Способ экстракции липидов (варианты), экстракт липидов криля и полная липидная фракция (варианты)

 

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно, к масложировой промышленности. Способ экстракции всех липидных фракций из материала морских и пресноводных животных включает помещение материала в кетоновый растворитель, разделение жидкого и твердого содержимого, извлечение первой богатой всеми липидами фракции из жидкого содержимого выпариванием растворителя, помещение указанного твердого содержимого в органический растворитель, выбранный из группы растворителей, состоящей из спирта, разделение жидкого и твердого содержимого, извлечение второй богатой всеми липидами фракции выпариванием растворителя из жидкого содержимого, извлечение твердого содержимого. Вышеописанным способом выделяют липидную фракцию из зоопланктона и рыбы. Экстракт липидов криля с содержанием каротиноидов в расчете на астаксантин составляет 75 мкг/г или более экстракта криля, а содержание каротиноидов в расчете на кантаксантин составляет 250 мкг/г или более экстракта криля. Полная липидная фракция, свободная от токсичных растворителей, экстрагированная из морских или пресноводных животных. Изобретение позволяет повысить выход липидов при экстракции. 9 с. и 45 з.п. ф-лы, 20 ил., 19 табл.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение касается экстракции липидных фракций из морских и пресноводных животных, таких как криль, Calanus, рыба и морские млекопитающие. Более конкретно данное изобретение относится к улучшенному способу экстракции липидных фракций посредством дегидратации растворителями и выделения твердого остатка, богатого активными ферментами.

ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Липидные фракции, полученные из морских и пресноводных животных, таких как криль, Calanus, рыба и морские млекопитающие, находят разнообразные применения

Применения в медицине

Масла морских и пресноводных животных и их фракции содержат различные терапевтические средства. Например, сообщается, что различные масла морских и пресноводных животных обладают противовоспалительными свойствами. Также сообщается, что масла морских и пресноводных животных полезны для снижения частоты сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, сообщается, что некоторые масла морских и пресноводных организмов подавляют развитие некоторых форм волчанки и болезней почек. В качестве дополнительного примера криль может использоваться как источник ферментов для очищения язв и ран, или облегчения переваривания пищи. Также масла морских и пресноводных животных содержат различные антиоксиданты, которые могут обладать потенциальными терапевтическими свойствами.

Пищевые продукты, обладающие лекарственными свойствами

Учитывая целебные действия омега-3 жирных кислот, масла криля, Calanus и рыб можно использовать в качестве диетических добавок к пище человека. Эти жирные кислоты необходимы для правильного развития мозга и глаз. Масла морских и пресноводных животных также богаты жирорастворимыми витаминами A, D и Е и каротиноидами.

Косметические средства

Различные масла морских и пресноводных животных используются для приготовления увлажняющих кремов.

Разведение рыбы

Среди липидов, обнаруженных в криле, Calanus и рыбе, в высокой концентрации присутствуют жирные кислоты 20:5 (эйкозапентаеновая кислота) и 22:6 (докозогексаеновая кислота). Данные жирные кислоты являются важными питательными веществами и полезны в качестве корма для рыб. Кроме того, эти важные питательные вещества переходят в пищу человека при питании рыбой, выращенной на таких кормах.

Корм для животных

Рационы питания животных, обогащенные омега-3 жирными кислотами, могут увеличивать уровень ненасыщенных жирных кислот и снижать уровень холестерина в мясе. Данное свойство уже используется в производстве домашней птицы, чтобы улучшить качество яиц.

Известны различные способы экстракции масел морских и пресноводных животных. Например, известно, что рыбий жир экстрагируют с использованием таких органических растворителей, как гексан и этанол. Также известно, что содержание жира в мышечной ткани рыб измеряется с использованием таких растворителей, как ацетон.

В патенте США 4331695 описан способ, в котором используются растворители под давлением, которые являются газообразными при комнатной температуре, такие как пропан, бутан или гексан. Экстракцию выполняют при предпочтительных температурах от 15 до 80°C на перемолотых растительных или тонко измельченных животных продуктах. Затем экстрагированные масла переводят в осадок при высоком давлении и повышенных температурах от 50 до 200°С. Однако гексан является плохим растворителем для экстракции из морских животных, таких как криль. Кроме того, высокие температуры, используемые на этапе осаждения, приводят к негативным изменениям липидов.

В заявке на патент Канады 2115571 описан способ экстракции масел из различных видов бурых и красных водорослей. В способе предлагается, например, экстракция по Сокслету с использованием почти чистого этанола в течение 40 часов.

В патенте США 5006281 описан способ экстракции масла из морских и пресноводных животных, таких как рыбы. Морское и пресноводное животное сначала обрабатывают антиоксидантным соединением, тонко измельчают и центрифугируют, чтобы отделить масляную фазу от водной фазы и твердой фазы. Затем масляную фазу дополнительно обрабатывают антиоксидантом, чтобы удалить нежелательный запах или вкус.

