Косметические композиции, включающие человеческий сывороточный альбумин, полученный от трансгенных животных, неявляющихся человеком

Изобретение относится к косметологии. Человеческий сывороточный альбумин (HAS) получают из трансгенного животного, не являющегося человеком, и смешивают его с подходящим носителем и/или адъювантом. HAS получают из крупного рогатого скота, овец, свиней, лошадей, грызунов или коз. HAS получают из молока или крови трансгенного животного, не являющегося человеком. HAS получают из яйца трансгенной птицы. Косметическую композицию получают этим способом. Косметическая композиция представляет собой лосьон, крем, гель или масло. Косметическая композиция для применения при косметическом лечении морщин, шрамов и ожоговых ран. Изобретение позволяет удешевить продукт при сохранении его высокой активности. 2 н. и 17 з.п. ф-лы.

 

Настоящее изобретение относится к способам получения косметических композиций, включающих человеческий сывороточный альбумин (HSA), где HSA получен от трансгенных животных. Изобретение, кроме того, относится к косметическим композициям, которые могут быть получены данным способом.

Альбумин является наиболее распространенным растворимым белком позвоночных и в то же время представляет собой белок с самой высокой концентрацией в плазме.

У людей HSA продуцируется в печени в виде глобулярного, негликозилированного белка с молекулярной массой 65 кДа. Данный белок участвует в большом числе существенных функций, которые включают регуляцию кровяного давления и осмотического давления в системе циркуляции, а также транспортировку жирных кислот, аминокислот, желчных пигментов и многих молекул сыворотки.

Для поддержания нормального осмотического давления у пациента, страдающего от потери жидкости, такой как в случае хирургической операции, шока, ожога или отека, HSA вводят в качестве заменителя плазмы. Для данной цели HSA в настоящее время производят путем фракционирования крови, собранной у доноров крови. Однако данный способ получения неизбежно включает опасность контаминации инфекционными агентами, такими как вирус гепатита, вирус иммунодефицита человека, и т.д. Поэтому очистка HSA из крови человека включает пастеризацию продукта и является очень дорогостоящей.

Хорошо известно, что HSA является главным компонентом человеческой кожи. Косметическое применение HSA, выделенного из человеческой крови, предполагалось, но никогда не было реализовано, поскольку такое применение противоречило бы этическим понятиям. Вследствие дорогостоящего способа выделения HSA из крови косметическое применение HSA, полученного таким образом, запрещено, кроме того, из-за стоимости данного белка.

Поскольку возрастает число продуктов крови, таких как факторы коагуляции, получаемых путем рекомбинантной экспрессии генов, кодирующих данные факторы, динамика рынка будет далее повышать относительные стоимости очистки HSA из крови. Для обеспечения достаточной поставки HSA для фармацевтического применения в данной области разработаны различные альтернативные способы получения HSA, в большей части которых применяется рекомбинантная экспрессия генов, кодирующих данный белок.

Клонирование кДНК, кодирующей HSA, в экспрессионный вектор, трансформация бактериальных или дрожжевых клеток хозяина с использованием данного вектора, культивирование трансформированных хозяев и выделение полученного таким образом HSA, описаны, например, в ЕР 074646, ЕР 091527, ЕР 366400 и ЕР 612761. Одна из проблем, связанных с выделением НSА из рекомбинантных клеток хозяина, основывается на том факте, что остаточные микробные компоненты, такие как бактериальные или дрожжевые белки или липиды, являются высоко антигенными для человека и, таким образом, HSA должен быть достаточно очищен.

Тот факт, что HSA как белку-носителю присуща связывающая активность в отношении множества микробных продуктов и компонентов культуры ткани, дополнительно усложняет схему счистки и ее результативность.

В качестве альтернативного способа получения рекомбинантного HSA было предложено получение трансгенных животных, экспрессирующих HSA, предпочтительно с использованием экспрессирующих векторов, способных обеспечивать экспрессию в молоке трансгенных животных. В WО 91/08216, например, описано получение экспрессирующего вектора, включающего полноразмерный геномный ген HSA под контролем 5'- и 3'-регуляторных последовательностей, происходящих от гена αS1-казеина крупного рогатого скота. Данный вектор применяется для трансформации in vitro зрелых и фертилизованных ооцитов путем микроинъекции. Ооциты последовательно культивируют in vitro, переносят в коров и дают возможность развиться в трансгенных животных. HSA секретируется в молоко данных трансгенных животных.

