Способ определения антигистоновой активности микроорганизмов

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения способности микроорганизмов к инактивации бактерицидных катионных белков. Способ осуществляют путем выращивания исследуемой культуры микроорганизмов в жидкой питательной среде. Отделяют культуральную жидкость, инкубируют ее с раствором гистонов. Готовят параллельно две контрольные пробы, инкубируют опытную и контрольные пробы, добавляют в пробы мясопептонный бульон и тест-культуру М. luteus ГИСК 211001, инкубируют и измеряют оптические плотности взвесей в опыте и контролях. Антигистоновую активность исследуемого микроорганизма рассчитывают по формуле ОД_ОП- оптическая плотность опытной пробы; ОД_К1 - оптическая плотность контроля 1; ОД_К2 - оптическая плотность контроля 2. Предлагаемый способ позволяет ускорить, упростить, повысить точность количественной оценки антигистоновой активности микроорганизмов, а также повысить чувствительность способа и тем самым определять антигистоновую активность у более широкого круга микроорганизмов. 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения способности микроорганизмов к инактивации бактерицидных катионных белков.

В настоящее время обнаружено, что некоторые патогенные микроорганизмы используют различные механизмы защиты от воздействия метаболитов внутри клетки эукариотического организма (человека, животного или свободноживущего простейшего) [1] . Обнаружено, что способность к выживанию внутри клетки может быть связана с инактивацией бактерицидного действия катионных белков, синтезируемых клеткой - лизоцима, лактоферрина и др. [2]. Оказалось, что некоторые микроорганизмы не ограничиваются локализацией в цитоплазме клетки хозяина, а проникают в ядро и могут там длительно сохраняться. Такая способность к внутриядерной персистенции была выявлена у бактерий - облигатных симбионтов простейших (Holospora obtusa и др.) [3]. Показано, что внутриядерное выживание микроорганизмов связано с антигистоновой активностью [4].

Известен чашечный способ определения антигистоновой активности микроорганизмов [5]. Способ заключается в том, что исследуемые штаммы бактерий засевают на поверхность плотной питательной среды, содержащей гистоны в определенной концентрации, и после инкубации в течение 20-24 ч выросшие культуры обрабатывают парами хлороформа в течение 20 мин. Затем на колонии исследуемых культур вторым слоем заливают 0,7% мясопептонный агар, содержащий взвесь тест-культуры Bacillus cereus и инкубируют в течение 16-24 ч. Антигистоновую активность бактерий определяют по наличию зоны роста тест-культуры над колонией исследуемого штамма. Количественную оценку антигистоновой активности исследуемой культуры производят по максимальной концентрации гистонов, которая инактивируется ею в питательной среде.

Однако указанный способ имеет ряд существенных недостатков. В известном способе инкубация гистонов с исследуемыми культурами осуществляется путем выращивания колоний микроорганизмов на поверхности твердой питательной среды, содержащей раствор гистонов. При этом колебания температуры и рН расплавленной питательной среды, в которую добавляется раствор гистонов, могут привести к денатурации и инактивации белка [6]. Кроме того, данный способ инкубации гистонов с исследуемыми культурами предполагает длительное время (20-24 ч), необходимое для роста микроорганизмов и инактивации гистонов. Известно, что предложенный способ предполагает применение гистонов в таких концентрациях, которые не встречаются в живых клетках (0,8-8 мг/мл) и в 1000-10000 раз превышают физиологическое содержание этих белков в клетках эукариот [7]. В связи с этим способность к инактивации гистонов определяется только по отношению к неестественно высокой концентрации белка, а более низкая экспрессия антигистоновой активности в известном способе фактически учитывается как ложноотрицательная, что снижает количество положительных результатов, а следовательно, чувствительность способа [8]. Также в способе-прототипе используется большой интервал количественной оценки антигистоновой активности (0,4 мг), что существенно снижает точность учета данных. Известно, что гистоны даже в низких концентрациях оказывают бактериостатическое действие на бактерии и значительно увеличивают длительность лаг-фазы роста [9] , что проявляется снижением скорости роста исследуемой культуры. Это явление приводит к тому, что наиболее чувствительные к гистонам штаммы слабо вырастают или вообще не вырастают на среде, содержащей гистоны в высокой концентрации. Иных способов определения антигистоновой активности неизвестно.

