Способ получения агроклавина

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности. Алкалоид агроклавин получают путем культивирования гриба Claviceps sp. с 106 в условиях аэрации и перемешивания в водной питательной среде, содержащей сахарозу, лимонную кислоту, дрожжевой экстракт и минеральные соли. Дополнительно среда содержит 1,0-20,0 мМ триптофана. рН среды доводят 25%-ным раствором NH₄OH до 4,5-5,4. Целевой продукт выделяют из культуральной жидкости известными способами. Способ обеспечивает повышение содержания агроклавина в культуральной жидкости и его доли в смеси алкалоидов. 1 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии и может быть использовано для получения алкалоида агроклавина, пригодного для использования в фармацевтической промышленности, медицине и научно-исследовательской практике.

Агроклавин - 6-метил-8-метил-Δ8,9-эрголен - вторичный метаболит, обладающий антипаркинсоническим действием, противоопухолевой и антибиотической активностями. Кроме того, описан ряд полусинтетических производных агроклавина с более выраженными цитостатической и иммуномодулирующей активностями по отношению к опухолевым клеткам, а также обладающих антипсихотическим действием.

Продуценты агроклавина широко распространены в природе и часто поражают сельскохозяйственные растения. Агроклавин синтезируется грибами родов Acremonium, Balansia, Epichloe, Hypomyces, Aspergillus, однако, основными продуцентами этого алкалоида являются различные виды грибов рода Claviceps.

Известен способ получения агроклавина с помощью гриба Claviceps sp. ИБФМ-F-401 (=ВКМ F-2609) (Козловский А.Г., Аринбасаров М.У., Соловьева Т.Ф., Аданин В.М., Григоров И., Ангелов Т.И., Слокоска Л.С., Ангелова М.Б. Алкалоиды гриба Claviceps sp.ИБФМ F-401.Прикладная биохимия и микробиология. 1980. Т. 16. Вып.4. С.569-577). Продуцент выращивают глубинным способом при перемешивании в колбах объемом 750 мл со 150 мл среды Т25 состава, (г/л): сахароза - 300,0; лимонная кислота - 15,0; КН₂PO₄ - 0,5; MgSO₄·7H₂O - 0,25; дрожжевой экстракт - 0,1; KCl - 0,12; ZnSO₄·7H₂O - 0,006; FeSO₄·7H₂O - 0,007; 25%-ый NH₄OH - до рН 5,2 при t=24°C. Длительность культивирования 12 сут.(6 сут. - выращивание посевного материала, 6 сут. - основная ферментация). Агроклавин выделяют экстракцией фильтрата культуральной жидкости хлороформом с последующей хроматографией на оксиде алюминия. Из 1 л культуральной жидкости (после выделения и очистки) получают 83,3 мг кристаллического алкалоида.

Описано получение агроклавина с помощью гриба Claviceps fusiformis штамма 00211 (Trinn M., Kordik G., Udvardy-Nagy nee Cserey Pechaany E., Vida Z., Zsoka nee Somkuti R. Clavine-producing strain, a process for the preparation thereof as well as a microbiological process for producing clavine alkaloids. US Patent 4618581, 21.10.1986.) Культуру выращивают глубинным способом в течение 19 суток (7 сут. - выращивание посевного материала, 12 сут. - основная ферментация) на среде, содержащей сахарозу (100 г/л) и янтарную кислоту (10 г/л). Концентрация агроклавина в культуральной жидкости составляет 240 мг/л (по данным ВЭЖХ).

Недостатком способов является низкая концентрация агроклавина в культуральной жидкости и его доля в смеси алкалоидов (менее 12%).

В литературе имеются сведения о синтезе агроклавина с помощью гриба Claviceps purpurea 129F (Pazoutova S., Flieger M., Sajdl P., Rehacek Z. The relationship between intensity of oxidation metabolism and predominance of agroclavine or elymoclavine in submerged Claviceps purpurea cultures. Journal of natural products. 1981. V.44. №2. P.225-235). Штамм выращивают в колбах глубинным способом в течение 31 суток (10 сут. - выращивание посевного материала, 21 сут. - основная ферментация) на среде состава, (г/л): сахароза - 100,0; лимонная кислота - 16,8; (NH₄)₂SO₄ - 10,0; CaCl₂ - 1.1; KH₂PO₄ - 0,25; MgSO₄·7Н₂О - 0,25; KCl - 0,12; ZnSO₄·7Н₂О - 0,015; FeSO₄·7H₂O - 0,02.

Концентрация алкалоидов в культуральной жидкости составляет 2,5 г/л (колориметрическое определение общей суммы алкалоидов в хлороформном экстракте с реактивом ВанУрка). Доля агроклавина в смеси алкалоидов достигает около 87%. Не приводится сведений о выделении алкалоидов из культуральной жидкости. Недостатком данного способа является длительность культивирования.

