Способ аттенуации вирусов

 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается способа аттенуации вирусов. Способ включает отбор кандидатов живых вирусных вакцин путем селекции вирусных вариантов, которые не связываются с препаратами мембранных рецепторов мозга, и заключается в смешивании вируса с количеством препарата мембранных рецепторов мозга, содержащего избыток мембранных рецепторов, центрифугировании указанной суспензии с образованием супернатанта, определении остаточной вирусной инфекционности в указанном супернатанте и выделении вирусных вариантов, которые не связываются с препаратом мембранных рецепторов. Преимущество изобретения заключается в повышении безопасности ослабленных вирусов. 6 з.п. ф-лы, 17 табл., 4 ил.

Область техники, к которой относится изобретение.

Настоящее изобретение относится большей частью к таким областям, как вирусология, иммунология и белковая химия. Точнее, настоящее изобретение относится к новому способу получения ослабленных вирусов.

Уровень техники Вакцинация является наилучшим способом для снижения смертности и заболеваемости человека, вызываемых инфекционными болезнями. Вакцины внесли значительный вклад в ликвидацию или предупреждение ряда основных инфекционных болезней в мире, таких как оспа, желтая лихорадка, полиомиелит и корь. В частности, живые ослабленные вакцины имели успех благодаря симуляции различных сил иммунного ответа хозяина. Эти живые вакцины являются природными вирусными вариантами, полученными с помощью пассирования вируса в атипичных хозяев, например вирус желтой лихорадки 17D в ткань цыпленка (Monath, 1990). Однако этот способ является эмпирическим, экономически неэффективным и требует длительного времени для создания пригодной для человека вакцины.

Вирус не может заражать восприимчивую клетку, если его вирусный белок прикрепления не соединяется на клеточной поверхности с молекулой, которая служит в качестве рецептора для данного вируса. Экспрессия рецептора на специфических клетках или тканях в целом хозяине является основным определяющим фактором внедрения вируса в хозяина, картины распределения вируса в хозяине и результирующего патогенеза (March and Helenius, 1989; Lentz, 1989; Dimmock and Primrose, 1995). Существует много факторов, определяющих сферу хозяина и тканевый тропизм вирусов, включая природу, количество и распределение рецепторных участков хозяйской клетки, которые могут быть мультивалентными и состоять из нескольких рецепторных единиц (Paulson, 1985; Mims, 1986).

Японский энцефалит (JE) является заболеванием, вызванным вирусом японского энцефалита, комариным флавивирусом, который является эпидемическим по всем Азиатским странам (Huang, 1982) и самым общим эпидемическим вирусом в мире. Вирус имеет тканевой тропизм для мозга, в особенности нейронов. Вирус японского энцефалита принадлежит к роду флавивирусов семейства Flaviviridae (Westaway et al., 1985). Геном вируса состоит из одной положительной смысловой одноцепочечной РНК, которая имеет 10986 нуклеотидов в цепи и содержит одну длинную открытую рамку считывания, которая кодирует три структурных белка у 5' конца (белки капсида (С), мембраны (М) и оболочки (Е)) и семь неструктурных белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5) у 3' конца. Вирус вызывает неврологическое заболевание со смертельным исходом до 50% и у до 70% оставшихся в живых могут развиться неврологические осложнения.

Для предотвращения заболевания терапии не существует. Следовательно, вакцины используются для борьбы с заболеванием (1). Попытки производства живых ослабленных вакцин оказались трудными вследствие нейротропизма вируса и потенциального возвращения вирулентности. В настоящее время мало известно о молекулярной основе ослабления и вирулентности вируса японского энцефалита.

Дикий тип вируса желтой лихорадки (YF), прототип члена рода Flavivirus, характеризуется тем, что вызывает гепатит и геморрагическую лихорадку (т.е. висцеротропное заболевание) и не вызывает нейротропное заболевание у человека и обезьяны. Желтая лихорадка предотвращается путем использования живых ослабленных вакцин, известных как 17D и FNV (французская нейротропная вакцина) (Barrett, 1997), которые проявляют различные степени нейротропизма у человека и обезьяны и не проявляют висцеротропизм.

Ослабленные FNV вирусы получают путем пассажа штамма дикого типа французского висцеротропного вируса (FVV) в мозг мыши (Mathis et al., 1928). Хотя FNV вирус был ослаблен в отношении висцеротропизма, было обнаружено, что он усиливает нейротропные свойства, включая летальность у обезьян после интрацеребральной инокуляции и высокую частоту поствакцинальных осложнений у детей в возрасте 11 лет (Durieux, 1956). В сравнении, 17D вакцина была ослаблена в отношении висцеротропизма и нейротропизма до такой степени, что 17D вирус редко убивал обезьян после интрацеребрального внесения и частота поствакцинальных осложнений была очень низкой, так что 17D вакцину можно с безопасностью давать детям в возрасте одного года. Более ослабленный фенотип 17D дает в результате 17D вирус, заменяющий FNV вирус в качестве вакцины, выбранной для предотвращения желтой лихорадки.

Предшествующий уровень техники является недостаточным из-за отсутствия эффективных средств создания ослабленных вирусов. Настоящее изобретение удовлетворяет назревшим требованиям и пожеланиям в данной области.

Сущность изобретения В настоящее время молекулярная основа ослабленности и вирулентности вируса японского энцефалита (JE) не полностью выяснена. Ослабленность и вирулентность проверяют с использованием двух систем: первая система включает процесс ослабления штамма дикого типа SA14 для получения живых ослабленных вакцин с помощью внесения в первичную клеточную культуру почки хомячка. Геном SA14 отличается от его четырех производных вакцин только по семи аминокислотам (Е-138, Е-176, Е-315, Е-439, NS2B-63, NS3-105 и NS4B-106). Вторая система включает анализ штамма дикого типа Р3, который является самым вирулентным штаммом, идентифицированным на сегодняшний день. Сравнение генома штамма Р3 с другими штаммами дикого типа дает возможность идентифицировать 16 уникальных аминокислот, включая 9 в белке оболочки (Е), вовлеченном в вирулентный фенотип штамма Р3. Проверка вариантов, устойчивых к связыванию с препаратами мембранных рецепторов мозга мыши, выделенных для получения этих вариантов, указывает на то, что Е-306 и Е-408 вовлекаются в связывание с рецептором. В общем, результаты исследований в настоящее время указывают на то, что Е белок является ключевой детерминантой ослабленного или вирулентного фенотипа вируса японского энцефалита.

Были отобраны три варианта штамма Р3 вируса японского энцефалита на устойчивость к связыванию с препаратами мембранных рецепторов (MRP) мозга мыши. Эти варианты (MRP^R) были в значительной степени ослаблены у мыши как в отношении нейроинвазивности (> 200 раз), так и в отношении нейровирулентности (> 1000 раз) по сравнению с их родительским вирусом. Все ослабленные варианты вируса MRP^R, полученные на основе MRP мозга мыши, воспроизводятся в сыворотке мыши либо после интрацеребральной (i. с.) либо внутрибрюшинной (i. p.) инокуляции, тогда как воспроизведение было определено в мозге мыши после интрацеребральной инокуляции. Мутации двух аминокислот были обнаружены в генах белка оболочки (Е) всех вариантов MRP^R, полученных на основе MRP мозга мыши, у остатков Е-306 и Е-408 белка Е по сравнению с P3 вирусом, выращенным в клетках С6-36 комара или очищенным и амплифицированным в Vero клетках почки обезьяны. Эти аминокислоты предположительно являются ответственными за ослабленность благодаря изменению в связывании вируса японского энцефалита с его клеточным рецептором в мозге мыши. Получение вариантов MRP^R вируса японского энцефалита на основе MRP мозга человека приводит к вирусам, которые являются ослабленными в 5000000 раз в отношении нейровирулентности мыши. Подобным образом, варианты MRP^R желтой лихорадки, полученные на основе MRP мозга обезьяны, были ослаблены в 8000 раз в отношении нейровирулентности мыши и варианты MRP^R вируса лангат, полученные на основе мозга мыши, были ослаблены вплоть до 16000 раз в отношении нейровирулентности мыши. Методология, разработанная в данном изобретении, используется в основном для достижения уменьшения вирулентности вирусов и для идентификации агентов, которые блокируют аминокислоты в вирусных белках прикрепления, которые взаимодействуют с клеточными рецепторами.

