Агент для использования при трансплантации
Изобретение относится к медицине, конкретно к трансплантологии. Предложен новый агент для защиты тканей, органов и клеток при трансплантации. Агент представляет собой соединение общей формулы (I), в котором значения радикалов указаны в формуле, и ранее был известен в качестве противовоспалительного средства и антиоксиданта. Изобретение позволяет устранить отрицательное воздействие длительного хранения (24 часа) и температуры на функционирование трансплантируемого органа и расширяет арсенал средств заявленного назначения. 7 з.п. ф-лы, 8 ил.
Настоящее изобретение относится к агенту для использования при трансплантации ткани или органа от донора реципиенту, нуждающемуся в таком органе.
Трансплантация тканей (органов) относится к быстро развивающейся области в системе здравоохранения, и число трансплантаций увеличивается с каждым годом. Абсолютно ясно, что запас тканей (органов) крайне ограничен и эти ткани (органы) в обычных условиях пригодны для использования только в течение нескольких часов до трансплантации. Ограничивающим фактором является время от момента взятия данной ткани (органа) у донора до начала функционирования этой ткани (органа) в организме реципиента. Таким образом, временной фактор имеет очень важное значение и требует проведения операций в ночное время (при этом, следует отметить, что проведение операций в дневное время в течение нескольких часов не представляется возможным), транспортировки в машине скорой помощи и воздушным транспортом и проведения непрерывных операций у реципиентов, которыми могут быть вплоть до 5-6 разных пациентов в разных клиниках. В случае трансплантации печени такая операция у реципиента может длиться вплоть до 12 часов.
Термин "ткань", используемый в нижеследующем описании и в формуле изобретения, включает все ткани, органы и клетки, которые могут быть трансплантированы. В настоящем описании эти термины являются взаимозаменяемыми.
При трансплантации имеют место три проблематичных стадии, каждая из которых представляет определенные трудности, связанные с окислительным стрессом, влияющим на качество ткани (органа), т.е. на срок жизнеспособности данной ткани.
I. Время интенсивной терапии донора. Это означает воздействие кислородом (более высоким процентом и при более высоком давлении) и нарушение ряда нормальных функций организма.
II. Время, прошедшее с момента взятия ткани у донора до ее функционирования у реципиента. Это время является в высокой степени критическим. Данный орган охлаждают до 4°С и промывают раствором для его последующего хранения и транспортировки, например UW-раствором. После удаления данный орган хранят в указанном растворе на льду. UW-раствор представляет собой физиологический раствор с добавками для поддержания солевого баланса и для предотвращения повреждения ткани.
III. У реципиента имеется несколько критических стадий, первой является реперфузия, т.е. для повторного возобновления кровотока. Реперфузия вызывает обширную окислительную вспышку. Другими стадиями являются иммунные реакции и продолжительные эффекты в результате транспортировки (частичная гибель некоторых групп клеток).
Оптимизация процедуры трансплантации имеет очень важное значение и жизнь многих пациентов зависит от того, чтобы эффективно проводилась вся процедура и чтобы органы не были повреждены в данном процессе.
Окислительный стресс возникает в том случае, если происходит дисбаланс между окислителями и свободными радикалами и защитными механизмами, такими как действие СОД (супероксид дисмутаза) ферментов и каталазы, ДНК-репарация и т.п. Окислительный стресс представляет собой серьезное или незначительное проявление большинства заболеваний, примерами которых являются инфаркт сердца/головного мозга, травма, сепсис, артрит, заболевания иммунной системы, рак, воспалительные заболевания, инфекционные заболевания и заболевания ЦНС. При всех этих заболеваниях окислительный стресс приводит к повреждению клеток и конечный результат лечения зависит от того, может ли данный орган выжить в период острой фазы заболевания, т.е. ситуации, которая наблюдается во время инфаркта, но может также иметь место при хронических заболеваниях, подобных артриту с постоянным окислительным стрессом суставов.
Настоящее изобретение относится к использованию агента при трансплантации органа от донора реципиенту, нуждающемуся в таком органе. Агент настоящего изобретения может быть использован в различных стадиях, которые связаны с процедурой трансплантации. Таким образом, данный агент может быть а) введен перорально, внутрибрюшинно или внутривенно донору, у которого должен быть взят орган; b) данный агент может быть добавлен в раствор, в котором этот орган должен быть сохранен и транспортирован (например, в UW-раствор), с) данный агент может быть введен перорально, внутрибрюшинно или внутривенно реципиенту, т.е. пациенту, которому должен быть имплантирован данный орган.
