Способ определения чувствительности организма к фармацевтическим препаратам, стоматологическим материалам

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике. Способ основан на наложении на десну образца испытуемого вещества, подсчете нейтрофилов в смывах из полости рта, взятых до и после контакта слизистой оболочки с веществом, их центрифугировании, определении уровня эмиграции нейтрофилов в полость рта и индекса сдвига нейтрофилов. Подсчет нейтрофилов осуществляют путем окрашивания пероксидазы раствором хромогена. Индекс сдвига нейтрофилов определяют по их оптической плотности по формуле:

При значениях индекса сдвига нейтрофилов в пределах от 0,75 до 1,5 чувствительность организма к испытуемому веществу определяют как нормальную. Способ позволяет сократить сроки исследования при определении чувствительности к фармацевтическим препаратам и стоматологическим материалам.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике.

Известен способ определения лекарственной аллергии путем выявления уровня торможения естественной эмиграции нейтрофилов в полость рта после полоскания рта раствором этого препарата в течение 1 мин (Адо А.Д., Польнер Н.И. Тест торможения естественной эмиграции нейтрофилов in vivo для специфической диагностики лекарственной аллергии. Методические рекомендации. - М., НИИ Иммунологии, 1986. - 20 с.). Этот тест является небезопасным для пациента, т.к. с препаратом контактирует слизистая оболочка всей полости рта. Кроме того, тест трудоемок и предполагает обязательное использование микроскопа.

Известен способ определения повышенной чувствительности организма к местным анестетикам на основе слизисто-десневого теста (Лебедев К.А., Максимовский Ю.М., Кулмагамбетов И.Р. и др., Слизисто-десневой тест для определения гиперчувствительности к местным анестетикам /Маэстро стоматологии. - 2003. - №3 (12). - С.74-78). Способ состоит в том, что носителем тестируемого препарата является лигниновый диск диаметром 10 мм и толщиной 3 мм, который позволяет создать градиент концентрации препарата и обеспечивает длительное воздействие препарата на слизистую оболочку, что позволяет провести более глубокое исследование влияния препарата на клетки организма. Диск, пропитанный раствором препарата, прикладывают к слизистой оболочке десны и выдерживают 50 мин, после чего клетки смывов, взятых до и после воздействия испытуемого препарата, осаждают центрифугированием, определяют количество нейтрофилов в смывах. Определяют индекс сдвига нейтрофилов по их количественному соотношению в смывах. Подсчет клеток осуществляют при помощи светового микроскопа. При значениях 0,8-2,0 определяют нормальную чувствительность организма к препарату. Данный способ является безопасным для пациентов, поскольку он основан на применении концентрации препарата в 10000 раз более низкой, кроме того, с препаратом контактирует не вся поверхность слизистой оболочки полости рта, а лишь небольшая ее часть. Однако и в данном способе оценку результатов осуществляют при помощи светового микроскопа, что ограничивает возможности использования данного способа наличием лаборатории, время оценки результата составляло - 20 мин на 1-го больного. Этот способ выбран за прототип.

Задача изобретения - обеспечение возможности определения чувствительности организма к практически любому веществу, сокращение сроков определения чувствительности организма. Это достигается за счет того, что подсчет нейтрофилов осуществляют путем окрашивания пероксидазы раствором хромогена, а индекс сдвига нейтрофилов определяют по их оптической плотности по формуле:

и при значениях индекса сдвига нейтрофилов в пределах от 0,75 до 1,5 чувствительность организма к испытуемому веществу определяют как нормальную.

В целом время исследования 1-го пациента к 1-му препарату по способу-прототипу занимает 2 часа, а при увеличении количества обследуемых пациентов, например 10 человек, увеличивается, и время исследования занимает 5-6 часов. Затраты времени увеличиваются за счет процедуры оценки результатов - каждый раз на 20 мин. Подсчет результатов под микроскопом - 20 мин на 1 пациента (10 пациентов - 20 мин (10=200 мин).

В предлагаемом способе исследование 1-го пациента занимает 1 час 20 мин, а обследование 10 человек занимает 2 часа 20 мин. Время сокращается за счет того, что оценка результатов осуществляется путем окрашивания пероксидазы раствором хромогена. По предлагаемому способу подсчет результатов 1 пациента - 2 мин (10 пациентов - 2 мин+9 мин (1=11 мин). Кроме того, исследование может проводиться в автоматизированном режиме (одновременно можно исследовать до 96 человек).

