Вакцина для специфической профилактики хламидиоза свиней
Владельцы патента RU 2247577:
Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт (RU)
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Вакцина содержит в качестве источника специфических антигенов равную смесь инактивированных очищенных хламидийных антигенов штаммов: "PC-85" - возбудитель хламидиозного аборта свиней и "ЛС-87" - возбудитель хламидиозной пневмонии свиней, выращенных одновременно в желточной и аллантоисной оболочках куриных эмбрионов, с концентрацией хламидий 10-15 мг/мл, адсорбированных на алюмокалиевых квасцах и эмульгированных в масляно-ланолиновом адъюванте, с содержанием 0,1% глутарового альдегида. Применение вакцины в неблагополучных по хламидиозу свиней свиноводческих хозяйствах уменьшает количество абортов и мертворождений у свиноматок, снижает заболеваемость и гибель поросят от хламидиозной инфекции. 10 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к производству вакцины для специфической профилактики хламидиоза свиней, этиологическим агентом которого являются хламидии вида Chlamydia psittaci.
Хламидиоз свиней - инфекционная болезнь, протекающая в виде абортов, бронхопневмоний, уретритов, полиартритов, энцефаломиелитов и других синдромов. Хламидиоз свиней в последние годы получил широкое распространение в свиноводческих хозяйствах страны (Г.П.Щербань и др., Г.Д.Фирсова, Т.Г.Воскресенская. Хламидиоз свиней. //Ж. Ветеринария. - 1978. - №8. - С.55-58; В.А.Бортничук. Хламидиоз свиней// Киев: Урожай, 1991; С.И.Прудников, П.И.Митрофанов, Т.М.Прудникова. Хламидиоз свиней // Хрон. инф. животных. - М.: Колос, 1984. - С.71-76). Для хламидиозной инфекции в целом характерна слабая иммунологическая реакция, тенденция к хроническому и латентному течению с сохранением возбудителя в организме даже после острого переболевания и клинического выздоровления (Хламидиозы сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1984. - С.71-76).
Меры борьбы с хламидиозами свиней как у нас в стране, так и за рубежом до недавнего времени были основаны на применении медикаментозных средств, ветеринарно-санитарных и ограничительных мероприятий. Если при хламидиозе овец и крупного рогатого скота разработаны и внедрены эффективные меры борьбы и специфической профилактики, то при хламидиозе свиней эти вопросы находятся в стадии разработки и апробации. В США в 1979 году A.S.Seawell предложил комплексную вакцину для профилактики хламидиоза овец, крупного рогатого скота и свиней. Препарат представляет собой живую эмбрион-вакцину - приготовленную из штамма хламидий пневмонии кошек, безопасного для с.-х. животных (Seawell A.S. Methods of wsing chlamydia vaccine for preventing and treating bovine and diseases, США). При учете эффективности применения живых вакцин исследователи пришли к выводу, что они более перспективны по сравнению с инактивированными препаратами, но в силу обстоятельств эти препараты не нашли широкого применения в ветеринарии, прежде всего это связано с тем, что живые вакцины имели ограниченный срок хранения (Н.З.Хазипов др. Иммунитет и специфическая профилактика // Хламидиозы с.-х. животных. - М.: Колос, - 1984. - С.193-200).
В нашей стране сотрудниками Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института (Г.П.Щербань, Г.Д.Фирсова, Т.Г.Воскресенская) была предложена поливалентная инактивированная вакцина против хламидиозов свиней, в качестве субстрата хламидий авторы использовали культуру куриных фибробластов (Хламидиоз свиней. Ж. Ветеринария. - 1978. - №8. - С.55-58). Согласно сообщению данная вакцина показала высокую эффективность при профилактике хламидиоза у свиней, лошадей и других видов животных.
Известна выпускаемая биологической промышленностью "Инактивированная эмульсин-вакцина против хламидиозного аборта овец" авторы Ю.Д.Караваев, И.И.Налетов (Авторское свидетельство СССР №692128) рекомендовали данную вакцину для специфической профилактики хламидиоза свиней, однако ее применение не привело к ощутимым результатам (Тр. института ВИЭВ. - 1981. - №53. - С.95-102). Для иммунопрофилактики на крупных свиноводческих комплексах позитивно зарекомендовала себя поливалентная вакцина "Плах" (против парвовирусной инфекции, лептоспироза, болезни Ауески и хламидиоза). В настоящее время вакцина еще проходит испытание в свиноводческих хозяйствах страны (В.А.Бортничук. Хламидиозы свиней //Киев: Урожай, 1991. - С.150).
