Композиция для доставки стабильных инъецируемых жидкостей и способ доставки

Изобретение относится к композиции для доставки стабильного, биологически активного соединения субъекту, включающей частицы стекла, содержащие указанное биологически активное соединение, имеющие диаметр в диапазоне от 0,1 до 100 мкм и суспендированные в жидкости, которая включает, по меньшей мере, один биосовместимый перфторуглерод, в котором указанные частицы не растворяются. Технический результат: создание полностью стабильных, готовых к инъекции композиций. 11 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

 

Предпосылки к созданию изобретения

Вакцины или готовые для инъекции лекарственные препараты в растворе являются, в действительности, нестабильными и их необходимо охлаждать. Фармацевтическая промышленность обычно решает проблемы относительно нестабильности препаратов путем сушки лекарственных средств лиофилизацией. Данный способ является дорогостоящим, неудобным и по сути опасным, так как перерастворение высушенных лекарственных препаратов может привести к ошибочным дозам или к загрязнению растворов. За последние 100 лет были предприняты попытки разработать надежные, стабильные, готовые для инъекции жидкие композиции, однако усилия не увенчались успехом. В действительности, только низкомолекулярные лекарственные препараты могут существовать в водных растворах в течение подходящего срока хранения.

Данная проблема представляется особенно острой в области производства вакцин. Было подсчитано, что во сем мире к 2005 году должно быть введено 3,6 биллиона доз вакцин. Всемирной организацией здравоохранения (WHO) было заявлено, что стандартные формы вакцин, которые необходимо охлаждать все время, не представляется возможным применять на практике ("Revolutionizing Immunizations". Jodar L., Aguado T., Lloyd J. and Lambert P-H. Genetic Engineering News Feb. 15.1998). В настоящее время в развитых странах применяется сеть холодильников, образующих "охлаждающую цепочку", которая вытягивается от производящих вакцины предприятий до провинциальных городов. Расходы на охлаждающую цепочку для индустрии вакцин и неправительственных организаций здравоохранения, проводящих кампании по иммунизации населения, являются огромными. WHO было установлено, что истинные расходы по хозяйственно-техническому обслуживанию охлаждающей цепочки составляют свыше 200 миллионов долларов США ежегодно. Кроме того, кампании по иммунизации могут проводиться только для тех людей, которые находятся вблизи от последнего звена охлаждающей цепочки.

Кампании по вакцинации населения требуют медицинского обученного персонала, чтобы гарантировать правильность введения дозы и отсутствие ее разрушения. Потребность в воссоздании некоторых вакцин, таких как против кори, желтой лихорадки и BCG, в данной области также представляет собой серьезную проблему. Проблему следует решать очень четко, чтобы обеспечить введение правильной дозировки и, кроме того, не внести возможный источник загрязнения, что часто приводит к неблагоприятным клиническим последствиям. Кроме того, часто требуется введение более одной вакцины в течение проведения кампании и для этого может потребоваться множество инъекций, так как отдельные смеси или "мультивалентные" вакцины могут быть недоступны вследствие химической несовместимости некоторых из компонентов. WHO выдвинул на первый план решение указанных проблем при активной поддержке исследований, направленных на создание стабильных вакцин следующего поколения, для которых не требуется охлаждение ("Pre-Filled Monodose Injection Devices: A safety standard for new vaccines, or a revolution in the delivery of immunizations?" Lloyd J. and Aguado M.T. WHO publication. May. 1998. "General policy issues: injectable solid vaccines: a role in future immunization?" Aguado M.T., Jodar L., Lloyd J., Lambert P.H. WHO publication No A59781).

Идеальным решением данной проблемы является создание полностью стабильных, готовых к инъекции композиций. Такие стабильные вакцины могут быть упакованы в устройства для введения или, для проведения кампаний по массовой иммунизации, могут быть транспортированы в больших объемах и введены посредством безыгольного инжектора. Чрескожная доставка сухих, твердых частиц с помощью безыгольной газоинжекционной системы была описана в публикации (Sarphie DF, Burkoth TL. Method for providing dense particle compositions for use in transdermal particle delivery. Международная публикация PCT Pub No. WO 9748485 (1996)) and transdermal vaccination with dry DNA vaccines is apparently very effective ("PowderJect^′s Hepatitis B DNA Vaccine First To Successfully Elicit Protective Immune Response In Humans" at http://www.powderject.com/pressrelases.htm (1998)).

Сверхзвуковая ударная волна газа гелия, который применяют, чтобы привести в рабочее состояние такие порошковые инжекторы, имеет ограниченную силу и не может доставить дозу тонких частиц внутримышечно. Это происходит вследствие того, что низкомолекулярные частицы не могут приобрести соответствующую движущую силу для глубокого проникновения. В то время, как интрадермальная доставка DNA вакцин, нанесенных на частицы коллоидного золота, является достаточной для достижения иммуногенности, общие вакцины, дополненные нерастворимыми солями алюминия или кальция, вызывают недопустимое раздражение кожи. Их следует вводить внутримышечно. Для введения таких вакцин требуется гибкая система, способная обеспечить широкий диапазон глубины доставки, от внутрикожного до глубокого внутримышечного, подобно системе доставки, достигаемой с помощью иглы и шприца. Для проведения кампаний по массовой вакцинации населения задача была решена путем разработки жидкостного безыгольного инжектора, способного ускорить поток узкой (˜0,15 мм диаметра) струи жидкости, используя давления около 3000 фунтов на квадратный дюйм, в виде «жидкого гвоздя». Данное устройство позволяет доставлять дозу безболезненно через кожу глубоко в подкожный слой или в мышечную ткань путем пробивания мельчайшего отверстия через эпидермис. Большая движущая сила, придаваемая жидкой струе, обеспечивает глубокое проникновение. До сих пор инъецируемые лекарственные препараты и вакцины были основаны на воде, но из-за проблем нестабильности, обсуждаемых выше, область стабильных в воде продуктов, доступных для данной методики, является весьма ограниченной.