Известен способ получения агроклавина путем культивирования гриба Claviceps fusiformis 139/2/1G (Banks G.T., Mantle P.O., Szczyrbak C.A. Large-scale production of clavine alkaloids by Claviceps fusiformis. Journal of General Microbiology. 1974. V.82. p.345-361). Культуру выращивают в течение 22 суток (4 сут. - в колбах, 4 сут. - в 5-литровом ферментере, 4 сут. - в 60-литровом ферментере, 10 сут. - в 400-литровом ферментере) глубинным способом на среде состава, (г/л): сахароза - 200,0; (NH₄)₂SO₄ - 11,8; КН₂РО₄ - 0,5; MgSO₄·7H₂O - 0,5; ZnSO₄·7H₂O - 0,108; FeSO₄·7H₂O - 0,033. Содержание алкалоидов - 4 г/л (колориметрическое определение общей суммы алкалоидов в культуральной жидкости с реактивом ВанУрка). При отъемно-доливном способе время культивирования составляет 30 сут. При этом концентрация алкалоидов увеличивается до 5-6 г/л. Следует учитывать завышенность результатов из-за неточности анализа содержания алкалоидов в культуральной жидкости, обусловленную неспецифичностью метода из-за присутствия других соединений, синтезируемых грибами, таких как соединения, обладающие индольной структурой (триптофан и содержащие его белки, N-ацетилтриптофан, индолилуксусная кислота), ацетиламиносахара т.д. Агроклавин в смеси алкалоидов данного штамма является основным (90%). В меньших количествах синтезируются элимоклавин, ханоклавин, сетоклавин, пенниклавин. Продукт выделяют из фильтрата культуральной жидкости экстракцией бутанолом. Затем проводят многостадийную очистку экстракта, используя гексан, винную кислоту, хлороформ и хроматографию экстрактов на оксиде алюминия. Содержание продукта в хлороформном экстракте составляет 70% от его содержания в культуральной жидкости, выход кристаллического агроклавина от его содержания в хлороформном экстракте - 80%.

Наиболее близким к предлагаемому по совокупности существенных признаков является способ получения агроклавина с помощью штамма Claviceps sp.с 106, полученного путем мутагенеза штамма Claviceps sp. BKM F-2609 (Веприцкая И.Г., Бойченко Л.В., Аринбасаров М.У., Зеленкова Н.Ф., Бобкова Н.В. Получение продуцентов эргоалкалоидов методом индуцированного мутагенеза. Прикл. биохимия и микробиология. 2002. Т.38. №1. С.35-39). Штамм культивируют в течение 13 сут.(6 сут. - получение посевного материала, 7 сут. - основная ферментация) глубинным способом в колбах на среде Т25 состава, (г/л): сахароза - 300,0; лимонная кислота - 15,0; КН₂PO₄ - 0,5; MgSO₄·7Н₂О - 0,25; дрожжевой экстракт - 0,1; KCl - 0,12; ZnSO₄·7H₂0 - 0.006; FeSO₄·7H₂O - 0,007; 25%-ый NH₄OH - до рН 5,2; при t=23-25°C. Концентрация агроклавина в культуральной жидкости составляет 350 мг/л (по данным ВЭЖХ).

Выделение алкалоидов из культуральной жидкости осуществляют трехкратной экстракцией хлороформом. Основными компонентами экстракта являются агроклавин и элимоклавин (10:1). В следовых количествах присутствуют ханоклавин, сетоклавин, пенниклавин. Недостатком данного способа является низкая концентрация целевого продукта в культуральной жидкости и недостаточно высокая доля агроклавина в смеси алкалоидов.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в разработке нового микробиологического способа получения агроклавина.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в повышении содержания агроклавина в культуральной жидкости и его доли в смеси алкалоидов.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что согласно способу получения агроклавина, включающему культивирование гриба Claviceps sp. с 106 в условиях аэрации и перемешивания на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, и выделение продукта известными методами, культивирование осуществляют в присутствии триптофана.

Содержание триптофана в питательной среде может составлять 1-20 мМ.

В качестве питательной среды может использоваться среда состава:

Сахароза	200,0-350,0 г/л;
лимонная кислота	10,0-20,0 г/л;
KH2PO4	0,25-0,75 г/л;
KCl	0,06-0,24 г/л;
MgSO4·7H2O	0,10-0,50 г/л;
дрожжевой экстракт	0,10-1,00 г/л;
ZnSO4·7H2O	0,001-0,06 г/л;
FeSO4·7H2О	0,001-0,07 г/л;
триптофан	1,0-20,0 мМ
рН доводят 25%-ым раствором NH4OH	до 4,5-5,4
вода водопроводная	до 1 л

Агроклавин может быть выделен из культуральной жидкости известными методами с использованием экстракции органическими растворителями и хроматографии.

Штамм Claviceps sp.с106 хранится в коллекции грибов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН.