Наиболее близким аналогом по сущности к предлагаемому изобретению (прототип) является “Вакцина против хламидиоза сельскохозяйственных животных”, содержащая в качестве антигена возбудитель хламидиозного аборта крупного рогатого скота, выращенный в желточной оболочке куриных эмбрионов, инактивированный мертиолятом, а в качестве адъюванта служат раствор тригидрооксиметиламинометана и тетраметилдиамина, раствор акриламинда и метилбисакриламида, раствор персульфата аммония и раствор глутарового альдегида (см. Авт. свид. №826744 “Вакцина против хламидиоза сельскохозяйственных животных”, кл. С 12 N 5/00 за 1984 г.).
Состав вакцины, взятый в качестве прототипа, следующий, мл:
Антигенная жидкость 20-40%-ной суспензии желточных мешков, зараженных хламидиями (ЭЛД 50 10-6,5-7,0) 8-10
Смесь растворов тригидрооксиметиламинометана (0,23%-ным) 1-2
Смесь растворов акриламида (30%-ного) и метилбисакриламида (0,8%-ного) 3-4
1,4%-ный раствор персульфата аммония 1-2
25%-ный раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 0,05 0,038
Недостатком известной вакцины является невысокая эффективность ее против хламидиоза свиней из-за существующих антигенных различий между штаммами хламидий крупного рогатого скота и свиней, а также неочищенность от компонентов желточной оболочки куриных эмбрионов исходной биомассы хламидий, в качестве которой используют 20-40%-ную суспензию возбудителя хламидиозного аборта коров (штамм “250”) и, как следствие этого, слабая иммуногенная активность вакцины, не обеспечивающая формирования длительного и напряженного иммунитета против хламидиоза свиней. Внутри вида Chl. psittaci, изолированного от свиней, штаммы отличаются между собой по биохимическим свойствам, антигенной структуре, а также вирулентностью по отношению к экспериментальным и естественным организмам. Это дает основание утверждать о существовании внутри вида Chl. psittaci серотипов и даже вариантов. Установлено, что штаммы, выделенные от свиней при аборте и бронхопневмонии, имеют существенные антигенные различия, которые необходимо учитывать при конструировании противохламидиозных вакцин. Но некоторые исследователи, исходя из наличия в составе всех хламидий общегруппового термостабильного комплементсвязывающего антигена, высказываются о возможности создания единой вакцины, обеспечивающей защиту от хламидиозов животных всех видов (В.А.Бортничук. Хламидиозы свиней // Киев: Урожай, 1991. - С.152).
Поэтому проблема создания эффективной вакцины против хламидиоза свиней продолжает оставаться актуальной.
Задачей изобретения является получение вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью и широким спектром антигенности при различных клинических формах заболевания свиней.
Сущность изобретения заключается в получении инактивированной вакцины против хламидиоза свиней, содержащей два очищенных антигена из штаммов хламидий вида Chlamydia psittaci: "PC-85" - возбудителя хламидиозного аборта свиней и "ЛС-87" - возбудителя хламидиозной пневмонии свиней, выращенные одновременно в желточной и аллантоисной оболочках куриных эмбрионов, с концентрацией 10-15 мг/мл, адсорбированных на алюмокалиевых квасцах и эмульгированных в масляно-ланолиновом адъюванте, с содержанием 0,1% глутарового альдегида, при следующем соотношении компонентов, об.%:
1. Инактивированные хламидийные антигены из штаммов вида Chl. psittaci, выделенные от свиней.
"PC-85" с титром ЭЛД5010-5,5-10-7,7 в 0,3 мм 24-25
"ЛС-87" с титром ЭЛД50 10-6,5-10-7,7 в 0,3 мм 24-25
2. Масляно-ланолиновый адъювант 48-49
3. Алюмокалиевые квасцы 0,4-0,5
10% раствор глутарового альдегида 0,1-0,15
Входящие в вакцину штаммы хламидий "ЛС-87" и "PC-85" изысканы и являются производственными.
Штамм "ЛС-87" возбудитель хламидиозной пневмонии свиней выделен в 1987 году из легких свиней, отнесен к порядку Chlamydiales, сем. Chlamydiасеае, роду Chlamydia, вида Chlamydia psittaci. Штамму возбудителя хламидиозной пневмонии свиней присвоен регистрационный номер ЛС-87 ДЕП во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ). Штамм депонирован 26 апреля 2000 г.
Штамм "PC-85" возбудитель хламидиозного аборта свиней выделен в 1986 г. от абортированного плода свиньи, отнесен к порядку Chlamydiales, сем. Chlamydiaceae, роду Chlamydia, вида Chlamydia psittaci. Штамму возбудителя хламидиозного аборта свиней присвоен регистрационный номер PC-87 ДЕП во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ). Штамм депонирован 26 апреля 2000 г.