Заявляемый способ решает задачу ускорения, упрощения, повышения чувствительности и точности количественной оценки антигистоновой активности микроорганизмов.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе исследуемую культуру микроорганизма выращивают в жидкой питательной среде, обрабатывают хлороформом, отделяют культуральную жидкость, смешивают ее с раствором гистонов, параллельно готовят две контрольные пробы, при этом в контроль 1 вместо раствора гистонов добавляют изотонический раствор NaCl, а в контроль 2 вместо культуральной жидкости - жидкую питательную среду, опытную и контрольные пробы инкубируют, после инкубации во все пробы добавляют мясопептонный бульон и тест-культуру Micrococcus luteus ГИСК 211001, инкубируют, измеряют оптическую плотность взвесей в опыте и контролях, затем рассчитывают антигистоновую активность по формуле где ОД_ОП ^- оптическая плотность опытной пробы; ОД_K1 - оптическая плотность контроля 1; ОД_K2 - оптическая плотность контроля 2.

Новым в заявленном способе является то, что в качестве питательной среды используют жидкие питательные среды (мясопептонный бульон, рыбопептонный бульон и др.); контакт гистонов производят не с микроорганизмами, а с культуральной жидкостью, в которой содержатся метаболиты исследуемых микроорганизмов; инкубацию раствора гистонов с культуральной жидкостью исследуемых микроорганизмов производят в течение 60 мин;
учет результата производят путем измерения оптической плотности опытной и контрольных проб;
в качестве тест-культуры используют штамм М. luteus ГИСК 211001;
антигистоновую активность рассчитывают по формуле

где ОД_ОП- оптическая плотность опытной пробы;
ОД_К1 - оптическая плотность контроля 1;
ОД_К2 - оптическая плотность контроля 2.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что новый способ определения антигистоновой активности микроорганизмов позволяет за счет использования более чувствительной к гистонам тест-культуры увеличить чувствительность и точность количественной оценки антигистоновой активности микроорганизмов. Также заявляемый способ в сравнении с известным способом наиболее прост в исполнении и требует меньшей затраты времени.

Известно использование твердых питательных сред для определения антигистоновой активности микроорганизмов [5]. Авторами экспериментально установлено, что применение жидких питательных сред дает возможность исключить ряд трудоемких и длительных этапов исследования: приготовление твердой питательной среды, содержащей различные концентрации гистонов, разлив питательной среды по чашкам Петри, подсушивание, посев исследуемых культур на поверхность агаризованной среды и выращивание в термостате в течение 24 ч. Жидкие питательные среды обеспечивают максимальный контакт исследуемой культуры с субстратом, уменьшают трудоемкость и длительность осуществления способа и повышают точность исследования.

В способе-прототипе производят инкубацию гистонов в твердой питательной среде с микроорганизмами, растущими на ее поверхности [5]. Авторами опытным путем установлено, что это сопровождается, с одной стороны, снижением или прекращением роста высокочувствительных к гистонам культур, а с другой стороны, низкой диффузией антигистонового фактора в агар-агаре. Предлагаемый способ лишен подобных недостатков, так как инкубацию гистонов производят не с живой культурой на поверхности твердой среды, а с культуральной жидкостью исследуемого микроорганизма. Это позволило уменьшить время инкубации гистонов с культуральной жидкостью исследуемого микроорганизма, а также сократить количество манипуляций, требуемых для воспроизведения исследования.

Также чашечный метод определения антигистоновой активности требует использования большого количества чашек Петри и недостаточно точен, так как зависит от технологии приготовления раствора гистонов в твердой питательной среде, степени кривизны дна чашек Петри, диаметра выросших колоний исследуемых микроорганизмов, субъективности визуального учета результата исследователем. В заявляемом способе оценку результатов производят путем расчета по формуле с учетом оптической плотности опытной и контрольных проб. Таким образом, повышается точность оценки и исключается искажающее влияние вышеперечисленных факторов на результаты исследования. В связи с использованием контрольных проб исчезает необходимость предварительной проверки тест-культуры на чувствительность к гистонам.

В известном способе в качестве тест-культуры используется чувствительный к гистонам штамм Bacillus cereus [5]. Однако уровень его чувствительности (0,8 мг/мл) соответствует высоким, нефизиологическим концентрациям гистонов.

