Способ оценки эффективности противолепрозных лекарственных средств

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, и касается, в частности, способа оценки эффективности противолепрозных лекарственных средств. Способ осуществляют путем микроскопического исследования сыворотки крови, при котором сыворотку крови интактных и зараженных М.leprae животных, получавших исследуемое лекарственное средство, в количестве 20 мкл наносят на поверхность предметного стекла, высушивают при комнатной температуре, затем, просматривая полученные образцы в световом микроскопе при малом увеличении, проводят сравнительный анализ их морфологических картин и при наличии в опытных образцах картины структуропостроения, сходной с таковой у интактных животных, судят об эффективности противолепрозной терапии, а при резких отличиях, выражающихся в нарушении радиальной симметрии трещин, их хаотичном расположении, образовании большого числа полигональных отдельностей, асимметричности расположения моно- и полиморфных конкреций, наличии маркеров воспаления, судят о ее неэффективности. Технический результат: упрощение способа. 5 ил.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, и может быть, в частности, использовано для оценки эффективности противолепрозных лекарственных средств.

Известен способ оценки эффективности противолепрозных лекарственных средств, основанный на методе серийных разведений лекарственного вещества на жидкой питательной среде Школьниковой с использованием в качестве тест-штамма культуры M.lufu (Иртуганова О.А., Урляпова Н.Г. Использование M.lufu для первичного отбора противолепрозных препаратов. // Актуальные вопросы лепрологии. - Астрахань, 1984. - С.147-150).

Однако способ имеет существенные недостатки, которые ограничивают его использование в практической деятельности лаборатории, - трудоемкость, необходимость дорогостоящих биологических сред, оборудования, красителей, длительность исполнения (не менее 20 дней), что не позволяет получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Известен также способ оценки эффективности противолепрозных лекарственных средств, основанный на изучении насыщенности макрофагов культуры лепрозной грануляционной ткани (Анохина В.В. Культивирование in vitro лепрозной грануляционной ткани и действие на нее противолепрозных препаратов. // Автореф. дисс...канд. мед. наук. - М., 1989. - 21 с.).

Недостатками этого способа являются сложность технического исполнения, необходимость наличия специально оборудованного помещения и обученного персонала, необходимость использования дорогостоящего оборудования, длительность исполнения (14 дней), что не позволяет получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ оценки эффективности противолепрозных лекарственных средств, заключающийся в определении количества M.leprae (Shepard C.C., McRae D.H. A method of counting acid-fast bacteria. - Int. J. Lepr. - 1968. - Vol.36. - P.78-82) в мягких тканях лап мышей, зараженных по методу Shepard C.C. (Shepard C.C. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice. - J. Exp. Med. - 1960. - Vol.112. - P.445-454). Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к лабораторным методам исследования, основаны на экспериментальном воспроизведении лепрозной инфекции по C.C. Shepard (1960), а также в микроскопическом исследовании морфологических параметров биологического материала.

Недостатками этого способа являются:

- многоэтапность (приготовление суспензии из мягких тканей подушечек лапок мышей, центрифугирование, приготовление мазка с использованием специальных предметных стекол с нанесенными на них 3 кругами площадью 1 см, высушивание мазка, фиксация, окраска, определение числа М.leprae с использованием иммерсионного объектива);

- трудоемкость (растирание лапок животных производится в ручном гомогенизаторе до однородной суспензии; используемая окраска по Циль-Нильсену включает нанесение карболфуксина через фильтровальную бумагу, подогрев над пламенем горелки до образования паров, последующее промывание проточной водой, обесцвечивание серной кислотой, окрашивание метиленовой синью, окончательное промывание проточной водой; для определения числа М.leprae производится просмотр 20 полей зрения по диаметру каждого круга, после чего вычисляется их количество в 1 мл суспензии по специальной формуле, при невозможности подсчета количества микобактерий суспензия разводится в 10, 100, 1000 и т.д. раз, в этом случае приготовление мазка, его окрашивание повторяются);

- непосредственный контакт с инфицированным материалом;

- необходимость использования дорогостоящих красителей;

- длительность исполнения (не менее 48 часов).