В настоящее время известно, что широкая область биоактивных молекул может быть стабилизирована путем высушивания в стеклообразном сахаре (Roser B. "Protection of proteins and the like" патент Великобритании No. 2187191. Roser B. and Colaco C. "Stabilization of biological macromolecular substances and other organic compounds" Международная публикация РСТ Pub No. WO 91/18091. Roser B. and Sen S. "New stabilizing glasses". РСТ патентная заявка No. 9805699.7. 1998). Такие сухие, стабилизированные активные вещества не подвергаются воздействию неблагоприятной среды, такой как высокие температуры и ионизирующая радиация.

Механизм, лежащий в основе значительной стабилизации молекул с помощью сахаров, заключается в стеклообразовании. Поскольку раствор сахара, содержащий активную молекулу, сушат, он может или кристаллизоваться при достижении предела растворимости сахара, или может образовать сверхнасыщенный сироп. Свойство сахара препятствовать кристаллизации является важным для хорошего стабилизатора. Пригодным для этого сахаром является трегалоза (Green JL. & Angel CA. Phase relations and vitrification in sacchsride water solutions and the trehalose anomaly J.Phys.Chem. 93, 2880-2882 (1989)), но она не является единственным сахаром. Кроме того, сушка постепенно приводит к отвердеванию сиропа, который достигает стеклообразного состояния при низком содержании остаточной воды. Незаметно активные молекулы переходят из жидкого водного раствора в твердый раствор в сухом стеклообразном сахаре. Химическая диффузия является незначительной в стеклообразном сахаре и поэтому химические реакции, в сущности, прекращаются. Поскольку денатурация представляет собой химическое изменение, оно не может происходить в стеклообразном сахаре, и в результате молекулы стабилизируются. В таком виде молекулы могут оставаться неизмененными, если выполняется другое условие. Этим условием является наличие второго важного свойства хорошего стабилизатора, а именно он должен быть инертным и нереактивным. Многие стеклообразные вещества невозможно получить, поскольку они реагируют с продуктом при хранении. Очевидные проблемы встречаются с редуцирующими сахарами, которые могут образовывать стеклообразные сахара с благоприятными физическими свойствами, но затем их альдегидные группы атакуют аминогруппы на продуктах, осуществляя типичную реакцию Мейлларда. Данный факт является основной причиной того, что многие высушенные лиофилизацией фармацевтические препараты требуют хранения при охлаждении. Нереактивные сахара дают стабильные продукты, которые не требуют охлаждения совсем.

Биомолекулы, иммобилизованные в стеклообразном сахаре, также являются стабильными в неводных промышленных растворителях, в которых они сами по себе, а также и сахар не растворяются (Cleland JL. and Jones AJS. "Excipient stabilization of polypeptides treated with organic solvents" патент США No. 5589167 (1994)). Поскольку стеклообразный сахар служит непроницаемым барьером в нерастворяющей жидкости, биомолекулы в твердом растворе в таком сахаре защищены как от химической реактивности растворителя, так и от окружающей среды. В том случае, если жидкость сама является стабильной, чувствительные продукты в суспендированных стеклообразных частицах создают стабильную двухфазную, жидкую композицию. Промышленные растворители типа, описанного Cleland and Jones (1994), имеют ограниченное применение в технологии. Замещение биосовместимой неводной жидкости должно привести к созданию стабильных жидких композиций, состоящих даже из самых нестабильных лекарственных средств, вакцин и диагностикумов.

Первое производство стабильных неводных жидкостей, предназначенных для использования в доставке лекарственного средства и вакцины (B.J.Roser and S.D.Sen "Stable particle in liquid formulations". РСТ патентная заявка No. GB98/00817), относилось к композициям из порошков стабилизирующих стеклообразных веществ, содержащих активное вещество, суспендированное в инъецируемых маслах, таких как кунжутное, арахисовое или соевое масло, или в сложных эфирах, таких как этилолеат. Суспендированные частицы стеклообразного сахара имеют чрезвычайно гидрофильную природу, в то время как масла являются гидрофобными. Из-за сильной тенденции гидрофильной и гидрофобной фаз к разделению частицы стеклообразного сахара стремятся к объединению. Для того чтобы стабилизировать такого типа суспензии "вода в масле", часто требуется применение растворимых в масле поверхностно-активных веществ, растворенных в непрерывной масляной фазе.

Указанные поверхностно-активные вещества с низким ГЛБ (гидрофильный/липофильный баланс) собираются у поверхности раздела между гидрофильными частицами и маслом и покрывают их амфифильным слоем, который в большей степени совместим с непрерывной масляной фазой. Поскольку каждая частица стеклообразного сахара отделяется от ее соседей сухим маслом, никакое химическое взаимодействие между частицами не возникает. Поэтому может существовать несколько различных популяций частиц, причем каждая содержит отличную потенциально взаимодействующую молекулу, в одном и том же масляном препарате без их взаимодействия друг с другом. Сложные мультивалентные вакцины могут быть получены таким же способом.

Однако впоследствии было найдено, что данный способ имеет определенные недостатки, которые мешают принятию универсального решения. Данные недостатки включают в себя неизбежную седиментацию суспендированных частиц, которые имеют плотность примерно 1,5 г/см³, в менее плотном маслянистом растворителе. Заявители признают существование такой проблемы и стремятся решить ее путем снижения размера частиц до размера ниже 1 мкм в диаметре, чтобы частицы оставались суспендированными посредством термодинамических сил, таких как броуновское движение. Требование в отношении размера частиц, который должен составлять ниже 1 мкм в диаметре, является недостатком предлагаемых композиций. Получение таких порошков с маленькими частицами никоим образом не является легкой задачей. Улучшенные модели распылительной сушилки дают возможность получить такие порошки, однако малый размер частиц будет препятствовать использованию коллекторов циклонного типа, в результате чего возникает потребность в системе фильтров для возвращения продукта.