При разработке настоящего способа авторами были проведены исследования по выбору тест-культуры, позволяющей тестировать наличие или отсутствие в среде гистонов, так как для осуществления способа необходим высокочувствительный к препарату гистонов штамм микроорганизма.

Авторами с помощью определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) препарата гистонов для различных групп микроорганизмов экспериментально отобрана тест-культура. Для этого в мясопептонном бульоне создавались определенные концентрации препарата гистонов (от 2 до 10000 мкг/мл). Затем к 0,9 мл раствора гистонов в мясопептонном бульоне добавляли по 0,1 мл взвеси исследуемых микроорганизмов. Пробы инкубировали в течение 60 мин при Т 37^oС и высевали на питательный агар. Процент выживших бактерий (сформировавшихся колоний) подсчитывали после 18-24 инкубации при Т 37^oС. Минимальную бактерицидную концентрацию определяли как концентрацию гистонов, вызывающую гибель 90% клеток бактерий относительно контроля без гистонов. По результатам исследований свежевыделенных и музейных штаммов в качестве тест-культуры был выбран штамм М. luteus, проявляющий наибольшую чувствительность к бактерицидному действию гистонов (МБК гистонов для данного штамма составила 20 мкг/мл) (табл. 1). Штамм депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича под регистрационным номером 211001 [10].

Предлагаемый штамм М. luteus растет на простых питательных средах, образует желтые гладкие колонии, клетки сферические, 0,5 - 3,5 мкм в диаметре, неподвижный, грамположительный, аэроб, образует каталазу, не сбраживает глюкозу.

Таким образом, использование более чувствительной к гистонам тест-культуры М. luteus ГИСК 211001 позволяет, с одной стороны, значительно (в сотни раз) сократить массу используемых в исследовании гистонов, а с другой стороны, определять инактивацию гистонов в количествах, физиологических для эукариотических организмов, что повышает чувствительность предлагаемого способа. Кроме того, применение тест-культуры, имеющей более высокий порог чувствительности к гистонам, расширяет возможности метода, так как позволяет выявлять антигистоновый признак у широкого круга микроорганизмов.

Известно применение математической формулы для оценки инактивации микроорганизмами бактерицидных и бактериостатических веществ [11, 12]. Для создания формулы количественного определения антигистоновой активности авторами экспериментально установлена зависимость ростовых характеристик тест-культуры М. luteus ГИСК 211001 от концентрации гистонов в жидкой питательной среде. Для этого в мясопептонном бульоне создавались определенные концентрации препарата гистонов (от 2 до 20 мкг/мл). Затем к 1,8 мл раствора гистонов в мясопептонном бульоне добавляли по 0,2 мл взвеси (10⁹ клеток/мл) исследуемой суточной культуры М. luteus. В контрольную пробу 1 вместо раствора гистонов добавляли изотонический раствор NaCl. В контрольную пробу 2 вместо взвеси бактерий добавляли изотонический раствор NaCl. Пробы инкубировали в течение 24 часов при температуре 37^oС и определяли степень подавления роста тест-культуры М. luteus раствором препарата гистонов. Для этого образцы опытных и контрольных проб объемом 200 мкл автоматическим дозатором вносили в лунки 96-луночного плоскодонного полистиролового планшета. Затем измеряли оптическую плотность опытных и контрольных проб на фотометре ИФА-ОЭП ("Оптоэлектронные приборы", Россия) при длине волны 492 нм (табл.2).

Результаты измерений оптической плотности опытных и контрольных проб переводили в относительные единицы по формуле
[(ОП_ОП-ОП_К2)/(ОП_К1-ОП_К2)]•100%,
где ОП_ОП - оптическая плотность опытной пробы;
ОП_К1 - оптическая плотность контрольной пробы 1;
ОП_К2 - оптическая плотность контрольной пробы 2.

В результате получили ряд значений, отражающих изменение оптической плотности тест-культуры (в %) в зависимости от концентрации препарата гистонов в жидкой питательной среде. Для стандартизации результатов исследования данный эксперимент авторы повторили десятикратно и вывели средние показатели зависимости ростовых характеристик тест-культуры М. luteus ГИСК 211001 от концентрации гистонов (табл. 2).

Для удобства использования результатов эксперимента авторами построен график.