В патенте Канады 1098900 описан способ экстрагирования масел из криля. Способ включает эмульгирование свежего или размороженного криля в водной среде. Масляную фракцию выделяют центрифугированием.

Folch в статье, опубликованной в 1957 году в J. biol. Chem. 226: 497-509 "A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues" предлагает способ экстракции с использованием хлороформа и метанола. Данный способ невозможен в промышленном масштабе из-за токсичности используемых растворителей.

Однако способы предшествующего уровня техники в основном невыполнимы в промышленном масштабе или дают низкий количественный выход. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение усовершенствованного способа экстракции масел морских и пресноводных животных, позволяющего извлекать ценную липидную фракцию и отдельно получать твердый остаток, обогащенный полезными белками, который содержит активные ферменты.

Другие цели и дополнительные рамки применения настоящего изобретения станут очевидными из детального описания, приведенного ниже. Однако следует понимать, что данное детальное описание, хотя и показывает предпочтительные варианты изобретения, дается только с целью иллюстрации, поскольку специалистам в данной области станут очевидными различные изменения и модификации в рамках сути и объема изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Газожидкостная хроматография жирных кислот из сушеного криля (хлороформ-метанол).

Фигура 2. Газожидкостная хроматография жирных кислот из сушеного криля (ацетон).

Фигура 3. Газожидкостная хроматография жирных кислот из замороженного криля (ацетон).

Фигура 4. Газожидкостная хроматография жирных кислот из замороженного криля (этанол).

Фигура 5. Газожидкостная хроматография жирных кислот из замороженного криля (трет-бутанол).

Фигура 6. Газожидкостная хроматография жирных кислот из замороженного криля (этилацетат).

Фигура 7. Тонкослойная хроматография нейтральных липидов Calanus sp. и М. norvegica.

Фигура 8. Тонкослойная хроматография нейтральных липидов Е. pacifica.

Фигура 9. Тонкослойная хроматография нейтральных липидов М. schmitti.

Фигура 10. Тонкослойная хроматография нейтральных липидов G. galeus.

Фигура 11. Тонкослойная хроматография нейтральных липидов морского ангела.

Фигура 12. Тонкослойная хроматография фосфолипидов Calanus sp. и М. norvegica.

Фигура 13. Тонкослойная хроматография фосфолипидов Е. pacifica.

Фигура 14. Тонкослойная хроматография фосфолипидов М. schmitti.

Фигура 15. Тонкослойная хроматография фосфолипидов G. galeus.

Фигура 16. Тонкослойная хроматография фосфолипидов морского ангела.

Фигура 17. Влияние объема ацетона на экстракцию липидов (Е. pacifica).

Фигура 18. Влияние времени инкубации в ацетоне на экстракцию липидов (Е. pacifica).

Фигура 19. Влияние объема этанола на экстракцию липидов (Е. pacifica).

Фигура 20. Влияние времени инкубации в этаноле на экстракцию липидов (Т. raschii).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА

Перед подробным описанием настоящего изобретения следует понять, что изобретение не ограничено в своих применениях описанным здесь в деталях способом. Изобретение допускает другие варианты реализации и использования на практике различным образом. Также следует понимать, что используемая здесь фразеология или терминология предназначена для описания, а не для ограничения.

Способ изобретения включает в себя суспендирование свежесобранного морского или пресноводного материала в ацетоне. Липиды экстрагируются кетоном, таким как ацетон. Это дает возможность для быстрой дегидратации животной ткани и миграции липидной фракции в растворитель. Сухой остаток является ценным продуктом, богатым активными ферментами.

В предпочтительном варианте экстракцию проводят последовательными обработками ацетоном и спиртом. Предпочтительными спиртами являются изопропанол и трет-бутанол. Спирт также может быть заменен сложным эфиром уксусной кислоты, таким как этилацетат. Такая методика дает две последовательные липидные фракции и сухой остаток, обогащенный белком, включая активные ферменты. Извлечение суммарных липидов сравнимо с процедурой Folch et al. (1957), описанной в разделе "Известный уровень техники". Способ тестировали на криле, Calanus, тканях рыб и акул.

Неожиданно было обнаружено, что последовательные экстрагирующие обработки, которые предлагаются в настоящем изобретении, дают лучший выход при экстракции липидов, чем экстракции в системе одного растворителя. Экстракция с использованием двух последовательных растворителей, которая начинается кетоном, таким как ацетон, обладает особым преимуществом, поскольку ацетон в сущности дегидратирует животную ткань. Наличие животной ткани в дегидратированной форме значительно облегчает процесс экстракции вторым растворителем, спиртом или сложным эфиром уксусной кислоты, таким как этилацетат.

В случае зоопланктона, такого как криль и Calanus, и в случае побочных продуктов разделки рыбы на филе, таких как внутренности рыб, отмечается, что экстракция одним ацетоном может быть достаточна, чтобы дать возможность для рентабельного извлечения липидных фракций и отдельного получения сухого твердого продукта, богатого белками, включая активные ферменты.