Кроме того, кДНК HSA экспрессировали под контролем промотора β-лактоглобулина в трансгенных животных, что также приводило к секреции HSA в молоко животных (WO 93/93164).

Способы выделения рекомбинантного HSA из молока трансгенных животных также описаны в данной области. Например, в WО 96/02573 описано, что HSA может быть выделен очисткой из молока трансгенных животных по способу, в котором с молока снимают сливки, затем удаляют казеины преципитацией кислотой и подвергают хроматографии с использованием колонки с голубой сефарозой Cibacron, которая подходит для специфичного связывания HSA, и таким образом обеспечивая разделение HSA и соответствующего бычьему белку, бычьему сывороточному альбумину (далее обозначенному как BSA).

BSA широко использовали в качестве активного соединения в косметических препаратах, таких как кремы и лосьоны, для достижения кондиционирования кожи (см. CTFA, Международный словарь косметических ингредиентов). Kligman и Christopher (J.Soc. Cosmetics Chemists, 16 (1965), р.557-562) в этом плане указывают, что очищенный раствор BSA быстро разглаживает мельчайшие морщины на стареющей коже лица. При клиническом исследовании было показано, что данный эффект преимущественно механический и достигается натяжением кожи при высыхании белка (Kligman, A.M. and Papa, С.М., Journ. Soc. Cosm. Chem., Vol. 16 (1965), р.557). Benhaim и Brun (Parfumerie und Kosmetik, Vol. 770 (1996), p.176-180) даже заключают, что в натяжении кожи ни один активный ингредиент до сих пор не мог достичь эффективности, равной эффективности BSA, который также был обозначен как “продукт сравнения” в косметике.

BSA, используемый до сих пор в косметических препаратах, излучали из коровьей крови на скотобойнях.

Помимо его выгодной активности BSA мог бы использоваться в косметических препаратах по нескольким причинам. В первую очередь, людям свойственно контактировать с продуктами, полученными от коров, т.е., белками, углеводами, липидами, жирными кислотами и т.д.; данные продукты, таким образом, в общем обладают малой антигенностью в отношении людей. Кроме того, местное применение белка вызывает меньше аллергических проблем, нежели другие способы применения, например инъекция. Поэтому косметическое применение BSA не требует высокоочищенного белка. Таким образом, BSA доступен по цене, которая позволяет включение его в косметический продукт.

Однако последние сообщения об инфекционных заболеваниях губчатой энцефалопатией (TSE/BSE, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота) и тот факт, что передача данных заболеваний людям через косметический продукт не может быть полностью исключена, привели к ситуации, когда продукты из крупного рогатого скота должны быть удалены из косметических препаратов.

Применение альтернативных источников альбумина описано в данной области ранее. Например, патент США 4863733 относится к способу косметического лечения людей, по которому у человека получают кровь, выделяют альбумин и повторно инъецируют пациенту для достижения кондиционирования кожи вблизи шрамов или областей имплантации. В то время как данный способ может применяться для аутологичного донорства HSA, случаи гетерологичного донорства опять противоречили бы этическим принципам, включали бы риск переноса инфекций и были бы слишком дорогостоящими.

В качестве альтернативных источников альбумина, кроме того, предполагались яйца и свиные яичники или плацента (патент США 2043657 и патент США 3041245).

В ЕР 180968 и ЕР 244849 описаны косметические препараты, содержащие HSA. Заявлено, что HSA может быть получен путем рекомбинантной экспрессии в бактериальных или дрожжевых клетках. Однако, как подчеркивалось выше, экспрессия в микроорганизмах неизбежно ведет к контаминации микробными антигенами и антигенами клеточных культур. Поэтому HSA, полученный из данных источников, необходимо очищать до экстремально высокого уровня, чтобы получить композицию, которая может использоваться людьми.