Теоретически, снижения размера частиц до субмикронного также можно достичь после того, как частицы суспендировали в масле с помощью аппарата для микрогомогенизирования под высоким давлением, такого как микрофлюидизатор (Constant Systems Inc.). Такая процедура подразумевает включение дополнительной стадии в способ, и заявители обнаружили, что она не является очень эффективной для разрушения микросфер стеклообразного сахара, высушенных распылением, которые обладают весьма высокой механической прочностью из-за их сферической формы. Она предполагает выполнение множественных прохождений через аппарат. И даже после такой процедуры большего размера частицы остаются нетронутыми, и для их удаления требуется последующая стадия фильтрации или седиментации. Кроме того, высокая вязкость суспензий в обычных маслянистых растворителях затрудняет их отбор в шприц, и вводить их нужно медленно. Такое обстоятельство препятствует быстрому прохождению потоков через тонкие отверстия, такие, которые имеют место в системе жидкостного безыгольного инжектора.

Кроме того, было обнаружено, что суспендированные в масле частицы, особенно такие, которые содержат поверхностно-активное вещество с низким ГЛБ, впоследствии трудно экстрагировать в водную среду, поскольку, к удивлению, они удерживают прочно связанное, водоотталкивающее покрытие из масла вокруг частиц, даже после промывки в водном буфере. Для того, чтобы частицы оставили масляную фазу и перешли в водную фазу, требуется очень энергичное встряхивание и смешивание или добавление более водорастворимого детергента (на этот раз с высоким ГЛБ). Такая процедура может создать большие проблемы, поскольку размер частиц при этом снижается. Конечным результатом является скорее загрязненная смешанная эмульсия, чем две чистые разделенные фазы. В организме такая эмульсия может способствовать медленному и непредсказуемому высвобождению активного вещества скорее, чем произойдет требуемая быстрая и прогнозируемая доставка. Экстракция in vitro в водную среду приводит к распространению масла наверху водной фазы, содержащей растворенное активное вещество. Такой результат может быть неприемлемым для некоторых употреблений in vitro, таких как диагностические наборы или системы автоматического анализа. В конце концов, большинство природных, FDA-одобренных масел, которые можно клинически применять, подвержены фотодеградации, окислению или другим видам разрушения и требуют тщательного хранения в темноте при относительно низких температурах. Кроме того, они не являются полностью химически инертными, так что они могут медленно взаимодействовать с суспендированными частицами.

Объединенная фармацевтическая компания исследовала применение порошков водорастворимых веществ в поразительных новых, неводных перфторуглеродных жидкостях (Kirkland WD Composition and method for delivering active agents, Патент США No. 5770181 (1995)). Данный патент, в основном, касается функции PFC в качестве пероральных, увеличивающих контрастность агентов для диагностической визуализации кишечника. Водорастворимые порошки, которые применяли в данном случае, добавляли для того, чтобы улучшить аппетит или усилить эффект контраста PFC в желудочно-кишечном тракте. Однако Kirkland предположил, что указанные жидкости также могут быть использованы для доставки лекарственных средств, хотя в патенте примеры не были приведены. В частности, в патенте приведен только срок хранения коммерчески доступных порошков. В настоящее время заявителями обнаружено, что для получения чрезвычайно стабильных двухфазных PFC жидких композиций, как для пероральной, так и парентеральной доставки, могут быть получены хрупкие активные частицы, стабилизированные в микросферах стеклообразного сахара. Данное обстоятельство в значительной степени расширяет возможности применения патента Kirkland до доставки парентеральных лекарственных средств и вакцин в виде готовых для введения композиций, для которых не требуется охлаждение любого типа. Особое значение представляет собой обнаружение того факта, что такие качества, как низкая вязкость, высокая плотность и низкое поверхностное натяжение PFC, способствуют тому, что данные стабильные суспензии могут быть доставлены с помощью автоматических устройств, таких как жидкостные безыгольные инжекторы. Данный факт приводит к возникновению двух возможных дополнительных областей применения помимо указанной, а именно кампании по массовой иммунизации и также самовведение.

Перфторуглеводороды (PFC) являются новыми, чрезвычайно стабильными жидкостями, полученными путем исчерпывающего фторирования определенных органических соединений. Они не могут быть классифицированы как гидрофильные или гидрофобные, так как они, фактически, не смешиваются ни с маслом, ни с водой или любым другим растворителем, является ли он полярным или неполярным, исключая другие PFC (Rewiewed in Krafft MP & Riess JG. "Highly fluorinated amphiphiles and colloidal systems, and their applications in the biomedical field. A contribution. "Biochimie, 80, 489-514, 1998). Кроме того, они не участвуют ни в гидрофобных взаимодействиях с маслами, ни в гидрофильных взаимодействиях с водой или гидрофильными материалами. В результате, как видно, грубое разделение фаз, при котором гидрофильные частицы прочно собираются вместе в масле, не происходит в PFC. Для получения стабильных суспензий не требуются поверхностно-активные вещества, но фторуглеводородные (FHC) поверхностно-активные вещества имеются в распоряжении (Krafft & Riess, 1998), и они являются активными при очень малых концентрациях в PFC жидкостях. При таких очень низких концентрациях FHC поверхностно-активные вещества способствуют образованию истинных монодисперсных систем определенных частиц, которые проявляют тенденцию агрегировать в их отсутствие. PFC жидкости сами по себе являются полностью химически нереактивными, и типы таких жидкостей с низким молекулярным весом не аккумулируют в организме, но, будучи летучими, в итоге испаряются при дыхании.

Поскольку они являются превосходными растворителями для газов, PFC уже использовали в больших количествах при весьма специальных случаях клинического применения. Их способность обменивать двуокись углерода на растворенный кислород оказалась лучше, чем способность гемоглобина. Впервые результаты были продемонстрированы на «бескровных крысах» исследователем R.P.Geyer в 1968 (Geyer RP, Monroe RG & Taylor K. "Survival of rats totally perfused with perfluorocarbon-detergent preparation." In: Organ Perfusion and Preservation, J.V.Norman, J.Folkman, L.E.Hardison, L.E.Riodolf and F.J.Veith eds. Appleton-Century-Crofts, New York. 85-95 (1968)). В настоящее время перфтороктилбромид, в виде эмульсии PFC в воде и под торговым названием Oxygent^TM (Alliance Pharmaceutical Corp.), применяют вместо крови для переливания при определенных хирургических процедурах. Кроме того, PFC используют в качестве жидкостей для ингаляции в легкие с целью лечения респираторного дистресс синдрома у недоношенных детей.

