Способ получения ферментного препарата липоксигеназы
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в хлебопекарной промышленности. Способ предусматривает глубинное культивирование штамма продуцента липоксигеназы Rhizopus oryzae ВКМ F-605 на питательной среде следующего состава: соевый жмых, подсолнечное масло, кукурузный экстракт, дигидрофосфат аммония, гидрофосфат натрия и воду с последующим выделением ферментного препарата. Изобретение позволяет синтезировать ферментный препарат с высокой липоксигеназной и низкой каротиноксидазной активностью, а также улучшает качественные характеристики хлеба. 2 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в хлебопекарной промышленности.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения ферментного препарата липоксигеназы путем глубинного культивирования ее продуцентов - грибов рода Aspergillus: A. oryzae 3-9-15 или A. awamori 466 на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода соевую муку и минеральные соли азота, фосфора, калия и магния; а в качестве индуктора - соевое масло. Активность липоксигеназы, определяемая каротиноксидазным методом, составляет 20000-50000 усл. ед на 1 см культуральной жидкости (а.с. СССР № 88542, МКИ С 12 N 9/02 / Способ получения ферментного препарата липоксигеназы /P.P.Токарева, Е.А.Двадцатова, М.В.Соловьева, В.Л.Яровенко, В.Л.Кретович, Е.В.Будницкая; №2949321 /28-13; заявл. 30.05.80; опубл. 15.08.83, Бюл. №30).Недостатком известного способа является высокая каротиноксидазная активность ферментного препарата, при которой разрушаются биологически активные вещества муки - каротиноиды.Техническая задача изобретения - получение ферментного препарата липоксигеназы с высокой активностью образования гидроперекисей и низкой каротиноксидазной активностью.Техническая задача достигается тем, что в способе получения ферментного препарата липоксигеназы, включающем подготовку питательной среды, глубинное культивирование штамма-продуцента, новым является то, что в качестве штамма-продуцента ферментного препарата липоксигеназы используют Rhizopus oryzae 605, а при подготовке питательной среды в нее вносят, мас.%: соевый жмых 2,0-2,5 и подсолнечное масло 0,7-0,9 в качестве органических питательных веществ, кукурузный экстракт 0,8-1,0 в качестве источника ростовых факторов, минеральные соли - гидрофосфат натрия 0,4-0,6, дигидрофосфат аммония 0,8-1,2, начальное значение рН среды 7,0.Технический результат изобретения выражается в синтезе ферментного препарата с высокой липоксигеназной и низкой каротиноксидазной активностью, позволяющего получать хлебобулочные изделия высокого качества.Способ реализуется следующим образом.Штамм-продуцент Rhizopus oryzae 605 получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов РАН, где хранится под номером ВКМ F-605.Чистую культуру выращивают на агаризированном сусле с содержанием сухих веществ 4% в течение 3-4 суток при температуре (30±1)С.Подготовка питательной среды заключается в следующем. В воде растворяют минеральные соли дигидрофосфат аммония в количестве 0,8-1,2 мас.% и гидрофосфат натрия 0,4-0,6 мас.%; добавляют, мас.%: кукурузный экстракт 0,8-1,0, соевый жмых 2,0-2,5, подсолнечное масло 0,7-0,9. Начальное значение рН среды доводят при необходимости до 7,0. Затем среду стерилизуют 1 ч при 0,1 МПа, а потом охлаждают.Подготовленную таким образом питательную среду, содержащую соевый жмых, подсолнечное масло, кукурузный экстракт, дигидрофосфат аммония, гидрофосфат натрия и воду инокулируют спорами штамма-продуцента Rhizopus oryzae 605 и выращивают при температуре 30-32С и аэрации в течение 72 ч.После окончания выращивания штамма-продуцента культуральную жидкость отделяют от биомассы фильтрованием. Ферментный препарат ли-поксигеназы получают осаждением изопропиловым спиртом (его концентрация 62 об.%) при минус 2 - минус 4С. Осадок ферментного препарата высушивают под вакуумом.В предлагаемом изобретении ферментный препарат липоксигеназы оценивают по липоксигеназной и каротиноксидазной активности (Оганесян Н.А., Борисова И.Г., Соломатин Д.А., Будницкая Е.В. Изоферментный состав и активность ЛО некоторых сортов пшеницы вида Triticum aestivum //Докл. АН СССР. 1983. Т.269. №4. С.1002-1005).Метод определения липоксигеназной активности основан на измерении количества образующихся конъюгированных гидроперекисей жирных кислот, регистрируемых при длине волны 234 нм на спектрофотометре и являющихся конечными продуктами окисления субстрата. Состав реакционной смеси: 0,2-0,3 см3 раствора субстрата, 0,5 см3 раствора фермента, 5 см3 0,05 М фосфатного буфера. Длительность реакции 1-2 мин, она прекращается при разведении 1 см3 реакционной смеси в 5 см3 60%-ного этилового спирта. Для приготовления контрольной пробы к 1 см3 реакционной смеси через 5-10 с от начала реакции добавляли этиловый спирт.