Штамм "ЛС-87" обладает следующими свойствами:
Морфологические признаки. Культура штамма представляет собой мелкие элементарные тельца хламидий, имеющие сферическую форму размером 200-400 нм, которые хорошо воспринимают карбол-фуксин Циля в разведении 1:5 и окрашиваются по модифицированному методу Стемпа в ярко-красный цвет.
Культуральные свойства. Штамм хламидий "ЛС-87" хорошо культивируются в желточной оболочке 6-7-суточных и аллантоисной оболочке 8-9-суточных развивающихся куриных эмбрионов.
Специфическая гибель куриных эмбрионов, инфицированных в желточную полость, отмечается на 5-9-сутки после заражения; при этом возбудитель накапливается в титре 10-5,25-10-6,5 ЭЛД50 в 0,3 мл.
Патогенные свойства. Штамм хламидий "ЛС-87" обладает высокой вирулентностью для лабораторных и восприимчивых животных. При заражении белых мышей и морских свинок интраназально, подкожно и внутрибрюшинно 10%-ной свежеполученной хламидиосодержащей взвесью отмечается 100% заболевание и гибель 31-73% мышей. Морские свинки переболевают, при и/н заражении гибнет около 25% животных. У свиней штамм хламидий "ЛС-87" вызывает пневмонию, рождение мертвых поросят после внутривенного заражения в дозе 5 мл 10-6,5 ЭЛД50 в 0,3 мл.
Антигенные свойства. Оценка антигенных свойств штамма проводилась в РСК, ИФА путем перекрестных исследований антигена, изготовленных из хламидий штамма "ЛС-87" согласно "Инструкции по изготовлению и контролю набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов с.-х. животных", утв. ГУВ Госагропрома СССР в 1988 году с иммунной сывороткой овцы, полученной гипериммунизацией данным штаммом, а также стандартных диагностикумов, изготовленных в условиях лаборатории вирусологии ВНИВИ из штаммов "Ростиново-70" возбудителя хламидиоза овец, штамма орнитоза "Лори", штамма "PC-85" - возбудителя хламидиозного аборта свиней и штамма "ЛС-87" - возбудителя хламидиозной пневмонии свиней (см. таблицу 1).
| Таблица 1 Изучение антигенных свойств штамма хламидий "ЛС-87" | |||||
| № п/п | Гипериммунные сыворотки, полученные к штаммам хламидий | Антигены из штаммов | |||
| ЛС-87 | РС-85 | Ростиново | Лори | ||
| 1. | "ЛС-87" | 160х | 40 | 80 | 20 |
| 2. | "Ростиново-70" | 40 | 80 | 160 | 40 |
| 3. | "Лори" | 10 | 20 | 80 | 20 |
| 4. | "PC-85" | 40 | 160 | 80 | 20 |
| Обозначение: "х" - обратная величина титров антигена. |
Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют о принадлежности штамма "ЛС-87" к хламидиям, антигенно отличающимся от штамма "PC-85", гипериммунные сыворотки и антигены из штамма "PC-85" реагируют с антигеном и сыворотками штамма "ЛС-87" в титрах 1:40, т.е. на два порядка ниже, чем с гомологичным 1:160.
Таким образом, штаммы "ЛС-87" и "PC-85" обладают отличительными антигенными свойствами.
Иммуногенные свойства. Изготовленный из штамма "ЛС-87" антиген в инактивированной адсорбированной эмульгированной вакцине обеспечивает формирование у привитых животных напряженного и длительного иммунитета.
В экспериментальных опытах на белых мышах установлено, что двукратная иммунизация вакциной на основе штамма "ЛС-87" предохраняет белых мышей от развития хламидиозной инфекции после искусственного заражения на 87% штаммом "ЛС-87" и на 30% от штамма "PC-85" (таблица 2).
Таким образом, в опытах на белых мышах установлена высокая иммуногенная активность штамма "ЛС-87", изготовленная на его основе вакцина обеспечивает формирование у привитых животных напряженного иммунитета от гомологичного штамма "ЛС-87", а при заражении штаммом "PC-85" иммунитет слабый.
Штамм "Chlamydia psittaci" "PC-85" обладает следующими свойствами:
Морфологические признаки. Культура штамма представляет собой мелкие элементарные тельца хламидий, имеющие сферическую форму размером 200-400 нм, которые хорошо воспринимают карбол-фуксин Циля в разведении 1:5 и окрашиваются по модифицированному методу Стемпа в ярко-красный цвет.
