необязательно вместе с по меньшей мере одним веществом, способствующим проникновению через поверхность, и необязательно с одним или более хелатирующим соединением в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного использования для лечения заболеваний или аномалий наружных или внутренних поверхностей тела, которые реагируют на фотохимиотерапию.

Кроме того, применение предшественника протопорфиринового фотохимиотерапевтического агента и локализующегося в сосудистой строме фотосенсибилизатора, необязательно вместе с по меньшей мере одним веществом, способствующим проникновению через поверхность, и необязательно с одним или более хелатирующим соединением при получении продукта для одновременного, раздельного или последовательного использования для лечения заболеваний или аномалий наружных или внутренних поверхностей тела, которые реагируют на фотохимиотерапию, составляет дополнительный аспект изобретения.

Как здесь использовано, "предшественник протопорфириновых фотохимиотерапевтических агентов" относится к структурным предшественникам протопорфирина и его производных, которые действуют в качестве фотохимиотерапевтических агентов, например ALA, порфобилиногену или их предшественникам, или производным, которые составляют предпочтительный аспект изобретения. Как правило, подобные агенты локализуются в клетках очагов повреждения, например опухолевой и больной клетке.

"Локализующиеся в сосудистой строме агенты" относятся к агентам, которые обычно после введения локализуются в сосудистой строме. Подходящие локализующиеся в сосудистой строме агенты включают:

HpD;

гематопорфирины, такие как фотофрин^® (Quadra Logic Technologies Inc., Ванкувер, Канада) и гематепорфирин IX (HpIX);

фотозан III (Seehef Laboratorium GmbH, Seehof, Wesselburenerkoog, Германия);

хлорины, такие как тетра(м-гидроксифенил)хлорины (m-ТНРС) и их бактериохлорины (Scotia Pharmaceuticals Ltd., Surrey, Великобритания), Mono-L-аспартилхлорин e6 (NPe6) (Nippon Petrochemical Co., CA, США), хлорин e6 (Porphyrin Products Inc.), бензопорфирины (Quadra Logic Technologies Inc., Ванкувер, Канада) (например, бензопорфириновое производное монокислотного кольца А, BPD-MA) и пурпурины (PDT Pharmaceuticals Inc., CA, США) (например, оловоэтилэтиопурпурин, SnET2);

фталоцианины (например, цинк - Quadra Logic Technologies Inc., Ванкувер, Канада), некоторые фталоцианины алюминия или кремния, которые могут быть сульфированы, в частности сульфированные фталоцианины, такие как фталоцианин алюминия дисульфонат (AlPcS_2а) или фталоцианин алюминия тетрасульфонат (AlPcS₄);

порфицины;

гипокреллины;

протопорфирин IX (Рр IX);

гематопорфирин диэфиры;

уропорфирины;

копропорфирины;

дейтеропорфирин и

полигематопорфирин (РНР) и их предшественники и производные.

Как упоминалось ранее, фотофрин^® включает смесь различных компонентов и каждый из этих отдельных компонентов или их комбинации можно использовать для обеспечения локализующегося в сосудистой строме агента.

"Сосудистая строма" предназначена обозначать сосудистую соединительную ткань, матрикс и его компоненты и нервы в дополнении к клеткам, таким как макрофаги и фибробласты, присутствующие в сосудистой системе, и другие клетки, которые проникают в строму. Понятно, что участок локализации будет зависеть от времени после введения, при котором определяется локализация. Так, фотосенсибилизаторы, которые первоначально располагаются в клетках, могут затем перемещаться в строму и наоборот. Например, фталоцианин алюминия дисульфонат первоначально локализуется в строме, в то время как через 24-72 часа после инъекции большая часть агента обнаружена в клетках.

Однако в основном локализующимися в сосудистой строме агентами считаются те, которые располагаются в строме в течение 24 часов после введения. Однако этим можно управлять, проводя PDT в различные периоды времени после назначения агента так, что во время облучения агент(ы) будет вести себя соответственно как локализующийся в сосудистой строме или как локализующийся в участке поражения агент.

Предпочтительно, если предшественником протопорфирина является ALA или ее предшественник или производное, и локализующимся в сосудистой строме фотосенсибилизатором является гематопорфирин (особенно фотофрин^®), хлорин (особенно m-ТНРС или хлорин е6) или сульфированный фталоцианин (особенно фталоцианин алюминия дисульфонат или фталоцианин алюминия тетрасульфонат).

Термин "предшественники", как здесь использовано, относится к предшественникам агента, которые метаболически превращаются в этот агент и, таким образом, по существу эквивалентны этому агенту, например ALA. Таким образом, термин "предшественник" распространяется на биологические предшественники протопорфирина на метаболическом пути биосинтеза гема. "Производные" включают фармацевтически приемлемые соли и химически модифицированные агенты, например эфиры, такие как эфиры ALA, описанные здесь ранее.

Можно использовать вещества, способствующие проникновению через поверхность, которые оказывают полезное действие для усиления фотохимиотерапевтического эффекта. Подобные вещества можно использовать даже, если фотохимиотерапевтические агенты не назначают местно. Особенно предпочтительны диалкилсульфоксиды, такие как диметилсульфоксид (ДМСО). Это детально описано в WO 95/07077.

Вещество, способствующее проникновению через поверхность, может быть одним из веществ, способствующих проникновению через кожу, описанных в фармацевтической литературе, например НРБ-101 (от Hisamitsu), ДМСО и другие диалкилсульфоксиды, в частности н-децилметилсульфоксид (NDMS), диметилсульфацетамид, диметилформамид (ДМФА), диметилацетамид, гликоли, различные производные пирролидона (Woodford et al., J. Toxicol. Cut. & Ocular Toxicology, 5, p.167-177, 1986) и азон^® (Stoughton et al., Drug Dpv. Ind. Pharm., 9, p. 725-744, 1983) или их смеси.

ДМСО, однако, имеет ряд полезных эффектов и он настоятельно предпочтителен. Так, в дополнение к эффекту, способствующему проникновению через поверхность (ДМСО особенно эффективен в увеличении глубины проникновения активного агента в ткани), ДМСО обладает антигистаминной и противовоспалительной активностью, приводящими к уменьшению боли во время воздействия светом. Кроме того, установлено, что ДМСО увеличивает активность ферментов ALA-синтетазы и ALA-дегидрогеназы (ферменты, которые, соответственно, катализируют образование и конденсацию ALA в порфобилиноген), тем самым способствуя образованию активной формы Pp.

Однако при заболеваниях, таких как псориаз, участки повреждения довольно легко проницаемы и значение вещества, способствующего проникновению, может быть менее важным. При некоторых обстоятельствах, например в случае рака кожи, когда очаги поражения трудно проницаемы, вещество, способствующее проникновению, можно использовать на предварительной стадии, как правило, в более высокой концентрации.