Далее будет описан общий способ экстракции данного изобретения. Исходный материал, состоящий из свежесобранного и предпочтительно тонко измельченного материала морских и пресноводных животных, подвергают экстракции ацетоном в течение примерно двух часов и предпочтительно в течение ночи. Однако время экстракции не является критическим для выхода продукта экстракции липидов. Чтобы облегчить экстракцию, предпочтительно использовать частицы меньше 5 мм в диаметре. Экстракцию предпочтительно проводят в инертной атмосфере и при температуре порядка примерно 5°С или ниже.

Предпочтительно начало экстракции проводят при перемешивании в течение примерно от 10 до 40 минут, предпочтительно 20 минут. Хотя время экстракции не является критическим, было обнаружено, что наилучшей является 2-часовая экстракция при объемном отношении ацетона к материалу морских или пресноводных животных 6:1.

Солюбилизированные липидные фракции отделяют от твердого материала с использованием стандартных технологий, включая, например, фильтрацию, центрифугирование или осаждение. Предпочтительно используют фильтрацию.

После разделения фильтрацией на устойчивом к органическим растворителям фильтре (металл, стекло или бумага) остаток необязательно промывают чистым ацетоном, предпочтительно двумя объемами (исходный объем материала), чтобы извлечь еще больше липидов. Объединенные фильтраты выпаривают при пониженном давлении. Необязательно можно использовать однократное испарение или распылительную сушку. Водному остатку, полученному после выпаривания, дают возможность отделиться от масляной фазы (фракция I) при низкой температуре.

Твердый остаток, собранный на фильтре, суспендируют и экстрагируют спиртом, таким как этанол, изопропанол, трет-бутанол, или, в альтернативном случае, этилацетатом, предпочтительно двумя объемами (исходный объем материала). Фильтрат выпаривают, получая вторую фракцию липидов (обозначенную как фракция II). Хотя длительность экстракции не является критической, было обнаружено, что время экстракции примерно 30 минут является достаточным при температурах ниже примерно 5°С.

Температура органических растворителей, за исключением трет-бутанола, и температура образца не являются критическими параметрами, но предпочтительно, чтобы они были как можно холоднее. Однако в случае трет-бутанола, который является твердым веществом при комнатной температуре, важно нагреть его перед использованием и сразу же выполнить экстракцию при 25°С.

Сравнительные примеры

Чтобы сравнить эффективность способов экстракции, к крилю была применена классическая технология (Folch et al. 1957) с использованием хлороформа и метанола. Данный способ является эталоном для измерения эффективности способа экстракции. Другое сравнение было проведено с технологией, использующей в качестве растворителя при экстракции гексан. Извлечение липидов оценивали путем суспендирования липидных фракций в небольших объемах их исходных растворителей и гравиметрического измерения небольших аликвот после выпаривания.

Для всех предоставленных здесь примеров способ настоящего изобретения включает в себя экстракцию ацетоном с последующей экстракцией вторым растворителем (например, этил-ацетатом), давая полупрозрачное масло, имеющее вид и свойства более привлекательные, чем у любого масла, полученного с помощью классической технологии Folch et al. (1957).

Чтобы проанализировать липидный состав, 780 мкг каждого экстракта наносили на пластинки силикагеля и фракционировали тонкослойной хроматографией, ТСХ (Bowyer et al. 1962) следующими растворителями. Нейтральные липиды: гексан, этиловый эфир, уксусная кислота (90:10:1, об./об.) и фосфолипиды: хлороформ, метанол, вода (80:25:2, об./об.). Состав жирных кислот Е. pacifica анализировали газожидкостной хроматографией, ГЖХ (Bowyer et al. 1962), включающей некоторые модификации исходной технологии: 2 ч при 65°С вместо 1 ч при 80°С, три промывки гексаном вместо двух и отсутствие промывки водой.

Чтобы избавиться от следов органических растворителей, лилидные фракции I и II нагревали примерно до 125°С в течение примерно 15 минут в инертной атмосфере.

Жир анализировали в соответствии с методикой AOCS (American Oil Chemist's Society). Для анализа экстрагированных липидов использовали следующие критерии: число омыления и йодное число Wijs, и уровни содержания влаги - летучего материала. Также определяли содержание холестерина методом Plummer 1987. Такие же и другие анализы были сделаны независимой лабораторией, которой заведует профессор Роберт Акман (Robert Ackman, Canadian Institute of Fisheries Technology, DalTech, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada). Данные анализы включают йодное число Wijs, значения пероксида и анизидина, состав классов липидов, состав жирных кислот, содержание МЭЖК свободных жирных кислот, холестерина, токоферола, всего транс-ретинола, холекальциферола, астаксантина и кантаксантина.

В таблице 1 показано, что более высокие уровни липидов экстрагируются из сушеного криля ацетоном, а затем этанолом по сравнению с классической процедурой Folch et al. (1957).

