Штамм mucor racemosus № 195, используемый при приготовлении иммуногенных препаратов против мукороза сельскохозяйственных животных
Владельцы патента RU 2248392:
Государственное научное учреждение Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)
Изобретение относится к микробиологии. Штамм Mucor racemosus №195 используют при приготовлении иммуногенных препаратов против мукороза сельскохозяйственных животных. Данный штамм обладает высокой спорообразующей активностью, отсутствием патогенности и продуцирует полисахариды, обладающие иммуногенными свойствами. 2 табл.
Изобретение относится к микробиологии, в частности к микологии, и может быть использовано для получения антигенов, применяемых при приготовлении диагностических и иммуногенных препаратов против мукороза сельскохозяйственных животных.
Максимальное получение антигенов прямо пропорционально продуктивности штамма по ряду признаков, одним из которых является интенсивность спорообразования.
Указанный признак, а также отсутствие токсигенности и выраженные иммупогенные свойства определяют целесообразность использования штамма для производства диагностикумов и конструирования вакцинных препаратов.
Известно использование штамма Mucor ATCC 15242 из Японской коллекции микроорганизмов JCM для получения трансглутаминазы, которую применяют с терапевтической целью и в виде лечебно-пищевых добавок (см. патент США №6 472 182, опуб. 29.10.2002 г.).
Однако данный штамм не предназначен для получения антигенов-полисахаридов и пептидогликанов.
Наиболее близким к заявляемому является штамм Mucor lusitanicus BKMF - 306 D, используемый для получения γ-линолиевой кислоты, являющейся основой липидного продукта, применяемого при лечении ран, ожогов и аллергических контактных дерматитов (см. патент РФ №2129002 по кл. МПК А 61К 35/70, опуб. 20.04.1999 г.).
Данный штамм, также как и предыдущий аналог, не синтезирует комплекс белков, полисахаридов и пептидогликанов.
Изобретение направлено на решение задачи создания нового штамма - Mucor racemosus №195, обладающего высокой спорообразующей активностью, отсутствием патогенности и продуцуированием пептидогликанов и полисахаридов, обладающих иммуногенными свойствами.
Штамм Mucor racemosus выделен в Саратовской области от теленка 15-дневного возраста, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ФГУ ВГНКИ), хранится в Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции (НИВС).
Штамм Mucor racemosus №195 характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
Рост гриба после инкубирования при 37°С на пластинчатом агаре Сабуро появляется через 24 часа в виде беловатого пушистого налета. Через 72 часа формируется объемная пушистая колония с мощным, хорошо развитым мицелием сероватого цвета. В бульоне Сабуро к 3 суткам культивирования в пробирках отмечается поверхностный рост культуры в виде плотных “войлочных” дисков с развитым мицелием и с одновременным образованием ватоподобного осадка.
При микроскопировании (с фиксацией в 10% КОН или в 50% глицерине) гриб представлен несептированным мицелием, имеющим различную ширину (до 20 мкм) на протяжении нити, древовидно ветвящийся. Обнаруживается при увеличении микроскопа (×7). Спорангиеносцы прямолинейные, спорангии шаровидные, не имеющие апофизы.
Токсинообразование происходит на бульоне Сабуро и средах, изготовленных по патенту Саратовской НИВС №2093569 (опуб. 20.10.97 г.).
Продукт, синтезируемый штаммом, - в основном, комплекс белков, полисахаридов, пептидогликанов, обладающих антигенными свойствами.
Чувствительность к антимикробным препаратам.
Зона задержки роста дисками, пропитанными амфотерицином - 9 мм; нистатином - 21 мм; клотримазолом - 27 мм; 0,01% раствором тимерсала -20 мм; 5% раствором препарата “А-24” - 26 мм; 0,03% раствором AgNO3 - 14 мм.
Вирулентные свойства.