Таким образом, не нужно одновременно использовать в композиции различные активные компоненты, а соответственно клиническим требованиям они могут назначаться раздельно или последовательно. Действительно, наблюдали, что во многих случаях особо полезный фотохимиотерапевтический эффект можно получить при предварительной обработке веществом, способствующим проникновению через поверхность, на отдельной стадии перед введением фотохимиотерапевтических агентов. Кроме того, было установлено, что в некоторых ситуациях выгодна предварительная обработка веществом, способствующим проникновению через поверхность, с последующим введением фотохимиотерапевтического агента совместно с веществом, способствующим проникновению через поверхность. Когда вещество, способствующее проникновению через поверхность, используется на стадии предварительной обработки, его можно применять в высокой концентрации, например, до 100% (масса/масса). Если используется такая предварительная стадия, фотохимиотерапевтический агент можно назначить последовательно с интервалом до нескольких часов после предварительной обработки, например с интервалом 5-60 минут после предварительной обработки.

Malik et al., в "Proceedings of Photodynamic Therapy of Cancer", 2078, p.355-362, 1993, описал в опытах in vitro действие ALA на индукцию биосинтеза протопорфирина и последующее радикальное уничтожение фотодеструкцией клеток мела-номы В 16 в культуре, которую предварительно инкубировали с ДМСО в качестве индуктора дифференциации и/или аллилизопропилацетамидом в качестве порфирогенного агента для увеличения уровня эндогенного порфирина перед инкубацией с ALA.

Doodstar et al., в "Biochemical Pharmacology", 42(6), р.1307-1303, 1991, описал исследование влияния культуральных условий на гепатоциты в культуре и, в частности, влияния ALA и ДМСО раздельно или в комбинации на увеличение активности цитохром Р450-зависимой оксидазы со смешанной функцией и УДФ-глюкуронозилтрансферазы по увеличению внутриклеточных концентраций гема в культуре гепатоцитов.

Хелатирующие соединения необязательно присутствуют в фармацевтической композиции или продукте по изобретению. Подобные вещества могут быть полезными вследствие двух эффектов: первое, для увеличения стабильности предшественника протопорфиринового фотохимиотерапевтического агента, например ALA, и второе, для усиления накопления Pp. Последний эффект достигается хелатированием железа, посредством чего предупреждается инактивирующее действие фермента феррохелатазы при включении металла в Рр, приводящее к накоплению Pp. Таким образом усиливается фотосенсибилизирующее действие.

Hanania et al., в "Cancer Letters", 65, р.127-131, 1992, предлагают использовать ALA в комбинации с хелатирующим соединением при фотохимиотерапии опухолей, обработанных местно.

Хелатирующие соединения на основе аминополикарбоновых кислот особенно пригодны для использования в этом отношении, включая любое из хелатообразующих соединений, описанных в литературе для детоксикации металлов или для хелатирования ионов парамагнитных металлов в соединениях для контрастного изображения в магнитном резонансе. Особое внимание следует обратить на ЭДТА, ЦДТА (циклогександиаминотетрауксусная кислота), DTPA, DOTA и 1,10-фенантролин. ЭДТА особенно предпочтительна ввиду стабилизации ALA. Для достижения железохелатирующего действия можно также использовать десферриоксамин и другие сидерофоры, например, совместно с хелатирующими агентами на основе аминополикарбоновых кислот, таким как ЭДТА.

Композиции по изобретению или использованные по изобретению могут быть дополнительно составлены и/или назначены вместе с другими агентами в целях увеличения эффективности PDT. Так, например, вместе с композициями по изобретению при PDT в целях дополнительного воздействия на сосудистую систему опухоли можно использовать ингибиторы ангиогенеза (противоангиогенные препараты), которые, как было установлено, полезны при лечении опухолей (O'Reilly et al., Nature Medicine, 2, р.689-692, 1996; Yamamoto et al., Anticancer Research, 14, p.l-4, 1994; and Brooks et al., J.Clin.Invest., 96, p.1815-1822, 1995). Ингибиторы ангиогенеза, которые можно использовать, включают TNP-470 (AGM-170, синтетический аналог продукта секреции грибков, называемый фумагиллином; Takeda Chemical Industries Ltd., Осака, Япония), ангиостатин (Surgical Research Lab. at Children's Hospital Medical Centre of Harvard Medical School) и интегрин α_vβ₃ антагонисты (например, моноклональные антитела к интефрину α_vβ₃, The Scripps Research Institute, LaJolla, CA).

Альтернативно или дополнительно можно использовать для улучшения PDT по изобретению иммунотерапевтические средства (например, антитела или эффекторы, такие как магрофагальный активирующий фактор) или химиотерапевтические препараты. Назначение этих дополнительных средств следует осуществлять соответственно пути, концентрации и лекарственной формы по известным способам для применения этих средств. Эти дополнительные соединения можно назначать до, после или во время PDT, в зависимости от их функции. Например, ингибиторы ангиогенеза можно добавлять 5-10 дней после PDT для предупреждения возобновления роста опухолей.

Было обнаружено также, что глюкоза, введенная местно или системно, способствует PDT. He желая быть связанным теорией, авторы считают очевидным, что назначение глюкозы приводит к снижению рН, которое усиливает гидрофобные свойства протопорфиринов так, что они могут легче проникать в клетки. Когда предполагается местное назначение, обычно лекарственная форма, например крем, может содержать от 0,01 до 10% глюкозы (масса/масса).

Предпочтительная композиция или продукт по изобретению включает ALA или ее предшественник или производное, фотофрин^®, ДМСО, ЭДТА и десферриоксамин.

Как упоминалось выше, наблюдали синергический эффект между предшественником протопорфирина и локализующимся в сосудистой строме фотохимиотерапевтическим агентом, посредством чего эффективность PDT увеличивается. Таким образом, это создает возможность использовать фотохимиотерапевтический агент в субтерапевтических дозах, т.е. дозах, при введении которых одного фотохимиотерапевтического агента не достигается полезного фотохимиотерапевтического эффекта.

В частности, было установлено, что полезные результаты можно получить, используя предшественник протопорфиринового агента, предпочтительно ALA или ее производное, в терапевтических дозах, стандартных для PDT, при использовании только одного фотохимиотерапевтического агента, в сочетании с субтерапевтическими дозами локализующегося в сосудистой строме агента, предпочтительно фотофрина^®.

Концентрация протопорфиринового предшественника фотохимиотерапевтического агента, например, ALA, в композиции обычно находится в пределах от 1 до 40%, например 2-25%, предпочтительно 5-20%; концентрация локализирующегося в сосудистой строме фотосенсибилизатора, например фотофрина^®, обычно находится в пределах от 0,1 до 1% или для m-THPC обычно в пределах 0,01-10%; концентрация хелатирующего агента предпочтительно находится в пределах от 1 до 20%, например от 2 до 10%, например 2,5%; концентрация вещества, способствующего проникновению через поверхность, например ДМСО, предпочтительно находится в пределах от 2 до 50%, например около 10%. Все указанные выше проценты являются весовыми. Необходимая концентрация агента зависит от конкретного агента, который используется и, безусловно, может быть изменена на подходящую соответственно информации и методам, известным в этой области. Кроме того, понятно, что использованная концентрация зависит от способа применения и времени, в течение которого используется композиция. Однако, как упоминалось выше, когда назначается вещество, способствующее проникновению через поверхность, отдельно на предварительной стадии, его можно использовать в более высоких концентрациях, даже до 100%. Композиции по изобретению можно назначать исключительно местно (при нанесении на внутренние или наружные поверхности, используя, например, крем, нанесение каплями, местное внутреннее назначение/инъекцию или ингаляцию), или системно (например, через рот или внутривенно), или при комбинации этих способов, при которых один или более компонентов композиции назначают местно, а другие компоненты вводят системно.

