Способ получения вакцины против туберкулеза

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Задачей изобретения является получение нового типа неживой бесклеточной (молекулярной) вакцины. Способ включает культивирование микобактерий из штамма БЦЖ, выделение двух фракций - цитоплазматической и фракции клеточных оболочек. Фракцию клеточных оболочек конъюгируют на целлюлозной матрице при соотношении 1: 10 (по массе) в присутствии треххлористого хрома, затем добавляют цитоплазматическую фракцию до содержания белка 1,5-2 мг/мл. Способ позволяет получить экологически чистую вакцину, обладающую высокой иммуногенностью. 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения вакцинных препаратов, и вакцина может быть использована для профилактики и оздоровления ферм от туберкулеза крупного рогатого скота в сочетании с вакциной БЦЖ.

Известен способ получения вакцины против туберкулеза, включающий культивирование микобактерий вакцинного штамма БЦЖ (BCG - Bacillus Calmette-Guerin) на питательной среде с последующим сбором микробных клеток, ресуспендированием и леофильным высушиванием. Живая вакцина БЦЖ достаточно эффективна и применяется для профилактики и оздоровления ферм крупного рогатого скота. Применение вакцины БЦЖ в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий позволяет сократить сроки оздоровления ферм с меньшими материальными затратами, однако при этом создаются трудности в диагностике туберкулеза (длительные поствакцинальные реакции на взрослом скоте). В связи с этим вакцину БЦЖ применяют только на новорожденных телятах (наставление "По применению вакцины БЦЖ при туберкулезе крупного рогатого скота" от 26.02.1990). Общий недостаток живых вакцин заключается в том, что они представляют собой малоконтролируемую смесь с большим количеством балластных, в том числе токсичных, компонентов из микробных клеток с высокими аллергизирующими свойствами.

Известен способ получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза (см. авторское свидетельство 1338859 от 23.09.87, БИ 35). Испытание на морских свинках корпускулярной иммуногенной фракции показало ее выраженное протективное действие. Однако препарат не нашел применения в ветеринарной практике.

Задачей изобретения является получение нового типа неживой бесклеточной (молекулярной) экологически чистой вакцины против туберкулеза животных, обладающей иммуногенностью и протективными свойствами и не осложняющей диагностику.

Задача достигается путем культивирования микобактерий из штамма БЦЖ с последующим разрушением их ультразвуком. Выделение цитоплазматической фракции осуществляют центрифугированием при 8000 об/мин. Полученную надосадочную жидкость сливают (цито-плазматическая фракция). Колориметрическим методом определяют количество белка в 1 мл раствора, а осадок растворяют в физиологическом растворе и дополнительно разрушают ультразвуком, затем центрифугируют при 15000 об/мин. Полученную надосадочную жидкость (фракция клеточных оболочек) сливают и определяют количество белка в ней, полученную фракцию конъюгируют на целлюлозной матрице при соотношении 1:10 (по массе) в присутствии треххлористого хрома. Реакционную смесь осаждают и 4-5 раз отмывают физиологическим раствором. Осадок конъюгата разводят физиологическим раствором в минимальном объеме. Определяют количество белка в 1 мл конъюгата и добавляют к нему цитоплазматическую фракцию до содержания белка в нем 1,5-2 мг/мл.

Отличительными признаками предложенного способа являются: культивирование микобактерий из штамма БЦЖ с последующим разрушением, выделяют две фракции - цитоплазматическую и фракцию клеточных оболочек, последнюю получают путем дополнительного разрушения ультразвуком и центрифугированием при 15000 об/мин, полученную фракцию клеточных оболочек конъюгируют на целлюлозной матрице при соотношении 1:10 (по массе) в присутствии треххлористого хрома, в полученном конъюгате определяют количество белка и добавляют к нему цитоплазматическую фракцию до содержания белка 1,5-2 мг/мл.

Неактивированная целлюлоза с белковыми молекулами, имеющими карбоксильные группы, способна образовывать сложные эфиры. Катализатором этого процесса служит СrСl₃, который активизирует реакцию этерификации, связывая молекулы воды.

В результате экспериментальной работы была подобрана концентрация СrСl₃ и соотношение целлюлоза:антиген. Данные приведены в таблице 1 и 2.

Результаты эксперимента показывают, что оптимальной концентрацией вводимого в раствор СrСl₃ является 25 мк-моль/л.

По результатам эксперимента выявлено оптимальное соотношение целлюлоза: антиген -10:1.

Пример 1. Получение фракций из вакцинного штамма БЦЖ.