Очистка будет столь дорогостоящей, что соответствующий способ не приведет к получению коммерческого продукта.

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, таким образом, состоит в получении косметического препарата с приемлемой ценой, который включает активное соединение, превосходящее по характеристике BSA.

Данная проблема решена способом получения косметической композиции, включающей HSA, где

(a) HSA получают из трансгенных животных, не являющихся человеком, и

(b) HSA смешивают с подходящим носителем и/или адъювантом.

Настоящее изобретение также относится к кocмeтичecкoй композиции, которую можно получить по вышеуказанному способу.

В настоящем изобретении раскрыто, что HSA, полученный из трансгенных животных, не являющихся человеком, неожиданно может использоваться для получения косметических композиций. Трансгенных животных обычно содержат в условиях закрытого контролируемого стада, совместимых с хорошей практикой производства. Поэтому сбор сывороточного альбумина от трансгенных животных, которые были специфично отобраны и о которых известно, что они не заражены патогенами и их держали изолированно от других животных, не включает риска передачи инфекционных заболеваний, таких как BSE/TSE.

По настоящему изобретению HSA может быть получен из любого трансгенного животного, не являющегося человеком, которое экспрессирует ген HSA. Однако HSA предпочтительно получают от крупного рогатого скота, овец, свиней, лошадей, грызунов или коз.

Для целей настоящей заявки термин “HSA” применяется для ссылки на человеческие белки суперсемейства альбуминов, первоначально обнаруженные в крови человека, а также их природные или модифицированные синтетически варианты. Некоторое количество полиморфизмов и мутантов человеческого альбумина известно специалистам в данной области (Т.Peters, All about Albumin. Biochemistry, Genetics and Medical Applications, Academic Press Inc., 1996) и охватываются термином “HSA”, так же как фрагменты человеческого белка, включающие по крайней мере 1/3 и предпочтительно 2/3 белковой последовательности.

Другие варианты могут быть получены путем замены, вставки или добавления нуклеотидов к гену, кодирующему HSA и охватываемых термином “HSA”, используемым в настоящей заявке, до тех пор, пока нуклеотидная последовательность HSA еще обладает гомологией, равной по крайней мере 75% по отношению к природной последовательности, где предпочтительной является гомология, равная по крайней мере 85%, и где наиболее предпочтительной является гомология, равная по крайней мере 90%.

Способы трансформации отдельных клеток животных, не являющихся человеком, гетерологичной ДНК, кодирующей интересующий чужеродный белок и регуляторные последовательности для экспрессии данного белка в трансгенном животном, а также способы воспроизводства трансгенных животных хорошо известны специалистам в данной области (WO 91/08216; Bondioli et al., Biotechnology, Vol. 16 (1991), 265; Ebert et al., Bio/Technology, Vol. 9 (1991), 835; Hammer et al., Nature, Vol. 315 (1985), 680; Houdebine L.M. (ed), Transgenic Animals - Generation and Use, Harwood Academic Publishers GmbH (1996), Amsterdam; Pinkert C.A. (ed), Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Academic Press, San Diego (1994), CA)).

Клетки могут трансформироваться нуклеиновой кислотой по любому из множества способов, ранее известных в данной области. Например, трансгенные животные, не являющиеся человеком, могут быть получены по способу, включающему

(а) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей HSA, в подходящую клетку реципиента, не являющегося человеком, и

(b) воспроизводство трансгенного животного, не являющегося человеком, из реципиентной клетки.

Реципиентная клетка предпочтительно представляет собой эмбриональную клетку, но также могут использоваться другие клеточные типы. Воспроизводство трансгенного животного, не являющегося человеком, из эмбриональной реципиентной клетки может включать перенос клетки в животное женского пола, не являющееся человеком, и предоставление возможности развития там эмбриона.