Общая доза вводимого локализирующегося в сосудистой строме фотосенсибилизатора, например, при внутривенном назначении предпочтительно находится в пределах от 0,01 до 10 мг/кг массы тела, например, для фотофрина^® предпочтительно от 0,01 до 1 мг/кг массы тела (субтерапевтическая доза) или для m-THPC предпочтительно от 0,01 до 0,2 мг/кг массы тела и для предшественника протопорфиринового фотохимиотерапевтического агента в пределах от 1 до 500 мг/кг тела, например от 1 до 250 мг/кг, например для ALA в пределах от 1 до 250 мг/кг, предпочтительно от 20 до 70 мг/кг массы тела.

Понятно, что необходимая дозировка зависит от способа и пути введения используемого агента и очага поражения, подвергающегося лечению. Несмотря на то что предпочтительны субтерапевтические дозы локализующегося в сосудистой строме агента, они могут быть увеличены, например, для лечения большого глубокого участка повреждения или трудного для терапии типа заболевания (например, меланомы). Наблюдаемый синергический эффект позволяет снизить ниже обычных терапевтических уровней дозы как локализующегося в сосудистой строме агента, так и предшественника протопорфиринового агента.

С другой точки зрения, этот аспект изобретения обеспечивает также набор в целях использования для фотохимиотерапии заболеваний или аномалий наружных и внутренних поверхностей тела, включающий:

a) первый контейнер, содержащий протопорфириновый предшественник фотохимиотерапевтического агента, например ALA, или ее предшественник, или производное;

b) второй контейнер, содержащий локализующийся в сосудистой строме фотосенсибилизатор, например фотофрин^® или m-ТНРС; и необязательно

c) по меньшей мере одно вещество, способствующее проникновению через поверхность, содержащееся внутри упомянутых первого или второго контейнера или в третьем контейнере; и/или

d) одно или более хелатирующих соединений, содержащихся или внутри упомянутых первого, второго или третьего контейнера, или в четвертом контейнере;

где упомянутый первый или второй контейнер может отсутствовать и агент или фотосенсибилизатор по пунктам а) или b) выше присутствует в одном из других контейнеров, имеющихся в наборе.

Могут быть также обеспечены дополнительные компоненты набора, такие как ингибиторы ангиогенеза или глюкоза, упомянутые выше.

Аномалии и заболевания, которые можно лечить по настоящему изобретению, включают любые злокачественные, предзлокачественные и незлокачественные аномалии или заболевания, реагирующие на фотохимиотерапию, например опухоли, дисплазия и другие виды роста, незлокачественные гинекологические заболевания, такие как меноррагия, эндометриоз и внематочная беременность, кожные заболевания, такие как псориаз, актиничные кератозы и воспаление сальных желез (акне), кожные повреждения и другие заболевания и инфекции, например бактериальные, вирусные или грибковые инфекции, например герпес-вирусные инфекции. Изобретение особенно пригодно для лечения заболеваний, нарушений и аномалий, при которых образуются разрозненные участки повреждения (участки повреждения используются здесь в широком смысле и включают опухоли и тому подобное). Однако способы по изобретению могут также использоваться для лечения аномалий и заболеваний, для которых нехарактерны участки повреждения, но при которых образуются разрозненные отдельные образования, которые характерны для этого заболевания, например нарушения в крови и костном мозге указывают на заболевания упомянутой крови и костного мозга или указывают на заболевание или нарушение, находящиеся где угодно в организме, которые могут дополнительно привести к наличию аномалий в крови или костном мозге, например циркулирующие трансформированные клетки.

Внутренние и наружные поверхности тела, которые можно лечить по изобретению, включают кожу и другие эпителиальные и серозные поверхности, включая, например, слизистые покровы органов, например дыхательного, желудочно-кишечного и мочеполового путей, и железы с протоками, которые выделяют свой секрет на такие поверхности (например, печень, сальные железы, молочные железы, слюнные железы и семенные пузырьки). В дополнение к коже, такие поверхности включают, например, покровы влагалища, эндометрий и уротелий. В число подобных поверхностей могут также входить полости, образованные в организме, после удаления больной или опухолевой ткани, например, мозговые полости после удаления опухолей, таких как глиомы.

Примеры поверхностей, таким образом, включают: i) кожу и конъюнктиву; ii) покровы рта, глотки, пищевода, желудка, кишечника и кишечных придатков, прямой кишки и заднего прохода; iii) покровы носовых ходов, носовых синусов, носоглотки, трахеи, бронхов и бронхиол; iv) покровы мочеточников, мочевого пузыря и уретры; v) покровы влагалища, шейки матки и матки; vi) париетальной и висцеральной плевры; vii) покровы брюшной и грудной полостей и поверхности органов, находящихся внутри этих полостей; viii) твердая мозговая оболочка и мягкие мозговые оболочки и ix) любые опухоли в твердых тканях, которые можно сделать чувствительными к фотоактивирующему свету, например, либо непосредственно во время операции, либо через оптический провод, введенный через иглу.

Композиции по изобретению можно составить обычным способом необязательно с одним или более физиологически приемлемым носителем или наполнителем по хорошо известным в этой области методам. Композиции для местного применения являются предпочтительными, за исключением того, когда по изобретению готовится одна композиция и композиция для местного использования непригодна для введения агента, например фотофрина^®, в этом случае необходимо системное введение, по меньшей мере для этого препарата. Композиции для местного применения включают гели, кремы, мази, спреи, лосьоны, бальзамы, карандаши, мыла, порошки, пессарии, аэрозоли, капли и любые из других обычных фармацевтических форм в этой области.

Мази или кремы могут быть, например, составлены на водной или жировой основе с добавлением пригодных сгустителей и/или желирующих агентов. Лосьоны можно составить на водной или жировой основе и, в основном, они будут также содержать одно или более эмульгирующих, диспергирующих, суспендирующих, сгущающих и окрашивающих соединений. Порошки можно сделать с помощью любой основы для порошка. Капли можно составить с водной или неводной основой, также включая одно или более диспергирующих, солюбилизирующих или суспендирующих веществ. Аэрозольные спреи обычно находятся в резервуарах под давлением с использованием пригодного пропеллента.

Альтернативно, вещество, способствующее проникновению через поверхность, наносят местно на отдельной стадии, и локализующийся в сосудистой строме фотосенсибилизатор, например фотофрин^®, и предшественник протопорфиринового фотохимиотерапевтического агента, например ALA, необязательно вместе или раздельно с одним или более хелатирующим соединением можно вводить альтернативными путями, например через рот или парентерально, например внутрикожной, подкожной, внутрибрюшинной или внутривенной инъекцией. Таким образом, альтернативные фармацевтические формы включают простые и покрытые оболочкой таблетки, капсулы, суспензии и растворы, содержащие активные компоненты необязательно вместе с одним или более инертным обычным носителем и/или разбавителем, например с кукурузным крахмалом, лактозой, сахарозой, микрокристаллической целлюлозой, стеаратом магния, поливинилпирролидоном, лимонной кислотой, винной кислотой, водой, водой/этанолом, водой/глицерином, водой/сорбитом, водой/полиэтиленгликолем, пропиленгликолем, стеариловым спиртом, карбоксиметилцеллюлозой или жировыми веществами, такими как твердый жир или их приемлемыми смесями.