В одном варианте настоящего изобретения обеспечивается способ выбора кандидатов вирусных вакцин путем отбора вирусных вариантов, которые не связываются с препаратами мембранных рецепторов мозга, включающий стадии: (а) - приготовления препарата мембранных рецепторов мозга; (b) - смешивания количества представляющего интерес вируса с количеством вышеуказанного препарата мембранных рецепторов, содержащего избыток мембранных рецепторов; (с) - центрифугирования вышеуказанной суспензии с образованием супернатанта; (d) - определения остаточной вирусной инфекционности в вышеуказанном супернатанте; (е) - выделения индивидуальных вирусных вариантов, устойчивых к связыванию с препаратом мембранных рецепторов, которые используют в качестве кандидатов вирусных вакцин.

Иные и последующие аспекты, особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего описания предпочтительных вариантов изобретения, представленных с целью полного раскрытия сущности изобретения.

Краткое описание чертежей Для того чтобы сущность изобретения с перечисленными выше особенностями, достижениями и объектами изобретения, а также сопутствующие вопросы стали бы более ясными и понятными, дается более подробное описание изобретения, коротко охарактеризованного выше, с помощью отсылки к определенным его аспектам, которые иллюстрируются в прилагаемых чертежах. Эти чертежи являются частью описания изобретения. Следует заметить, однако, что прилагаемые чертежи иллюстрируют предпочтительные варианты изобретения и поэтому не должны рассматриваться как ограничивающие область притязания изобретения.

Фиг.1 показывает стадии пассажа вакцинных вирусов производных SA14.

Фиг. 2 показывает модель структуры эктодомена Е белка (модифицирована из 17 ссылки). Панель А: вид сверху, панель В: вид сбоку.

Фиг. 3 показывает модель растворимой части Е белка с соответствующими аминокислотами, "высвеченными" (модифицирована из Rey et al., 1995). Панель А: вид сверху, панель В: вид сбоку.

Фиг. 4 показывает модель растворимой части Е белка с соответствующими аминокислотами, "высвеченными" (модифицирована из Rey et al., 1995). Панель А: вид сверху, панель В: вид сбоку.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения В настоящем изобретении использовали высоко вирулентный флавивирус, вирус японского энцефалита, в качестве модельной системы для исследования взаимодействия вирусного белка прикрепления с клеточным рецептором. Была разработана новая методология, чтобы отобрать потенциальных кандидатов вирусной вакцины. В настоящем изобретении оценивается степень уменьшения у мыши нейровирулентности и нейроинвазивности вариантов MRPR, полученных на основе MRP мозга человека, и сравнивается генетическая мутация (мутации), которая может быть ответственна за уменьшение вирулентности JE вируса в отношении человеческого и мышиного мозга.

Одной из задач настоящего изобретения является выбор вариантов вируса японского энцефалита, которые не связываются с препаратами мембранных рецепторов мозга мыши (MRPR).

Другой задачей настоящего изобретения является оценка степени уменьшения нейровирулентности и нейроинвазивности у мыши MRPR вариантов.

Следующей задачей настоящего изобретения является анализ генетической мутации (мутаций), ответственной за уменьшение вирулентности MRPR вариантов. Идентификация аминокислот в вирусном белке прикрепления, который связывается с клеточным рецептором, представляет подходящий путь для приготовления живых ослабленных вакцин и для понимания молекулярной основы тропизма клетка/ткань вирусов.

Настоящее изобретение направлено на способ выбора кандидатов вирусной вакцины путем отбора вирусных вариантов, которые не связываются с препаратами мембранных рецепторов мозга, включающий: (а) - приготовление препарата мембранных рецепторов мозга; (b) - смешивание количества представляющего интерес вируса с количеством вышеуказанного препарата мембранных рецепторов, содержащего избыток мембранных рецепторов; (с) - центрифугирование вышеуказанной суспензии с образованием супернатанта; (d) - определение остаточной вирусной инфекционности в вышеуказанном супернатанте; (е) - выделение индивидуальных вирусных вариантов, устойчивых к связыванию с препаратом мембранных рецепторов, которые используют в качестве кандидатов вирусных вакцин. Предпочтительным является то, что мембраны мозга выбираются из группы, состоящей из мембран мозга мыши и мембран мозга человека. При условии приготовления по описанному здесь способу препарат мембранных рецепторов мозга имеет белковую концентрацию около 20-40 мг влажного мозга на мл. Предпочтительно для японского энцефалита остаточная вирусная инфекционность в супернатанте определяется с помощью инфицирования Vero клеточного монослоя и подсчета образованных колоний. Предпочтительно после изолирования колоний индивидуальных вариантов, устойчивых к связыванию с препаратом мембранных рецепторов, выделенных для получения этих вариантов, вирусы амплифицируют. Варианты, полученные описанным здесь способом, инкубируют со свежими препаратами мембранных рецепторов мозга и отсутствие связывания вариантов со свежими препаратами мембранных рецепторов мозга подтверждает, что варианты являются истинными вариантами. Наиболее предпочтительно, чтобы варианты были ослаблены в отношении нейроинвазивности и нейровирулентности. Хотя фактически любой вирус можно ослабить путем использования способов настоящего изобретения, но характерный вирус включает вирусы желтой лихорадки, денге-4 и лангат.

При наличии техники, описанной в настоящем описании, обычные специалисты в данной области могут сконструировать антивирусные соединения на основании идентификации аминокислот, обуславливающих участки для клеточного рецептора, в трехмерной структуре вирусного белка прикрепления, который связывается с рецептором.

При наличии техники, описанной в настоящем описании, обычный специалист в данной области способен создать последовательные мутации путем получения MRPR мутанта, используя одну ткань с последующим отбором, используя MRPR мутант из второй ткани. Подобным путем можно создать вариант, который будет ослаблен для множества тканей и он будет подходящим вариантом, т.к. некоторые вирусы вызывают заболевания в различных тканях.

Следующие примеры даны с целью иллюстрации различных вариантов изобретения, и они не должны рассматриваться как ограничивающие область притязания изобретения.

ПРИМЕР1 Молекулярные детерминанты вирулентности JE вируса Как и большинство вирусов, вирус японского энцефалита имеет вариации штамма. Штамм Р3 рассматривается как высоковирулентный штамм, в то время как штаммы JaOArS982 и Nakayama проявляют промежуточную вирулентность и штамм SA14 проявляет низкую вирулентность (ТАБЛИЦА I).

ПРИМЕР 2 Белок оболочки Е белок является основным структурным белком вируса и, как полагают, представляет вирусный белок прикрепления, т.е. вирусный белок, который взаимодействует с клеточным рецептором. Т.к. четыре из семи аминокислотных замен вакцины SA14 находятся в Е белке, уменьшение вирулентности может иметь место, частично, благодаря изменению клеточного тропизма вакцинных штаммов. Это подтверждается с помощью иммунногистохимических исследований, которые показывают, что очень незначительное количество нейронов мозга мыши содержат SA14-14-2 вирусный антиген и ни одного цитопатологического проявления не наблюдается после инфицирования родительским штаммом SA14 вируса дикого типа (9).