Проводят посев вакцинного штамма БЦЖ на жидкую синтетическую среду Сотона. Вакцинный штамм культивируется в конических колбах емкостью 0,5-1,0 л при температуре 37^oС в течение 2-3-х недель. Выросшею бактериальную массу собирают и трижды отмывают стерильным физиологическим раствором, центрифугируют в течение 20 мин при 3 тыс. об/мин. Отмытую бактериальную массу ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе из расчета 1:5 (1,0 г бактериальной массы и 5 мл физиологического раствора). Флаконы с суспензией бактериальных клеток помещают на 24 часа на шуттель-аппарат при комнатной температуре.

Суспензию бактериальных клеток подвергают ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 (22-35 кГц, 60-70 Вт/см² в течение 8-10 мин), полученную взвесь центрифугируют 30 мин при 8000 об/мин (см. Ходун Л.М., Цунская Н.И. Тест-система ELIZA для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и критерии оценки результатов метода // Разработка средств и методов борьбы с туберкулезом животных: Сб. науч. тр. / ВАСХНИЛ. ВНИИБТЖ, - Омск, 1990. - С. 10-24). Надосадочную жидкость собирают и используют в качестве антигенов цитоплазматической фракции. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и вновь подвергают дезинтеграции в течение 30 мин. Полученную взвесь центрифугируют 30 мин при 15000 об/мин (этот параметр является оптимальным для получения фракции клеточных оболочек) и надосадочную жидкость используют в качестве антигенов фракции клеточных оболочек.

Количество белка во фракциях определяют на фотоэлектроколориметре с использованием красителя бромфенолового синего (БФС). На кружок фильтровальной бумаги диаметром 2 см, помещенный на пористый фильтр, вставленный в колбу с отсосом (водоструйный насос), наносят пробу фракции. Осадок, образовавшийся на фильтровальной бумаге, промывают 4 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты, затем тремя порциями дистиллированной воды. Фильтр с осадком помещают для окрашивания в 0,05%-ный раствор БФС в 2%-ной уксусной кислоте, инкубируют 30 мин, затем в течение 30 мин отмывают от несвязавшегося красителя в трех сменах 2%-ной уксусной кислоты. Отмытый фильтр переносят в пробирку, содержащую 5 мл 0,025 н. раствора NaOH, инкубируют 30 мин и колориметрируют синий элюат при 590 нм. Количество белка в пробе определяют по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой на фильтр наносят по 25 мкл растворов, содержащих известные количества белка (от 10 до 150 мкг в пробе). Фильтраты высушивают на воздухе, инкубируют 30 мин в 10%-ной трихлоруксусной кислоте, отмывают 3 раза дистиллированной водой, помещают для окрашивания на 30 мин в 0,05%-ный раствор БФС, отмывают 30 мин 2%-ной уксусной кислотой, элюируют краситель в 5 мл 0,025 н. раствора NaOH в течение 30 мин и колориметрируют элюаты при 590 нм.

Пример 2. Приготовление суспензии целлюлозы.

Суспензию целлюлозы готовят по методу Лехтцинд Е.В., Эльгорт Д.А. (см. Лехтцинд Е.В., Эльгорт Д.А. Приготовление иммуносорбентов на основе суспензии диальдегидцеллюлозы // Иммуносорбенты и их использование в биотехнологии. Сб. НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, - М., 1987. - С. 92-95). Мелко нарезают 5 г хлопковой ваты и замачивают в 100 мл 25%-ного раствора аммиака.

Для получения гидроокиси меди готовят два раствора: 1) в 250 мл дистиллированной воды растворяют 15,6 г CuS0₄•5Н₂О и добавляют 0,5 мл глицерина; 2) в 300 мл дистиллированной воды растворяют 5,6 г NaOH. Раствор щелочи медленно при постоянном перемешивании выливают в раствор сернокислой меди, при этом выпадает осадок гидроокиси меди.

Выпавший осадок гидроокиси меди отмывают на воронке Бюхнера или центрифугированием (5 мин при 2000 об/мин) 0,1%-ным раствором глицерина в воде до исчезновения ионов SО₄ ^2- в промывной жидкости. Для этого ставят пробу с 10%-ным раствором ВаСl₂, в присутствии ионов SО₄ ^2- выпадает белый осадок.

Свежеприготовленную гидроокись меди и 50 мл 25%-ного раствора аммиака добавляют к замоченной вате и тщательно перемешивают. Через час к полученной смеси добавляют еще 50 мл 25%-ного раствора аммиака, вновь тщательно перемешивают и оставляют на ночь.

К полученной смеси добавляют 25%-ный раствор аммиака до конечного объема 500 мл и тщательно перемешивают. Полученную суспензию целлюлозы выливают в сосуд, содержащий 5 л дистиллированной воды, перемешивают и медленно, небольшими порциями, при постоянном перемешивании добавляют концентрированную серную кислоту до исчезновения синей окраски раствора.

Выпавшую суспензию целлюлозы отмывают на капроновом сите 76 или при центрифугировании (5 мин при 2000 об/мин) дистиллированной водой до исчезновения ионов S0₄ ^2- в промывной жидкости.