Таким образом, перечисленные недостатки не позволяют получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - упрощение способа. Поставленной задачей было устранение указанных недостатков и создание такого способа определения эффективности противолепрозных лекарственных средств, который позволил бы в короткие сроки, на малых объемах биологических жидкостей, с минимальными материальными затратами определить адекватность проводимой терапии. Это достигается тем, что в способе оценки противолепрозной активности лекарственных средств, включающем микроскопическое исследование высушенной сыворотки крови, сыворотку крови интактных и зараженных M.leprae животных, получавших исследуемое лекарственное средство, в количестве 20 мкл наносят на поверхность предметного стекла, высушивают при комнатной температуре, затем, просматривая полученные образцы в световом микроскопе при малом увеличении, проводят сравнительный анализ их морфологических картин и при наличии в опытных образцах картины структуропостроения, сходной с таковой у интактных животных, судят об эффективности противолепрозной терапии, а при резких отличиях, выражающихся в нарушении радиальной симметрии трещин, их хаотичном расположении, образовании большого числа полигональных отдельностей, асимметричности расположения моно- и полиморфных конкреций, наличии маркеров воспаления, судят о ее неэффективности.

Сыворотка крови является тканью организма, но тканью высокоподвижной за счет слабых межмолекулярных связей между ее элементами. Структуру этих связей можно выявить путем их фиксации, которая достигается в процессе фазового перехода из жидкого состояния в твердое (фиксированное).

Упрощение способа дает возможность исключить многоэтапность, непосредственный контакт с инфекционным материалом, сократить материальные (не требуются специальные стекла, красители, иммерсионные объективы), временные затраты (18-24 часа).

Изложенная сущность изобретения поясняется фотографиями, где:

фиг.1 - морфологическая картина крови интактных животных;

фиг.2 - морфологическая картина сыворотки крови зараженных животных, не получавших лечения;

фиг.3 - морфологическая картина сыворотки крови зараженных животных, получавших основной противолепрозный препарат - дапсон;

фиг.4 - морфологическая картина сыворотки крови зараженных животных, получавших исследуемое соединение D 069;

фиг.5 - морфологическая картина сыворотки крови зараженных животных, получавших исследуемое соединение D 127.

Способ осуществляют следующим образом.

20 мкл сыворотки крови интактных животных и животных, получавших интрагастрально исследуемое лекарственное средство, наносят на поверхность стандартного предметного стекла 75×25 мм и высушивают при комнатной температуре 18-25°С при относительной влажности воздуха 50-70% в течение 18-24 часов. Предварительно стекла замачивают на 24-48 часов в растворе детергента, затем промывают в проточной воде в течение 10 минут и помещают в смесь Никифорова, состоящую из равных соотношений спирта и эфира, на 30 мин. Перед нанесением пробы стекла вытирают сухой безворсовой тканью. Полученные образцы просматривают в проходящем свете при малом увеличении, оценивают их морфологическую картину, после чего производят сравнительный анализ опытных и контрольных препаратов.

Если морфологическая картина образца сыворотки крови опытного (инфицированного, получающего препарат) животного отличается от образца контрольного (интактного) животного нарушением радиальности трещин, их беспорядочным расположением, асимметричностью локализации моно- и полиморфных конкреций, высоким уровнем структурированности (дробление участков на более мелкие), наличием патологических образований в виде языковых структур (маркер воспаления), расщепления образца (маркер интоксикации), то это свидетельствует о неэффективности проводимой терапии.

Если морфологическая картина образца сыворотки крови опытного животного незначительно отличается от образца контрольного (интактного) животного и характеризуется сохранностью радиальной симметрии трещин, однообразием форм секторов, отдельностей, конкреций, отсутствием патологического маркера воспаления (языковые поля), то это свидетельствует о нормализации межмолекулярных связей элементов сыворотки крови инфицированных животных за счет эффективного действия противолепрозного лекарственного препарата.

Предлагаемый способ был успешно апробирован в НИИ по изучению лепры МЗ РФ в течение 2000-2001 г. на 350 мышах линии СВА.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1.