Изучение вариантов (MAbR), устойчивых к нейтрализации моноклональных антител к вирусу японского энцефалита, показывает, что мутации у Е-52+Е-364 4-Е-367 (10), или Е-270 или Е-333 (11) уменьшают нейроинвазивность у мыши, но не нейровирулентность. Исследование вариантов, устойчивых к нейтрализации моноклональных антител, на другие флавивирусы обнаруживает, что сниженная нейроинвазивность (но не нейровирулентность) соответствует Е-277 для вируса энцефалита долины Мюррея (12), Е-308 (эквивалент к Е-305 для вируса японского энцефалита) для вируса, вызывающего атерому (13) и Е-384 (эквивалент к Е-384 для вируса японского энцефалита) для вируса Центральноевропейского энцефалита (СЕ ТВЕ) (14). Два других исследования, включающие мутагенез вируса японского энцефалита, показывают, что Е-138 уменьшает нейровирулентность мыши и имеет замещение Glu на Lys, идентичное у Е-138 в SA14 серии вакцин (15, 16).

Для того чтобы продемонстрировать взаимодействие вируса японского энцефалита с мозгом мыши более подробно, приготовляют препараты мембранных рецепторов из мозга мыши, используя стандартную фармакологическую технику. Препараты мембранных рецепторов мозга мыши используют для того, чтобы получить варианты (MRPR), устойчивые к связыванию с препаратами мембранных рецепторов мозга мыши. Три варианта, устойчивые к связыванию с препаратами мембранных рецепторов мозга мыши, получают из штамма P3, которые не связываются со свежими MRP мозга мыши и являются ослабленными в отношении нейроинвазивности и нейровирулентности у мыши (ТАБЛИЦА II). Все три имеют одинаковые аминокислотные замены у Е-306 и Е-408. Оба остатка являются уникальными для штамма P3, и MRPR мутация приводит к возвращению к остаткам, найденным в других штаммах вируса японского энцефалита.

ПРИМЕР 3 Вирусы и клетки
Штаммы P3 вируса японского энцефалита дикого типа были предоставлены Dr. Robert Shope of Yale Arboviras Research Unit. Клетки почки обезьяны (Vero) и С6-36 клетки комара Аеdes albopictus выращивали при 37^oС и 28^oС соответственно в минимальной поддерживающей среде Игла (ЕМЕМ; Sigma), дополненной 10% термоинактивированной эмбриональной сывороткой теленка, 2 мМ L-глутамина (Sigma) и антибиотиками.

ПРИМЕР 4
Препарат мембранных рецепторов мозга мыши
Мышиные мозги собирают у 3-4-недельных самок мыши balb/C. Препараты мембранных рецепторов мозга (MRP) получают на основании способа, описанного для анализа связывания нейротрансмиттерного рецептора (Middlemiss and Frozard, 1983). Кратко, мозги быстро иссекают, взвешивают в гомогенизируют в трис буфере (50 мМ, рН 7,6). Гомогенат центрифугируют (35600 g в течение 10 минут), остаток ресуспендируют в таком же объеме трис буфера и этот процесс повторяют дважды. Между вторым и третьим центрифугированиями гомогенат инкубируют при 37^oС в течение 10 минут. Конечный остаток ресуспендируют в таком объеме трис буфера (50 мМ, рН 7,6), чтобы конечная концентрация белка была приблизительно 20-40 мг влажного мозга на мл и хранят при -70^oС.

ПРИМЕР 5
Получение вирусных вариантов (MRP^R) на основе уклонения от связывания с MRP мозга мыши
Перед использованием аликвоты замороженных препаратов мембранных рецепторов и вирус извлекают из холодильника с температурой -70^oС, быстро оттаивают и держат во льду (4^oС). 100 мкл аликвоты вируса добавляют к 900 мкл препарата мембранных рецепторов мозга, содержащего избыток мембранного рецептора (рецепторов), и перемешивают. Контрольные вирусные образцы получают таким же способом, но смешивают с 900 мкл трис буфера (50 мМ трис, рН 7,6) вместо препарата мембранных рецепторов. Образцы инкубируют при 37^oС в течение 30 минут при вращении. После инкубации суспензию вирус-препарат мембранных рецепторов и контрольные образцы вирус-трис буфер центрифугируют при 13000 об. мин в течение 10 минут для удаления мембранного материала и связанного вируса. Остаточную вирусную инфекционность в супернатанте определяют путем инфицирования Vero клеточного монослоя и подсчета колоний, образованных после 5 дней инкубации при 37^oС. Колонии индивидуальных MRP^R вариантов отбирают и амплифицируют в Vero клетках. Полученные вирусные варианты исследуют на связывание со свежими препаратами мембранных рецепторов. Отсутствие связывания вирусных вариантов со свежими препаратами мембранных рецепторов мозга мыши подтверждает, что они являются истинными MRP^R вариантами.

ПРИМЕР 6
Изучение патогенности у мыши
Аутбридинговых самок белой мыши NIH-Swiss в возрасте от 3 до 4 недель получают из Harlan, Indianapolis, IN. Мышам вносят либо 20 мкл вируса интрацеребральным способом (i.e.), либо 100 мкл вируса внутрибрюшинным способом (i. p. ). Изучение вирулентности проводят на 8 мышах на дозовую группу. Определяют величины LD₅₀ и среднее время продолжительности жизни (AST). Мышей, проверяемых на инфекционность, забивают на второй или седьмой день после i. e. или i. p. инокуляции и отбирают мозги и сыворотку для титрования на инфекционность с помощью анализа колоний.

ПРИМЕР 7
Изучение иммуногенности
Аутбридинговых самок белой мыши NIH-Swiss в возрасте от 3 до 4 недель получают из Harlan, Indianapolis, IN. Четырем мышам для каждого MRP^R варианта вносят 10³ pfu вируса внутрибрюшинным способом. Мышей забивают на 15-й день после инокуляции и собирают кровь с помощью кардиальной пункции. Фракцию сыворотки собирают и хранят при -20^oС. Анализ нейтрализации выполняют, как описано у Wills et al., (1992).

ПРИМЕР 8
Секвенирование и анализирование генома вирусных РНК
RT-PCR, клонирование и секвенирование вируса RNA описано ранее (Ni et al., 1994). Компьютерный анализ данных нуклеиновой кислоты и построение аминокислотных последовательностей выполняют с использованием MICROGENIE (Queen and Korn, 1984), PCGENE and Genetic Computer Group (Devereux et al., 1984).

ПРИМЕР 9
Создание и подтверждение MRP^R вариантов
Штамм Р3 вируса японского энцефалита, выращенный в С6-36 клетках (Р3/С6-36), смешивают и инкубируют с препаратами мембранных рецепторов (MRP) мозга мыши, мозга обезьяны или печени обезьяны при 37^oС в течение 30 минут; смесь центрифугируют и супернатант обрабатывают, как описано выше. Вирус Р3 японского энцефалита связывается с препаратами мембранных рецепторов мозга мыши и обезьяны, но не с MRP печени обезьяны (ТАБЛИЦА III). Р3/С6-36 вирус связывается с препаратами мембранных рецепторов мозга обезьяны полностью. Для отбора MRP^R вариантов, устойчивых к связыванию с препаратами мембранных рецепторов мозга мыши, Р3/С6-36 вирус смешивают с избытком препаратов мембранных рецепторов мозга мыши, что приводит к 10^3,6 раз снижению инфекционности (ТАБЛИЦА III). Три колонии Р3 вируса, которые избежали связывания с препаратами мембранных рецепторов мозга мыши, отбирают и амплифицируют в Vero клетках.