После нанесения на поверхность, или системного введения, или обоими путями обработанный участок подвергается воздействию света для достижения фотохимиотерапевтического эффекта. Это обычно может быть порядка от нескольких минут до 96 часов, предпочтительно от 15 минут до 3 часов. Период времени перед воздействием света также зависит от способа введения и также дозы и конкретного используемого агента.

Облучение будет в целом применяться в дозе от 10 до 250 Дж/см² с интенсивностью 20-200 мВт/см², когда используется лазер, и в дозе 10-540 Дж/см² с интенсивностью 50-300 мВт/см², когда применяется лампа. Было установлено, что при 100 Дж/см² проникновение облучения является довольно глубоким. Облучение проводят предпочтительно в течение от 5 до 30 минут, предпочтительно в течение 15 минут. Можно использовать однократное облучение или раздельные световые дозы, в которых световая доза разделяется на две фракции, например, с интервалом между облучениями от нескольких минут до нескольких часов.

Длина волны света, используемая для облучения, может быть выбрана для достижения эффективного фотохимиотерапевтического эффекта. Обычно, когда для фотохимиотерапии используют порфирины, то они облучаются светом, примерно совпадающим с максимумом поглощения порфирина. Так, например, в случае применения ALA на предшествующем уровне в целях фотохимиотерапии рака кожи использовали длины волн в области 350-640 нм, предпочтительно 610-635 нм. Однако, выбрав широкий диапазон длин волн для облучения вне пределов максимума поглощения порфирина, можно усилить фотосенсибилизирующий эффект. Не стремясь быть связанными с теорией, авторы полагают, что это является следствием того факта, что когда Рр и другие порфирины подвергаются воздействию света, имеющего длины волн внутри его спектра поглощения, он деградирует на различные фотопродукты, включая, в частности, фотопротопорфирин (РРр). РРр является хлорином и обладает значительным фотосенсибилизирующим эффектом; спектр его поглощения не выходит за пределы длин волн, при которых поглощает Рр, т.е. почти до 700 нм (Рр почти не поглощает выше 650 нм). Были установлены другие агенты для использования в PDT, которые поглощают свет даже при более высоких значениях длин волн. Таким образом, при обычной фотохимиотерапии используемые длины волн не возбуждают РРр и, следовательно, при этом не получают выигрыша от его дополнительного фотосенсибилизирующего действия. Было установлено, что облучение светом с длинами волн в пределах 350-900 нм особенно эффективно, хотя это зависит от агента, который используется. Особенно важно включить диапазон длин волн между 600 и 700 нм, особенно между 630 и 690 нм, особенно в пределах от 630 до 670 нм.

Дополнительный аспект изобретения, таким образом, обеспечивает способ фотохимиотерапевтического лечения заболеваний или аномалии наружных или внутренних поверхностей тела, включающий нанесение на поврежденные поверхности композиции или продукта, как здесь ранее определено, и воздействие на упомянутые поверхности светом, предпочтительно светом с диапазоном длин волн 350-900 нм. Однако альтернативно можно использовать свет с узким интервалом длин волн, например, когда используется лазер, можно применять свет с длиной волны около 630 нм.

Способы облучения различных участков тела, например, лампами или лазерами, хорошо известны в этой области (смотри, например, Van den Bergh, Chemistry in Britain, May 1986, p.430-439).

Понятно, если способ лечения, в котором используются соединения по изобретению, неизбежно вовлекает флуоресценцию больного или аномального участка, который следует лечить. В то время как интенсивность этой флуоресценции можно применять для удаления аномальных клеток, локализацию флуоресценции можно использовать для визуальной оценки размера, степени и расположения аномалии или заболевания. Это становится возможным за счет способности агентов, используемых по изобретению, преимущественно локализоваться в аномальной ткани.

Аномалию или заболевание, обнаруженные таким образом или подтвержденные в месте обследования, можно затем лечить альтернативными методами, например хирургически, или химиотерапией, или способом лечения по изобретению при создании длительной флуоресценции или при дополнительном использовании соединений по изобретению в соответствующем месте. Понятно, что для диагностических методов требуются более низкие уровни флуоресценции в целях визуального обследования, чем те, которые используются для лечения. Так, обычно пригодные концентрации находятся в пределах от 1 до 50%, например,1-5% (масса/масса). Места, методы и способы введения рассматривались ранее в отношении использования изобретения для лечебных целей и они также применимы для диагностических целей, описанных здесь. Соединения по изобретению можно также использовать для диагностических методов in vitro и in vivo, например для обследования клеток, содержащихся в жидкостях организма. Более интенсивная флуоресценция, присущая аномальной ткани, обычно может указывать на наличие аномалии или заболевания. Этот способ является высокочувствительным и может быть использован для раннего выявления аномалий или заболеваний, например карциномы мочевого пузыря или легких, обследованием эпителиальных клеток соответственно в пробах мочи и мокроты. Другие пригодные жидкости, которые можно использовать для диагностики в дополнение к моче и мокроте, включают кровь, сперму, слезы, испражнения, спинно-мозговую жидкость и т.п. Можно также исследовать тканевые пробы или препараты, например пробы биопсии ткани или костного мозга. Настоящее изобретение, таким образом, распространяется на применение соединений по изобретению или их солей для диагностики по вышеупомянутым способам для фотохимиотерапии и продуктов и наборов для постановки упомянутых методов диагностики.

Дополнительный аспект изобретения относится к способу диагностики in vitro аномалий или заболеваний путем исследования пробы жидкости организма или ткани пациента, упомянутый метод включает по меньшей мере следующие стадии:

i) смешение упомянутой жидкости или ткани организма с соединением, описанным здесь ранее,

ii) воздействие светом на упомянутую смесь,

iii) оценку уровня флуоресценции, и

iv) сравнение уровня флуоресценции с контрольными уровнями.

Изобретение сейчас будет описано более детально в следующих не ограничивающих его примерах при обращении к чертежам, в которых:

Фиг. 1 является графическим изображением, показывающим усредненные результаты кривых роста человечьей карциномы толстого кишечника WiDr, подкожно трансплантированной нуд-мышам, которым внутривенно ввели фотофрин^® и/или внутрибрюшинно ALA с последующим через 3 часа облучением лазером (632 нм, 150 мВт/см² в течение 15 минут): контроль (без препаратов, без света); контроль (только свет); ALA 250 мг/кг, облучение через 3 часа; фотофрин^® 1 мг/кг, облучение через 3 часа; ALA 250 мг/кг и фотофрин^® 1 мг/кг, облучение через 3 часа; абсцисса показывает дни после лечения; ордината показывает относительный объем опухолей. Линии показывают стандартную ошибку среднего значения (SEM), полученного по меньшей мере на 3 животных в каждой группе.