На чертеже представлен калибровочный график зависимости ростовых характеристик тест-культуры М. luteus ГИСК 211001 от концентрации гистонов, где на оси абсцисс отмечена концентрация гистонов (в мкг/мл), а на оси ординат - изменение оптической плотности тест-культуры (в%), рассчитанное по формуле. На графике видно, что изменение оптической плотности тест-культуры связано линейной зависимостью с концентрацией гистонов в диапазоне от 2 до 14 мкг/мл. По калибровочному графику можно рассчитать, что снижению концентрации активных гистонов на 12 мкг/мл в диапазоне от 14 до 2 мкг/мл соответствует увеличение оптической плотности тест-культуры на 93,2%. Следовательно, возрастание оптической плотности тест-культуры в опыте на 100% будет соответствовать снижению концентрации активных гистонов в исследуемом растворе на 12/93,2•100≈12,834 мкг/мл. На основании установленной зависимости ростовых характеристик тест-культуры М. luteus ГИСК 211001 от концентрации гистонов в жидкой питательной среде была выведена формула расчета антигистоновой активности микроорганизмов:

где ОД_ОП - оптическая плотность опытной пробы;
ОД_К1 - оптическая плотность контроля 1;
ОД_К2 - оптическая плотность контроля 2.

Таким образом, применение математической формулы, построенной на результатах многократно проведенного эксперимента, повышает точность количественного определения антигистоновой активности микроорганизмов.

Для осуществления способа используется препарат гистонов из коровьего тимуса, производства фирмы "Sigma" (США), номер по каталогу Н 9250 [13], в виде лиофилизированного порошка, содержащего общую фракцию гистонов.

Способ осуществляется следующим образом.

Все манипуляции проводят в асептических условиях в стерильном боксе, обработанном ультрафиолетовым излучением, с использованием стерильных свежеприготовленных питательных сред и растворов, стерильных бумажных фильтров, наконечников для автоматических дозаторов и лабораторной посуды.

1) Исследуемую культуру микроорганизма стандартной микробиологической петлей диаметром 3 мм засевают в 3 мл жидкой питательной среды (для каждого вида микроорганизмов используют соответствующий тип питательной среды) и выращивают при 37^oС в течение 24-36 ч.

2) В пробирку с выросшей исследуемой культурой добавляют 0,1 мл хлороформа, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин, периодически встряхивая.

3) Надосадочную жидкость отделяют от хлороформа и бактериальных клеток центрифугированием в течение 20 мин при 3000 об/мин.

4) На изотоническом растворе NaCl готовят раствор препарата гистонов с концентрацией 210 мкг/мл. Концентрация 210 мкг/мл выбрана в связи с тем, что в дальнейшем при добавлении всех необходимых компонентов концентрация гистонов в конечном объеме реакционной смеси составит 14 мкг/мл, которая соответствует максимальной концентрации гистонов, инактивацию которой можно определить по калибровочной кривой зависимости ростовых характеристик тест-культуры М. luteus ГИСК 211001 от концентрации гистонов (чертеж).

5) Культуральную жидкость исследуемого штамма микроорганизмов объемом 0,6 мл смешивают с 0,2 мл приготовленного раствора гистонов.

6) Параллельно с опытной готовят две контрольные пробы:
Контроль 1. Для учета возможного ингибирующего или стимулирующего действия исследуемой культуры на тест-культуру определяют влияние культуральной жидкости исследуемого микроорганизма на ростовые характеристики индикаторной культуры. Для этого к 0,6 мл культуральной жидкости исследуемого штамма добавляют 0,2 мл изотонического раствора NaCl.

Контроль 2. К 0,6 мл жидкой питательной среды, используемой для выращивания исследуемой культуры, добавляют 0,2 мл приготовленного раствора гистонов.

7) Опытную и контрольные пробы инкубируют в течение 60 мин при 37^oС.

8) После инкубации в опытную и контрольные пробы добавляют по 2,0 мл мясопептонного бульона и по 0,2 мл предварительно подготовленной и стандартизованной суспензии тест-культуры М. luteus ГИСК 211001. Для этого 16-18 часовую агаровую культуру М. luteus смывают изотоническим раствором NaCl и фильтруют с помощью воронки через крупнопористый бумажный фильтр (красная лента, ОАО "Химреактивкомплект", Россия) в асептических условиях. Затем суспензию клеток отмывают от питательной среды путем трехкратного центрифугирования в изотоническом растворе NaCl при 3000 об/мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендируют в изотоническом растворе NaCl и доводят до концентрации 10⁹ клеток/мл по стандарту мутности 10 единиц (ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

9) Опытную и контрольные пробы инкубируют в течение 24 ч при 37^oС.