После изолирования колоний и амплификации в Vero клетках ни один из трех MRP^R вариантов вируса не связывается со свежими препаратами мембранных рецепторов мозга мыши (ТАБЛИЦА IV), что подтверждает тот факт, что они являются истинными MRP^R вариантами. Параллельно, Р3/С6-36 вирус, используемый для получения MRP^R вариантов, изолируют и амплифицируют в Vero клетках (Р3/Vero) для определения действия пассажа в Vero клетки на фенотип Р3 вируса. Этот Р3/Vero вирус связывается с препаратами мембранных рецепторов мозга мыши со связывающим эффектом, аналогичным для Р3/С6-36 вируса (ТАБЛИЦА IV).

ПРИМЕР 10
Патогенность штаммов P3 вируса JE дикого типа и его вариантов
Группам аутбридинговых HIS-Swiss мышей вводят интрацеребрально или внутрибрюшинно либо родительский P3/С6-36 вирус, либо P3/Vero вирус или один из MRP^R вариантов. Определяют величины pfu/LD₅₀ и AST±SEM. Сравнение родительского P3/С6-36 и P3/Vero вирусов показывает, что изолирование колоний и амплификация в Vero клетках оказывает небольшое действие на вирулентность P3 вируса на основании показаний LD₅₀ после интрацеребрального или внутрибрюшинного введения (ТАБЛИЦА V), хотя P3/Vero вирус был несколько менее вирулентным, чем P3/С6-36 вирус. В сравнении, все три MRP^R варианта, полученные на основе MRP мозга мыши, являются ослабленными, по крайней мере, в 200 раз по сравнению с родительским P3 вирусом после внутрибрюшинной инокуляции (т. е. нейроинвазивность) (ТАБЛИЦА V). Хотя все три MRP^R варианта, полученные на основе MRP мозга мыши, в значительной степени ослаблены в отношении нейровирулентности (по крайней мере, в 500 раз) по сравнению с их родительскими вирусами после интрацеребральной инокуляции у мыши (ТАБЛИЦА II). Средняя продолжительность жизни мыши, инфицированной MRP^R вариантами, полученными на основе MRP мозга мыши, была длиннее, чем продолжительность жизни у мыши, инфицированной P3 вирусом (ТАБЛИЦА V).

ПРИМЕР 11
Определение инфекционности MRP^R вариантов после интрацеребральной и внутрибрюшинной инокуляции
Для того чтобы определить могут ли MRP^R варианты реплицироваться в крови и мозге мыши, мышей забивают на второй и седьмой день после интрацеребральной инокуляции 1 единицы pfu вируса или после внутрибрюшинной инокуляции 1000 единиц pfu вируса. Все три MRP^R варианта, полученные на основе MRP мозга мыши, реплицируются в инфицированных мышах (ТАБЛИЦА VI). Инфекционность MRP^R вариантов в мозге и сыворотке ниже, чем инфекционность их родительского вируса, на второй день после интрацеребральной инокуляции. Однако все мыши, в которые внесены родительские P3 вирусы интрацеребральным путем, погибли на седьмой день после внесения. Инфекционность MRP^R вариантов значительно ниже, чем инфекционность родительского вируса в сыворотке на второй и седьмой день после внесения.

ПРИМЕР 12
Иммуногенность MRP^R вариантов
Все мыши NIH-Swiss, которым вносили MRP^R варианты, полученные на основе MRP мозга мыши, индуцируют нейтрализующие антитела у всех инфицированных мышей на 15-й день после внутрибрюшинной инокуляции (ТАБЛИЦА VII).

ПРИМЕР 13
Сравнение изменений нуклеотидной и аминокислотной последовательностей MRP^R вариантов, подученных на основе MRP мозга мыши и человека, с родительскими P3 вирусами дикого типа и изолированными из колоний и амплифицированными в Vеrо клетках P3 вирусами
Для исследования генетических различий, а также домена прикрепления к рецепторам родительского P3 вируса и его MRP^R вариантов клонируют и секвенируют гены P3 вирусов и MRP^R вариантов, кодирующие белки премембраны (рrМ), мембраны (М) и оболочки (Е). P3/Vero вирус имеет 13 нуклеотидных отличий по сравнению с P3/С6-36 вирусом в генах белков премембраны, мембраны и оболочки, приводящих к заменам 5 аминокислот в положениях Е-46, Е-129, Е-209, Е-351 и Е-387 (ТАБЛИЦА VIII), которые могут быть ответственны за снижение вирулентности P3/Vero вируса по сравнению с P3/С6-36 вирусом. Эти замены в аминокислотном составе не могут рассматриваться как ответственные за ослабление MRP^R вариантов вируса.

Три MRP^R варианта, полученные на основе MRP мозга мыши, имеют идентичную нуклеотидную последовательность в генах белков премембраны, мембраны и оболочки. Они по 23 нуклеотидам отличаются от P3/С6-36 вируса и по 20 нуклеотидам отличаются от P3/Vero вируса. Однако эти MRP^R варианты, полученные на основе MRP мозга мыши, имеют только два отличия в аминокислотном составе от состава родительского P3/С6-36 вируса и P3/Vero вируса у остатков Е-306 (G-->E) и Е-408 (L-->S) (ТАБЛИЦА VIII).

ПРИМЕР 14
Анализ вторичных структур Е белка
Анализируют вторичную структуру Е белка родительского вируса и MRP^R вариантов в области около Е-306 и Е-408 с помощью Novotny и GGBSM программ в PCGENE. Программа Novotny обнаружила, что профиль заряженных остатков, альфа-спиральная область, бета-складчатый слой и область обратного поворота изменяются, когда Е-306 остаток глицина заменяется на остаток глутаминовой кислоты, а профиль гидрофобности, альфа-спиральная область, бета-складчатый слой и область обратного поворота изменяются, когда Е-408 остаток лейцина заменяется на остаток серина. Программа GGBSM указывает, что спираль, ее распространение и профиль изменяются, когда происходит замена остатков либо Е-306 (G<-->E), либо Е-408 (L<-->S).

Связывание вируса с рецепторами поверхности клетки хозяина является первой стадией в цикле вирусной репликации и непосредственно включается в тканевой тропизм и патогенез многих вирусов (Fields and Greene, 1982). Несмотря на их значение, идентичность и функции рецепторы клетки хозяина известны и широко признаны лишь для малого количества клеточных рецепторов вирусов. Для флавивирусов клеточные рецепторы не идентифицированы, хотя предполагается, что Е белок флавивирусов играет роль в клеточном тропизме, будучи включенным в связывание вируса с клеточным рецептором. Недавно, Chen et al. , экспрессировал Е белок вируса денге-2, который связывается с Vero, CHO, эндотелиальными и глиальными клетками. Рекомбинантный Е белок тормозит инфицирование Vero клеток вирусом денге.