Отмытый осадок переносят во флакон емкостью 500 мл и доводят водой объем суспензии до 400 мл. Хранят при 4^oС, используя по мере необходимости.

Сухое вещество в суспензии целлюлозы определяют путем высушивания бюкса до постоянного веса в сушильном шкафу. Во взвешенный бюкс наливают 0,5-1,0 мл суспензии целлюлозы и вновь высушивают до постоянного веса. Вычисляют вес осадка в бюксе и по нему рассчитывают содержание сухого вещества в суспензии целлюлозы.

Пример 3. Конъюгирование фракции клеточных оболочек на целлюлозной матрице.

Фракцию клеточных оболочек смешивают с суспензией целлюлозы в соотношении 100 мг белка на 1 г целлюлозы при одновременном добавлении 25 μM СrСl₃. После тщательного перемешивания смесь ставят на магнитную мешалку при температуре 4^oС на 3 суток.

Реакционную смесь осаждают и 4-5 раз отмывают физиологическим раствором, центрифугируя 15 мин при 2000 об/мин. Осадок конъюгата разводят физиологическим раствором в минимальном объеме.

Присоединившийся белок определяют по окрашиванию бромфеноловым синим (Е. В. Лехтцинд, Д.А. Эльгорт, 1987).

В полученный препарат добавляют антигены цитоплазматической фракции до концентрации в конъюгате белка 1,5-2,0 мг/мл с целью стандартизации дозы препарата по белку. В результате получают противотуберкулезную бесклеточную вакцину на целлюлозной матрице (ТБЦ).

Пример 4. Испытание протективных свойств на морских свинках.

В опыте были использованы 79 морских свинок весом 300-400 г, предварительно исследованных ППД-туберкулином и не реагирующих на него. Из экспериментальных животных сформировали 13 групп. Морские свинки 1-й группы были привиты конъюгатом из антигеновцитоплазматической фракции с добавлением фракции клеточных оболочек в качестве свободного белка (ТБЦ-1) в дозе 500 мкг белка; 2-й - привиты ТБЦ-1 в дозе 1000 мкг белка; 3-й - конъгатом, полученным предложенным способом (ТБЦ-2) в дозе 500 мкг; 4-й группы привиты ТБЦ-2 в дозе 1000 мкг белка; 5-й и 6-й - антигенами цитоплазматической фракции (Ф-1) в дозе 500 мкг и 1000 мкг белка; 7-й и 8-й - антигенами фракции клеточных оболочек (Ф-2) в дозе 500 мкг и 1000 мкг белка; 9-й - привиты суспензией целлюлозы (СЦ) в дозе 1,5 мл; 10-й и 11-й - привиты вакциной БЦЖ в дозе 500 мкг и 1000 мкг; 12-й группы введен физиологический раствор и 13-я группа морских свинок контрольная.

Дозу препаратов вводили в объеме 1,5 мл. Для изучения протективных свойств препаратов морским свинкам через 2 мес. после вакцинации в область левого паха была введена вирулентная культура M.bovis шт. 14 ВНИИБТЖ в дозе 0,001 мг. Убой животных был проведен через 4 мес. после вакцинации. Результаты эксперимента показаны в таблице 3.

Процент иммунных животных определяется по формуле: ПИ=(А-В)/100%, где ПИ - процент иммунных; А - всего животных; В - животные, у которых при патологоанатомическом исследовании выявлены поражения туберкулезного характера.

Интенсивность поражений и индекс защиты по методу С.И. Гельберг, Е.А. Финкель (см. Гельберг С. И. , Финкель Е.А. К методике экспериментального изучения иммунногенных свойств противотуберкулезных вакцин и эффективности методов их применения // Проблемы туберкулеза, 1959. - 2. - С. 80-84).

Как видно из таблицы 3 противотуберкулезный препарат ТБЦ-2 проявляет достаточные протективные свойства, сравнимые по своему уровню с вакциной БЦЖ.

Препарат предполагается использовать для реиммунизации крупного рогатого скота, ранее привитого вакциной БЦЖ.

Формула изобретения

Способ получения вакцины против туберкулеза, включающий культивирование микобактерий с последующим разрушением ультразвуком и выделением антигена клеточных оболочек и его конъюгацией с носителем, отличающийся тем, что для культивирования используют штамм БЦЖ, антиген получают путем дезинтеграции культуры, надосадочную жидкость сливают (цитоплазматическая фракция), осадок вновь подвергают дезинтеграции, осаждают при 15000 об/мин, полученную надосадочную жидкость (фракция клеточных оболочек) конъюгируют на целлюлозной матрице при их соотношении 1:10 (по массе) в присутствии треххлористого хрома до получения эффекта, добавляют цитоплазматическую фракцию до содержания в конъюгате белка 1,5-2,0 мг/мл.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3