10) После инкубации содержимое опытной и контрольных проб тщательно перемешивают и гомогенизируют с помощью миксера, образцы проб объемом 200 мкл автоматическим дозатором вносят в лунки 96-луночного плоскодонного полистиролового планшета и определяют оптическую плотность образцов на фотометре ИФА-ОЭП ("Оптоэлектронные приборы", Россия) при длине волны 492 нм.

11) Рассчитывают антигистоновую активность исследуемого микроорганизма по формуле

где ОД_ОП - оптическая плотность опытной пробы;
ОД_К1 - оптическая плотность контроля 1;
ОД_К2 - оптическая плотность контроля 2.

Примеры конкретного выполнения заявляемого способа.

Пример 1. У штамма Escherichia coli 37, выделенного из протозойно-бактериальной ассоциации реки Каргалка, была определена антигистоновая активность.

Для этого исследуемую культуру выращивали в 3 мл мясопептонного бульона при 37^oС в течение 24-36 ч. В пробирку с выросшей культурой добавляли 0,1 мл хлороформа, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин, периодически встряхивая. Надосадочную жидкость отделяли от хлороформа и бактериальных клеток центрифугированием в течение 20 мин при 3000 об/мин. На изотоническом растворе NaCl готовили рабочий раствор препарата гистонов с концентрацией 210 мкг/мл. Культуральную жидкость исследуемого штамма объемом 0,6 мл смешивали с 0,2 мл приготовленного раствора гистонов. Параллельно с опытной готовили две контрольные пробы.

Контроль 1. К 0,6 мл культуральной жидкости исследуемого штамма добавляли 0,2 мл изотонического раствора NaCl.

Контроль 2. К 0,6 мл мясопептонного бульона добавляли 0,2 мл приготовленного раствора гистонов.

Опытную и контрольные пробы инкубировали в течение 60 мин при 37^oС. После инкубации в опытную и контрольные пробы добавляли по 2 мл мясопептонного бульона и по 0,2 мл предварительно подготовленной и стандартизованной суспензии тест-культуры М. luteus ГИСК 211001. Для этого 16-18 часовую агаровую культуру М. luteus смывали изотоническим раствором NaCl и фильтровали с помощью воронки через крупнопористый бумажный фильтр (красная лента, ОАО "Химреактивкомплект", Россия) в асептических условиях. Затем суспензию клеток отмывали от питательной среды в изотоническом растворе NaCl путем трехкратного центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в изотоническом растворе NaCl и доводили до концентрации 10⁹ клеток/мл по стандарту мутности 10 единиц (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Опытную и контрольные пробы инкубировали в течение 24 ч при 37^oС. После инкубации содержимое опытной и контрольных проб тщательно перемешивали и гомогенизировали с помощью миксера, образцы проб объемом 200 мкл автоматическим дозатором вносили в лунки 96-луночного плоскодонного полистиролового планшета и определяли оптическую плотность образцов на фотометре ИФА-ОЭП ("Оптоэлектронные приборы", Россия) при длине волны 492 нм.

Были получены следующие значения оптической плотности:
0,155 - оптическая плотность опытной пробы;
0,187 - оптическая плотность контроля 1;
0,124 - оптическая плотность контроля 2.

Рассчитывали антигистоновую активность исследуемого микроорганизма количественно по формуле

Таким образом, с использованием предлагаемого способа выявлено, что исследуемый штамм Е. coli проявлял антигистоновую активность на уровне 6,3 мкг/мл.

Пример 2. У штамма Klebsiella ozaenae 14, выделенного из реки Урал, была определена антигистоновая активность. Определение антигистоновой активности микроорганизма проводили заявляемым способом аналогично примеру 1.

Были получены следующие значения оптической плотности:
0,124 - оптическая плотность опытной пробы;
0,174 - оптическая плотность контроля 1;
0,124 - оптическая плотность контроля 2.