Исследование in vivo клеточных рецепторов для вирусов представляется сложным вследствие проведения манипуляций с животными тканями и неспособности достаточно очистить вирус для того, чтобы выполнить физический анализ связывания. Настоящее изобретение описывает способ отбора вариантов, которые могут быть получены с помощью выбора вирусов, связывающихся с препаратами мембранных рецепторов (MRP) (ТАБЛИЦЫ II и III). В качестве модели изучают связывание вируса японского энцефалита с MRP мозга мыши. Специфичность этого способа демонстрируется с помощью неспособности вируса японского энцефалита связываться с MRP печени обезьян (ТАБЛИЦА III), и получение вариантов доказывается с помощью неспособности вариантов, полученных на основе MRP мозга мыши, связывать свежие MRP мозга мыши (ТАБЛИЦА III). Все три MRP^R варианта, полученные на основе MRP мозга мыши, являются в значительной степени ослабленными в отношении нейроинвазивности и нейровирулентности по сравнению с их родительским P3 вирусом дикого типа (ТАБЛИЦА IV). Предполагают, что выбор MRP^R вариантов можно использовать как новый способ для получения кандидатов вакцин.

Уменьшение нейровирулентности MRP^R вариантов, полученных на основе MRP мозга мыши, P3 штамма вируса японского энцефалита может происходить после отбора вариантов в вирусном препарате, который имел мутации в домене прикрепления вируса к рецепторам, которым в случае флавивирусов является Е белок. Подобные варианты могут изменять тканевой тропизм. Только две общие аминокислотные замены идентифицируют у остатков Е-306 и Е-408 (ТАБЛИЦА VIII). Эти две замены в значительной степени изменяют вторичную структуру Е-белка. Таким образом, эти две аминокислоты играют критическую роль в ослаблении MRP^R вариантов, полученных на основе MRP мозга мыши.

Вовлечение Е-306 в ослабление фенотипа находится в соответствии с предварительными исследованиями по флавивирусам и подтверждает использование MRP для создания ослабленных вирусных вариантов. Было сообщено о четырех других ослабленных производных вируса японского энцефалита дикого типа. Две группы исследователей сообщили о вариантах (МАb^R), устойчивых к нейтрализации моноклональных антител, которые имеют мутации у Е-270 и Е-333 или Е-52, Е-363 и Е-366. Все эти варианты снижают нейроинвазивность у мыши, но не нейровирулентность у мыши. В сравнении с этим серия живых вакцин, полученных из SA14 вируса, имеет четыре замены в Е белке у положений Е-138, Е-176, Е-315 и Е-435. Эта вакцины являются ослабленными в отношении нейровирулентности у мыши и нейроинвазивности у человека. Symiyoshi et al. (15) предполагает, что мутация у Е-138 является главной детерминантой уменьшения нейровирулентности у мыши.

Картирование аминокислотных замещений в вышеупомянутых мутантах и MRP^R вариантах мыши настоящего изобретения на предполагаемой модели трехмерной структуры Е белка вируса клещевого энцефалита (ТВЕ) (Rey et al., 1995), флавивируса, родственного вирусу японского энцефалита, обнаруживает, что многие из мутантов группируются в кластеры по домену Ш Е белка, что предполагает важность домена Ш в проявлении вирулентности у мыши, вероятно в качестве домена прикрепления вируса к клеточным рецепторам мыши. Эти данные находятся в соответствии с предположением Rey et al., (1995) и подтверждаются исследованиями по другим флавивирусам, которые показывают, что MRP^R варианты к вирусу, вызывающему атерому, (Е-308, Е-310 и Е-311; Jiang et al., 1993; Gao et al., 1994), ТВЕ вирусу (Е-387) и вирусу денге (Е-383, Е-384 и Е-385; Hiramatsu et al. , 1996; E-390, Sanchez et al., 1996) являются все ослабленными в отношении нейровирулентности мыши, и эти мутации картируют к домену III Е белка.

Замена аминокислоты у остатка Е-408 MRP вариантов расположена в "стебельковой" области Е белка флавивируса, которая связывает эктодомен с мембранной якорной областью. Как было недавно предположено, трансмембранная альфа-спиральная "стебельковая" область является важным элементом для олигеномной перегруппировки Е белка, вызванной низким рН. Замена у Е-408 изменяет альфа-спираль и вызванное вирусом слияние мембран.

ТАБЛИЦА II показывает, что нейроинвазивность MRP^R вариантов, полученных на основе MRP мозга мыши, уменьшается больше, чем нейровирулентность по сравнению с их родителями. Тот факт, что MRP^R варианты обнаруживают в сыворотках, а не
в мозге на второй и седьмой день после инокуляции внутрибрюшинным способом (ТАБЛИЦА IV), указывает на то, что P3 варианты вируса могут реплицироваться в кровеносных сосудах, но они с трудом проникают через барьер кровь-мозг.

Настоящее изобретение демонстрирует, что MRP^R варианты, полученные на основе MRP мозга мыши, вируса японского энцефалита можно легко изолировать in vitro от родительского вируса, внесенного в присутствии избыточного количества MRP. Отобранные MRP^R вирусные варианты имеют ослабленный фенотип у мыши. Настоящее изобретение предполагает, что отбор MRP^R вариантов из ткани-мишени для вируса является одним из убедительных способов создания ослабленных вирусных штаммов и что возможно получить ослабленные варианты со множественными мутациями, используя MRP последовательно из различных тканей. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает новый способ, позволяющий относительно дешево и быстро отбирать кандидатов вирусных вакцин.

ТАБЛИЦА Х показывает, что методология настоящего изобретения не ограничивается получением MRP мозга мыши. Используют также МRР мозга человека, чтобы получить MRP^R, ослабленные в 5000000000 раз в отношении нейровирулентности мыши. Кроме того, методология настоящего изобретения не ограничивается вирусом японского энцефалита (ТАБЛИЦА IX). MRP^R варианты вируса желтой лихорадки, полученные на основе MRP мозга обезьяны, являются ослабленными в отношении нейровирулентности мыши после интрацеребрального внесения отъемышу мыши и MRP^R варианты вируса лангат, полученные на основе MRP мозга мыши и человека, являются ослабленными в отношении нейровирулентности мыши после интрацеребрального внесения отъемышу мыши.

ПРИМЕР 15
Получение вариантов вируса, "уклоняющегося" от связывания с препаратами мембранных рецепторов мозга человека и печени человека
Отбирают мозг у 74-летней женщины, которая умерла в результате сердечного приступа, и печень 76-летнего мужчины, который умер от рака легкого. Препараты мембранных рецепторов (MRP) получают на основе метода, описанного для анализа связывания рецептора трансмиттера (Middlemiss and Frozard, 1983), но конечный MRP ресуспендируют в минимальной необходимой среде Игла (Sigma), содержащей 2% сыворотки эмбриона теленка и антибиотики. Шесть вариантов, полученных на основе MRP мозга человека, отбирают после того, как штамм P3 родительского JE вируса дикого типа инкубируют с MRP мозга человека, полученными либо из серого, либо из белого вещества. Титрование инфекционности JE вируса выполняют в Vero клетках.

ПРИМЕР 16
Сравнение индекса связывания рецептора между вирусами JE дикого типа и вакцинными вирусами.

Для того чтобы определить специфичность взаимодействия JE вируса с MRP, штамм P3 вируса дикого типа размножают в С6-36 клетках комара (P3/С6-36) и живой ослабленный вакцинный штамм SA14-14-2 вируса также размножают в С6-36 клетках комара, (SA14-14-2/C6-36) (Yu et al, 1981), смешивают и инкубируют либо с MRP мозга мыши или мозга человека либо с MRP печени человека или PBS в течение 30 минут при 37^oС. Смесь вируса и MRP центрифугируют, затем вирус, который остается в супернатанте, образует колонии в Vero клетках. JE P3 вирус связывается с MRP мозга мыши (MB), MRP серого вещества мозга человека (HBG) и MRP белого вещества мозга человека (HBW) с подобными индексами связывания (от 3,3 до 4,0), но не с MRP печени человека (индекс связывания 0,3). Живой ослабленный вакцинный штамм SA14-14-2 вируса JE плохо связывается с MRP серого (HBG) и белого вещества мозга (HBW) человека (индекс связывания 0,7 и 0,8 соответственно) (ТАБЛИЦА XI). Таким образом, полученные результаты находятся в соответствии с тканевым тропизмом JE вируса дикого типа (т.е. нейротропизм JE вируса) и ослабленным фенотипом вакцинного штамма SA14-14-2.