В деградации тканей участвуют несколько механизмов, поскольку окислительный стресс поражает ткани несколькими различными механизмами, а именно путем окисления белков, липидов и ДНК. В процессе окисления белков и липидов тканей все структуры в значительной степени разрушаются под действием свободных радикалов, в результате чего происходит потеря их функции, что приводит к гибели клеток и, в конце концов, и к гибели ткани.
В соответствии с настоящим изобретением было неожиданно обнаружено, что при использовании агента, которым является замещенный индолохиноксалин нижеследующей общей формулы I, обеспечивается защита данного трансплантированного органа от деградации, вызываемой окислительным стрессом, в процессе проведения всей последовательности стадий, необходимых для осуществления трансплантации.
Агентом настоящего изобретения, который может быть использован при указанной трансплантации, является соединение нижеследующей общей формулы I:
в которой R1 представляет водород или один или несколько, предпочтительно 1-4, одинаковых или различных заместителей в положениях 1-4 и/или 7-10, выбранных из галогена, предпочтительно Вr, низший алкил/алкоксигруппы, имеющей не более 4 атомов углерода, трифторметильной группы, трихлорметильной группы, а в одном из положений 7-10 R1 может представлять гидроксильную группу;
Х представляет группу -(CH2 )nR2, где R2 представляет азотсодержащий основный остаток, такой как NH2, NHR4 или NR5R6, где R4, R5 и R6 независимо представляют низший алкил или циклоалкил, n равно целому числу от 1 до 4, а R3 представляет водород, низший алкил/циклоалкильную группу, имеющую не более 4 атомов углерода, и физиологически приемлемые продукты присоединения данных соединений с кислотами и продукты присоединения галогенов, предпочтительно продукты присоединения йода, монохлорида йода или монобромида йода.
r1 предпочтительно выбран из водорода и низших алкильных групп, в частности метила. Более предпочтительно, если R1 представляет метил в положениях 2 и 3 и водород в других положениях.
Соединение, которое, как было подтверждено, является особенно эффективным, представляет собой соединение нижеследующей формулы II:
Указанные соединения и способы их получения описаны в патенте ЕР 0238459 и в патенте США 4990510, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Применение агента настоящего изобретения в указанных трех стадиях (I, II и III) имеет профилактические цели и направлено на предупреждение повреждения ткани в процессе трансплантации. Так, например, при обработке ткани, которая должна быть трансплантирована in situ, активируются защитные механизмы, ответственные за выживание данного органа. Таким образом, агент настоящего изобретения действует так, чтобы механизмы деградации тканей подвергались негативной регуляции/блокированию, а это значит, что период хранения и транспортировки ткани будет увеличиваться. Такое увеличение периода времени означает, что в обмене тканями для трасплантации могут участвовать большее число стран и регионов. Таким образом, при трансплантации тканей они подвергаются деградации в том случае, когда ДНК/белок/ферменты данных тканей и т.п. не защищены от деградации.
Общее повреждение ткани может быть измерено путем определения метаболической активности или функции тканей. Так, например, для ткани, подобной печени, такими показателями (индикаторами) является ее способность снижать уровни лактата в крови и продуцировать желчь. Поскольку ДНК контролирует все функции клеток и тем самым всю ткань, окисление ДНК также является фактором риска в отношении жизнеспособности ткани. Окисление ДНК также является промутагенным событием.
При окислении ДНК клетки подвергаются действию реакционноспособного кислорода. Во время этого окислительного стресса гидроксильные и супероксидные радикалы окисляют dG, что приводит к образованию 8-OH-dG, которое представляет собой промутагенное событие, приводящее к разрушению цепи, замещению оснований, размыканию кольца dG и/или воздействию на метилирование ДНК (dG означает дезоксигуанозин, который является одним из оснований ДНК).
Агент формулы I представляет собой важный агент, который может повышать выживаемость клеток и органов в процессе трансплантации посредством резкого уменьшения окислительного стресса. Агент формулы I представляет собой нетоксичное in vivo вещество и способствует защите тканей двумя путями. Во-первых, он блокирует окислительные ферменты (оксидазы), которые генерируют окислители. Во-вторых, он осуществляет регуляцию генов, которые активируют общую защиту клеток. Таким образом, агент формулы I действует не как антиоксидант, а как активатор защитных механизмов клетки путем стимуляции защиты от окислительного стресса.