Было найдено, что их высокая плотность в сочетании с химической инертностью является весьма ценным качеством. Перфторфенантрен под торговым названием Vitreon^TM (Vitrophage Inc.) используют для того, чтобы предотвратить коллапс капсулы глаза в течение операции и осуществить перестановку отслоенной сетчатки. Кроме того, PFC используют в качестве контрастных сред для визуализации методом ядерно-магнитного резонанса (MRI), и с этой целью исследователями было показано, что гидрофильные порошки могут быть суспендированы в них для того, чтобы улучшить визуализацию или сделать их более приятными (Kirkland W.D. "Composition and method for delivering active agents" патент США No. 5770181, 1998). Данный патент также предполагает использовать PFC в качестве непрерывной фазы для доставки сыпучих водорастворимых лекарственных препаратов. Поскольку число парентеральных лекарственных препаратов, которые являются стабильными в виде сухих порошков при комнатной температуре, ограничено, данный патент неприменим к большинству инъецируемых лекарственных препаратов. Однако использование стабилизации лекарственного средства в порошках стеклообразных сахаров в виде микросфер, как описано у исследователей Roser and Garcia de Castro (1998), а также инъецируемых PFC делает такой способ применимым к фактически всем парентеральным лекарственным препаратам и вакцинам.

Изобретение относится к композиции для доставки стабильного биологически активного соединения субъекту, включающей частицы стекла, содержащие указанное биологически активное соединение и характеризуемой тем, что частицы суспендированы в жидкости, которая включает, по меньшей мере, один перфторуглерод, в котором указанные частицы не растворяются.

Стекло предпочтительно включает сахарное стекло, металкарбоксилатное стекло и/или фосфатное стекло.

Таким образом изобретение представляет в качестве композиции для доставки лекарственного средства двухфазную систему с перфторуглеродами в качестве непрерывной фазы, содержащей дискретную фазу стекла в суспензии, в качестве препаратов для доставки лекарственных средств.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение включает в себя использование двухфазной системы с PFC в виде непрерывной фазы, содержащей дискретные фазы стеклообразного вещества в суспензии, в качестве препаратов для доставки лекарственного средства. Препараты, основанные на перфторуглероде, имеют основные преимущества, заключающиеся в том, что различные PFC могут быть смешаны с образованием конечных смесей с плотностями, колеблющимися приблизительно от 1,5 до 2,5 г/см³. Такой подход дает возможность получить частицы с плотностями, соответствующими суспензионной жидкости, для того, чтобы данные частицы не всплывали на поверхность или не падали на дно контейнера, но оставались в виде стабильной суспензии. Поэтому частицы не должны быть субмикронного размера, как это требуется для препаратов, основанных на масле, чтобы предотвратить седиментацию, но они могут в значительной степени отличаться по размеру. Предельный размер частиц определяется только тем, для чего применяется или безыгольной инъекции, могут содержать частицы размером в области от 0,1 до 100 микрометров, или предпочтительно от 1 до 10 микрометров. Такой подход позволяет в значительной степени упростить способ производства частиц и избежать необходимости получения частиц с чрезвычайно малым размером путем измельчения. Частицы могут быть получены с помощью обычной сушки распылением или сушки лиофилизацией с последующей простой сушкой или мокрым измельчением. В случае, когда требуется высокое содержание твердых частиц, в суспензии, желательно, чтобы частицы были сферическими по форме. Частицы неправильной формы проявляют намного выше тенденцию «связываться» вместе, тормозя свободное течение, в то время как сферические частицы обладают свойственной им «смазывающей способностью», дающей возможность достичь содержания твердых частиц свыше 20%. Предпочтительно содержание твердых частиц составляет от 1% до 40%, или более предпочтительно от 10% до 15%. Такие частицы легко получить посредством сушки распылением, сушки лиофилизацией и отвердения эмульсии. Для суспендированных порошков, если они получены соответствующим образом, не требуются поверхностно-активные вещества, образующие стабильные суспензии, из которых частицы сахарного стекла растворяются почти мгновенно при встряхивании с водой. Если незначительную агрегацию воспринимать как проблему, то небольшое количество FHC поверхностно-активного вещества, как описано у Krafft and Riess (1998), можно добавить к PFC жидкости до или после добавления стабильного порошка. В случаях использования поверхностно-активного вещества, оно предпочтительно содержится в концентрации от 0,01 масс.% до 10 масс.%, оптимально возможно около 1%. Подобно PFC, указанные FHCs, в действительности, являются крайне инертными и нереактивными. Таким образом, сольватации частиц и химической реакции между суспендированными частицами и PFC фазой не происходит. Так как частицы подходящего стекла и PFC жидкость являются стабильными с экологической точки зрения, деградации вследствие освещения, высоких температур, кислорода и т.д. не происходит. Они имеют незначительную in vivo и in vitro токсичность, и они были широко проверены и одобрены распорядительными органами для введения животным и человеку в больших объемах с целью восполнения кровопотери. Было сообщено, что в то время, как высокомолекулярные PFC накапливаются в печени, низкомолекулярные образцы, применяемые согласно настоящему изобретению, элиминируются из организма при дыхании.

Низкое поверхностное натяжение и низкая вязкость указанных PFC дают им возможность течь очень легко через узкие отверстия, которые могут быть в иглах для подкожных инъекций, автоматических системах или жидкостных безыгольных инжекторах. PFC являются превосходными диэлектриками, и поэтому можно легко получить монодисперсные суспензии частиц, несущих на поверхности такой же малый электростатический заряд. Они являются сухими и полностью негигроскопичесными жидкостями. Степень сухости суспендированных порошков поддерживается низким содержанием воды, предупреждая растворение или деградацию включенных активных частиц. Данные соединения не обладают свойствами растворителей, что делает их идеальными для суспендирования гидрофильных или гидрофобных частиц, и это означает, что конечные суспензии являются совместимыми, фактически, с любыми материалами, применяемыми в контейнерах или устройствах для доставки. Такие качества соединений противоположны качествам препаратов, основанных на масле, которые могут вызвать серьезные повреждения шприцов, например, при набухании резиновых уплотнений на поршнях. PFC могут быть получены с плотностями, упругостями пара и летучестями в области, указанной в таблице (таблица 1). Высокие плотности соединений приводят к оседанию в самых обычных буферах, допуская легкое отделение от полученных частиц, которые растворяются в водной фазе, расположенной сверху. Данное обстоятельство способствует использованию указанных соединений in vitro, например для диагностики.