В таблице 2 показаны результаты экстракции липидов из замороженных Euphausia pacifica, вида криля из Тихого океана. Если допустить, что содержание воды составляет восемьдесят процентов, содержание липидов сравнимо с сушеным крилем, как показано в таблице 1. Изопропанол, трет-бутанол и этил-ацетат в качестве растворителя для второй экстракции дают менее существенный выход, чем этанол, но не обязательно являются менее эффективными при извлечении липидов, так как этанол несет больше примесей, чем изопропанол, трет-бутанол или этилацетат. Значит, они также могут быть использованы в качестве второго растворителя после ацетона. Различия между результатами ацетоновых экстракций главным образом обусловлены разделением фаз вода-масло. На эти разделения влияет количество остаточного ацетона в водно-масляном растворе после выпаривания ацетона. Это количество ацетона варьирует от одного эксперимента к другому, поскольку система выпаривания, используемая в небольшом масштабе, менее воспроизводима (в промышленном масштабе этап выпаривания будет оптимизирован). Также были испытаны растворители по отдельности на экстракцию всего количества липидов из криля. При этом видно, что этилацетат (степень экстракции 1,37%), так же как гексан в отдельности (степень экстракции 0,23%) не являются достаточно хорошими растворителями по сравнению с ацетоном в отдельности (степень экстракции 1,86%, и даже более высокие степени экстракции при эффективной системе выпаривания ацетона).

Одним из основных преимуществ процедуры является удаление бактерий из экстрактов (липидная фракция и твердый, богатый белками материал). Действительно, образцы Е. pacifica, инкубированные при различных соотношениях ацетона при 4°С в течение 112 дней, высевали на среду NA, содержащую 0,3% мясного экстракта Bacto^TM, 0,5% пептона Bacto^TM и 1,5% агара Bacto^TM (Difco Laboratories, Detroit, USA), затем инкубировали при комнатной температуре или 4°С в течение 18 дней. Не наблюдалось значительного бактериального роста при соотношении 1 объема ацетона на грамм криля. При более высоких пропорциях ацетона (2 объема и 5 объемов) вообще не было бактериального роста, что означает, что ацетон консервирует образцы криля. Ацетон известен как эффективное бактерицидное и противовирусное средство (Goodman et al. 1980).

В таблице 3 показаны выходы липидов из М. norvegica. Процент липидов (3,67%) сравним с процентом, полученным с Е. pacifica (3,11%), показанным в таблице 2. Отклонения могут быть отнесены на счет питания и времени (сезона) сбора, которые отличаются для этих двух видов.

В таблице 4 показано влияние измельчения на эффективность экстракции липидов М. norvegica. Данные экстракции проводили при оптимальных условиях, и они показали несомненное преимущество данной процедуры над классическим способом (4,46% против 3,30%). Также показано, что измельчение может быть важным фактором в том случае, когда вид крупный (4,46% против 3,53%).

В таблице 5 представлены данные по экстракции липидов из Calanus. Были получены большие количества липидов. Некоторые вариации в составе вида Calanus могут объяснить различия между экспериментами 1 и 2 (8,22% и 10,90% сырого веса).

В таблицах 6-8 сообщается об общем количестве липидов, экстрагированных из ткани рыб. Способ данного изобретения был продемонстрирован на макрели, форели и сельди. Способ был продемонстрирован на периферических тканях (главным образом мышцах) и внутренностях. Преимущественно данное изобретение позволяет извлекать ценные липидные фракции из частей рыбы, которые обычно идут в отходы после изъятия филейных частей рыбы. Такие ткани рыб, не используемые после переработки рыбы для потребления человеком, можно хранить в ацетоне, и из них можно экстрагировать липиды согласно данному изобретению, даже если способ Folch [1957] извлекает больше липидов, чем способ заявителей. Действительно небольшие количества липидов были экстрагированы из макрели (0,52% из внутренностей и 1,45% из тканей) способом Folch после первой экстракции ацетоном и этанолом, как описано в данном изобретении. Сравнительные экстракции способом, описанным в данном изобретении, выполненные в параллели со способом Folch на форели и сельди, показали большее извлечение последним способом. Однако заслуживает внимания тот факт, что способ Folch не может применяться для извлечения липидов для коммерческого использования (вследствие токсичности).

В таблицах с 9 по 11 показаны результаты экстракции липидов из тканей печени акулы. Для этого вида нет заметных различий в результатах между технологиями.