На фиг.1 проиллюстрированы окислительные повреждения ДНК (8-OH-dG) в перфузионной системе печени.
На фиг.2 проиллюстрирован in vivo-тест крысиной печени для анализа на 8-OH-dG.
На фиг.3 проиллюстрировано индуцирование ишемии в перфузионной системе печени и снижение уровня лактата.
На фиг.4 и 5 проиллюстрированы уровни лактата и выделение желчи из крысиной печени в перфузионных системах.
На фиг.6 и 7 проиллюстрировано общее выделение желчи из крысиной печени в перфузионных системах.
На фиг.8 проиллюстрированы уровни лактата в крысиной печени в перфузионной системе.
Для исследования агентов настоящего изобретения, используемых при трансплантации, крысиную печень тестировали в перфузионном растворе в аппарате искусственного кровообращения "сердце/легкие". Для измерения повреждения органа было проанализировано количество 8-OH-dG в данной печени. В качестве индуктора образования 8-OH-dG в перфузионный раствор добавляли диметилсульфоксид (ДМСО, который представляет собой известное соединение, которое воздействует на клеточные мембраны). В данном эксперименте были использованы различные тестируемые группы, а именно контрольная группа печени, называемая контролем С, которую тестировали без какого-либо добавления в перфузионный раствор; одна группа, которую тестировали с добавлением в перфузионный раствор 100 мкл ДМСО, что приводило к значительному увеличению уровня 8-OH-dG, и три другие различные группы, которые тестировали с добавлением соединения, используемого в настоящем изобретении (В220) в дозах 2, 5 и 10 мг соответственно с последующим добавлением 100 мкл ДМСО. Результаты данного теста можно видеть на фиг.1 прилагаемого графического материала.
На фиг.1 можно видеть, что В220 защищает ДНК от окисления дозозависимым способом. Кроме того, можно видеть, что В220 может снижать уровни 8-OH-dG до значений ниже контрольных (негативная регуляция).
В другом эксперименте крыс тестировали in vivo и их печень анализировали на 8-OH-dG. В этом эксперименте использовали три тестируемые группы. Одна из них представляла собой контрольную группу, другая представляла собой группу, которой перорально вводили 2,7-динитрофлуорен (2,7-dNF), являющийся хорошо известным канцерогеном, обнаруженным в отработанном дизельном топливе, и индуктор образования 8-OH-dG, а третья группа представляла собой группу, которой вводили как 2,7-dNF, так и соединение, используемое в качестве агента настоящего изобретения (В220). В220 вводили через три временных интервала после введения дозы 2,7-dNF, а именно через -48 ч, -24 ч и +6 ч. Все дозы вводили перорально с указанным веществом в кукурузном масле. Контрольная группа получала только носитель. Окисление ДНК (окисление гуанина, 8-OH-dG) измеряли в печени. Образование 8-OH-dG представляет собой промутагенное событие, которое коррелирует с несколькими заболеваниями различных типов, например с раком, диабетом и инфекционными заболеваниями.
Результаты данного эксперимента представлены на фиг.2. На фиг.2 видно, что В220 не только защищает от 2,7-dNF-индуцированного образования 8-OH-dG, но также способствует снижению уровней 8-OH-dG ниже контрольных значений (негативная регуляция).
Был осуществлен третий эксперимент, где у крыс брали печень и подвергали ее перфузии в аппарате "сердце/легкие". Перфузионный раствор представляет собой кровь с имплантированной печенью. Когда эта система достигала равновесия, перфузионный поток прекращался и через 10-20 минут возобновлялся снова, и этот процесс называется реперфузией (ишемия). Известное токсическое действие реперфузии (ишемия/ инфаркт) (повреждение ткани окислительным стрессом) заключается в пониженной способности удаления лактата из перфузата. В этом эксперименте агент настоящего изобретения, используемый при трансплантации (В220), тестировали путем сравнения с тремя различными соединениями, о которых известно, что они обеспечивают защиту ткани, а именно с ацетилсалициловой кислотой (ASA, хорошо известным противовоспалительным и жаропонижающим средством), с клометиазолом (новым сильнодействующим лекарственным средством для лечения повреждения головного мозга после инфаркта) и с витамином Е (хорошо известным антиоксидантом, акцептором свободных радикалов). У контрольной группы (С) индуцировалась только ишемия. В случае других четырех групп перед ишемией к перфузату добавляли указанные вещества (5 мг). В220 представляет собой лишь вещество, которое способствует значительному снижению уровня лактата. ASA, которая, как известно, действует как ингибитор повышения температуры, воспалений и боли, не оказывает какого-либо защитного действия. Аналогичный результат был получен для клометиазола (лекарственное средство для защиты ткани головного мозга после инфаркта) и витамина Е, хорошо известного антиоксиданта и вещества, обеспечивающего защиту тканей.