ПРИМЕР 17
Получение вариантов вируса, "уклоняющегося" от связывания с MRP мозга человека
Для отбора MRP^R вариантов, полученных на основе MRP мозга человека, вирус P3/С6-36, который не связывается ни с MRP серого вещества мозга (HBG), ни с MRP белого вещества мозга (HBW), изолируют из колоний и амплифицируют в Vero клетках. Шесть MRP^R вариантов вируса JE P3, полученных на основе MRP мозга человека, отбирают на основании отсутствия связывания со свежими MRP мозга человека и тем самым подтверждают, что они являются истинными MRP^R вариантами. Три MRP^R варианта получают путем инкубации вируса с MRP серого вещества мозга и называют HBG MRP^R I, II и III соответственно. Другие три варианта получают путем отбора MRP^R, полученных на основе MRP белого вещества мозга, и называют HBW MRP^R I, II и III соответственно. Ни один из шести MRP^R вариантов, полученных на основе MRP мозга человека, не связывается с MRP серого вещества мозга человека, белого вещества мозга человека и мозга мыши.

ПРИМЕР 18
Вирулентность мыши штамма P3 вируса JE дикого типа и его MRP^R вариантов, полученных на основе MRP мозга человека
Группе аутбридинговых мышей NIH-Swiss вносят интрацеребральным или внутрибрюшинным путем родительский P3 вирус либо один из MRP^R вариантов, полученных на основе MRP мозга человека. Все шесть MRP^R вариантов, полученных на основе MRP мозга человека, являются ослабленными для мыши (ТАБЛИЦА XII). По сравнению с родительским JE P3 вирусом дикого типа, который переносят в Vero клетки (P3/Vero вирус), все тестируемые MRP^R варианты, полученные на основе MRP мозга человека, являются ослабленными, по крайней мере, в 200 раз после внутрибрюшинного внесения (т.е. нейроинвазивность) и являются ослабленными, по крайней мере, в 25 миллионов раз по сравнению с их родителем в отношении нейровирулентности после интерацеребрального внесения мыши. Интересно, что MRP^R варианты, полученные на основе MRP мозга человека, являются, по крайней мере, в 10000 раз более ослабленными в отношении нейровирулентности, чем MRP^R варианты, полученные на основе MRP мозга мыши.

ПРИМЕР 19
Иммуногенность у мыши MRP^R вариантов вируса, полученных на основе MRP мозга человека
У мышей, которым вносили 10000 единиц pfu либо HBG MRP^R I либо HBW MRP^R I вариантов, продуцируются нейтрализующие антитела во всех иммунизированных мышах на 15-й день после внутрибрюшинной инокуляции (ТАБЛИЦА XIII). Мыши, иммунизированные посредством 10000 единиц pfu MRP^R I варианта вируса, полученного на основе MRP серого вещества мозга человека, либо посредством 1(ЦМУ) единиц pfu MRP^R I варианта вируса, полученного на основе MRP белого вещества мозга человека, были защищены от контрольного заражения родительским P3 вирусом дикого типа. Однако мыши оказались незащищенными от заражения родительским P3 вирусом дикого типа, когда их иммунизируют посредством внутрибрюшинной инокуляции 1000 единиц pfu этих MRP^R вариантов (ТАБЛИЦА XIV). Эта данные указывают на то, что MRP^R варианты, полученные на основе MRP мозга человека, являются менее иммуногенными, чем MRP^R варианты, полученные на основе MRP мозга мыши, которые защищают мышей после иммунизации посредством внутрибрюшинной инокуляции 1000 единиц pfu вируса.

ПРИМЕР 20
Сравнение изменений в нуклеотидной и аминокислотной последовательности MRP^R вариантов родительского P3 вируса дикого типа, полученных на основе MRP серого вещества (HBG) и белого вещества (HBW) мозга человека
Гены Е белка родительских P3 вирусов и четыре MRP^R варианта, полученные на основе MRP мозга человека (HBG MRP^RI и II, HBW MRP^RI и II) амплифицируют с помощью RT-PCR, клонируют и секвенируют. HBG MRP^R I и II варианты имеют идентичные нуклеотидные последовательности, в то время как HBW MRP^R I и II варианты имеют одно молчащее нуклеотидное различие у нуклеотида 1199 (U/C). Существует 5/6 нуклеотидных различий между секвенированными HBG MRP^R и HBW MRP^R вариантами, что приводит к уникальным аминокислотным заменам у Е-488 и Е-329 соответственно (ТАБЛИЦА XV). Два HBG MRP^R варианта имеют 34 нуклеотидных различия по сравнению с P3/С6-36 вирусом в гене Е белка, что приводит к 10 аминокислотным заменам у остатков Е-46, Е-61, Е-76, Е-200, Е-351, Е-387, Е-408, Е-418, Е-475 и Е-488 (ТАБЛИЦА XV). Два HBW MRP^R варианта имеют 40/41 нуклеотидных различий по сравнению с P3/С6-36 вирусом, что приводит к 10 аминокислотным заменам у Е-46, Е-61, Е-76, Е-200, Е-329, Е-351, Е-387, Е-408, Е-418 и Е-475 (ТАБЛИЦА XV). Эти аминокислотные замены локализованы в доменах I, II, III и области, охватывающей "стебельковую" и якорную части Е белка (Rey et al., 1995).

Изолирование колоний родительского вируса P3/С6-36 из Vero клеток приводит к P3/Vero вирусу с 5 аминокислотными заменами по сравнению с P3/С6-36 вирусом, у Е-46, Е-129, Е-209, Е-351 и Е-387. Следовательно, HBG MRP^R варианты отличаются от P3/Vero вируса дикого типа по 8 остаткам у Е-46, Е-61, Е-76, Е-200, Е-408, Е-418, Е-475 и Е-488. Сходным образом HBW MRP^R варианты также отличаются от P3/Vero вируса дикого типа по 8 остаткам у Е-46, Е-61, Е-76, Е-200, Е-329, Е-408, Е-418 и Е-475.

ПРИМЕР 21
Интерпретация аминокислотных замен
Rey et al. (1995) сообщил о трехмерной структуре растворимой части Е белка вируса центральноевропейского клещевого энцефалита (ТВЕ). Было показано, что белок существует как димер, каждый мономер которого содержит три домена (I, II и Ш). Благодаря сохранению цистеинов между флавивирусами возможно смоделировать Е белок JE вируса на основе опубликованной модели структуры ТВЕ вируса. Фиг.3 показывает диаграммное представление растворимой части Е белка JE вируса с "высвеченными" аминокислотными заменами. Как можно видеть, аминокислотные заместители сгруппированы в четыре группы (Е-61 (домен I); Е-46, Е-76 и Е-200 (домен II) и Е-329 (домен III) соответственно). Мутации у Е-408, Е-418, Е-475 или Е-488 имеют место в области, охватывающей "стебельковую" и якорную части Е белка флавивируса и могут вызывать конформационные изменения в эктодомене Е белка. Замена у Е-46 пространственно расположена около Е-138 в предполагаемой трехмерной структуре Е белка JE вируса. Поэтому делается предположение, что мутация у Е-46, по крайней мере, частично, ответственна за ослабление фенотипа MRP^R вариантов вируса мозга человека.