Способ осуществляют следующим образом: у пациента берут смыв из полости рта (пациент полощет рот фиксированным количеством физиологического раствора, обычно 8 мл, в течение 1 мин, затем осторожно сливает его обратно в пробирку). Затем к десне прикладывают образец испытуемого вещества. В случае, если испытуемое вещество имеет жидкую консистенцию, то можно применить, например, лигниновый диск диаметром 10 мм и толщиной 3 мм, пропитанный раствором испытуемого препарата в разведении 10^-7 от используемых терапевтических растворов на физиологическом растворе на 50 мин, а при исследовании чувствительности к веществам твердой консистенции, в виде гелей или паст - кусочек этого вещества.

Через 50 мин образец испытуемого вещества удаляют, а у пациента берут еще один смыв из полости рта при соблюдении тех же условий, что и первый смыв. Нейтрофилы из обоих смывов осаждают центрифугированием. Надосадочную жидкость сливают, а клетки отмывают физиологическим раствором, приливая к осадкам 8 мл физиологического раствора и ресуспендируя их (таким образом, удаляют остатки слюны, которая содержит большое количество пероксидазы). Клетки вновь осаждают центрифугированием в том же режиме.

Далее надосадочную жидкость сливают, а к осадкам приливают равное количество дистиллированной воды (обычно 1 мл), тщательно перемешивают. Спустя 2 мин находящиеся в пробирке клетки лизируются, при этом из нейтрофилов высвобождается пероксидаза. В лунки плоскодонного планшета для проведения иммуноферментного анализа заливают по 0,1 мл из каждой пробирки. Приливают по 0,1 мл раствора тетраметилбензидина (ТМБ). При этом уже через 1-5 мин начинает развиваться голубое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации пероксидазы в жидкости. Через 10-30 мин реакцию останавливают, добавляя в лунки 0,1 мл 5%-ного раствора серной кислоты. Результат оценивают визуально (с использованием цветовой шкалы) или при помощи вертикального фотометра. Определяют индекс сдвига нейтрофилов по их оптической плотности (интенсивность окрашивания) по формуле:

и при значениях от 0,75 до 1,5 определяют чувствительность организма к испытуемому веществу как нормальную.

Оценка результатов занимает 2 мин, что в 10 раз меньше, чем по способу-прототипу.

Клинический пример 1.

У пациентки Н. (и/б №6014-03), 43 лет, определяли чувствительность к местным анестетикам с целью подбора препарата для проведения терапевтического стоматологического лечения. В день определяли чувствительность к 1 препарату.

Перед проведением исследования у пациентки брали контрольный смыв: полоскание рта 8 мл физиологического раствора в течение 1 мин. Затем к десне прикладывали лигниновый диск диаметром 10 мм и толщиной 3 мм, пропитанный раствором Ultracaine D-S forte в разведении 10^-7 от терапевтической концентрации. Длительность аппликации составила 50 мин. Затем у пациентки вновь взяли смыв из полости рта в тех же условиях. В обоих смывах клетки осаждали центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали 8 мл физиологического раствора, осадок ресуспендировали. Эту процедуру осуществляли непосредственно после взятия смывов.

Далее клетки обоих смывов осаждали центрифугированием в том же режиме. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали дистиллированную воду до объема 1 мл. Тщательно перемешивали. Через 2 мин по 0,1 мл полученной жидкости заливали в лунки плоскодонных планшетов, туда же приливали по 0,1 мл стандартного раствора ТМБ (производство Хема-Медика, Россия). Спустя 15 мин приливали по 0,1 мл 5%-ного раствора серной кислоты. Измеряли оптическую плотность (ОП) при помощи вертикального фотометра при длине волны 450 нм. ОП контрольного смыва составила 0,412, после аппликации препарата - 1,123, т.е. была в 2,73 раза больше (на 173%). Также можно оценить визуально (с использованием цветовой шкалы). Был сделан вывод о повышенной чувствительности пациентки к данному препарату и невозможности его использования для местной анестезии. При опросе пациентки выяснилось, что ранее выявлялись клинические симптомы аллергии (сыпь) после применения сульфаниламидных препаратов (ультракаин является серосодержащим препаратом).