Подробное описание изобретения

Таблица 1 Свойства некоторых PFC
Перфтор-	Мол. Вес	Плотность (кг/л)	Вязкость (мПа·с)	Поверхностное натяжение мН/м	Упругость пара (мбар)
гексан	338	1,682	0,656	11,1	294
n-октан	438	1,75	1,27	16,98	52
декалин	462	1,917	5,10	17,6	8,8
фенантрен	624	2,03	28,4	19	<1

Применение PFC в качестве растворителей для доставки фармакологических агентов или биоактивных агентов было ранее предложено Kirkland (1995). Данный патент был приведен в качестве примера в отношении, действительно, только стабильных коммерчески доступных ароматизирующих или шипучих порошков и тому подобное. Он не содержит примеров каких-либо стабилизированных биоактивных препаратов, таких как вакцины или фармацевтические препараты. Кроме того, в нем не рассматривается возможность получения инъецируемого (парентерального) препарата с помощью PFC в качестве суспензионного растворителя для активных частиц. Для того, чтобы добиться получения стабильной композиции, содержащей, по сути, неустойчивые биомолекулы, с продолжительным сроком хранения, используя PFC в качестве неводного растворителя, частицы получают, предпочтительно, с содержанием стеклообразующего агента, способного стабилизировать включенное активное вещество. Указанный агент может быть из ряда сахаров, включая трегалозу, лактит, палатинит и т.д., как описано в международной публикации РСТ No. WO 91/18091, или более предпочтительно другими более эффективными сахарными спиртами, состоящими из моносахаридов, или с текло образующими агентами, описанными в патентной заявке Великобритании No. 9820689.9.

Для того чтобы частицы не всплывали в плотной PFC фазе, целесообразно включить в частицы регулирующий плотность агент, например неорганическую соль. Таким агентом может быть растворимая соль, такая как натрия или калия хлорид или сульфат или, более предпочтительно, нерастворимый материал, такой как сульфат бария, фосфат кальция, двуокись титана или гидроокись алюминия. Нерастворимые, нетоксичные материалы являются предпочтительными, поскольку высвобождение больших количеств ионных солей в организме может вызвать значительную локальную боль и раздражение. В некоторых случаях, таких как препараты вакцин, нерастворимыми материалами может быть часть активного препарата в качестве адъюванта. Регулятор плотности может находиться в твердом растворе в частицах сахарного стекла или в нерастворимом, сыпучем материале в суспензии в сахарном стекле. Частицы сахарного стекла, корректно приготовленные, имеют плотность, приблизительно соответствующую жидкости PFC, имеют нейтральную плавучесть, и не плавают на поверхности, не оседают вниз, но остаются в стабильной суспензии без образования комков.

Так как PFC жидкости являются хорошими диэлектриками с величиной удельного сопротивления обычно выше, чем 10¹³ Ом·см, небольшие заряды на поверхности суспендированных частиц могут оказывать значительное воздействие на стабильность суспензии. Для того чтобы предохранить суспендированные частицы от агрегации, обусловленной слабыми силами с малым радиусом действия, их производят с наполнителем, таким как лизин или аспарагиновая кислота, способным передать слабый, остаточный, электростатический заряд сухим частицам. В результате агрегация частиц предотвращается путем отталкивания их заряда, подобно тому, что происходит в стабильных коллоидах. В качестве альтернативы, небольшие количества FHC поверхностно-активных веществ, таких как перфтордекановая кислота, могут быть растворены преимущественно в PFC с образованием дисперсных, предпочтительно монодисперсных, суспензий.

Такие частицы могут быть произведены рядом способов, включая воздушную сушку, сушку распылением или сушку лиофилизацией, и не должны быть очень маленькими, а могут представлять собой гетерогенную смесь частиц с размерами, колеблющимися между 0,1 мк и 100 мк в диаметре. В некоторых случаях подходящими могут быть частицы даже миллиметрового размера.

Применение таких стабильных суспензий не ограничивается ни парентеральным введением, как указано в примере выше, ни пероральным введением, как приведено у Kirkland (1995). Так как PFC жидкий растворитель является нетоксичным и нереактивным, он представляет собой идеальный растворитель для доставки к слизистой оболочке, включая внутрилегочную доставку, назальную, глазную, ректальную и вагинальную доставку. Значительным достижением данного изобретения является возможность производить стабильные, стерильные и нераздражающие композиции для доставки к слизистой оболочке даже очень нестабильных лекарственных препаратов или вакцин. Кроме того, по природе PFC жидкость является самой сухой и полностью негигроскопичной, что в значительной степени содействует поддержанию стерильности данных препаратов в течение продолжительного срока хранения и периодического использования, поскольку микроорганизмы не могут расти в отсутствие воды.

Поскольку летучие перфторуглеводороды и хлорфторуглероды давно применяли в качестве пропеллантов в ингаляторах, предназначенных для доставки лекарственных средств в легкие, то стабильные PFC композиции, описанные в данном тексте, являются идеальными для получения мелких туманоподобных STASIS капелек жидкости для внутрилегочной доставки. Для такого использования размер частиц, которые составляют прерывистую суспендированную фазу в PFC капельках, имеет большое значение и не должен превышать размер от 1 до 5 мкм, предпочтительно от 0,1 до 1 мкм в диаметре. Для доставки к другим слизистым поверхностям, например, носа или глаза, размер частиц является менее важным и может составлять вплоть до 100 мкм или даже несколько мм в диаметре.