Фиг. 2 является графическим изображением, показывающим усредненные результаты кривых роста человечьей карциномы толстого кишечника WiDr, подкожно транспланированной нуд-мышам, которым внутривенно ввели m-THPC и/или внутрибрюшинно ALA с последующим через 3 часа облучением лазером (632 нм, 150 мВт/см² в течение 15 минут): контроль (без препаратов, без света); контроль (только свет); ALA 250 мг/кг, облучение через 3 часа; m-THPC 75 мкг/кг, облучение через 3 часа; ALA 250 мг/кг и m-THPC 75 мкг/кг, облучение через 3 часа; абцисса показывает дни после лечения; ордината показывает относительный объем опухолей. Линии показывают стандартную ошибку среднего значения (SEM), полученного по меньшей мере на 3 животных в каждой группе.

Фиг. 3 - микрофотографии флуоресценции человечьей папиллярной ворсинчатой аденомы прямой кишки от 75-летнего мужчины (А) и 87-летней женщины (В), через 44 часа после внутривенного введения фотофрин^® в дозе 2 мг/кг (А) и через 4,5 часа после введения через рот ALA в дозе 60 мг/кг (В).

Фиг. 4 является аналогичной фиг. 1, когда внутривенно ввели хлорин е6 и/или внутрибрюшинно ALA с последующим через 1 час облучением лампой: Х контроль; ALA 250 мг/кг; хлорин е6 1 мг/кг; ALA 250 мг/кг и хлорин е6 1 мг/кг. Абсцисса показывает дни после лечения; ордината показывает относительный объем опухолей.

Фиг. 5 является аналогичной фиг. 1, когда внутривенно ввели AlPcS_2а и/или внутрибрюшинно метиловый эфир 5-ALA с последующим через 1 час облучением лампой: контроль; AlPcS_2а 1 мг/кг; метиловый эфир 5-ALA 273 мг/кг; Х метиловый эфир 5-ALA 273 мг/кг и AlPcS_2а 1 мг/кг. Абсцисса показывает дни после лечения; ордината показывает относительный объем опухолей.

Фиг. 6 является аналогичной фиг. 1, когда внутривенно ввели AlPcS₄ и/или внутрибрюшинно бутиловый эфир 5-ALA с последующим через 1 час облучением лампой: контроль; AlPcS₄ 5 мг/кг; Х А1РсS₄ 1 мг/кг; Ж бутиловый эфир 5-ALA 338 мг/кг; бутиловый эфир 5-ALA 338 мг/кг и AlPcS₄ 1 мг/кг. Абцисса показывает дни после лечения; ордината показывает относительный объем опухолей.

Фиг. 7 является аналогичной фиг. 1, когда внутривенно ввели AlPcS_2a и/или внутрибрюшинно бутиловый эфир 5-ALA с последующим через 1 час облучением лампой: контроль; AlPcS_2а 1 мг/кг; Х бутиловый эфир 5-ALA 338 мг/кг; бутиловый эфир 5-ALA 338 мг/кг и AlPcS_2a 1 мг/кг. Абсцисса показывает дни после лечения; ордината показывает относительный объем опухолей.

Фиг. 8 является аналогичной фиг. 1, когда внутривенно ввели А1РсS₄ и/или внутрибрюшинно метиловый эфир 5-ALA с последующим через 1 час облучением лампой. контроль; А1РсS₄ 1 мг/кг; Хметиловый эфир 5-ALA 273 мг/кг; метиловый эфир 5-ALA 273 мг/кг и AlPc_S4 1 мг/кг. Абсцисса показывает дни после лечения; ордината показывает относительный объем опухолей.

Пример 1. Лекарственные формы

1.1. Крем для местного применения, содержащий ALA

ALA-содержащий крем, включающий 5-30% ALA, готовят смешением ALA с имеющейся в продаже основой для крема.

Крем с 20% ALA приготовили смешением с основой для крема "Urguentum Merck" (от Merck), состоящей из окиси кремния, жидкого парафина, вазелина, альбумина, цетостеарола, полисорбата 40, глицерина моностеарата, миглиола^® 812 (смесь растительных жирных кислот), полипропиленгликоля и очищенной воды.

1.2. ALA для системного введения

Для введения через рот ALA растворяют в кислых безалкогольных напитках. Для внутривенного назначения ALA растворяют в изотоническом солевом растворе.

1.3. Фотофрин^® для системного введения

Фотофрин^® растворяют в 5% растворе глюкозы.

Пример 2. PDT с использованием ALA+ фотофрин^®

Материалы и методы

Химические реактивы

5-Аминолевулиновую кислоты (ALA) гидрохлорид получили от Sigma Chemical Company (St.Louis, МО). Приготовили свежий раствор ALA на изотоническом солевом растворе и ввели внутрибрюшинно мышам. Фотофрин^® получили от Quadra Logic Technologies (Ванкувер, Канада). Раствор фотофрина^® приготовили на изотоническом солевом растворе, содержащем 5% декстрозы, и ввели внутривенно мышам в хвостовую вену.

Животные и линии опухолей

Нуд-мышей-самок Balb/c nu/nu получили из The Animal Department, The Norwegian Radium Hospital, в каждой клетке находилось по 10 животных и их содержали в условиях, свободных от специфических патогенов. Опыты начали, когда мыши находились в возрасте 6 недель и весили 20-22 г. Человечью карциному толстого кишечника WiDr, использованную в настоящем исследовании, выращивали серийной трансплантацией нуд-мышам. Опухолевый материал без некроза для инокуляции получали вскрытием в стерильных условиях крупных выступающих опухолей от сингенных мышей. Макроскопически видимую ткань опухолей мягко измельчали ножницами и под давлением многократно пропускали через стерильные иглы при уменьшении их размера с 19 номера до 25 номера для приготовления суспензии опухолевой ткани, по 0,02 мл которой вводили каждой мыши в дорсальную часть правой передней конечности. Процент успешно проведенных трансплантаций в настоящих опытах приближался к 100%. В опухолях не наблюдали спонтанного некроза, которые достигали поперечного диаметра в 5-7 мм (примерно 14 дней после заражения) на день лечения, который измеряли с помощью кронциркуля через день. Объем опухоли рассчитывали, используя следующую формулу:

V=n/6(D₁ х D₂ х D₃),

где D₁, D₂ и D₃ являются тремя ортогональными диаметрами опухолей, которые ежедневно определяли кронциркулем.

Воздействие света

Мышей без анестезии фиксировали зажимным приспособлением Lucite, специально сконструированным для облучения. Участок с опухолью подвергали воздействию красного света от цветного лазера с дицианометилан-2-метил-6-(п-диметиламиностирил)-4н-пираном (DCM), подкаченным 5-ваттным аргоновым ионным лазером (Spectra Physics, 164). Диапазон настройки был равен 610-690 нм. Цветной лазер был настроен при 632 нм, как для PpIX, производного ALA, так и фотофрина^®, настройку контролировали с помощью монохроматора. Лазерный пучок дефокусировали с помощью микроскопического окуляра. Свет подавали со скоростью потока 150 мВт/см² в течение 15 минут. Скорость потока света на участок с опухолью регулярно контролировали откалиброванной интегрирующей сферой с фотодиодом, соединенным с ручным мультиметром (Keithby Instruments, Германия), перед и сразу же после облучения светом.