Аналогичным способом на следующий день у пациентки определяли чувствительность к лидокаину 3% (Россия). ОП контрольного смыва составила 0,533, после аппликации препарата - 0,540, т.е. превышение было в 1,013 (на 1,3%). Был сделан вывод об отсутствии повышенной чувствительности организма к данному анестетику, лидокаин данной фирмы был рекомендован для использования у данной пациентки. Пациентка успешно прошла терапевтическое лечение у стоматолога с применением данного препарата.

Клинический пример 2.

Пациентка Е. (и/б №358-03), 39 лет, обратилась в нашу клинику по поводу болезненности и отека слизистой оболочки в районе 13 зуба. В анамнезе 6 недель назад было проведено лечение периодонтита этого зуба, каналы запломбированы. Рентгеновкий снимок показал удовлетворительное состояние обтурации каналов. Предположили, что у пациентки имеется непереносимость материала, использованного для пломбирования (цинкоксидэвгеноловой пасты). Встали вопросы, во-первых, о подтверждении или опровержении данного предположения, во-вторых, в случае выявления непереносимости данного пломбировочного материала о подборе нового материала для пломбирования. Для проведения слизисто-десневого провокационного теста использовали кусочки готового пломбировочного материала в том виде, в котором им заполняли канал зуба (но не отдельные его компоненты). Перед проведением исследования у пациентки взяли контрольный смыв: полоскание рта 8 мл физиологического раствора в течение 1 мин. Далее к десне прикладывали кусочек испытуемого материала, длительность аппликации составила 50 мин. После удаления материала у пациентки вновь взяли смыв из полости рта в тех же условиях. Клетки в обоих смывах осаждали центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. Измеряли ОП при помощи вертикального фотометра при длине волны 450 нм. ОП, непосредственно после взятия смывов, затем приливали 8 мл физиологического раствора, клетки ресуспендировали.

Отмытые клетки смывов осаждали центрифугированием в том же режиме. Затем надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали дистиллированную воду до объема 1 мл, перемешивали. Через 5 мин по 0,1 мл полученной жидкости заливали в лунки плоскодонного планшета. Приливали по ОД мл стандартного раствора ТМБ. Спустя 25 мин реакцию останавливали добавлением ОД мл 5%-ного раствора серной кислоты. Измеряли ОП при помощи вертикального фотометра при длине волны 450 нм. ОП контрольного смыва составила 0,428, смыва после аппликации материала - 0,830, т.е. коэффициент стимуляции составил 1,94 (превышение клеток составило 94%). Это соответствовало наличию у пациентки реакции средней силы на данный материал, что вполне могло давать имевшиеся у нее клинические проявления. В результате было решено произвести перепломбировку канала.

Для подбора нового пломбировочного материала у пациентки была определена чувствительность к двум пломбировочным материалам: 1) Силдент и 2) цинкоксидэвгеноловая паста (ЦОЭП) так, как описано выше (чувствительность проверяли у материалов - 1 тест в 1 день). При исследовании материала 1 (Силдент) ОП в контрольном смыве составила 0,475, после аппликации препарата - 0,608 (то есть ИС составил 1,28. При исследовании материала 2 (ЦОЭП) оптическая плотность в контрольном образце смыва составила 0,377, после аппликации препарата - 0,622 (то есть ИС составил 1,65). Для пломбирования канала был отобран материал 1 (Силдент). После перепломбирования канала с использованием этого материала клинические симптомы, по поводу которых пациентка обратилась к нам в клинику, исчезли.

Формула изобретения

Способ определения чувствительности организма к фармацевтическим препаратам, стоматологическим материалам, основанный на наложении на десну образца испытуемого вещества, подсчете нейтрофилов в смывах из полости рта, взятых до и после контакта слизистой оболочки с веществом, центрифугировании их, определении уровня эмиграции нейтрофилов в полость рта, определении индекса сдвига нейтрофилов, отличающийся тем, что подсчет нейтрофилов осуществляют путем окрашивания пероксидазы раствором хромогена, а индекс сдвига нейтрофилов определяют по их оптической плотности по формуле

и при значениях индекса сдвига нейтрофилов в пределах от 0,75 до 1,5 чувствительность организма к испытуемому веществу определяют как нормальную.