Полипептидные варианты с повышенной гепаринсвязывающей способностью

 

Изобретение касается полипептидных вариантов, обладающих повышенной гепаринсвязывающей способностью. Повышенная гепаринсвязывающая способность достигается добавлением, инсерцией аминокислотной последовательности и/или заменой на аминокислотную последовательность RKRA (SEQ ID NO:3 или RKRAKHKQ (SEQ ID NO:4) в аминокислотной последовательности полипептида, выбранного из членов суперсемейства TGFβ. Полипептидные варианты по изобретению особенно пригодны для стимуляции хондрогенеза, остеогенеза и заживления ран. Изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептидные варианты, клеткам-хозяевам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, и к способам получения полипептидных вариантов, а также к фармацевтическим композициям. Преимущество изобретения заключается в разработке новых препаратов, которые могут быть использованы для стимуляции репаративных процессов остеогенеза и хондрогенеза. 8 с. и 17 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).

Формула изобретения

1. Полипептидный вариант, выбранный из членов суперсемейства TGFβ, отличающийся тем, что вариант полипептида обладает повышенной гепаринсвязывающей способностью, причем к аминокислотной последовательности полипептида, выбранного из членов суперсемейства TGFβ, добавлен по меньшей мере один олигопептид, и/или в аминокислотную последовательность полипептида встроен по меньшей мере один олигопептид, и/или по меньшей мере одна олигопептидная последовательность, встречающаяся в естественных условиях в аминокислотной последовательности полипептида, заменена олигопептидом, где олигопептид включает последовательность RKRA (SEQ ID NO:3) или RKRAKHKQ (SEQ ID NO:4).

2. Полипептидный вариант по п.1, отличающийся тем, что 1-4 копии этого олигопептида встраивают в 1-4 положениях полипептида.

3. Полипептидный вариант по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что олигопептид добавляют к N-концу, и/или встраивают в N-концевую область, и/или им заменяют часть N-концевой области.

4. Полипептидный вариант по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность полипептидного варианта дополнительно содержит последовательность, пригодную для рекомбинантной экспрессии на N-конце, эта последовательность, пригодная для рекомбинантной экспрессии, представляет собой М или MZ, где М обозначает метионин и Z обозначает одну или несколько аминокислот.

5. Полипептидный вариант по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что полипептидный вариант дополнительно содержит His-метку.

6. Полипептидный вариант по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что полипептид изменяют путем добавления, замены, инсерции, инверсии и/или делении, причем полипептид, измененный с помощью добавления, замены, инсерции, инверсии и/или делеции, обладает по меньшей мере 10% биологической активности неизмененного полипептида, и/или по меньшей мере 50% гомологией относительно неизмененного полипептида.

7. Полипептидный вариант по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что полипептид представляет собой BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7/OP-1 или ВМР-8/ОР-2.

8. Полипептидный вариант по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что олигопептид встраивают перед цистеиновым узлом.

9. Полипептидный вариант по п.7 или 8, отличающийся тем, что полипептидный вариант имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5 (Т3) или SEQ ID NO:6 (Т4).

10. Полипептидный вариант по пп.1-9, отличающийся тем, что полипептидный вариант представляет собой полимер, олигомер или димер полипептидного варианта по любому из пп.1-9.

11. Молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидный вариант по любому из пп.1-10.

12. Молекула нуклеиновой кислоты по п.11, отличающаяся тем, что эту нуклеотидную последовательность получают из геномной ДНК или кДНК или она представляет собой синтетическую ДНК.

13. Молекула нуклеиновой кислоты по п.11 или 12, дополнительно включающая промотор, пригодный для контроля экспрессии, причем нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептидный вариант, находится под контролем промотора.

14. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.11-13, где молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере часть вектора.

15. Способ получения полипептидного варианта, обладающего повышенной гепаринсвязывающей способностью, по любому из пп.1-10, предусматривающий добавление к аминокислотной последовательности полипептида по меньшей мере одного олигопептида, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1 или SEQ NO:2; и/или встраивание в аминокислотную последовательность полипептида по меньшей мере одного олигопептида, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1 или SEQ NO:2; и/или замену по меньшей мере одной олигопептидной последовательности, которая в естественных условиях входит в состав аминокислотной последовательности, на олигопептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что способ предусматривает использование метода химического и/или ферментативного синтеза.

17. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что способ предусматривает использование методов генной технологии.

18. Способ по любому из пп.16 и 17, отличающийся тем, что способ предусматривает а) мутагенез in vitro кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты, например: (I) добавление к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей олигопептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; и/или (II) встраивание в нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей олигопептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; и/или (III) замену по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности во встречающейся в естественных условиях нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, на нуклеотидную последовательность, кодирующую олигопептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; б) клонирование мутантной нуклеиновой кислоты в приемлемом векторе экспрессии; в) трансформацию/трансфекцию приемлемой клетки-хозяина полученным вектором экспрессии; г) культивирование трансформированной/трансфектированной клетки-хозяина в условиях, приемлемых для экспрессии; д) выделение и при необходимости ренатурацию экспрессируемого полипептида.

19. Способ по любому из пп.15-18, отличающийся тем, что способ осуществляют с использованием прокариотической клетки-хозяина, такой, как предпочтительно Е.coli.

20. Способ по любому из пп.15-18, отличающийся тем, что способ осуществляют с использованием эукариотической клетки-хозяина, предпочтительно клетки дрожжей, растения или насекомого, СНО- или COS-клетки.

21. Фармацевтическая композиция для стимуляции остеогенеза, или заживления ран, или для лечения воспаления или рака, включающая полипептидный вариант по любому из пп.1-10 и необязательно физиологически совместимые добавки.

22. Композиция для остеоиндукции, включающая полипептидный вариант по любому из пп.1-10 и носитель, выбранный из ряда, включающего гепарин, гидроксиапатит, гиалуроновую кислоту, синтетические полимеры и коллаген.

25. Остеоиндуктивный матрикс, отличающийся тем, что он представляет собой матрикс, содержащий или покрытый гепарином или гепаринподобными субстанциями, с адсорбированными на нем полипептидными вариантами по любому из пп.1-10.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48