Результаты указанных тестов проиллюстрированы на фиг.3. На фиг.3 видно, что В220 является лишь одним из тестируемых веществ, которые дают статистически значимую защиту.
Была проведена серия экспериментов на печени крыс с использованием аппарата "сердце/легкие" (фиг.4 и 5).
К контрольному перфузионному раствору печени добавляли лактат и измеряли выделение желчи и уровень лактата в зависимости от времени. Выделение желчи является клиническим параметром функции печени, и чем больше выделение желчи, тем лучше функция печени. Результаты, полученные для контрольных групп, показаны на верхних диаграммах фиг.4 и 5. Нормальная печень очень быстро снижает уровень лактата до in vivo-уровней (3-5 нМ). Нормальное выделение желчи для контрольных групп представлено пунктирной линией.
В следующем эксперименте аппарат "сердце/легкие" выключали на 10 минут, а затем снова запускали для индуцирования окислительного стресса (реперфузии). Количество лактата, которое является мерой повреждения ткани, определяли в зависимости от времени, а также в зависимости от времени определяли выделение желчи, которое является индикатором токсического действия. Результаты показаны на фиг.4, на средней диаграмме, указывающей на высокий уровень лактата (сплошная кривая) и пониженное выделение желчи (пунктирная кривая) после реперфузии. Оба эти эффекта являются показателями повреждения ткани.
Затем был проведен аналогичный эксперимент по реперфузии с применением соединения В220, присутствующего в данной системе в количестве 2 мг. Результаты, выраженные в виде количества лактата и выделения желчи, представлены в нижней диаграмме на фиг.4. Как видно из результатов, представленных на фиг.4, количество лактата и уровни выделения желчи быстро достигали нормальных значений, что указывало на то, что В220 предотвращает повреждение ткани печени, вызываемое реперфузией. Показатели снижения лактата и выхода желчи были лучше, чем у контрольных групп.
В следующем эксперименте (фиг.5) к перфузионной жидкости было добавлено очень токсическое соединение - трифорболовый эфир (ТРА). ТРА представляет собой индуктор воспаления и очень сильный стимулятор роста опухолей. Результаты, выраженные в виде количества лактата и выделения желчи, представлены на средней диаграмме на фиг.5 и указывают на очень ограниченную способность снижать лактат и очень ограниченную способность продуцировать желчь.
Затем повторяли тот же самый эксперимент в тех же условиях за исключением того, что к перфузионному раствору добавляли 2 мг В220. Результаты представлены на нижней диаграмме фиг.5. Исходя из этих результатов можно видеть, что если в данной системе присутствует В220, то токсические эффекты ТРА предотвращаются, и уровни лактата и выхода желчи восстанавливаются (и даже становятся лучше по сравнению с контролем на фиг.5, верхняя диаграмма). Эти данные соответствуют тому факту, что в долговременных экспериментах in vivo B220 может предотвращать очень сильное опухолестимулирующее действие ТРА (самого сильного стимулятора роста опухоли, который известен из экспериментов на животных) и "прекращает" процесс развития опухоли. Механизм действия заключается в блокировании гиперплазии/воспаления.
В следующем эксперименте печень крыс тестировали при изолированной перфузии, где B220 вводили донору. Этим донорам вводили одну дозу B220 за 24 часа до хирургического удаления печени и выдерживали при 30°С в течение 2 ч перед началом перфузии (группа 3). (Для стимуляции трансплантации осуществляли "кратковременное" хранение (2 ч) печени крысы при высокой температуре). Второй группе не вводили B220, а первой группе вводили контроль непосредственно перед началом перфузии. При введении дозы B220 данному донору (вн.бр., за 24 ч до хирургической операции) предотвращение токсических эффектов определяли как общий выход желчи в процессе перфузии. "Транспортировка" и реперфузия продуцировали обширный окислительный стресс, который приводил к повреждению тканей.