В качестве субстрата использовали линолевую кислоту.За единицу липоксигеназной активности принимали изменение экстинции на 0,001 за 1 мин, отнесенное к 1 г препарата.Метод определения сопряженного окисления -каротина в присутствии линолевой кислоты, основанный на измерении оптической плотности реакционной смеси, содержащей -каротин, при длине волны 440 нм регистрирует степень разрушения каротина промежуточными продуктами окисления жирных кислот при участии липоксигеназы. Для получения раствора -каротина к 40 мг его добавляют 150 см3 смеси этанола и ацетона, взятых в соотношении 1:1. Реакционная смесь состоит из 4 мл 0,05 М фосфатного буфера, 0,2-0,3 см3 раствора каротина, 0,2-0,3 см3 раствора субстрата (Оганесян Н.А., Борисова И.Г., Соломатин Д.А., Будницкая Е.В. Изоферментный состав и активность ЛО некоторых сортов пшеницы вида Triticum aestivum //Докл. АН СССР. 1983. Т.269. №4. С.1002-1005), 0,2-0,5 см3 раствора фермента. Реакцию проводят 60 с; затем добавляют в реакционную среду 1,0 см3 1 М раствора NaOH. В контроле щелочь вносится в реакционную среду перед введением фермента.За единицу каротиноксидазной активности принимали изменение оптической плотности на 0,001 за 1 мин.Особенность штамма-продуцента и состав питательной среды для его культивирования обеспечивают биосинтез липоксигеназы с высокой липок-сигеназной и низкой каротиноксидазной активностью.Способ поясняется примерами.Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:Соевый жмых 1,8Масло подсолнечное 0,5Кукурузный экстракт 0,6NH4H2PO4 0,6Na2HPO4 0,2Вода ОстальноеДля инокуляции среды готовят водно-споровую суспензию штамма-продуцента Rhizopus oryzae 605. Для этого скос 4-суточной культуры в пробирках 18180 мм заливают 10 см3 стерильной воды и смывают споры. В колбы Эрленмейера емкостью 750 см3 вносят по 100 см3 питательной среды, которую засевают водно-споровой суспензией в количестве 1% к объему среды. Выращивание продуцента проводят на качалке при скорости 1,7-1,8 с-1, температуре (30±2)С в течение 72 ч. Затем мицелий и взвешенные частицы отделяют от культуральной жидкости фильтрованием.Ферментный препарат получают осаждением изопропанолом с концентрацией 62 об.% при температуре минус 2 минус 4С. Препарат высушивают под вакуумом.Активность липоксигеназы составляет 285700 ед/г, каротиноксидазная - 19800 ед/г.Пример 2. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:Соевый жмых 2,0Масло подсолнечное 0,7Кукурузный экстракт 0,8NH4H2PO4 0,8Na2HPO4 0,4Вода ОстальноеКультивирование штамма-продуцента Rhizopus oryzae 605: приготовление споровой суспензии, инокуляция посевного материала, выращивание, отделение мицелия, осаждение ферментного препарата, определение активности липоксигеназы проводят аналогично примеру 1.Полученный ферментный препарат имеет активность липоксигеназы 336400 ед/г, каротиноксидазная активность составляет 22600 ед/г.Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:Соевый жмых 2,5Масло подсолнечное 0,9Кукурузный экстракт 1,0NH4H2PO4 1,2Na2HPO4 0,6Вода ОстальноеКультивирование продуцента: приготовление споровой суспензии, инокуляция посевного материала, выращивание, отделение мицелия, осаждение ферментного препарата, определение активности липоксигеназы проводят аналогично примеру 1.Полученный ферментный препарат имеет активность липоксигеназы 356800 ед/г, каротиноксидазную 26400 ед/г.Пример 4. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:Соевый жмых 2,7Масло подсолнечное 1,2Кукурузный экстракт 1,2NH4H2PO4 1,4Na2HPO4 0,8Вода ОстальноеКультивирование продуцента: приготовление споровой суспензии, инокуляция посевного материала, выращивание, отделение мицелия, осаждение ферментного препарата, определение активности липоксигеназы проводят аналогично примеру 1.В полученном ферментном препарате активность липоксигеназы - 315200 ед/г, каротиноксидазная активность - 19100 ед/г.Как видно из примеров, при культивировании Rhizopus oryzae 605 на питательной среде состава, мас.%: соевый жмых 2,0-2,5; масло подсолнечное 0,7-0,9; кукурузный экстракт 0,8-1,0; (NH4)2HPO4 0,8-1,2; Na2HPO4 0,4-0,6, дает максимальный эффект (примеры 2 и 3). По сравнению с известным способом активность липоксигеназы выше, а окисление -каротина происходит в меньшей степени.