В таблице 12 показаны некоторые характерные свойства фракции I (ацетон) и фракции II (спирт или этилацетат) масла криля (Е. pacifica). Прежде всего, число омыления фракции I (130,6) свидетельствует о том, что данная фракция содержит жирные кислоты с более длинными цепями по сравнению с фракцией II (185,7). Йодное число Wijs фракции I показывает, что данная фракция содержит высокие уровни полиненасыщенных жирных кислот по сравнению с оливковым маслом, которое имеет число 81.1. Это объясняет, почему фракция I является жидкой при комнатной температуре. Хорошо известно, что полиненасыщенные жирные кислоты имеют точку плавления ниже точки плавления их насыщенных гомологов. Такие же наблюдения сделаны для фракции II, которая имеет йодное число 127,2. Состав жирных кислот, показанный в таблице 14, подтверждает данные йодные числа: фракция I имеет высокий процент (30,24%) полиненасыщенных жирных кислот (пентаены + гексаены), равно как и фракция II (22,98%). Наконец в таблице 12 также показано, что фракция I после выпаривания растворителя на 10,0% состоит из летучего вещества и влаги. В таком же тесте фракция II дает значение 6,8%. Чтобы избавиться от следов растворителей важно за короткое время нагреть (примерно до 125°С в течение примерно 15 мин) масло в атмосфере азота.

Результаты, полученные для масел криля в соответствии со способом данного изобретения (фракция I, экстрагированная ацетоном, и фракция II, экстрагированная этилацетатом), представлены в таблицах 12, 13, 14, 15, 16 и 17. Заслуживает упоминания тот факт, что в таблице 17 содержание каротиноидов было существенно высоким, как измерено на основе двух каротиноидов, а именно астаксантина и кантаксантина. Действительно, анализы в двух повторах показали значения от 92 до 124 мкг/г липидной фракции для астаксантина и от 262 до 734 мкг/г для кантаксантина. Такие образом, можно сказать, что для целей данного изобретения экстракт криля содержит астаксантина, по меньшей мере, 75 и предпочтительно, по меньшей мере, 90 мкг/г липидной фракции. В случае кантаксантина содержание составляет, по меньшей мере, 250 и предпочтительно, по меньшей мере, 270 мкг/г липидной фракции. Низкие значения для пероксида и анизидина являются благоприятными и являются следствием наличия высоких уровней природных антиоксидантов (астаксантина и кантаксантина). Данные соединения являются показателями благоприятных фармацевтических и косметологических свойств экстракта криля, поскольку высокие уровни каротиноидов свидетельствуют о превосходных характеристиках трансдермального переноса. Таким образом, экстракт криля является хорошим кандидатом для трансдермальной доставки лекарственных средств.

В таблице 18 показан наилучший вариант способа согласно данному изобретению для экстракции липидов тканей пресноводных животных.

Таблица 19 показывает, что ферментативная активность твердой фракции сохраняется после осуществления способа данного изобретения. Действительно, демонстрация этого факта осуществлена для твердого остатка криля, полученного после последовательной экстракции ацетоном и этилацетатом. Протеолитические активности измеряли по освобождению аминогрупп путем спектрофотометрического анализа с использованием в качестве реагента о-фталевого диальдегида. Концентрации белка измеряли методом Бредфорда. Растворимые белки экстрагировали водой и добавляли к 10% концентрату белка сыворотки молока, полученному ультрафильтрацией. В конце инкубации при 37°С в буфере с 50 мМ фосфатом калия добавляли трихлоруксусную кислоту, и измеряли количество NН₃ групп в супернатанте в соответствии с методом Church et al. [1983, J. Dairy Sci. 66: 1219-1227].

На фигурах с 1 по 6 показаны хроматограммы композиции жирных кислот в липидах Е. pacifica. На каждой из них видны и представлены двумя отдельными пиками высокие соотношения 20:5 и 22:6 жирных кислот (типичные для масел морских и пресноводных животных).

Вариации липидных наборов нейтральных липидов (с фигуры 7 по фигуру 11) от одного вида к другому объясняются различиями в источниках питания. В пределах вида (например, Е. pacifica) нет заметных вариаций в наборе липидов, полученных с использованием различных технологий экстракции липидов. Что касается фосфолипидов (фигуры с 12 по 16) наблюдается противоположное: вариации объясняются различными способами экстракции липидов, так как использование одного и того же вида не приводит к одинаковому набору липидов. Липиды видов акулы (экстрагированные указанными способами) и коммерческого рыбьего жира из печени трески (образец, имеющийся в аптеках Uniprix, Province of Quebec, Canada) главным образом состоят из нейтральных липидов, в противоположность фосфолипидам.

Влияние объема растворителя и времени инкубации на эффективность экстракции ацетоном липидов из Е. pacifica показано на фигурах 17 и 18 соответственно. Соотношение 1:6 (мас./об.) давало оптимальный выход, близкий к полной экстракции, через 2 час. Эксперимент этапа второй экстракции выполняли с этанолом. Объем данного растворителя, по-видимому, не является критическим, так как один и тот же выход получали с различными объемами этанола (фигура 19), но время выдерживания в этаноле должно быть, по меньшей мере, 30 минут, о чем свидетельствуют результаты на фигуре 20.

Один из заявителей доктор Adrien Beaudoin исследовал различные фракции липидов криля. Не наблюдалось признаков побочного действия.