Культуральные свойства. Штамм хламидий "PC-85" хорошо культивируется в желточной оболочке 6-7-суточных и аллантоисной оболочке 8-9-суточных развивающихся куриных эмбрионов.
Специфическая гибель куриных эмбрионов, инфицированных в желточную полость, отмечается на 5-9 сутки после заражения; при этом возбудитель накапливается в титре 10-6,25- 10-6,5 ЭЛД50 в 0,3 мл.
Патогенные свойства. Штамм хламидий "PC-85" обладает высокой вирулентностью для лабораторных и восприимчивых животных. При заражении белых мышей и морских свинок интраназально, внутрибрюшинно и подкожно 10%-ной свежеполученной хламидиосодержащей взвесью отмечается 100% заболевание и гибель 54-73% зараженных белых мышей. Морские свинки переболевают. У свиней штамм хламидий "PC-85" вызывает аборты, рождение нежизнеспособных поросят после внутривенного заражения в дозе 5,0 мл 10-6,5 ЭЛД50 в 0,3 мл.
Антигенные свойства. Оценку антигенных свойств штамма "PC-85" проводили в (РСК, ИФА) путем перекрестных исследований антигена, изготовленного из штамма хламидий "PC-85" согласно "Инструкции по изготовлению и контролю набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов с.-х. животных", утвержденной ГУВ Госагропрома СССР в 1988 году с иммунной сывороткой овцы, полученной гипериммунизацией данным штаммом, а также стандартных диагностикумов, изготовленных в условиях лаборатории вирусологии ВНИВИ из штаммов "Ростиново-70" - возбудителя хламидиоза овец, штамма орнитоза - "Лори", штамма "ЛС-87" - возбудителя хламидиозной пневмонии свиней и штамма "PC-85" - возбудителя хламидиоза аборта свиней.
Приведенные в таблице 3 данные свидетельствуют о принадлежности штамма "PC-85" к хламидиям, антигенно отличающимся от штамма "ЛС-87". Так гипериммунные сыворотки и антигены из штамма "ЛС-87" реагировали с антигеном и сыворотками из штамма "PC-85" в титрах 1:40, а с гомологичными 1:160.
| Таблица 3 Изучение антигенных свойств штамма хламидий "PC-85" | |||||
| № п/п | Гипериммунные сыворотки, полученные к штаммам хламидий | Антигены из штаммов | |||
| PC-85 | ЛС-87 | Ростиново-70 | Лори | ||
| 1. | "PC-85" | 160х | 40 | 80 | 20 |
| 2. | "Ростиново-70" | 80 | 40 | 160 | 40 |
| 3. | "Лори" | 10 | 20 | 80 | 20 |
| 4. | "ЛС-87" | 40 | 160 | 80 | 20 |
| Обозначение: "х" - обратная величина титров антигена. |
Таким образом, антигенные свойства штамма "PC-85" - возбудителя хламидиозного аборта свиней отличаются от антигенных свойств штамма "ЛС-87" - возбудителя хламидиозной пневмонии свиней.
Иммуногенные свойства. Использование в качестве антигена биомассы, приготовленной из штамма "PC-85" в инактивированной адсорбированно-эмульгированной вакцине, обеспечивает формирование у 80% привитых животных напряженного и длительного иммунитета.
В экспериментальных опытах (таблица 4) при двукратной иммунизации белых мышей вакциной на основе штамма "PC-85" установлено, что она предохраняла белых мышей от развития хламидиозной инфекции после искусственного заражения их вирулентными штаммами возбудителя хламидиоза аборта свиней "PC-85" на 80% и на 36% от возбудителя хламидиозной пневмонии свиней (штамм "ЛС-87").
Таким образом в опытах на белых мышах установлена высокая иммуногенная активность штамма "PC-85". Изготовленная на его основе вакцина обеспечивает формирование у привитых животных напряженного иммунитета.
При сравнительной оценке двух штаммов "PC-85" и "ЛС-87", относящихся к одному виду Chl. psittaci, были выявлены существенные различия в вирулентности, иммуногенности и антигенности (таблица 5). Так при внутрибрюшинном способе заражения белых мышей штаммом "PC-85" наблюдалась гибель белых мышей более 73%, а при подкожном и интраназальном способах 54-57%. У штамма "ЛС-87" наибольшая гибель белых мышей наблюдалась при интраназальном способе заражения - 73%, а при подкожном и внутрибрюшинном - 31-34% соответственно. При заражении морских свинок штаммом "PC-85" все животные переболевали, тогда как при заражении штаммом "ЛС-87" более 25% морских свинок из числа заболевших погибали от пневмонии.