Содержание воды в микрочастицах предпочтительно не более чем 4%, предпочтительно менее 2% и идеально менее чем 1%.

Описание чертежей

Фигура 1

Щелочная фосфатаза (Sigma Aldrich Llt.) была стабилизирована в стекле, основанном на манните, 33,3%, лактате кальция, 33,3%, и деградированном желатине, 33,3% (Вусо С, Croda Colloids Ltd.), высушена распылением в виде микросфер и хранилась при 55°С либо как сухой порошок, либо как стабильная суспензия в перфтордекалине. Активность оставалась примерно на 100%-ном уровне (103% в течение 20 дней и 94% в течение 30 дней). Потеря активности была больше в сухом порошке, который не был суспендирован в PFC (около 80% активности оставалось).

Фигура 2

Коммерческая противостолбнячная вакцина (#Т022 любезно предоставлена Evans Medeva plc) была получена в виде порошка подходящей плотности, используя добавленный фосфат кальция в 20% растворе трегалозы. Она была высушена лиофилизацией с помощью распыления в жидком азоте, используя сопло с двумя струями текучей среды, с последующей лиофилизацией замороженного порошка, состоящего из микросфер, в сублимационной сушилке фирмы Labconco с первоначальной температурой при -40°С в течение всего времени основной сушки. Гуморальный иммунный ответ шести групп из 10 морских свинок измеряли через 4, 8 и 12 недель после инъецирования одной и той же дозой ASSIST стабилизированной противостолбнячной вакцины, перерастворенной в забуференном физиологическом растворе/ или в виде безводных препаратов в масле или PFC.

Иммунные ответы ко всем высушенным препаратам были ниже, чем к контрольной свежей вакцине (данные не показаны), указывая на значительную потерю иммуногенности при сушке распылением. Антигенные свойства токсоида, оцененные посредством поглощения ELISA, не изменялись в процессе сушки. На основании полученных данных было сделано заключение, что для осуществления защиты адъюванта гидроокиси алюминия при сушке потребуется больше усилий.

Иммунный ответ животных к STASIS вакцине, плотность которой подводили с помощью фосфата кальция (группа 3), в основном, был таким же, как и ответ к контрольной вакцине, перерастворенной в водном буфере (группа 1), и к вакцине порошка в масле (группа 2), в то время как иммунный ответ контрольных животных, инъецируемых неводными растворителями только (группы 4 & 5), не был показан.

Десять нижеследующих примеров представлены для описания осуществления изобретения.

ПРИМЕР 1:

Высушенные распылением частицы в PFC.

Частицы были получены посредством сушки распылением из водного раствора с помощью распылительной сушилки фирмы Labplant модели SD 1, используя сахара и другие наполнители. Обычные композиции были следующие:

А. Маннит	15% мас./об.
Лактат кальция в воде	15% мас./об.
В. трегалоза	15% мас./об.
Фосфат кальция в воде	15% мас./об.

Частицы были получены, используя сопло с двумя струями текучей среды с отверстием 0,5 мм по внутреннему диаметру. Было обнаружено, что оптимальный поток воздуха из сопла составлял половину максимального потока, и температура в сушильной камере составляла 135°С на входе и 70-75°С на выходе. Частицы собирали в стеклянный циклон и подвергали вторичной сушке в вакуумной печи, осуществляя спад температуры до 80°С, в течение свыше 4 часов. После охлаждения их суспендировали в PFC, используя обработку ультразвуком. Показано, что для обработки приблизительно 75% порошка было достаточно осуществить 30-секундное выделение ультразвуковой энергии из титанового зонда в ультразвуковое отделение MSE МК 2, или поместить порошок вплоть до 10 минут в ультразвуковую баню Decon FS200 Frequency sweep.

Образованная суспензия была монодисперсной и состояла из сферических стеклообразных частиц, колеблющихся по размеру приблизительно от 0,5 до 30 микрон со средней величиной приблизительно 10 микрон, измеренных с помощью микроскопа. Частицы, основанные на манните/лактате кальция, поднимались вверх слоя, состоящего из PFC, в течение нескольких минут, но легко вновь подвергались суспендированию при слабом встряхивании. Частицы, основанные на трегалозе/фосфате кальция, были подобраны по плотности посредством PFC и образовывали стабильную суспензию.

Высушенные распылением порошки частиц сахарного стекла суспендировали в перфторгексане, перфтордекалине и перфторфенантрене при концентрации 1, 10, 20 и 40% мас./об. Было обнаружено, что они образуют монодисперсные суспензии с незначительной тенденцией к агрегации. Добавление 0,1% перфтордекановой кислоты к PFC приводило к подавлению незначительной тенденции агрегировать на поверхностях. Было найдено, что указанные суспензии легко проходили через 25 g иглу путем аспирации или выброса.

ПРИМЕР 2:

Стабильность суспензии фермента, стабилизированного стеклом в PFC

Щелочную фосфатазу (Sigma Aldrich Ltd.) сушили распылением в аппарате фирмы Labplant, как описано выше. Композиция содержала 33,3% мас./мас. маннита, 33,3% мас./мас. фосфата кальция и 33,3% мас./мас. деградированного желатина (Вусо С, Croda colloids Ltd.). Высушенный фермент хранили при температуре 55°С в виде сухого порошка или в виде суспензии в перфтордекалине. Фермент, включенный в такие микросферы, состоящие из сахарного стекла, основанного на манните, суспендированного в перфтордекалине, сохранял ферментативную активность, близкую к 100%, в течение более 30 дней при 55°С (Фиг.1).

ПРИМЕР 3:

Эффективность in vivo

Предклинические испытания подобной композиции, содержащей клиническую противостолбнячную вакцину (любезно предоставленную Medeva plc), были предприняты совместно с Национальным институтом по биологическим стандартам и контролю (метрологическая лаборатория с правом проверки и аттестации средств измерений Всемирной организации здравоохранения). Результаты такого испытания показали, что стабильный STASIS препарат был полностью эквивалентен основанной на воде жидкой вакцине в отношении ее способности иммунизировать морских свинок для развития защитного иммунного ответа (фигура 2). Полученные данные подтверждают, что суспензия в PFC представляет собой готовую к инъекции композицию с такой же биодоступностью in vivo, как обычная основанная на воде жидкая композиция.