Хотя изобретение описано выше по отношению к одной конкретной форме, специалисту в данной области будет очевидно, что его можно модифицировать и усовершенствовать различными способами. Поэтому желательно понимать, что данное изобретение не должно быть ограничено рамками, за исключением условий приведенной далее формулы изобретения.

Демонстрация того, что остаток криля, полученный после экстракции ацетоном и этилацетатом, содержит активности протеолитических ферментов. Протеолитические активности измеряли по освобождению аминогрупп с помощью спектрофотометрического анализа, используя в качестве реагента о-фталевый диальдегид. Концентрации белка измеряли методом Бредфорда.

Источником ферментов был остаток, полученный после экстракции липидов ацетоном и этилацетатом. Растворимые белки экстрагировали водой и добавляли к 10% концентрату белка сыворотки молока, полученному ультрафильтрацией.

В конце инкубации при 37°С в буфере с 50 мМ фосфатом калия добавляли трихлоруксусную кислоту и измеряли количество NН₃ групп в супернатанте в соответствии с методом Church et al. 1983.

Источники информации

Bowyer, D.E., Leat, W.M.F., Howard, A.N. and Gresham, G.A. 1962. The determination of the fatty acid composition of serum lipids separated by thin-layer chromatography; and a comparison with column chromatography. BBA. 70:423-431.

Chandrasekar, В., Troyer, D.A., Venkatraman, J.T. and Fernandes, G. 1996. Tissue specific regulation of transforming growth factor beta by omega-3 lipid-rich krill oil in autoimmune murine lupus. Nutr Res. 16(3): 489-503.

Christensen, M.S., Hoy, C-E. and Redgrave, T.G. 1994. Lymphatic absorption of n-3 polyunsaturated fatty acids from marine oils with different intramolecular fatty acid distributions. BBA. 1215: 198-204.

Church, F.C., Swaisgood, H.E., Porter, D.H. and Catignani, G.L. 1983. Spectrophotometric assay using o- Phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins. J Dairy Sci. 66: 1219-1227.

Difco laboratories. 1984. Difco Manual Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology. 10^th ed. Detroit.

Folch, J., Lees, M. and Sloane-Stanley, G.H. 1957. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. biol. Chem. 226:497-509.

Goodman Gilman, A., Goodman, L.L and Gilman, A. 1980. The Pharmacological Basis of Therapeutics. 6^th ed. Collier Macmillan Canada ltd, Toronto.

Harwood, H.J. and Geyer. R.P. 1964. Biology Data Book. The Federation of American Societies for Experimental Biology, Washington.

Hellgren, L., Karlstam, В., Mohr, V. and Vincent. J. 1991. Krill enzymes. A new concept for efficient debridement of necrotic ulcers. Int J Dermatol. 30(2): 102-103.

Plummer, D.T. 1987. An introduction to practical biochemistry. 3^th ed. McGraw-Hill Book Company, London.

Rawn. J.D. 1990. de biochimie. De Boeck-Wesmael, Bruxelles.

Runge, J.A. and Joly. P. 1994. Rapport sur des en 1994: 7:0 Zooplancton et Calanus) de I'Estuaire et du Golfe du Saint-Laurent. Sargent, J.R. 1997. Fish oils and human diet. Br J Nutr.78 Suppl 1: S5-S13.

Формула изобретения

1. Способ экстракции всех липидных фракций из материала морских и пресноводных животных, включающий следующие стадии: (a) помещение материала морских и пресноводных животных в кетоновый растворитель, предпочтительно ацетон, чтобы достичь экстракции растворимой липидной фракции из указанного материала морских и пресноводных животных; (b) разделение жидкого и твердого содержимого; (c) извлечение первой богатой всеми липидами фракции из жидкого содержимого, полученного на стадии b) выпариванием растворителя, присутствующего в жидком содержимом; (d) помещение указанного твердого содержимого в органический растворитель, выбранный из группы растворителей, состоящей из спирта, предпочтительно этанола, изопропанола или трет-бутанола, и сложных эфиров уксусной кислоты, предпочтительно этилацетата, чтобы достичь экстракции оставшейся растворимой липидной фракции из указанного материала морских и пресноводных животных; e) разделение жидкого и твердого содержимого; f) извлечение второй богатой всеми липидами фракции выпариванием растворителя из жидкого содержимого, полученного на стадии е); g) извлечение твердого содержимого.

2. Способ по п.1, где во время стадии (а) растворитель и животный материал гомогенизируют.

3. Способ по п.1, где во время стадии (d) растворитель и твердое содержимое гомогенизируют.

4. Способ по любому из пп.1-3, где стадии (b) и (d) проводят в атмосфере инертного газа.

5. Способ по любому из пп.1-4, где стадии (b) и (е) осуществляют с помощью методики, выбранной из фильтрации, центрифугирования и осаждения.