Способ продуцирования трансгенных животных, не являющихся человеком, может, кроме того, включать клонирование животных. Способы клонирования животных хорошо известны специалистам в данной области (Baguisi et al., Nature Biotech., Vol. 17 (1999), 456-461; Campbell et al., Nature, Vol. 380 (1996), 64-66; Cibelli et al., Science, Vol. 280 (1998), 1256; Kato et al., Science Vol. 282 (1998), 2095-2098; Schnieke et al., Science, Vol. 278 (1997), 2130-2133; Vignon et al., C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life Sciences Vol. 321 (1998), 735-745; Wakayama et al., Nature, Vol. 394 (1998), 369-374; Wells et al., Biol. Reprod. Vol. 57 (1997), 385-393; Wilmut et al., Nature, Vol. 385 (1997), 813) и могут легко применяться по настоящему изобретению для получения большого количества трансгенных животных.

В одном из осуществлении HSA получают из молока или крови трансгенного животного, не являющегося человеком, предпочтительно из молока лактирующего крупного рогатого скота.

В альтернативном осуществлении HSA получают из яйца трансгенной птицы. Трансгенная птица предпочтительно представляет собой курицу. Способы экспрессии белков в трансгенных курах так, чтобы белок транспортировался в яйца данных кур, известны в данной области (см., например, Morrison et al., Immunotechnology, Vol. 4 (1998), р.115-125).

Части или продукты трансгенного животного, включающие HSA, например молоко или яйцо, могут непосредственно составлять косметический препарат. Альтернативно HSA может частично или полностью выделяться оттуда. Настоящее изобретение, таким образом, также относится к способу получения косметической композиции, который включает стадию выделения HSA из трансгенного животного.

Многие способы очистки белков известны специалисту в данной области и могут использоваться по настоящему изобретению для получения очищенного HSA. Если, например, необходимо выделять HSA из молока трансгенного животного, не являющегося человеком, способ выделения может включать стадию очистки, которая предпочтительно осуществляется путем фильтрации.

Альтернативно или в дополнение к очистке способ выделения HSA может, кроме того, включать одну или несколько стадий, где HSA преципитирует из раствора, включающего HSA. Например, HSA метет быть получен с высокой чистотой из молока или крови в одну стадию преципитации. Подходящие средства, способные грецилитировать HSA, известны в данной области и могут быть определены специалистом с использованием простых экспериментов. Впоследствии HSA может ресуспендироваться в требуемом растворителе с использованием хорошо известных способов. Предпочтительно, растворитель обладает характеристиками, которые упрощают косметическое применение HSA (рН, подбор ионов).

Способы выделения HSA могут далее включать стадию хроматографической очистки, которая может осуществляться по любому из большого количества способов хроматографии, известных в данной области. Применение аффинной или ионообменной хроматографии является предпочтительным.

По настоящему изобретению HSA, полученный от трансгенных животных, не являющихся человеком, не обязательно требует высокой степени очистки. Препарат HSA, применяемый для составления косметической композиции, таким образом, может, например, еще включать остаточное количество BSA в пределах 0-10% по массе от выделенного HSA, предпочтительно в пределах 0,05-2,5%, наиболее предпочтительно в пределах 0,5-1,0% по массе от выделенного HSA.

Косметические соединения могут, кроме того, включать другие вещества из трансгенных животных, такие как другие белки, липиды, жирные кислоты, углеводы, и т.д. Поскольку большинству людей свойственно контактировать с продуктами данных животных, риск аллергических реакций после применения препарата по настоящему изобретению является низким.

Косметическая композиция, полученная способом по настоящему изобретению, может включать HSA в любом количестве, подходящем для косметического препарата. Обычно количество HSA находится в пределах от 0,1 до 30% по массе от косметической композиции, и предпочтительно в пределах от 1 до 15% по массе от косметической композиции. Концентрация HSA в пределах от 3 до 8% по массе от косметической композиции является наиболее предпочтительной.

Широкое разнообразие носителей и адъювантов для составления косметических препаратов известно специалистам в данной области (только для примера приведена ссылка на Jellinek, Kosmetologie, Dr. Alfred Verlag; Janistyn, Taschenbuch der modernen und Kosmetik, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart; und Bauer et al., Pharmazeutische Technologie, Thieme Verlag). Поэтому тип(ы) носителя и/или адъювантов, подлежащих использованию для получения косметической композиции по настоящему изобретению, зависят от типа косметического продукта, который надлежит получить. Любой из носителей и адъювантов, известных в данной области, которые подходят для введения HSA, могут использоваться по способу получения косметической композиции по настоящему изобретению.