Эффективность PDT при использовании одной ALA или одного фотофрина^® или комбинации ALA с фотофрином^®

Мышей с опухолями соответствующего размера разделили на 5 групп (по меньшей мере по 3 животных в каждой группе): группа 1 (контроль), мышам не вводили ни ALA, ни фотофрин^®, их не облучали светом, только внутрибрюшинно ввели по 0,1 мл физиологического раствора; группа 2 (контроль, только на свет), опухоли облучали в тех же дозах, что и в группах мышей, получавших лечение PDT; группа 3 (одна ALA), мышам внутрибрюшинно ввели ALA в дозе 250 мг/кг массы тела с последующим через 3 часа воздействием света, как описано выше; группа 4 (один фотофрин^®), мышам внутривенно ввели фотофрин^® в дозе 1 мг/кг массы с последующим через 3 часа облучением светом; группа 5 (ALA и фотофрин^®), мышам ввели внутрибрюшинно ALA в дозе 250 мг/кг и внутривенно 1 мг/кг фотофрина, опухоли были подвергнуты воздействию светом через 3 часа для обоих ALA и фотофрина^®. Ответные реакции опухолей после лечения оценивали по времени регрессии/возобновления роста опухоли. Размер опухолей определяли каждый день и, когда подвергшиеся лечению опухоли достигли объема, в 5 раз превышающего объем на день перед облучением светом, мышей убили. Данные по измерению объемов опухолей в каждой группе объединили для построения усредненных кривых роста опухолей.

Результаты

Рост опухолей, подвергнутых воздействию света через 3 часа после внутрибрюшинного введения ALA или внутривенного введения фотофрина^® одних и обоих ALA и фотофрина^®, представлен на фиг. 1. Контрольные опухоли (ни препарата, ни света) росли экспоненциально с увеличением вдвое примерно за 5 дней. Лазерный свет, которым облучали опухоли у мышей, получивших только ALA, имел эффект на рост опухолей. Эффект не наблюдали после PDT только с одним фотофрином^® в дозе 1 мг/кг, в дозе, которая не индуцирует какую-либо кожную фототоксичность (данные не показаны). PDT с комбинацией ALA (250 мг/кг) и фотофрина^® (1 мг/кг) тормозила рост опухолей более эффективно, чем PDT с использованием одной ALA (250 мг/кг).

Пример 3. PDT с использованием ALA+m-THPC

PDT проводили, в основном, как описано в примере 2, при использовании следующих групп животных с по меньшей мере 3 животными в группе: группа 1 (контроль), мыши не получали ни ALA (m-THPC), ни свет, только внутрибрюшинно ввели по 0,1 мл физиологического раствора; группа 2 (только свет), опухоли облучали светом в тех же дозах, что использовали для тех групп, где проводили лечение PDT; группа 3 (одна ALA), мышам внутрибрюшинно ввели ALA в дозе 250 мг/кг массы с последующим через 3 часа воздействием света (632 нм), как описано ранее; группа 4 (один m-THPC), мышам внутривенно ввели m-ТНРС в дозе 75 мкг/кг массы тела (доза, при которой не индуцируется кожная фототоксичность) с последующим через 3 часа облучением светом (652 нм); группа 5 (ALA и m-THPC), мышам ввели внутрибрюшинно ALA в дозе 250 мг/кг и внутривенно m-ТНРС в дозе 75 мкг/кг, опухоли подвергли воздействию света (при соответствующих длинах волн) через 3 часа для обоих ALA и m-THPC. Ответные реакции леченых опухолей оценивали, как описано ранее.

Результаты

На фиг. 2 показано, что контрольные опухоли (ни препарат, ни свет) росли экспоненциально с увеличением вдвое примерно за 5 дней. Лазерный свет, которым облучали опухоли мышей, получавших только ALA, оказал эффект на рост опухолей, но эффекта на наблюдали после проведения PDT с m-THPC в дозе 75 мкг/кг. PDT с комбинацией ALA (250 мг/кг) и m-THPC (75 мкг/кг) синергически усиливала тормозящее действие на рост опухолей.

Пример 4. Распределение ALA и фотофрина^®

Методы

Человечью папиллярную ворсинчатую аденому прямой кишки от 2 пациентов с сильной дисплазией и наличием в анамнезе диареи в течение нескольких месяцев перед постановкой диагноза исследовали через 44 часа после внутривенного введения фотофрина^® в дозе 2 мг/кг массы тела или через 4,5 часа после назначения ALA в дозе 60 мг/кг через рот. Пробы были немедленно погружены в жидкий азот, затем помещены в среду (Tissue TeK II embedding compound; BDH, Poole, Великобритания). Замороженные кусочки ткани резали криостатом до толщины 8 мкм и помещали на чистые предметные стекла. Под флуоресцентным микроскопом оценивали расположение флуоресценции PpIX, индуцированного ALA и фотофрина^®. Флуоресцентную микроскопию проводили на микроскопе Axioplan (Zeiss, Германия). Комбинация фильтров включала фильтр возбуждения 390-440 нм, расщепитель луча 460 нм и фильтр эмиссии >> 600 нм. Изображение флуоресценции записывали камерой CCD (Astromed CCD 3200, Кэмбридж, Великобритания) и преобразующим изображение устройством (Astromed/Visilog, PC 486DX2 66 MHz VL).

Результаты

Результаты по локализации фотофрина^® (А) и ALA (В) представлены на фиг. 3. Аденома (А) была от мужчины в возрасте 75 лет и (В) от женщины в возрасте 87 лет. Флуоресценция фотофрина^®, в основном, распределялась в строме опухолевой ткани, в то время как флуоресценция порфиринов, индуцированных ALA, почти полностью локализовалась в опухолевых клетках.

Пример 5. Материал и методы

Химические реактивы

5-ALA, метиловый эфир 5-ALA и бутиловый эфир 5-ALA были производства Norsk Hydro Research Center, Porsgrunn, Норвегия.

5-ALA (ALA) и метиловый эфир ALA (ME) растворили в изотоническом солевом растворе до конечной концентрации 0,375 мМ.

Бутиловый эфир ALA растворили в небольшом количестве этанола и затем разбавили изотоническим солевым раствором до конечной концентрации 0,375 мМ (конечная концентрация этанола составляла 1% объем/объем).

Фталоцианин алюминия дисульфонат (AlPcS_2a) (Porhyrin Products Inc.) растворили в нескольких каплях 1 М NaOH и разбавили забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS, 10 мМ Na-фосфат, рН 7,4/150 мМ NaCl) до конечной концентрации 0,25 мг/мл.

Фталоцианин алюминия тетрасульфонат (AlPcS₄) (Porhyrin Products Inc.) растворили в PBS до конечной концентрации 0,25 г/мл или до 1,25 мг/мл для эксперимента с высокой дозой в примере 5.3.

Фотофрин (PII) (Quadra Logic Technologies) растворили в 5% глюкозе на H₂O до конечной концентрации 0,25 мг/мл.

Хлорин е6 (е6) (Porhyrin Products Inc.) растворили в PBS до конечной концентрации 0,25 мг/мл.