ПРИМЕР 4:

Частицы, полученные с помощью лиофильной сушки с распылением

Частицы были получены путем распыления жидких капелек в жидком азоте и затем вакуумной сушки замороженного порошка. Полученные частицы были менее плотными, чем высушенные распылением порошки, и образовывали пасты в PFC при концентрациях выше, чем 20% мас./об. При более низких концентрациях они образовывали монодисперсную суспензию после обработки ультразвуком.

Обычные используемые композиции были следующие:

Вещество	Конечная концентрация мас./мас.
А. Трегалоза	100%
В. Трегалоза	50%
Фосфат кальция	49,5%
Гидроокись алюминия	0,5%

ПРИМЕР 5:

Измельченные гидрофобные частицы

Гидрофобные производные сахара октаацетат сахарозы и октаацетат трегалозы легко достигали стеклообразного состояния либо при резком охлаждении расплава, либо при быстром высушивании из раствора хлороформа или дихлорметана. Их использование было описано в качестве матрикса контролируемого высвобождения для доставки лекарственного препарата (Roser et al "Solid delivery systems for controlled release of molecules incorporated therein and methods of making same", международная публикация PCT Pub No WO 96/03978, 1994).

Порошок октаацетата трегалозы был получен путем плавления в муфельной печи и резкого охлаждения расплава на пластине из нержавеющей стали. Полученные стеклянные диски были измельчены в ступке с пестиком и затем в высокоскоростном гомогенизаторе с получением мелкого порошка. Порошок суспендировали в перфторгексане, перфтордекалине и перфторфенантрене при концентрации 1 и 10% мас./об. Было показано, что они образуют хорошо диспергированные суспензии. Было найдено, что такие суспензии легко проходят через 23 g иглу.

ПРИМЕР 6:

Перерастворение в водных средах

Исходя из природы растворимых частиц сахарного стекла и свойств PFC, было предположено, что активные вещества в таких суспензиях должны быстро высвобождаться в организме. Для того, чтобы достичь полного высвобождения включенного активного вещества, были получены частицы, содержащие:

Трегалозу	20% мас./об.
Лактат кальция	20% мас./об.
Лизин	0,5% мас./об.
Краситель Mordant Blue 9	1% мас./об.

Композицию сушили с распылением, как описано выше, и добавляли к перфторфенантрену и перфтордекалину с получением 20% мас./об темно-синих, непрозрачных суспензий. Было найдено, что при добавлении воды к равному объему суспензий и встряхивании весь синий краситель действительно высвобождался в водную фазу, которая образовывала прозрачный синий слой, находящийся на поверхности почти бесцветного PFC с чистой, четкой границей между ними.

ПРИМЕР 7:

Отсутствие реактивности между частицами в суспензии

Поскольку индивидуальные микросферы в PFC суспензии физически изолированы от всех других частиц, потенциально реактивные вещества могут находиться вместе в такой же суспензии в отдельных частицах без какого-либо риска их взаимодействия. Когда сахарное стекло растворяется, и молекулы собираются вместе, происходит взаимодействие.

Для того, чтобы продемонстрировать это, была получена суспензия, содержащая два типа частиц, один (а) с ферментом щелочной фосфатазой и другой (b) с ее бесцветным субстратом, паранитрофенилфосфатом.

Композиции имели следующий состав:

а) Трегалоза	10% мас./об.
Сульфат натрия	10% мас./об.
Щелочная фосфатаза	20 ед./мл
В 5 мМ трис/HCl буфере, рН 7,6
b) Трегалоза	10% мас./об.
Сульфат натрия	10% мас./об.
Паранитрофенилфосфат	0,44% мас./об.

В 100 мМ глициновом буфере, рН 10,2, содержащем 1 мМ каждого из Zn⁺⁺ и Mg⁺⁺ хлорида.

Было обнаружено, что в суспензии порошков в перфтордекалине, содержащей 10% мас./об. порошка "а" и 10% мас./об. порошка "b", не развивается никакой цветной реакции, но она остается белой в течение 3 недель при 37°С.

При добавлении воды и встряхивании порошки растворялись в нижней водной фазе. Ферментативная реакция протекала в течение нескольких минут, производя интенсивное желтое окрашивание, обусловленное образованием п-нитрофенола, как в свежеприготовленном образце, так и в таком образце, который поддерживали при температуре 37°С в течение 3 недель.

ПРИМЕР 8:

Высвобождение продукта в модели "тканевого пространства"

Для того, чтобы проиллюстрировать возможное поведение PFC суспензий при инъекции in vivo, была приготовлена модель светопроницаемого, гидратированного тканевого пространства путем получения 0,2% агарозных гелей в полистироловых склянках. В агарозный гель вносили 0,1 мл перфтордекалиновой суспензии из примера 5 посредством 25g иглы. В результате образуется расплющенный белый шар суспензии. Через следующие 5-10 минут белая краска перешла из нижней части шара вверх, оставляя прозрачный шар PFC позади. Так как фермент и субстрат высвобождались при растворении частиц стекла, они взаимодействовали между собой, при этом образовывался продукт реакции желтого цвета п-нитрофенол, который затем диффундировал через агарозу в течение следующего 1 часа.

ПРИМЕР 9:

Доведение плотности до соответствующего уровня

Частицы сахарного стекла (т.е. трегалозы), полученные любым из обычных способов сушки, имели типичные величины плотностей около 1,5 г/см³. Тестированные перфторуглероды обычно имели плотности, колеблющиеся от 1,68 до 2,03 г/см³ (таблица 1). По этой причине при получении суспензии частицы сахарного стекла имеют тенденцию держаться на поверхности PFC слоя, что приводит к получению препарата, в котором активное вещество распределено неоднородно. Однако порошки можно модифицировать для получения стабильной суспензии в PFC, в которой они имеют нейтральную плавучесть и не оседают и не плавают на поверхности. Таких результатов можно достичь путем добавления материалов с высокой плотностью до стадии образования частиц. Такие материалы могут быть водорастворимыми или нерастворимыми в воде.