Внутрибрюшинное введение 3-суточной культуры в объеме 0,5 мл и концентрации спор 1·107 в см3 гибели белых мышей не вызывает; LД50 - 5·107 спор/см3, LД100 - 1·108 спор/см3 (гибель на 4-5 сутки). Внутривенное заражение белых крыс в объеме 1 мл и концентрации спор от 1·106 до 1·107 в см3 вызывает гибель на 3 сутки, в дозе 7·107 в см3- на 2 сутки у 100% животных.
Штамм относится к III группе патогенности - условно патогенный.
Штамм Mucor racemosus №195 поддерживается методом периодических пересевов на искусственных питательных средах по признаку спорообразования и культурально-морфологическим свойствам. В работе со штаммом мутагены не использовались.
Пассажирования на животных не требуется.
Штамм Mucor racemosus №195 хранят на агаре Сабуро в течение не более 20-30 суток, с последующим пересевом вначале на бульон Сабуро, а затем на агар Сабуро. Оптимальный способ хранения штамма - в ампулах в лиофилизированном состоянии при температуре 4°С до 1 года.
Способ, условия и состав среды для размножения штамма - бульон и агар Сабуро. Культивирование осуществляется при температуре 26-37°С.
Пример 1.
Штамм Mucor racemosus №195 культивируют на плотных средах: Чапека, Сабуро, Дрожжевой или разработанной Саратовской НИВС по патенту РФ №2093569 (опуб. 20.10.97 г.), содержащей, мас.%: глюкозу 4-5, гидролизат лактальбумина 0,45-0,55, сыворотку крови крупного рогатого скота 9,0-11,0, пептон 0,95-1,05, агар 3,5-3,6, солевой раствор Хенкса - остальное.
Спорообразование штамма испытано методом подсчета клеток в камере Горяева с использованием фазоконтрастного устройства по формуле:
(а·4000·1000):в=х,
где а - число сосчитанных клеток,
в - число малых квадратов камеры.
Результаты спорообразования штамма М. racemosus №195 на твердых питательных средах представлены в таблице 1.
| Таблица 1 | |||||
| Питательный агар | Кол-во проб | Время отбора проб (сутки) | |||
| 3 | 6 | 9 | 12 | ||
| Среднее количество спор в 1 мл пробы, млн | |||||
| Чапека | 10 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 9,0 |
| Сабуро | 10 | 40,5 | 50,5 | 70,5 | 76,0 |
| Дрожжевой | 10 | 60,0 | 69,0 | 100,0 | 89,0 |
| Среда по Патенту СНИВС №2093569 | 10 | 44,0 | 47,0 | 100,0 | 100,0 |
Пример 2.
Штамм Mucor racemosus №195 культивируют при температуре 37°С в течение 12 суток на питательной среде, разработанной Саратовской НИВС по патенту №2093569, состав которой описан в примере 1, но без добавления агара, т.е. жидкой. После завершения культивирования мицелий и споры разрушают в течение 2-х часов ультразвуковым дезинтегратором.
Затем осуществляют фильтрацию через мембрану “Владипор” №3 для освобождения от мицелия и спор культуры штамма. Вносят раствор формалина 0,4% конечной концентрации и добавляют масляный адьювант в соотношении 5 частей антигена и 1 часть адьюванта.
Полученным антигеном иммунизировали лабораторных животных. В последующем их подвергали внутривенному заражению вирулентным штаммом Mucor racemosus. В качестве контроля использовали неиммунизированных животных. Результаты иммунизации представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||
| Вид животных | Кол-во голов, иммунизированных антигенами из штамма Mucor racemosus | Кол-во выживших животных из числа иммунизированных | Кол-во голов не иммунизированных животных | Кол-во выживших животных из числа не иммунизированных |
| Мыши | 10 | 9 | 10 | 0 |
| Морские свинки | 8 | 4 | 8 | 0 |
| Кролики | 5 | 3 | 5 | 0 |
Таким образом, предлагаемый штамм Mucor racemosus №195 обладает высокой спорообразующей способностью, а в антигенном отношении - иммуногенностью.
Штамм Mucor racemosus №195, депонированный во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов и хранящийся в Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции, используемый при приготовлении иммуногенных препаратов против мукороза сельскохозяйственных животных.