Рассчитывали антигистоновую активность исследуемого микроорганизма количественно по формуле

Таким образом, с использованием предлагаемого способа выявлено, что исследуемый штамм К. ozaenae не проявлял антигистоновую активность.

Пример 3. Для сравнения чувствительности определения антигистоновой активности известным способом и заявляемым было проведено выявление антигистоновой активности у 10 штаммов, не проявляющих искомого признака при обнаружении его способом-прототипом.

При определении антигистоновой активности исследуемых штаммов бактерий предлагаемым способом были получены различные значения этого признака (табл. 3). В частности, 4 штамма не проявляли антигистоновой активности, а 6 штаммов показали наличие искомого признака на уровне от 0,8 до 13,3 мкг/мл. Это связано с тем, что заявляемый способ позволяет определять более низкие значения антигистоновой активности микроорганизмов в пределах от 0 мкг/мл до 14 мкг/мл по сравнению со способом-прототипом, который выявляет значения антигистоновой активности, равные или превышающие 0,8 мг/мл, с шагом в 0,4 мг/мл.

Предлагаемый способ существенно повышает чувствительность определения антигистоновой активности микроорганизмов, что в свою очередь позволяет определить антигистоновую активность у более широкого круга микроорганизмов.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет ускорить, упростить, повысить точность количественной оценки антигистоновой активности микроорганизмов, а также повысить чувствительность способа и тем самым определить антигистоновую активность у более широкого круга микроорганизмов.

Источники информации
1. Полянский Ю. И. Внутриклеточный паразитизм - особая форма хозяино-паразитных отношений // Паразитоценология. Теоретические и прикладные проблемы. - Киев: Наукова думка, 1985. - С. 48 - 55.

2. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 1999. - 267 с.

3. Осипов Д.В., Подлипаев С.А. Теоретические и практические аспекты взаимоотношений простейших с микроорганизмами // Протозоология. - Вып.6. Взаимоотношения простейших с вирусами. - Л.: Наука. - 1981. - С. 5-30.

4. Соколов В. Ю. Изменения в структуре хроматина под влиянием внутриядерных бактерий с антигистоновой активностью // Бюлл. экспер. биол. мед. - 1993. - 11. - С. 536-538.

5. Соколов В.Ю. Антигистоновая активность бактерий // Бюлл. экспер. биол. мед. - 1993. - 2. - С. 180-183 (прототип).

6. Молекулярная биология. Структура и функции белков / Под ред. А.С. Спирина. -М.: Высшая школа, 1996. - 335 с.

7. Введение в количественную цитохимию / Под ред. В.Я. Бродского и Н.И. Полякова. - М.: Мир, 1969. - 440 с.

8. Энциклопедия клинического обследования больного. Пер. с англ. - М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1997. - 1246 с.

9. Ждан-Пушкина С.М., Авенирова Е.Л., Архипченко И.А., Ашмарин И.П .Поиски механизмов антибиотического действия гистонов // Антибиотики. - 1972. - Т. 17, 12. - С. 1080-1085.

10. Каталог штаммов Всесоюзного музея патогенных бактерий. Вып.1. - М. - 1982.

11. RU 2126051 С1, МПК 6 С 12 Q 1/02, 10.02.99.

12. RU 2156807 С2, МПК 7 С 12 Q 1/02, 1/04, 27.09.2000.

13. Каталог фирмы "Sigma". Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук. - 1999. - С. 547.

Формула изобретения

Способ определения антигистоновой активности микроорганизмов, отличающийся тем, что исследуемую культуру микроорганизма выращивают в жидкой питательной среде, обрабатывают хлороформом, отделяют культуральную жидкость, смешивают ее с раствором гистонов, параллельно готовят две контрольные пробы, при этом в контроль 1 вместо раствора гистонов добавляют изотонический раствор NaCl, а в контроль 2 вместо культуральной жидкости - жидкую питательную среду, опытную и контрольные пробы инкубируют, после инкубации во все пробы добавляют мясопептонный бульон и тест-культуру М. luteus ГИСК 211001, инкубируют, измеряют оптическую плотность взвесей в опыте и контролях, затем рассчитывают антигистоновую активность по формуле

где ОД_оп - оптическая плотность опытной пробы;
ОД_к1 - оптическая плотность контроля 1;
ОД_к2 - оптическая плотность контроля 2.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4