На фиг.6 показан общий выход желчи как индикатор повреждения ткани, индуцированного трансплантацией. Контрольные печени были непосредственно трансплантированы в перфузионную систему, а вторую группу печеней выдерживали в течение 2 ч при 30°С перед трасплантацией. Третья группа подвергалась 2-часовой обработке при 30°С, но при введении В220 донорам. Как можно видеть на фиг.6, В220 способствовало полному восстановлению уровня выхода желчи по сравнению с контрольными образцами.
Повторяли тот же самый эксперимент за исключением того, что использовали температуру, которая обычно применяется во время транспортировки печени (4°С). Перед введением в перфузионную систему печень хранили в течение 24 часов. Это время хранения значительно больше по сравнению с 12 ч, которое является максимальным для трансплантируемой печени человека. Как можно видеть на фиг.7, при предварительном введении В220 донору, выход желчи восстанавливался. На фиг.8 проиллюстрировано то же самое протективное действие на уровни лактата. Этот эксперимент был идентичен эксперименту, проиллюстрированному на фиг.6, за исключением используемых времени и температуры.
Данные эксперименты показывают, что агент формулы I защищает печень в условиях трансплантации печени человеку. Это означает, что данный агент может функционировать при температурах хранения (4°С) и времени транспортировки, которые обычно используются при трансплантации печени. Защитное действие данного агента может быть достигнуто путем внутрибрюшинного, перорального или внутривенного введения. Время для предварительной подготовки может быть снижено, если этого требует критическая ситуация. Кроме того, время с момента взятия органа у донора до введения реципиенту может быть, по всей вероятности, продлено до 24 ч, в отличие от 12 ч, как это практикуется в настоящее время.
Исходя из вышеописанных примеров можно видеть, что в случае трансплантации предварительное введение В220 донору способствует эффективному ингибированию окислительного стресса. Такое ингибирование не только предотвращает окислительный стресс, вызываемый транспортированием органа, но даже подавляет окислительный стресс до уровней ниже контрольных значений. Этот эффект в сочетании с очень низкой токсичностью (практически отсутствием токсичности) В220 дает основание предположить, что В220 участвует в нормальной регуляции (защите) от окислительного стресса. Кроме того, липофильный характер В220 способствует его быстрой абсорбции через клеточную мембрану.
Следовательно, что касается трансплантации, то можно утверждать, что появилась возможность увеличения жизнеспособности тканей, то есть увеличения времени транспортировки и хранения тканей (может быть трансплантировано большее количество органов), и увеличились шансы на сохранение жизнеспособности и функции данного органа.
Формула изобретения
1. Применение соединения, которое представляет собой замещенный индолохиноксалин общей формулы I
в которой R1 представляет водород или один или несколько, предпочтительно 1-4, одинаковых или различных заместителей в положениях 1-4 и/или 7-10, выбранных из галогена, предпочтительно Вr, низший алкил/алкоксигруппы, имеющей не более 4 атомов углерода, трифторметильной группы, трихлорметильной группы, а в одном из положений 7-10 R1 может представлять гидроксильную группу;
Х представляет группу -(CH2 )nR2, где R2 представляет азотсодержащий основный остаток, такой, как NH2, NHR4 или NR5R6, где R4, R5 и R6 независимо представляют низший алкил или циклоалкил, n равно целому числу от 1 до 4, а R3 представляет водород, низший алкил/циклоалкильную группу, имеющую не более 4 атомов углерода,
и физиологически приемлемых продуктов присоединения данных соединений с кислотами и продуктов присоединения галогена, предпочтительно продуктов присоединения йода, монохлорида йода или монобромида йода, в целях получения агента для защиты тканей, органов и клеток при трансплантации.
2. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанным соединением является соединение, где R1 представляет метил в положениях 2 и 3 и водород в других положениях.
3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанным соединением является соединение, где R1 представляет гидрокси в одном из положений 7-10, предпочтительно в положении 9.
4. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанным соединением является соединение, где Х представляет СН2N(СН 3)2, а R3 представляет водород.
5. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное соединение добавляют в перфузионный раствор, в котором должен храниться или транспортироваться трансплантируемый орган.
6. Применение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что указанное соединение добавляют в перфузионную систему одновременно с трансплантацией.
7. Применение по любому из пп.1-4, где указанное соединение инъецируют или вводят донору, от которого должна быть взята данная ткань.
8. Применение по любому из пп.1-4, где указанное соединение инъецируют или вводят реципиенту, которому трансплантируют данную ткань.
РИСУНКИ