ПРИМЕР 22
Взаимодействие нейротропной вакцины вируса французской желтой лихорадки (FNV) с мозгом обезьяны
Описанную выше методологию используют, чтобы исследовать взаимодействие FNV с мозгом обезьяны (МКВ). Специфичность связывания определяют с помощью сравнения штаммов дикого типа и вакцины вируса желтой лихорадки с другими флавивирусами, а именно штаммом P3 вируса японского энцефалита (JE) и новогвинейского С штамма (NGC) серотипа 2 вируса денге (DEN-2). Нейротропный P3 штамм JE вируса связывается с MRP мозга обезьяны, но не с MRP печени обезьян (MKL) (ТАБЛИЦА XVI), в то время как DEN-2 NGC штамм не связывается ни с MRP мозга обезьяны ни с MRP печени обезьяны. Штаммы Asibi и FVV вируса желтой лихорадки дикого типа связываются с MRP печени обезьяны, но плохо связываются с MRP мозга обезьяны, в то время как вакцинный штамм 17D-204 плохо связывается с MRP мозга обезьяны и печени обезьяны. Единственный штамм FNV вируса желтой лихорадки связывается с MRP мозга обезьяны. Интересным является тот факт, что 17D-204 вакцина вируса плохо связывается с MRP мозга обезьяны и печени обезьяны. Это обстоятельство может косвенно влиять на ослабление фенотипа 17D вируса.

ПРИМЕР 23
МRPR варианты нейтропной вакцины вируса французской желтой лихорадки
Четыре MRP^R варианта, полученные на основе MRP мозга обезьяны, создают для FNV "штамма" Yale (Wang et аl., (1995)), за исключением того, что MRP получают из мозга обезьян cynomolgus. Отбирают три MRP^R варианта в буфере при рН 7,6 и обозначают как МКВ MRP^R I, MKRP^R II и МКВ MRP^R III соответственно. Четвертый вариант отбирают в буфер при рН 6,0 и обозначают как МКВ MRP^R (рН 6,0). Два MRP^R варианта также выбирают из FNV-Yale после инкубации с MRP мозга мыши при рН 7,6 и обозначают их как MS MRP^R I и MRP^R II.

Как известно, FNV-Yale является высоко вирулентным вирусом для мыши после интрацеребральной инокуляции (Wang et al., 1995) и, как было обнаружено, имеет значение pfu/LDso, равное 0,08 для 4-х недельной самки мыши NIH-Swiss, в то время как MRP^R вариант вируса, полученный на основе MRP мозга обезьяны и отобранный при рН 7,6, является ослабленным, по крайней мере, в 400 раз (например, 32 pfu/LD₅₀ для МКВ MRP^R II) (ТАБЛИЦА XVII). МКВ MRP^R (рН 6,0) вариант вируса, полученный на основе MRP мозга обезьяны, является ослабленным в 87 раз по сравнению с родительским FNV-Yale вирусом и менее ослабленным, чем MRP^R вариант вируса, полученного на основе MRP мозга обезьяны и отобранного при рН 7,6. Два MS MRP^R варианта, полученные на основе MRP мозга мыши, являются также ослабленными в 100 раз или менее по сравнению с родительским FNV-Yale вирусом (ТАБЛИЦА XVII). Секвенирование генов белков премембраны (рrМ) и Е белка родительского вируса и MRP^R вариантов вируса обнаруживает, что каждый вариант имеет только одно изменение в нуклеотидном составе, приводящее к замене одной аминокислоты в Е белке по сравнению с родительским FNV-Yale вирусом. Никаких изменений не наблюдают в гене мембранного белка (М). МКВ MRP^R (рН 6,0) вариант, полученный на основе MRP мозга обезьяны, имеет одну аминокислотную замену у Е-458 (G-->R) и три МКВ MRP^R варианта, полученные на основе MRP мозга обезьяны, отобранные при рН 7,6, имеют каждый единственную замену аминокислоты у Е-260 (G-->A), E-274 (Y-->H) или Е-237 (H-->Y) для МКВ MRP^R I, МКВ MRP^R II и МКВ MRP^R III соответственно. Два варианта MS MRP^R, полученные на основе MRP мозга мыши, каждый имеют идентичную аминокислотную замену у Е-457 (М-->I).

ПРИМЕР 24
Аминокислотные замены в нейротропных вакцинах вируса французской желтой лихорадки
Предварительные исследования показали, что Е белок висцеротропного FVV вируса дикого типа отличается от четырех "штаммов" FNV вируса по трем общим аминокислотным заменам у Е-54, Е-227 и Е-249 (Wang et al., 1995). Фиг.4 показывает диаграммное представление трехмерной структуры растворимой части Е белка YF вируса на основании структуры ТВЕ вируса, сообщенной Rey et al. (1995), с аминокислотными заменами, найденными в FNV вирусах, которые "высвечены" (Е-54, Е-227 и Е-249). Единственные аминокислотные замены в Е белках МКВ MRP^R I, MKB MRP^R II и МКВ MRP^R III вариантов приводят к мутациям в домене II у Е-237, Е-260 и Е-274 соответственно, которые находятся около замещения у Е-249, найденного в FNV вакцинных вирусах, что предполагает, что эта область Е белка включается в связывание вируса с мозгом обезьян и может быть косвенно связана с увеличением нейротропизма у обезьян в отношении FNV вирусов. Замещение у Е-249 является уникальным для четырех "штаммов" FNV вакцинного вируса (Wang et al., 1995). Ни один из 17D вакцинных вирусов, секвенированных до сих пор (Ryman et al., 1997; Rice et al., 1985; Post et al, 1990; Dupuy et al., 1989) и 28 штаммов дикого типа (Chang et al., 1995; Wang et al., 1996; Wang et al., 1997) не имеют этого замещения.

Замены у Е-260, Е-274 или Е-237 МКВ MRI^R варианта, полученного на основе MRP мозга обезьяны и отобранного при рН 7,6, отличается от МКВ MRP^R варианта, полученного на основе MRP мозга обезьяны и отобранного при рН 6,0, который имеет аминокислотную замену у Е-458 в области, охватывающей "стебельковую" и якорную части. Делается предположение, что это замещение является следствием конформационного изменения в Е белке, которое имеет место благодаря уменьшению рН среды, и эти данные находятся в соответствии с данными для ТВЕ вируса (Stiasny et al., 1996). Также замена, обнаруженная в двух MS MRP^R вариантах YE FNV-Yale штамма, полученных на основе MRP мозга мыши и отобранных при рН 7,6, локализована у Е-457 в области, охватывающей "стебельковую" и якорную части Е белка. Предполагается, что взаимодействия Е белка FNV вируса со связывающими участками клеток мозга мыши и обезьяны различаются и этот факт может указывать на то, что FNV вирус распознает различные клеточные рецепторы на клетках мозга мыши и обезьяны. Это предположение находится в соответствии с биологическими исследованиями, которые показывают, что все штаммы вируса желтой лихорадки инфицируют мозг мыши после интрацеребральной (i.e.) инокуляции, в то время как только FNV инфицирует мозг обезьяны после интрацеребральной инокуляции (Freestone, 1995).

В описании приводятся следующие ссылки:
Anderson, R., et al. 1992. J. Gen. Virol. 73: 2155-2159.

Cao, J.X., et al. 1995. J. Gen. Virol. 76: 2757-2764.

Cecilia, D. & Gould. E. A. 1991. Virology 181: 70-77.