ALA, метиловый эфир ALA или бутиловый эфир ALA вводили внутрибрюшинно (в/б), в то время как сенсибилизаторы - внутривенно (в/в).

Животные

Животных использовали как описано в примере 2.

Все животные получили одинаковое количество ALA (1,5 ммоль) либо в виде свободной кислоты, либо в виде эфира. Вследствие различий в молекулярной массе между ALA и эфирами животным ввели 250 мг/кг ALA, 278 мг/кг метилового эфира ALA и 338 мг/кг бутилового эфира ALA.

Эксперименты

Приготовили суспензии человечьей опухоли (карцинома толстого кишечника WiDr, выращиваемая серийной трансплантацией) из участков соответствующих опухолей без некроза и ввели (20 мкл) каждой мыши в правую переднюю конечность. Когда опухоли достигли диаметра 5-7 мм, каждой мыши ввели препараты и контроли, как описано в примерах 5.1.-5.5. Объем введения: 100 мкл на мышь (примерно с массой 25 г).

Облучение проводили через один час после введения препаратов вместо 3 часов, как использовали в предыдущих примерах. В противоположность предыдущим примерам, вместо лазера использовали лампу с широкой полосой, которая покрывала диапазон длин волн 600-700 нм (Curelight, заявка на патент, поданная PhotoCure AS). Это было вследствие того, что свет должен был покрывать комбинации фталоцианинов (максимум поглощения 670 нм) и протопорфирина IX (максимум поглощения 630 нм), индуцированного ALA или эфирами ALA соответственно.

Однако лампа дает свет с меньшей интенсивностью, чем лазер. Таким образом, комбинации ALA и фотофрина^®, которые были эффективны в предыдущих примерах, когда использовали лазер, не будут эффективными при использовании лампы. Это время облучения является оптимальным для получения сосудистого эффекта для большинства сенсибилизаторов и оптимальным для эфиров ALA, но субоптимальным для ALA.

Определяли средний объем опухолей в каждой группе (среднее значение ± стандартная ошибка) и строили график по отношению ко времени. Опыт закончили, когда объем опухолей достиг в 4-5 раз превышающего первоначальный объем.

Пример 5.1. ALA с хлорином е6

Мышей с опухолями соответствующего размера разделили на три группы по 4-5 мышей.

Группа 1: контроль (100 мкл физиологического раствора в/б).

Группа 2: 5-ALA 250 мг/кг (1,5 ммоль) в/б + хлорин е6 (1 мг/кг) в/в.

Группа 3: 5-ALA 250 мг/кг (1,5 ммоль) в/б.

Группа 4: хлорин е6 (1 мг/кг) в/в.

Через один час после введения препаратов мышей облучили, используя лампу Curelight с широкой полосой (161 мВт/см² в течение 15 минут - 144,9 Дж/см²).

Ответные реакции опухолей оценивали по времени регрессии/возобновления роста. Размер опухолей определяли через день и высчитывали объемы опухолей по формуле в примере 2. Мышей убили, когда объем опухоли достиг 5-кратного, по сравнению с первоначальным объемом. Для каждой временной точки рассчитывали среднее значение (и стандартную ошибку среднего значения) объема опухолей (n=4-5). Данные подвергли статистическому анализу (Q-тест/уровень достоверности 90%) и экстремальные значения были отброшены. В большинстве случаев значения стандартной ошибки были ≤1.

Результаты

Результаты представлены на фиг. 4. Для лучшего восприятия линии стандартных отклонений опустили. Из фигуры видно, что объем контрольных опухолей достиг превышающего первоначальный в 4 раза в течение 10 дней и что контрольные опухоли имели логарифмический рост. Кроме того, применение ALA и хлорина е6 по отдельности не имело эффекта в использованных дозах. Однако комбинация ALA и хлорина е6 значительно тормозила рост опухолей. Фактически, необходимо было 39 дней для опухоли, которая была обработана комбинацией, чтобы достичь 4-кратного первоначального объема.

Пример 5.2. Метиловый эфир ALA с AlPcS_2a

Мышей с опухолями соответствующего размера разделили на три группы по 4-5 мышей.

Группа 1: контроль (100 мкл физиологического раствора в/б).

Группа 2: AlPcS_2a (1 мг/кг) в/в.

Группа 3: метиловый эфир ALA (272 мг/кг) (1,5 ммоль) в/б.

Группа 4: метиловый эфир ALA (272 мг/кг) (1,5 ммоль) в/б + AlPcS_2a (1 мг/кг) в/в.

Мышей облучили через один час после введения и ответные реакции опухолей оценивали по времени регрессии/возобновления роста, как в примере 5.1.

Результаты

Результаты представлены на фиг. 5. Из фигуры можно видеть, что контрольные опухоли достигли объема, превышающего первоначальный в 4 раза за 10 суток, и что контрольные опухоли имели логарифмический рост. Метиловый эфир ALA не обладал противоопухолевым действием в использованной дозе, в то время как AlPcS_2a оказал слабый эффект. Удивительно, комбинация (метиловый эфир ALA+AlPcS_2a) привела к значительному действию. Фактически объем опухолей значительно не увеличивался в течение 40 дней после лечения.

Пример 5.3. Бутиловый эфир ALA с AlIPcS₄

Мышей с опухолями соответствующего размера разделили на пять групп по 4-5 мышей.

Группа 1: контроль (100 мкл 2 % этанола в/б).

Группа 2: бутиловый эфир 5-ALA 338 мг/кг (1,5 ммоль) в/б + Al PcS₄ (1 мг/кг) в/в.

Группа 3: AlPcS₄ (5 мг/кг) в/в.

Группа 4: AlPcS₄ (1 мг/кг) в/в.

Группа 5: бутиловый эфир 5-ALA 338 мг/кг (1,5 ммоль) в/б.

Этанол использовали в качестве контрольной обработки, поскольку лекарственная форма на основе бутилового эфира ALA содержала примерно 2% этанола. Через один час после введения мышей облучили и оценивали ответные реакции опухолей по времени регрессии/возобновления роста, как в примере 5.1.

Результаты

Результаты представлены на фиг. 6. Из фигуры можно видеть, что контрольные опухоли (2% этанол) и опухоли, которые обработали бутиловым эфиром ALA, достигли объема, превышающего первоначальный в 4 раза, соответственно через 9 и 11 дней. Также можно видеть, что контрольные опухоли имели логарифмический рост. Видно, что AlPcS₄ (1 мг/кг) имел средний эффект на рост опухолей. Однако опухоли, обработанные комбинацией бутилового эфира ALA и AlPcS₄, показали значительно более замедленный рост, почти идентичный тому, что получен с AlPcS₄ в высокой дозе (5 мг/кг). Однако, использование высокой дозы AlPcS₄ привело к развитию большого отека. При использовании комбинации противоопухолевый эффект был тем же, что и с AlPcS₄ в высокой дозе, в то время как первоначальный отек был заметно меньше.

Пример 5.4. Бутиловый эфир АLА с AlPcS_2a

Мышей с опухолями соответствующего размера разделили на три группы по 4-5 мышей.

Группа 1: контроль (100 мкл физиологического раствора в/б).

Группа 2: бутиловый эфир 5-ALA 338 мг/кг (1,5 ммоль) в/б + AlPcS_2a (1 мг/кг) в/в.