6. Способ по любому из пп.1-5, где стадии (с) и (f) осуществляют с помощью методики, выбранной из вакуумного испарения, мгновенного испарения и распылительной сушки.

7. Способ по любому из пп.1-6, где после стадии (b) и перед стадией (с) способ дополнительно включает в себя промежуточный этап промывки твердого содержимого растворителем и добавления полученного в результате промывки раствора к жидкому содержимому стадии (b).

8. Способ по любому из пп.1-7, где после стадии (е) и перед стадией (f), способ дополнительно включает промежуточную стадию промывки твердого содержимого органическим растворителем, выбранным на стадии (d).

9. Способ по любому из пп.1-8, где перед стадией (а) материал морских и пресноводных животных тонко измельчают, предпочтительно до среднего размера частиц 5 мм или меньше.

10. Способ по любому из пп.1-9, где стадию (а) и стадию (b) проводят при температурах растворителя примерно 5°С или ниже.

11. Способ по любому из пп.1-10, где указанным морским и пресноводным животным является зоопланктон.

12. Способ по п.11, где указанным зоопланктоном является криль.

13. Способ по п.12, где указанным зоопланктоном является Calanus.

14. Способ по пп.1-10, где указанное морское и пресноводное животное представляет собой рыбу.

15. Способ экстракции по любому из пп.1-14, в котором извлекают твердое содержимое стадий b) и/или е), и оно состоит из дегидратированного остатка, содержащего активные ферменты.

16. Способ экстракции всех липидных фракций, содержащих астаксантин и кантаксантин, из материала морских и пресноводных животных, выбранных из зоопланктона и рыбы, который включает следующие стадии: (a) помещение указанного животного материала в кетоновый растворитель, предпочтительно ацетон, чтобы достичь экстракции растворимой липидной фракции из указанного материала морских и пресноводных животных; (b) разделение жидкого и твердого содержимого; (c) извлечение богатой липидами фракции из жидкого содержимого выпариванием растворителя, присутствующего в жидком содержимом, посредством чего получают полную липидную фракцию, содержащую астаксантин и кантаксантин.

17. Способ по п.16, где животным материалом является криль.

18. Способ по п.16, где животным материалом является Calanus.

19. Способ по любому из пп.16-18, где во время стадии (a) животный материал гомогенизируют.

20. Способ по любому из пп.16-19, где стадии (b) и (d) проводят в атмосфере инертного газа.

21. Способ по любому из пп.16-20, где стадию (b) осуществляют с помощью методики, выбранной из фильтрации, центрифугирования и осаждения.

22. Способ по любому из пп.16-21, где стадию (с) осуществляют с помощью методики, выбранной из вакуумного испарения, мгновенного испарения и распылительной сушки.

23. Способ по любому из пп.16-22, где, после стадии (b) и перед стадией (с), способ дополнительно включает стадию промывки указанного твердого содержимого растворителем и добавления полученного в результате промывки раствора к жидкому содержимому, полученному на стадии (b).

24. Способ по любому из пп.16-23, где перед стадией (а) материал морских и пресноводных животных тонко измельчают, предпочтительно до среднего размера частиц 5 мм или меньше.

25. Способ по любому из пп.16-23, где стадии (а) и (b) проводят при температурах растворителя примерно 5°С или ниже.

26. Способ экстракции липидов по любому из пп.16-25, в котором извлекают твердое содержимое со стадии b), и оно состоит из дегидратированного остатка, содержащего активные ферменты.

27. Способ экстракции всех липидных фракций из материала морских и пресноводных животных, выбранных из зоопланктона и рыб, который включает следующие стадии: (a) помещение указанного животного материала в смесь растворителей, содержащую ацетон и этанол, чтобы достичь экстракции растворимой липидной фракции из указанного материала морских и пресноводных животных; (b) разделение жидкого и твердого содержимого; (c) извлечение богатой липидами фракции из жидкого содержимого выпариванием растворителя, присутствующего в жидком содержимом, посредством чего получают полную липидную фракцию.

28. Способ по п.27, где животным материалом является криль.

29. Способ по п.27, где животным материалом является Calanus.

30. Способ по любому из пп.27-29, где во время стадии (а) животный материал гомогенизируют.

31. Способ по любому из пп.27-30, где стадии (b) и (d) проводят в атмосфере инертного газа.

32. Способ по любому из пп.27-31, где стадию (b) осуществляют с помощью методики, выбранной из фильтрации, центрифугирования и осаждения.

33. Способ по любому из пп.27-32, где стадию (с) осуществляют с помощью методики, выбранной из вакуумного испарения, мгновенного испарения и распылительной сушки.

34. Способ по любому из пп.27-33, где, после стадии (b) и перед стадией (с), способ дополнительно включает стадию промывки указанного твердого содержимого растворителем и добавления полученного в результате промывки раствора к жидкому содержимому, полученному на стадии (b).