Нерастворимые в воде материалы

Трикальцийфосфат имеет плотность 3,14 г/см³, принят как адъювант для вакцин и практически нерастворим в воде. Порошки, содержащие около 50% фосфата кальция, имеют повышенную плотность, около 2 г/см³, и 20% твердых частиц образуют стабильные суспензии в перфторфенантрене.

Примеры порошков, которые при содержании 20% твердых частиц в PFC образуют стабильные суспензии, включают в себя:

1 В перфтордекалине

Вещество	Конечная концентрация мас./мас.
А. Трегалоза	50%
Фосфат кальция	50%
В. Трегалоза	47,5%
Лактат кальция	10,0%
Фосфат кальция	42,5%

2 В перфторфенантрене

Вещество	Конечная концентрация мас./мас.
Маннит	18,2%
Инозит	18,2%
Лактат кальция	18,2%
Фосфат кальция	45,4%

Другие используемые нерастворимые в воде материалы, которые увеличивали плотность, включали в себя сульфат бария и двуокись титана. Любой нетоксичный и нерастворимый материал с соответствующей плотностью мог быть использован.

Водорастворимые материалы

Растворимые соли, такие как сульфат натрия с плотностью 2,7 г/см³, также могут быть использованы в качестве повышающих плотность агентов. Приведены следующие стабильные суспензии порошка в перфтордекалине:

Вещество	Конечная концентрация мас./мас.
Трегалоза	50%
Сульфат натрия	50%

Другие нетоксичные водорастворимые материалы с высокой плотностью также могут быть использованы. Было найдено, что такие композиции вызывают дискомфорт после подкожной инъекции морским свинкам, возможно из-за быстрого растворения ионной соли при высоких концентрациях.

ПРИМЕР 10:

Влияние подобранной плотности на активные вещества в суспензиях

Определенные вакцины получают адсорбированными на нерастворимых гелях или частицах, которые служат в качестве адъювантов. Для этих целей широко использовали гидроокись алюминия и фосфат кальция. Такие нерастворимые адъюванты могут сами по себе быть использованы для увеличения плотности частиц, которые должны быть суспендированы. В таком случае материал с высокой плотностью не является полностью инертным, но фактически адсорбирует активную макромолекулу из раствора. Нужно было показать, что такая адсорбция не денатурирует активное вещество. Для того, чтобы это проверить, использовали щелочную фосфатазу в качестве модели активного вещества/вакцины.

Был приготовлен следующий раствор

Адъювант типа
фосфата кальция	10% мас./об. (Superphos Kemi a/s)
Трегалоза	10% мас./об.
ZnCl2	1 мМ
Щелочная фосфатаза	20 ед./мл

В 5 мМ трис-HCl буфере, рН 7,6

Затем раствор тщательно перемешивали в течение 10 минут при 37°С, чтобы осуществить адсорбцию щелочной фосфатазы с помощью фосфата кальция. Изменение уровня абсорбции в минуту определяли, осуществляя стадии центрифугирования фосфата кальция, взятия пробы супернатанта и ферментативной кинетики, используя в качестве субстрата п-нитрофенилфосфат и измерение поглощения при длине волны 405 нм. Раствор сушили распылением с получением тонкого порошка. В супернатанте измеряли какую-либо десорбцию фермента после повторной гидратации порошка. Порошок был суспендирован при концентрации 20% мас./об. в перфторфенантрене и было обнаружено, что он образует стабильную суспензию.

Тестируемый образец	dпоглощение/мин (405 нм)
Исходный раствор (25 мкл)	0,409
Супернатант из раствора выше (25 мкл)	0,034
Повторно гидратированный порошок
(25 мкл 20% мас./об. в воде)	0,425
Супернатант из раствора выше (25 мкл)	0,004
20% мас./об. порошок в
перфтордекалине (25 мкл)	0,430

В результате эксперимента было показано: плотность частиц может быть подогнана до плотности PFC растворителя путем включения адъюванта фосфата кальция. В процессе получения частиц значительной десорбции или потери ферментативной активности не наблюдали.

1. Композиция для доставки стабильного, биологически активного соединения субъекту, включающая частицы стекла, содержащие указанное биологически активное соединение, отличающаяся тем, что частицы имеют диаметр в диапазоне 0,1-100 мкм и суспендированы в жидкости, которая включает, по меньшей мере, один биосовместимый перфторуглерод, в котором указанные частицы не растворяются.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что частицы получены сушкой распылением.

3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что частицы включают смесь, содержащую сахар и фосфат металла.

4. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой указанное стекло включает сахарное стекло, металкарбоксилатное стекло и/или фосфатное стекло.

5. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что частицы содержат вещество, способствующее стеклообразованию.

6. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что жидкость включает поверхностно-активное вещество.

7. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что частицы включают сахарное стекло, образованное из сахара, выбранного из группы, состоящей из трегалозы, сахарозы, рафинозы, стахиозы, глюкопиранозилсорбита, глюкопиранозилманнита, палатинита, лактита, моносахаридного спирта или молекул сахара, модифицированных гидрофобными боковыми цепями, выбранными из группы, состоящей из октаацетата сахарозы или октаацетата трегалозы.

8. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что частицы включают фосфаты двухвалентных металлов или карбоксилаты металлов.

9. Композиция по п.5 или любому другому пункту, зависимому от него, отличающаяся тем, что указанное соединение, способствующее стеклообразованию, выбирают из группы, состоящей из пептида, белка, декстрана, поливинилпирролидона, боратного иона, лактата кальция, полифосфата натрия и силиката или ацетата (солей).

10. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что плотность частиц соответствует плотности жидкости.

11. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что включает наполнитель, который передает указанным частицам слабый остаточный электростатический заряд таким образом, что указанные частицы отталкиваются друг от друга.

12. Композиция по п.11, где указанным наполнителем является аминокислота.