Существенные различия в клинических признаках наблюдали при заражении свиней штаммами "PC-85" и "ЛС-87". Так, у животных, зараженных штаммом "PC-85", в основном отмечали аборты и рождение нежизнеспособного приплода, а при заражении штаммом "ЛС-87" в клинике заболевания преобладала пневмония. Таким образом на основании изучения биологических свойств штаммов "PC-85" и "ЛС-87" установили межштаммовые различия в вирулентности по отношению к экспериментальным и естественным животным.
При изучении антигенных свойств штаммов "PC-85" и "ЛС-87" выявили, что антигены и сыворотки, полученные к штаммам "PC-85" и "ЛС-87", реагируют с сыворотками и антигенами из штаммов "ЛС-87" и "PC-85" на два порядка ниже, чем с гомологичными. Таким образом установили, что штаммы "PC-85" и "ЛС-87" значительно отличаются в антигенном отношении.
Сравнительное изучение иммуногенных свойств штаммов "PC-85" и "ЛС-87" показало, что иммунизация белых мышей штаммов "PC-85" предохраняет белых мышей от развития хламидиозной инфекции после заражения штаммом "PC-85" на 80% и на 36% от штамма "ЛС-87". Иммунизация белых мышей штаммом "ЛС-87" предохраняла их от развития хламидиозной инфекции после заражения штаммом "ЛС-87" на 87% и на 30% от возбудителя хламидиозного аборта свиней (штамм "PC-85").
| Таблица 5 Сравнительная характеристика свиных штаммов хламидий: "PC-85" - возбудителя хламидиозного аборта и "ЛС-87" возбудителя хламидиозной пневмонии | |||
| № п/п | Данные | Штаммы | |
| PC-85 | ЛС-87 | ||
| 1. | 2. | 3. | 4. |
| Патогенность | |||
| Для белых мышей в процентах гибель при способе заражения | |||
| 1. | Интраназально | 57±2 | 73±2 |
| 2. | Подкожно | 54±3 | 31±4 |
| 3. | Внутрибрюшинно | 73±2 | 34±3 |
| Морских свинок в процентах | |||
| 1. | Подкожно | переболевают | переболевают |
| 2. | Внутрибрюшинно | переболевают | переболевают |
| 3. | Интраназально | переболевают | 25±2 гибель от пневмонии |
| Свиней | |||
| 1. | 2. | 3. | 4. |
| 1. | внутривенно, внутримышечно | аборты, рождения мертвых и нежизнеспособных поросят | пневмония, рождения мертвых поросят |
| Антигенным свойствам | |||
| Сывороткой, полученной к штаммам: | Антиген из штамма "PC-85" | Антиген из штамма "ЛС-87" | |
| 1. | PC-85 | 160х | 40 |
| 2. | Ростиново-70 | 80 | 40 |
| 3. | Лори | 10 | 20 |
| 4. | ЛС-87 | 40 | 160 |
| х - обратная величина титров антител | |||
| Иммуногенным свойствам | |||
| Процент выживания белых мышей, иммунизированных штаммами: | |||
| 1. | PC-85 | 80+4 | 36±5 |
| 2 | ЛС-87 | 30±4 | 87±2 |
| Контроль | 23±2 | 30±4 |
Таким образом, в опытах по изучению иммуногенных свойств штаммов "PC-85" и "ЛС-87" установили, что изготовленные на их основе препараты обеспечивают формирование у привитых животных напряженного иммунитета от заражения гомологичными штаммами, и слабый - от гетерологичного штамма.
Полученные данные при изучении иммуногенных свойств "свиных" штаммов: "PC-85" и "ЛС-87" свидетельствуют о разной их иммуногенной активности и, как следствие, слабом перекрестном иммунитете.
Таким образом, работа, проведенная нами по сравнительному изучению свойств свиных штаммов хламидий "PC-85" и "ЛС-87", показала, что выделенные штаммы значительно отличаются между собой, хотя и относятся к одному и тому же виду хламидий - Chl. psittaci. Полученные данные служили научной предпосылкой при конструировании противохламидиозной свиной вакцины. Поэтому для повышения эффективности созданной противохламидиозной свиной вакцины были взяты два штамма: возбудителя хламидиозного аборта свиней "PC-85" и возбудителя хламидиозной пневмонии свиней "ЛС-87", тем самым мы добились значительного повышения иммуногенности созданной вакцины за счет расширения спектра антигенности и иммуногенности препарата, что является отличительным признаком созданной противохламидиозной вакцины от существующего прототипа.
Пример 1. Приготовление нативных суспензий хламидий свиней.