Chang, G. J., et al. 1995. J. Virol. 69: 5773-5780.

Chen, Y., et al. 1996. J. Virol. 70: 8765-8772.

Devereux J., et al. 1984. Nucl. Acid. Res. 12: 387-395.

Dupuy. A., et al. 1989. Nucleic Acids Res. 17: 3989-3994.

Fields. B.N. & Greene, M.I. 1982. Nature 300: 19-23.

Freestone, D.S. 1995. Yellow fever vaccines. Pp. 74.1-779. In Vaccines, second edit., eds: Plotkin, et al. W.В..Saunders, Philadelphia.

Gao, G.F., et al. 1994. J.Gen.Virol. 75, 609-614.

Guirakhoo. P., et al. 1991. J. Gen. Virol. 72: 1323-1329.

Heinz. F.X., et al. 1994. Arch. Virol. 9: 339-348.

Hiramatsu. К.. el al. 1996. Virology 224: 437-445.

Huang С.Н. 1982. Adv. Virol. Res. 27: 71-101.

Ikmura. Т. & Ohyama. A. 1988. J. Gen. Virol. 69: 1247-1254.

Jiang. W.R., et al. 1993. J. Gen. Virol. 74, 931-935.

Lentz. Т. L. 1990. J. Gen. Virol. 71: 751-766.

Middlemiss, D.N. 1983. Euro. J. Pharmacol. 90: 151-153.

Mims. C.A. 1986. J. Infect. 12: 199-203.

Monath, T. P. et al. 1989. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 40: 663-668.

Monath, Т. Р. 1990. Flavivirus. p. 763-814. In "Virology". B.N. Fields, D.M. Knipe, et al., eds. Raven press New York.

Ni, H., Bums, et al. 1994. J. Gen. Virol. 75: 1505-1510.

Olmsted, R.A., et al. 1984. Science 225: 424-426.

Paulson, J. C. 1985. Interaction of animal viruses with cell surface receptors. Vol. 2, p. 131-219. In: The receptors, Edited by Conn, P.M. Orlando: Academic Press.

Post. P.R., et al. 1990. Virus Res. 18: 291-302.

Rey, F.A., et al. 1995. Nature 375: 291-298.

Rice, C.M., et al. 1985. Science. 229: 726-733.

Ryman, К.D., et al. 1997. Virol. 230: 376-380.

Sanchez I.J., & Ruiz В. H. 1996: J. Gen. Virol. 77: 2541-2545.

Stiasny, K. et al., 1996. J. Virol. 70: 8141-8147.

Suniyoshi, H., et al. 1992. J. Virol. 66: 5425-5431.

Wang. E et al. 1995 J. Gen. Virol. 76-2749-2755.

Wang. E. еt аl. 1996. Virol. 115: 214-281.

Wang H. et al. 1997. J. Gen. Virol. 78: 1349-1352.

Westway. E.G. et al. 1985. Intervirology 24: 183-192.

Wills. M. R., et al. 1992. Vaccine 10: 861-872.

Yu, Y.X., et al. 1981. J Microbiol. Immunol. 1: 77-84.

Yu, Y.X., et al. 1988. Am. J.Trop. Med. Hyg. 39: 214-217.

В описании цитируются следующие публикации по номерам:
1. Tsai et al., Japanese encephalitis vaccines. In: Plotkin et al., eds. Vaccines. 2nd ed. Philadelphia: WB Sanuders. 1995: 671-713.

2. Ni et al., J Gen Virol 1996; 77: 1449-1455.

3. Eckels et al., Vaccine 1988; 6: 513-518.

4. Aihara et аl., Virus Genes 1991; 5: 95-109.

5. Nitayaphan et al. Virology 1990; 177: 541-552.

6. Ni et al., J Gen Virol 1994; 75: 1505-1510.

7. Ni et al., J Gen Virol 1995; 76: 409-4l3.

8. Chen et al. Am J Trap Med Hyg 1982; 31: 403407.

9. Hase et al., Arch Virol 1993; 130: 131-143.

10. Hasegawa et al. Virology 1992; 191: 158-165.

11. Cecilia et al. Virology 1991; 181: 70-77.

12. McMinn et al. Virology 1995; 211: 10-20.

13. Jiang et al. J Gen Virol 1993; 74: 931-935.

14. Holizmann et al. J Virol 1990; 64: 5156-5159.

15. Sumiyoshi et al. J Inf Dis 1995; 171: 1144-51.

16. Chen et al. Virology 1996; 223: 79-88.

17. Rey et al. Nature 1995; 375: 291-298.

18. Jan et al. J Gen Virol 1995; 76: 573-580.

19. Falgout et al., J Virol 1993; 67: 2034-2042.

20. Wallner et al., J Gen Virol 1996; 77: 1035-1042.

Любые из патентов и публикаций, упомянутых в этом описании, даны в расчете на уровень специалистов в области, к которой относится данное изобретение. Эти патенты и публикации цитируются в данном описании в их полноте в зависимости от специфичности и индивидуальности.

Специалисты в данной области легко оценивают, что настоящее изобретение подходит для выполнения задач и успешного получения результатов, которые также присущи изобретению. Настоящие примеры наряду со способами, процедурами, обработками, молекулами и специфическими соединениями, описанными в настоящем изобретении, представляют предпочтительные варианты, являются типичными и не рассматриваются как ограничивающие область притязания изобретения. Изменения и иные аспекты использования будут иметь место в настоящем описании в дополнение к тем достижениям в этой области, которые составляют смысл изобретения, как определено с помощью охвата формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Способ отбора кандидатов живых вирусных вакцин путем селекции вирусных вариантов, которые не связываются с препаратами мембранных рецепторов мозга, включающий в себя следующие стадии: (а) приготовление препарата мембранных рецепторов мозга; (b) смешивание количества представляющего интерес вируса с количеством указанного препарата мембранных рецепторов мозга, содержащего избыток мембранных рецепторов, с образованием суспензии, содержащей вирус и препарат мембранных рецепторов; (с) центрифугирование указанной суспензии с образованием супернатанта; (d) определение остаточной вирусной инфекционности в указанном супернатанте; и (е) выделение индивидуальных вирусных вариантов, которые не связываются с указанным препаратом мембранных рецепторов, где указанные вирусные варианты являются аттенуированными в отношении нейроинвазивности и нейровирулентности и используются в качестве кандидатов вирусных вакцин.

2. Способ по п.1, где указанный препарат мембранных рецепторов мозга выбран из группы, состоящей из препарата мембранных рецепторов мозга мыши и препарата мембранных рецепторов мозга человека.

3. Способ по п.1, где в указанном препарате мембранных рецепторов мозга концентрация белка составляет приблизительно 20-40 мг влажного мозга на мл.

4. Способ по п.1, где указанная остаточная вирусная инфекционность в указанном супернатанте определяется путем инфицирования монослоя клеток Vero и подсчета образующихся колоний.

5. Способ по п.4, где указанное выделение индивидуальных вирусных вариантов, которые не связываются с указанным препаратом мембранных рецепторов, производят путем амплификации из колоний, продуцируемых указанными вирусными вариантами.

6. Способ по п.1, где указанные полученные варианты инкубируют со свежими препаратами мембранных рецепторов мозга, и отсутствие связывания вариантов со свежими препаратами мембранных рецепторов мозга подтверждает тот факт, что варианты являются истинными вариантами.

7. Способ по п.1, где указанный вирус выбран из группы, состоящей из вируса желтой лихорадки, вируса японского энцефалита и вируса лангат.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 09.06.2007

Извещение опубликовано: 10.08.2010        БИ: 22/2010

---