Множество примеров (масло в воде и/или вода в масле) кремов, лосьонов, масел, гелей, гидрогелей, препаратов, блокирующих действие солнечных лучей, препаратов, применяемых после воздействия солнечных лучей, а также препаратов после бритья, описаны в W.Umbach, Kosmetik: Entwicklung, Herstellung u. Anwendung kosmet. Mittel, Thieme, 1955. HSA может быть включен в любой из таких препаратов способами, хорошо известными специалисту в данной области.

Вследствие его разглаживающей и увлажняющей активности HSA предпочтительно включается в “остающиеся на поверхности” (leave-on) продукты, такие как гидрогели, кремы, гели, блокирующие действие солнечных лучей, препараты, применяемые после воздействия солнечных лучей и после бритья, а также карандаши для губ. По настоящему изобретению включение HSA в препараты на основе эмульсий масла в воде или воды в масле и в образующих пленки препараты, что особенно предпочтительно.

Помимо HSA, косметический препарат может включать одно или несколько дополнительных активных соединений, например, антибактериальные или противогрибковые соединения.

В дальнейшем осуществлении настоящее изобретение относится к косметической композиции, которую можно получить способами, детально описанными выше. Косметическая композиция может быть в любой форме известных косметических композиций, но предпочтительно представляется в форме лосьона, крема, геля или масла.

Наконец, настоящее изобретение также относится к применению данных композиций для кондиционирования кожи вообще и конкретно при косметическом лечении морщин, шрамов и ожоговых ран.

1. Способ получения косметической композиции, включающей человеческий сывороточный альбумин (HSA), где

(a) HSA получают из трансгенного животного, не являющегося человеком;

(b) HSA смешивают с подходящим носителем и/или адъювантом.

2. Способ по п.1, где HSA получают из крупного рогатого скота, овец, свиней, лошадей, грызунов или коз.

3. Способ по п.1 или 2, где HSA получают из молока или крови трансгенного животного, не являющегося человеком.

4. Способ по одному из пп.1-3, где HSA получают из молока лактирующей коровы.

5. Способ по п.1 или 2, где HSA получают из яйца трансгенной птицы.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадия получения HSA включает стадию очистки.

7. Способ по п.6, где очистка проводится путем фильтрации.

8. Способ по одному из пп.1-7, где стадия получения HSA включает преципитацию HSA из раствора, содержащего HSA.

9. Способ по любому из пп.1-8, где стадия получения HSA, кроме того, включает стадию хроматографической очистки.

10. Способ по п.9, где стадию хроматографии проводят путем аффинной или ионообменной хроматографии.

11. Способ по любому из пп.1-10, где HSA, выделенный из трансгенных животных, неявляющихся человеком, включает остаточное количество бычьего сывороточного альбумина (BSA) в пределах 0-10% по массе от выделенного HSA.

12. Способ по п.11, где остаточное количество BSA находится в пределах 0,05-2,5% по массе от выделенного HSA.

13. Способ по п.12, где остаточное количество BSA находится в пределах 0,5-1,0% по массе от выделенного HSA.

14. Способ по любому из пп.1-13, где HSA включен в косметическую композицию в концентрации, лежащей в пределах 0,1-30% по массе от косметической композиции.

15. Способ по п.14, где HSA включен в косметическую композицию в концентрации, лежащей в пределах 1-15% по массе от косметической композиции.

16. Способ по п.15, где HSA включен в косметическую композицию в концентрации, лежащей в пределах 3-8% по массе от косметической композиции.

17. Косметическая композиция, полученная способом по любому из пп.1-16.

18. Косметическая композиция по п.17, которая представляет собой лосьон, крем, гель или масло.

19. Косметическая композиция по одному из п.17 или 18 для применения при косметическом лечении морщин, шрамов и ожоговых ран.