Используют куриные эмбрионы 6-7-дневного возраста, половину которых заражают в желточную полость суспензий свежепассированных штаммов хламидий "PC-86" возбудителя хламидиозного аборта свиней и вторую половину "ЛС-88" возбудителем хламидиозной пневмонии свиней, разведенной до 10-4 в дозе 0,3 мл. Инфицированные эмбрионы инкубируют при 37-38°С в течение двух дней, затем проводят овоскопию, отбирают и уничтожают павших (неспецифическая гибель), а живые эмбрионы заражают повторно в аллантоисную полость суспензией, разведенной до 10-3 в дозе 0,3 мл соответственно штаммами "PC-86" и "ЛС-87". Далее зараженные эмбрионы инкубируют при 37-38°С в течение 7-8 дней. Специфическая гибель 90-95% инфицированных эмбрионов происходит на 6-9 дни после первичного заражения. Павшие эмбрионы охлаждают и вскрывают. От каждого эмбриона отсасывают 4-5 мл хламидиосодержащей аллантоисной жидкости и отбирают 1-2 г хорин-аллантоисной и - желточной оболочек вместе с сопутствующим желтком.
Хламидиосодержащий материал до использования хранят в замороженном при минус 20-30°С состоянии. Аллантоисную жидкость перед заморозкой осветляют центрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение 30 минут.
Для получения полуфабриката вакцины из хламидиосодержащего материала двух штаммов готовят 10%-ную исходную суспензию на фосфатно-буферном физиологическом растворе (ФСБ) рН 7,2-7,4 следующим образом: хламидиосодержащие оболочки взвешивают, подвергают термолизису путем трехкратного замораживания и оттаивания и суспендируют до 20%-ной концентрации на коллоидной мельнице, добавив расчетное количество ФБР. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут и отсасывают средний слой центрифугата - взвесь хламидий. Осадок тканей и верхний желточный слой повторно гомогенизируют в таком же количестве ФБР, центрифугируют в тех же условиях и снова отсасывают суспензию хламидий.
Замороженную хламидиосодержащую аллантоисную жидкость размораживают по возможности быстро в водяной бане при температуре 37°С, интенсивно встряхивая флакон с целью предотвращения образования крупных хлопьев. Размороженную слегка опалесцирующую аллантоисную жидкость разводят в соотношении 1:1 с ФБР.
Пример 2. Объединение штаммов хламидий и инактивация.
Хламидиосодержащие суспензии инфицированных оболочек и аллантоисной жидкости штаммов "PC" и "ЛС" объединяют и добавляют формальдегид в конечной концентрации 0,2%. Суспензию после добавления реагентов перемешивают и выдерживают в течение 48 часов при температуре 37-38°С для инактивации хламидий. Хламидий из инактивированной суспензии осаждают путем центрифугирования ее при 18-20 тыс. об/мин в течение 60 минут. Надосадочную жидкость вместе с верхним желточным слоем удаляют, осадок элементарных телец хламидий взвешивают и ресуспендируют в соотношении 1:25 с ФБР, содержащим 0,1% глутарового альдегида.
Стандартизацию суспензии по содержанию элементарных телец хламидий осуществляют путем определения ее оптической плотности. Для этого из приготовленной взвеси хламидий готовят разведение 1:10 (к 0,5 мл взвеси добавляют 4,5 мл ФБР) и измеряют коэффициент поглощения на ФЭК 56 М при длине волны 540 нм в кюветах с рабочей длиной 10 нм. Оптимальным для получения иммуногенной вакцины является коэффициент поглощения, равный 1,4-1,6 единиц, что соответствует содержанию 10-15 мг антигена в одном мл суспензии.
Стандартизированную взвесь хламидий пропускают через коллоидную мельницу, добавляют алюмокалиевые квасцы в конечной концентрации 0,5% и снова гомогенезируют в течение 5 минут, затем взвесь сливают в стеклянные баллоны и помещают в рефрижератор при 4-6°С на 1-2 сутки. В этих условиях хламидий адсорбируются на алюмокалиевых квасцах и осаждаются в виде хлопьев. Надосадочную жидкость осторожно отсасывают и удаляют, а осадок ресуспендируют до исходного объема фосфатно-буферным раствором, содержащим 0,1% глутарового альдегида. Полученные полуфабрикаты вакцины с консервантом хранят в рефрижераторе при 4-6°С.
Пример 3. Приготовление вакцины.
Для изготовления 1 литра вакцины берут 450 мл инактивированного антигена Chlamydia psittaci штаммов "ЛС-87" и "PC-86", содержащего 10-15 мг/мл хламидий, адсорбированных на алюмокалиевых квасцах с 0,1% глутарового альдегида. Добавляют 550 мл стерильной масляно-ланолиновой смеси в соотношении 84-16. Пропускают через коллоидную мельницу и расфасовывают в стерильные флаконы по 100 мл.