Таким образом, предложенный способ позволяет получить ферментный препарат липоксигеназы, обладающий высокой активностью образования гидроперекисей и низкой активностью окисления -каротина, что важно для улучшения физических свойств теста в хлебопечении и одновременно сохраняет биологически ценные вещества муки.Пример 5. Использование препарата липоксигеназы в технологии приготовления хлеба майского. Рецептура и режим приготовления теста представлены в табл.1. Ферментный препарат дозируется в количестве 0,015% к муке в тесте. Предварительно он растворяется в воде и вносится в тесто при замесе. Показатели качества хлеба майского представлены в табл. 2. Использование такого препарата в хлебопечении улучшает физические свойства теста - вязкость возрастает, адгезия уменьшается. Улучшаются такие показатели качества хлеба, как удельный объем на 18-25%; формоустойчивость на 11-15%; пористость на 7-10% (табл. 2).Особенно важно применение препарата при переработке муки со слабой клейковиной. По основным характеристикам клейковина, отмытая из теста с внесением липоксигеназы, переходит из разряда удовлетворительно слабой в разряд удовлетворительно крепкой. При этом сохраняются биологически активные вещества муки - каротиноиды.Формула изобретения
Способ получения ферментного препарата липоксигеназы, предусматривающий глубинное культивирование штамма–продуцента на питательной среде, содержащей органические питательные вещества, источник ростовых факторов, минеральные соли и воду с последующим выделением ферментного препарата, отличающийся тем, что используют штамм-продуцент Rhizopus oryzae ВКМ F-605, культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве органических питательных веществ соевый жмых, подсолнечное масло, в качестве источника ростовых факторов – кукурузный экстракт, минеральные соли – дигидрофосфат аммония, гидрофосфат натрия при следующем содержании компонентов, мас.%:соевый жмых 2,0-2,5подсолнечное масло 0,7-0,9кукурузный экстракт 0,8-1,0гидрофосфат натрия 0,4-0,6дигидрофосфат аммония 0,8-1,2вода остальное
Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии
Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано для получения кисло-молочных продуктов
Изобретение относится к биологической очистке воды и почвы от нефти и нефтепродуктов
Изобретение относится к биологической очистке воды и почвы от нефти и нефтепродуктов
Изобретение относится к области экологии, в частности к надзору за загрязненностью окружающей среды, конкретно - водных источников
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии
Изобретение относится к биотехнологии
Изобретение относится к способу микробиологического получения аминокислот семейства аспартатов и/или глутаматов по п.п.1-17 формулы изобретения, генам пируваткарбоксилазы по п.п.18-23 формулы изобретения, генным структурам по п.24 формулы изобретения, векторам по п.25 формулы изобретения, трансформированным клеткам по п.п.26-31 формулы изобретения, а также к их применению по п.п.32-37 формулы изобретения
Способ лечения заболеваний позвоночника // 2231373
Изобретение относится к области медицины, точнее к способам лечения с помощью лекарственного электрофореза, а именно для лечения угревой болезни и заболеваний позвоночника, в частности к способам лечения компрессионно-ишемических плексопатий
Изобретение относится к защите растений, в частности к композиции для подавления болезнетворных бактерий и/или грибов на растениях и т.п., а также к способу, в котором применяется данная композиция, и к набору для ее получения
Изобретение относится к биотехнологии; многокомпонентная система для опосредуемого медиатором ферментативного окисления включает а) катализатор окисления, который выбирают из группы марганецзависимых оксидаз, б) окислитель, который выбирают из группы, включающей кислород и кислородсодержащие соединения, в) медиатор - из группы соединений, содержащих ионы Mn
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в селекции растений
Изобретение относится к области получения новых белков методами генетической инженерии и может быть использовано в любых анализах, основанных на определении аденозинтрифосфата (АТФ)
Люциферазы // 2192467
Изобретение относится к области биохимии и генетической инженерии и может быть использовано в люминометрических анализах для измерения уровней АТФ
Способ выделения супероксиддисмутазы // 2186848
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, ветеринарии и смежных областях науки и техники для получения супероксиддисмутазы (СОД)
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в селекции растений
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в хлебопекарной промышленности