35. Способ по любому из пп.27-34, где перед стадией (а) материал морских и пресноводных животных тонко измельчают, предпочтительно до среднего размера частиц 5 мм или меньше.

36. Способ по любому из пп.27-34, где стадии (а) и (b) проводят при температурах растворителя примерно 5°С или ниже.

37. Способ экстракции липидов по любому из пп.27-36, в котором извлекают твердое содержимое со стадии b), и оно состоит из дегидратированного остатка, содержащего активные ферменты.

38. Экстракт липидов криля, отличающийся тем, что содержание каротиноидов в расчете на астаксантин составляет 75 или более и, предпочтительно, 90 или более мкг/г экстракта криля, а содержание каротиноидов в расчете на кантаксантин составляет 250 или более и, предпочтительно, 270 или более мкг/г экстракта криля.

39. Экстракт липидов криля по п.38, отличающийся тем, что он выбран из группы, состоящей из медицинских продуктов, пищевых добавок с лекарственными свойствами, косметических продуктов, продуктов для разведения рыб и кормления животных.

40. Экстракт липидов криля по п.38, применимый в производстве продукта, выбранного из группы, состоящей из медицинских продуктов, пищевых добавок с лекарственными свойствами, косметических продуктов, продуктов для разведения рыб и кормления животных.

41. Способ экстракции всех липидных фракций из материала морских и пресноводных животных, который включает следующие стадии: (a) помещение материала морских и пресноводных животных в кетоновый растворитель, предпочтительно ацетон, чтобы достичь экстракции растворимой липидной фракции из указанного материала морских и пресноводных животных; (b) разделение жидкого и твердого содержимого; (c) извлечение первой богатой всеми липидами фракции из жидкого содержимого, полученного на стадии b), выпариванием растворителя, присутствующего в жидком содержимом; (d) помещение указанного твердого содержимого в органический растворитель, выбранный из группы растворителей, состоящей из спирта, предпочтительно этанола, изопропанола или трет-бутанола, и сложных эфиров уксусной кислоты, предпочтительно этилацетата, чтобы достичь экстракции оставшейся растворимой липидной фракции из указанного материала морских и пресноводных животных; e) разделение жидкого и твердого содержимого; f) извлечение второй богатой всеми липидами фракции выпариванием растворителя из жидкого содержимого, полученного на стадии е), посредством чего получают полную липидную фракцию.

42. Способ экстракции липидов по п.41, где извлекают твердое содержимое со стадии b) и/или е), и оно состоит из дегидратированного остатка, содержащего активные ферменты.

43. Полная липидная фракция, свободная от токсичных растворителей, экстрагированная из морских или пресноводных животных способом по любому из пп.1-15.

44. Фракция липидов по п.43, отличающая тем, что она выбрана из группы, состоящей из медицинских продуктов, пищевых добавок с лекарственными свойствами, косметических продуктов, продуктов для разведения рыб и кормления животных.

45. Фракция липидов по п.43, применимая в производстве продукта, выбранного из группы, состоящей из медицинских продуктов, пищевых добавок с лекарственными свойствами, косметических продуктов, продуктов для разведения рыб и кормления животных.

46. Полная липидная фракция, свободная от токсичных растворителей, экстрагированная из морских или пресноводных животных способом по любому из пп.16-26.

47. Фракция липидов по п.46, отличающаяся тем, что она выбрана из группы, состоящей из медицинских продуктов, пищевых добавок с лекарственными свойствами, косметических продуктов, продуктов для разведения рыб и кормления животных.

48. Фракция липидов по п.46, применимая в производстве продукта, выбранного из группы, состоящей из медицинских продуктов, пищевых добавок с лекарственными свойствами, косметических продуктов, продуктов для разведения рыб и кормления животных.

49. Полная липидная фракция, свободная от токсичных растворителей, экстрагированная из морских или пресноводных животных способом по любому из пп.27-37.

50. Фракция липидов по п.49, отличающаяся тем, что она выбрана из группы, состоящей из медицинских продуктов, пищевых добавок с лекарственными свойствами, косметических продуктов, продуктов для разведения рыб и кормления животных.

51. Фракция липидов по п.49, применимая в производстве продукта, выбранного из группы, состоящей из медицинских продуктов, пищевых добавок с лекарственными свойствами, косметических продуктов, продуктов для разведения рыб и кормления животных.

52. Полная липидная фракция, свободная от токсичных растворителей, экстрагированная из морских или пресноводных животных способом по любому из пп.41 и 42.

53. Фракция липидов по п.52, отличающаяся тем, что она выбрана из группы, состоящей из медицинских продуктов, пищевых добавок с лекарственными свойствами, косметических продуктов, продуктов для разведения рыб и кормления животных.

54. Фракция липидов по п.53, применимая в производстве продукта, выбранного из группы, состоящей из медицинских продуктов, пищевых добавок с лекарственными свойствами, косметических продуктов, продуктов для разведения рыб и кормления животных.

РИСУНКИРисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20