Группа 3: AlPcS_2a (1 мг/кг) в/в.

Группа 4: бутиловый эфир 5-ALA 338 мг/кг (1,5 ммоль) в/б.

Мышей облучили через один час после введения и ответные реакции опухолей оценивали по времени регрессии/возобновления роста, как в примере 5.1.

Результаты

Результаты представлены на фиг. 7. Из фигуры можно видеть, что контрольные опухоли достигли объема, превышающего первоначальный в 4 раза, через 10 дней и что опухоли имели логарифмический рост. Как было видно ранее, бутиловый эфир почти не имел эффекта в отношении опухолей, в то время как AlPcS_2a имел кратковременный эффект (4-кратный объем в течение 14 дней). Вновь комбинация значительно тормозила рост опухолей, приводя к медленному возобновлению роста. Видно (после экстраполяции), что 4-кратный первоначальный объем будет достигаться примерно через 30 дней.

Пример 5.5. Метиловый эфир АLА с AlPcS₄

Мышей с опухолями соответствующего размера разделили на три группы по 4-5 мышей:

Группа 1: контроль (100 мкл физиологического раствора в/б).

Группа 2: метиловый эфир 5-ALA 273 мг/кг (1,5 ммоль) в/б + AlPcS₄ (1 мг/кг) в/в.

Группа 3: метиловый эфир 5-ALA 273 мг/кг (1 ммоль) в/б.

Группа 4: AlPcS₄ (1 мг/кг) в/в.

Мышей облучили через один час после введения и ответные реакции опухолей оценивали по времени регрессии/возобновления роста, как в примере 5.1.

Результаты

Результаты представлены на фиг. 8. Из фигуры можно видеть, что контрольные опухоли достигли объема, превышающего первоначальный в 4 раза, за 10 дней и контрольные опухоли имели логарифмический рост. Как показано ранее, метиловый эфир не оказывал никакого эффекта на рост опухолей, в то время как AlPcS₄ имел промежуточный эффект. Поразительно, комбинация метилового эфира ALA+AlPcS₄ первоначально привела к значительному снижению объема опухолей с последующим медленным возобновлением роста. Фактически, это была единственная комбинация, которая действительно привела к первоначальной потере размеров опухолей. Опухоль достигла 4-кратного первоначального объема примерно за 35 дней.

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция, обладающая фотосенсенсибилизирующим действием и предназначенная для использования в фотохимиотерапии, включающая протопорфириновый предшественник фотохимиотерапевтического агента, выбранный из ALA, порфобилиногена, или их предшественников или производных и локализующийся в сосудистой строме фотосенсибилизатор, выбранный из гематопорфирина, или хлорина, или сульфированного фталоцианина, или их предшественников, или производных.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно включает по меньшей мере одно средство, способствующее проникновению через поверхность и/или один или более хелатирующих агентов.

3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что доза протопорфиринового предшественника фотохимиотерапевтического агента находится в пределах от 1 до 500 мг/кг массы тела и доза локализирующегося в сосудистой строме фотосенсибилизатора находится в пределах от 0,01 до 10 мг/кг массы тела.

4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3 для лечения заболеваний или аномалий наружных или внутренних поверхностей тела, которые реагируют на фотохимиотерапию.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, терапевтическая эффективность которой усиливается в сравнении с использованием одного фотохимиотерапевтического агента или одного фотосенсибилизатора.

6. Фармацевтическая композиция по п.4 или 5, в которой терапевтическая эффективность синергически повышается.

7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что включает локализующийся в сосудистой строме фотосенсибилизатор в субтерапевтической дозе.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что локализующийся в сосудистой строме агент является фотофрином^® m-ТНРС, хлорином е6, фталоцианином алюминия дисульфонатом, или фталоцианином алюминия тетрасульфонатом, или их предшественниками, или производными.

9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что предшественником протопорфирина является 5-аминолевулиновая кислота, или ее предшественник, или производное.

10. Фармацевтическая композиция по п.9, отличающаяся тем, что производным 5-аминолевулиновой кислоты является сложный эфир 5-аминолевулиновой кислоты.

11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что средством, способствующим проникновению через поверхность, является ДМСО.

12. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-11, отличающаяся тем, что включает 5-аминолевулиновую кислоту, или ее предшественник, или производное, фотофрин^®, ДМСО, ЭДТК и десферриоксамин.

13. Комбинированный препарат, включающий протопорфириновый предшественник фотохимиотерапевтического агента и локализующийся в сосудистой строме фотосенсибилизатор, предназначенный для одновременного, раздельного или последовательного лечения заболеваний или аномалий наружных или внутренних поверхностей тела, реагирующих на фотохимиотерапию.

14. Комбинированный препарат по п.13, отличающийся тем, что дополнительно содержит по меньшей мере одно средство, способствующее проникновению через поверхность и/или один или более хелатирующих агентов.

15. Комбинированный препарат по п.13 или 14, отличающийся тем, что доза протопорфиринового предшественника фотохимиотерапевтического агента находится в пределах от 1 до 500 мг/кг от веса тела и доза локализирующегося в сосудистой строме фотосенсибилизатора находится в пределах от 0,01 до 10 мг/кг массы тела.

16. Способ фотохимиотерапевтического лечения расстройств или аномалий наружных или внутренних поверхностей тела, включающий нанесение на пораженные поверхности фармацевтической композиции или комбинированного препарата по любому из пп.1-15 и воздействие на указанные поверхности светом, предпочтительно светом с диапазоном длин волн 350-900 нм.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что общая назначаемая доза локализирующегося в сосудистой строме фотосенсибилизатора находится в пределах от 0,01 до 10 мг/кг массы тела и для протопорфиринового предшественника фотохимиотерапевтического агента находится в пределах от 1 до 500 мг/кг массы тела.

18. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что фотохимиотерапию проводят облучением светом с диапазоном волн 350-900 нм.

19. Набор для применения в фотохимиотерапии нарушений или аномалий наружных или внутренних поверхностей тела, включающий первый контейнер, содержащий протопорфириновый предшественник фотохимиотерапевтического агента, как определено в любом из пп.1, 9 или 10; второй контейнер, содержащий локализующийся в сосудистой строме фотосенсибилизатор, как определено в п.1; и необязательно по меньшей мере одно средство, способствующее проникновению через поверхность, содержащееся в указанных первом или втором контейнере или в третьем контейнере, как определено в одном из п.1 или 11 и/или, один или более хелатирующих агентов, содержащихся в первом, втором, или третьем контейнере, или в четвертом контейнере, где указанный первый или второй контейнер могут отсутствовать, и агент или фотосенсибилизатор, как определено для первого или второго контейнера, присутствует в одном из других контейнеров, имеющихся в наборе.

20. Способ диагностики in vitro аномалий или нарушений наружных или внутренних поверхностей тела путем исследования пробы жидкости организма или ткани пациента, включающий по меньшей мере следующие стадии: смешение указанной жидкости организма или ткани с фармацевтической композицией, определенной в одном из пп.1-12, воздействие на указанную смесь светом, оценку уровня флуоресценции и сравнение уровня флуоресценции с контрольными уровнями.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8