При изменении минимума или максимума в соотношениях компонентов при изготовлении вакцины происходит расслоение эмульсии на водную и масляную фракции, что снижает иммуногенность эмульсионной вакцины.
Пример 4. Контроль вакцины на стерильность, безвредность и на антигенную и иммуногенную активность.
Контроль вакцины на стерильность, стойкость эмульсии и безвредность проводится по общепринятым методам.
Испытывалось 10 серий вакцины на лабораторных животных и беременных подсвинках. Белых мышей массой 16-18 г вакцинировали внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл, морских свинок подкожно по 1,0 мл с последующим наблюдением за состоянием подопытных животных в течение 14 и 23 дней соответственно.
Падежа лабораторных животных после вакцинации в течение срока наблюдения не установлено. Общее состояние вакцинированных животных во всех сериях опытов было удовлетворительным. Испытуемые серии вакцины против хламидиоза свиней были стерильны, безвредны (таблицы 6, 7).
| Таблица 6 Результаты изучения стерильности экспериментальных серий вакцины против хламидиоза свиней | |||||||
| № п/п | Номера серии вакцины | Бактериальные питательные среды | |||||
| МПБ | МПА | МППБ | Сабуро | ||||
| 1. | №1 | стерильно | стерильно | стерильно | стерильно | ||
| 2. | №3 | стерильно | стерильно | стерильно | стерильно | ||
| 3. | №5 | стерильно | стерильно | стерильно | стерильно | ||
| 4. | №8 | стерильно | стерильно | стерильно | стерильно | ||
| 5. | №13 | стерильно | стерильно | стерильно | стерильно | ||
| 6. | №14 | стерильно | стерильно | стерильно | стерильно | ||
| 7. | №19 | стерильно | стерильно | стерильно | стерильно | ||
| 8. | №20 | стерильно | стерильно | стерильно | стерильно | ||
| 9. | №23 | стерильно | стерильно | стерильно | стерильно | ||
| 10. | №24 | стерильно | стерильно | стерильно | стерильно | ||
| Таблица 7 Результаты изучения безвредности экспериментальных серий вакцины против хламидиоза свиней на белых мышах и морских свинках | |||||||
| № п/п | Номера серии вакцины | Вакцинировано | Снято с контроля | Пало животных | |||
| б/м | м/с | б/м | м/с | б/м | м/с | ||
| 1. | №1 | 12 | 4 | 12 | 4 | 0 | 0 |
| 2. | №3 | 12 | - | 12 | - | 0 | - |
| 3. | №5 | 15 | 4 | 15 | 4 | 0 | 0 |
| 4. | №8 | 15 | - | 15 | - | 0 | - |
| 5. | №13 | 10 | 4 | 10 | 4 | 0 | 0 |
| 6. | №14 | 12 | 2 | 12 | 2 | 0 | 0 |
| 7. | №19 | 12 | - | 12 | - | 0 | - |
| 8. | №20 | 12 | 4 | 12 | 4 | 0 | 0 |
| 9. | №23 | 12 | - | 12 | - | 0 | - |
| 10. | №24 | 10 | 4 | 10 | 4 | 0 | 0 |
| ВСЕГО: | 122 | 22 | 122 | 22 | 0 | 0 | |
| Примечание: б/м - белые мыши; м/с - морские свинки. |
Контроль иммуногенности проводят на морских свинках. Животных вакцинируют в дозе 0,5 мл подкожно в области лопатки справа и слева (по 0,25 мл). Вакцинация способствует выработке специфических хламидийных комплементсвязывающих антител на 30-35 день в титрах 1:5-1:80 (средний арифметический титр не ниже чем 1:20) (таблица 8).
Контроль иммуногенной активности вакцины против хламидиоза свиней проводят на белых мышах. Мышей вакцинируют подкожно в дозе 0,1-0,15 мл. Контрольное заражение опытных и интактных животных проводят штаммами хламидий “PC-86” и “ЛС-88” внутрибрюшинно в дозе 0,5 мл через 30 дней после иммунизации. Выживаемость белых мышей после контрольного заражения вирулентными культурами хламидий штаммом “PC-86 и “ЛС-88” колебалась в пределах 73-85% (79,6±4,3%) и 73-80% (76,6±2,4%) соответственно. Средний процент выживаемости вакцинированных мышей после контрольного заражения составил 78,2±2,1% (таблица 9). В группах контрольных мышей после заражения отмечается 100% клиническое заболевание и гибель от 60 до 80% животных. Выживаемость интактных мышей после заражения штаммами хламидий “PC-86” и “ЛС-88” колеблется в пределах 20-26% (24±2,4%) и 28-40% (35,6±4,7%) соответственно.