Эксперимент поставлен на 60 мышах линии СВА. 20 мышам, зараженным М.leprae по методу С.С. Shepard, интрагастрально посредством зонда в дозе 25 мг/кг массы вводили основной противолепрозный препарат диаминодифенилсульфон (ДДС, дапсон). В качестве контроля использовали интактных и зараженных животных (40 шт.). По окончании эксперимента в лапах инфицированных животных осуществляли подсчет числа М.leprae по методу С.С. Shepard, D.Н. McRae. Морфоструктурный анализ сыворотки крови экспериментальных животных проводили предлагаемым способом.

Число микобактерий лепры в подушечках лап зараженных животных, не получавших лечения, достигло (2,71±0,49)×10 ⁷ микробных тел/мл. Аналогичный показатель у мышей, получавших дапсон, составил (0,025±0,005)×10⁷ микробных тел/мл, что было достоверно ниже по сравнению с нелеченым контролем (р<0,05) и свидетельствовало об эффективности испытуемого средства.

Морфологическая картина образца сыворотки крови интактных животных, которая была принята нами за норму, характеризовалась радиальной симметрией трещин, однообразием форм основных структурных элементов (секторов, отдельностей, конкреций), отсутствием маркеров воспаления и интоксикации (фиг.1).

Для морфологической картины образца сыворотки крови зараженных животных, не получавших лечения, было характерно нарушение радиальной симметрии трещин, их хаотичное расположение, образование большого числа полигональных отдельностей, а также наличие маркера воспаления - локальных языковых полей. В ряде случаев имела место тенденция формирования двойной фации - признак интоксикации (фиг.2).

Морфологическая картина образцов сыворотки крови инфицированных животных, получавших дапсон, отличалась незначительным нарушением радиальной симметрии трещин. Отмечалась тенденция к однообразию форм секторов, отдельностей, конкреций. Патологические маркеры - воспаления, интоксикации - отсутствовали (фиг.3).

Таким образом, характерными признаками морфограммы зараженных животных являются нарушение секторального ритма, хаотичность расположения трещин, образование большого числа полигональных отдельностей, наличие патологических структурных образований типа “языков Арнольда”. В свою очередь идентичность морфограмм сыворотки крови интактных животных и животных, получавших дапсон, свидетельствует об эффективности ДДС-терапии, что подтверждается также значительным снижением числа М.leprae в мягких тканях подушечек лап животных.

Заключение: испытуемое лекарственное средство по предлагаемому способу оценки является эффективным.

Пример 2.

Эксперимент поставлен на 60 мышах линии СВА. 20 мышам, зараженным М.leprae по методу С.С. Shepard, интрагастрально посредством зонда в дозе 6 мг/кг массы тела вводили исследуемое лекарственное средство D 069. В качестве контроля использовали интактных и зараженных животных (40 шт.). По окончании эксперимента в лапах инфицированных животных осуществляли подсчет числа М.lерrае по методу С.С. Shepard, D.H. McRae. Морфоструктурный анализ сыворотки крови экспериментальных животных проводили предлагаемым способом.

Число микобактерий лепры в подушечках лап зараженных животных, не получавших лечения, достигло (2,71±0,49)×10⁷ микробных тел/мл. Число микобактерий лепры в подушечках лап мышей, получавших лекарственное средство D 069, было достоверно (р<0,05) ниже показателя в контроле и составило (0,02±0,006)×10 ⁷ микробных тел/мл, что свидетельствовало об эффективности исследуемого средства.

Морфологическая картина образца сыворотки крови интактных животных, которая была принята нами за норму, характеризовалась радиальной симметрией трещин, однообразием форм основных структурных элементов (секторов, отдельностей, конкреций), отсутствием маркеров воспаления и интоксикации (фиг.1).

Для морфологической картины образца сыворотки крови зараженных животных, не получавших лечения, было характерно нарушение радиальной симметрии трещин, их хаотичное расположение, образование большого числа полигональных отдельностей, а также наличие маркера воспаления - локальных языковых полей. В ряде случаев имела место тенденция формирования двойной фации - признак интоксикации (фиг.2).

Для морфологической картины образцов сыворотки крови инфицированных животных, получавших исследуемое лекарственное средство, была характерна тенденция формирования секторов выдержанной размеренности, мономорфных отдельностей, конкреций. Маркеры воспаления, интоксикации отсутствовали (фиг.4).

Таким образом, картина структуропостроения сыворотки крови животных опытной группы была максимально приближена к таковой у интактных животных, что соотносилось с результатами подсчета числа М.leprae по С.С. Shepard, D.H. McRae и свидетельствовало об эффективности препарата D 069 в качестве противолепрозного лекарственного средства.

Заключение: испытуемое лекарственное средство по предлагаемому способу оценки является эффективным.

Пример 3.

Эксперимент поставлен на 60 мышах линии СВА. 20 мышам, зараженным М.leprae по методу С.С. Shepard, интрагастрально посредством зонда вводили исследуемое лекарственное средство D 127. В качестве контроля использовали интактных и зараженных животных (40 шт.). По окончании эксперимента в лапах инфицированных животных осуществляли подсчет числа M.leprae по методу С.С. Shepard, D.H. McRae. Морфоструктурный анализ сыворотки крови экспериментальных животных проводили предлагаемым способом.

Число микобактерий лепры в подушечках лап зараженных животных, не получавших лечения, достигло (2,71±0,49)×10⁷ микробных тел/мл. Число микобактерий лепры в подушечках лап мышей, получавших лекарственное средство D 127, составило (2,14±0,3)×10⁷ микробных тел/мл, что было близко к показателям в нелеченом контроле (р>0,05) и свидетельствовало об отсутствии противолепрозной активности у исследуемого средства.

Морфологическая картина образца сыворотки крови интактных животных, которая была принята нами за норму, характеризовалась радиальной симметрией трещин, однообразием форм основных структурных элементов (секторов, отдельностей, конкреций), отсутствием маркеров воспаления и интоксикации (фиг.1).

Для морфологической картины образца сыворотки крови зараженных животных, не получавших лечения, было характерно нарушение радиальной симметрии трещин, их хаотичное расположение, образование большого числа полигональных отдельностей, а также наличие маркера воспаления - локальных языковых полей. В ряде случаев имела место тенденция формирования двойной фации - признак интоксикации (фиг.2).

Морфологическая картина сыворотки крови животных опытной группы характеризовалась асимметричным расположением радиальных трещин, отсутствием тенденции к однообразию форм секторов, отдельностей, конкреций. Отмечался высокий уровень структурированности (большое количество полигональных отдельностей), а также наличие маркеров воспаления (фиг.5).

Таким образом, картина структуропостроения фации сыворотки крови животных опытной группы была аналогична наблюдавшейся у зараженных животных, не получавших средств с антибактериальным действием, что соотносилось с результатами подсчета числа М.leprae по методу С.С. Shepard, D.H. McRae и свидетельствовало о неэффективности исследуемого лекарственного средства.

Заключение: испытуемое лекарственное средство по предлагаемому способу оценки является неэффективным.

Применением предложенного способа по сравнению со способом-прототипом достигается положительный результат, заключающийся в упрощении способа. Способ прост в техническом исполнении и анализе результатов, отсутствует многоэтапность исследований. Длительность осуществления предлагаемого способа по сравнению с прототипом (48 часов) требует 18-24 часов. Преимуществом предлагаемого способа является также необходимость незначительных количеств сыворотки крови, что актуально для экспериментальных исследований. Способ экономичен - не требует наличия специализированной лаборатории, использования дорогостоящей аппаратуры, реактивов, красителей.

Предлагаемый способ может быть рекомендован к использованию в морфологических, биохимических, микробиологических лабораториях.

Формула изобретения

Способ оценки эффективности противолепрозных лекарственных средств, включающий микроскопическое исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что сыворотку крови интактных и зараженных М.leprae животных, получавших исследуемое лекарственное средство, в количестве 20 мкл наносят на поверхность предметного стекла, высушивают при комнатной температуре, затем, просматривая полученные образцы в световом микроскопе при малом увеличении, проводят сравнительный анализ их морфологических картин и при наличии в опытных образцах картины структуропостроения сходной с таковой у интактных животных судят об эффективности противолепрозной терапии, а при резких отличиях, выражающихся в нарушении радиальной симметрии трещин, их хаотичном расположении, образовании большого числа полигональных отдельностей, асимметричности расположения моно- и полиморфных конкреции, наличии маркеров воспаления судят о ее неэффективности.

РИСУНКИ