В опытах на свиноматках в экспериментальных условиях было установлено, что однократное внутримышечное введение вакцины в дозе по 2,0 мл свиноматкам предохраняет их от развития хламидиозного аборта и пневмонии свиней после контрольного заражения вирулентными штаммами хламидий "PC-86" и "ЛС-88" (таблица 10).
Вакцину применяют с профилактической целью в хозяйствах и племпредприятиях, неблагополучных по хламидиозу свиней. Вакцинируют клинически здоровых животных однократно. Больных хламидиозом животных перед вакцинацией подвергают лечению антибиотиками тетрациклинового ряда. Свиноматок и ремонтных свинок вакцинируют за 15-20 дней до осеменения или случки. Вакцину применяют свиньям внутримышечно в области шеи в дозе: взрослым животным - 2 мл; 3-6-месячным свиньям - 1 мл. У вакцинированных животных на месте введения вакцины наблюдают местную реакцию в виде небольшой припухлости, которая исчезает в течение 2-4 недель. Иммунитет у привитых животных наступает через месяц после прививки и сохраняется в течение шести месяцев. Срок годности вакцины 1 год.
Производственное испытание вакцины, изготовленной в лаборатории вирусологии во ВНИВИ (г.Казань), проводили в условиях свинокомплекса "Сосновоборский" Республики Татарстан, совхозе им.Г.Д. Гая Сенгелеевского района Ульяновской области, в совхозе "Звениговский" Марий-Эл и хозяйствах Чувашии Урмарского района: СХП "МИР", КЛП им. "Мичурина", ПСХ "Чакинское". Данные по вакцинации против хламидиоза свиней в неблагополучных хозяйствах Татарстана, Марий-Эл, Чувашии и Ульяновской области представлены в таблице 11, из которой следует, что в результате применения вакцины количество абортов и мертворождений в 6-ти неблагополучных хозяйствах до вакцинации колебались в пределах 10,6-66% (в среднем 48%); падеж и вынужденный убой поросят составил от 8-43% (в среднем 26%).
В результате применения вакцины количество абортов и мертворождений в этих хозяйствах составило от 1,0-16,0 (в среднем 8%), т.е. уменьшилось в 6 раз. Также значительно (в 2,3 раза) сократилась заболеваемость, падеж и вынужденный убой поросят от хламидиозной инфекции.
За период 1995-2000 г. изготовлено более 200000 доз вакцины против хламидиоза свиней, которая используется в 22 неблагополучных по хламидиозу свиней хозяйствах Российской Федерации (таблица 12), в том числе в двух крупных свиноводческих комплексах: "Сосновоборский" Республики Татарстан и "Звениговский" Республики Марий-Эл.
Опыты по широкому производственному испытанию разработанной нами инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней в различных регионах показали, что вакцина обладает высокой эффективностью и при систематическом использовании обеспечивает стабилизацию эпизоотической ситуации по хламидиозу и оздоровление свинопоголовья от хламидиозной инфекции.
| Таблица 10 Данные до вакцинации свиней против хламидиоза в неблагополучных хозяйствах РФ | |||
| № п/п | Области и республики РФ | Количество хозяйств | Количество вакцинированных свиней |
| Республики | |||
| 1. | Татарстан | 8 | 22450 |
| 2. | Марий-Эл | 3 | 9600 |
| 3. | Чувашия | 1 | 400 |
| 4. | Башкортостан | 1 | 3000 |
| 5. | Мордовия | 2 | 1650 |
| Области | |||
| 1. | Пермская | 3 | 2400 |
| 2. | Курская | 1 | 6000 |
| Приморский край | 3 | 2125 | |
| ИТОГО: | 22 | 47625 |
Вакцина для специфической профилактики хламидиоза свиней, содержащая инактивированный антиген Chlamydia psittaci, адъювант и консервант, отличающаяся тем, что содержит инактивированный и очищенный хламидийные антигены из штаммов PC-85 - возбудителя хламидиозного аборта свиней и ЛС-87 - возбудителя хламидиозной пневмонии свиней, выращенных одновременно в желточной и аллантоисной оболочках куриных эмбрионов, взятых в равном количестве с концентрацией хламидий 10-15 мг/мл, адсорбированных на алюмокалиевых квасцах и эмульгированных в масляно-ланолиновом адъюванте, с содержанием 0,1% глутарового альдегида в качестве консерванта.