По нашим сведениям, ранее триптофан не использовался в питательных средах при культивировании грибов с целью получения агроклавина. В ходе разработки данного способа было установлено, что культивирование продуцента агроклавина на питательной среде, содержащей триптофан, позволяет значительно повысить содержание агроклавина в культуральной жидкости (до 3 г/л).

Культивирование может осуществляться как периодическим, так и отьемно-доливным способом.

Для определения содержания агроклавина и других алкалоидов проводят экстракцию культуральной жидкости хлороформом. Хлороформный экстракт обезвоживают, концентрируют в вакууме и анализируют методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе, оборудованном УФ-детектором с переменной длиной волны и интегратором "LKB-Pribori AB" (Швеция). Колонку (250×4,5 мм) заполняют сферисорбом ODS2 (размер частиц 5 мкм). Рабочая длина волны 224 нм, расход подвижной фазы метанол - вода - 25%-ный раствор аммиака (75:25:0,036, об./об.) составляет 1,5 мл/мин.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Выращивают штамм Claviceps sp. с 106 в колбах объемом 750 мл с 100 мл среды состава, (г/л): сахароза - 200,0; лимонная кислота - 15,0; КН₂PO₄ - 0,25; KCl - 0,06; MgSO₄·7H₂O - 0,25; дрожжевой экстракт - 0,1; ZnSO₄·7Н₂О - 0,006; FeSO₄·7Н₂О - 0,007; триптофаи - 10 мМ, 25%-ный раствор NH₄OH - до рН 5,2; вода водопроводная. Все компоненты среды, кроме сахарозы и триптофана, разводят водопроводной водой, заливают в колбы, доводят рН среды 25%-ным раствором аммиака до 5,2. Стерилизуют при температуре 110°С, давлении 0,5 атм в течение 30 мин. Сахарозу и триптофан разводят отдельно водопроводной водой до получения, соответственно, 50%-го и 2%-го растворов и стерилизуют в автоклаве при температуре 110°С, давлении 0,5 атм в течение 30 мин, после чего вносят в колбы. Культивирование проводят 14 суток на качалке при 200-240 об/мин и температуре 24±1°С.

К концу ферментации содержание агроклавина в культуральной жидкости - 1680 мг/л. Доля агроклавина в смеси алкалоидов составляет 96±1%.

Пример 2. Штамм Claviceps sp.с 106 выращивают как указано в примере 1, но содержание в среде лимонной кислоты - 20,0 г/л; КН₂РО₄ - 0,5; KCl - 0,12; триптофана - 7,5 мМ, рН среды доводят до 5,2. Культивирование проводят 14 суток.

К концу ферментации содержание агроклавина в культуральной жидкости составляет 1440 мг/л. Доля агроклавина в смеси алкалоидов - 96±1%.

Пример 3. Способ осуществляют, как указано в примере 1, но содержание в среде, (г/л): сахарозы - 300,0; лимонной кислоты - 10,0; КН₂РО₄ - 0,5; KCl - 0,12; MgSO₄·7H₂O - 0,10; триптофана - 5,0 мМ. Культивирование проводят 13 суток.

К концу ферментации содержание агроклавина в культуральной жидкости составляет 1800 мг/л. Доля агроклавина в смеси алкалоидов - 96±1%.

Пример 4. Способ осуществляют, как указано в примере 1, но содержание в среде, (г/л): сахарозы - 350,0; КН₂РО₄ - 0,5; KCl - 0,12; ZnSO₄·7Н₂О - 0,001; FeSO₄·7H₂O - 0,001. В среду вносят 5 мМ триптофана. Культивирование проводят 13 суток.

К концу ферментации содержание агроклавина в культуральной жидкости - 1910 мг/л. Доля агроклавина в смеси алкалоидов составляет 96±1.

Пример 5. Способ осуществляют, как указано в примере 1, но содержание в среде, (г/л): сахарозы - 300,0; КН₂РО₄ - 0,5; KCl - 0,12; MgSO₄·7Н₂О - 0,5; дрожжевого экстракта - 1,0; триптофана - 7,5 мМ, 25%-ный раствор NH₄OH - до рН 5,2, Культивирование проводят 13 суток.

К концу ферментации содержание агроклавина в культуральной жидкости - 2980 мг/л. Доля агроклавина в смеси алкалоидов составляет 96±1%.

Пример 6. Способ осуществляют, как указано в примере 1, но содержание в среде, (г/л): сахарозы - 300,0; КН₂PO₄ - 0,75; KCl - 0,24; триптофана - 5,0 мМ; 25%-ный раствор NH₄ОН - до рН 5,4. Культивирование проводят 13 суток.

К концу ферментации содержание агроклавина в культуральной жидкости - 1780 мг/л. Доля агроклавина в смеси алкалоидов составляет 96±1%.

Пример 7. Способ осуществляют, как указано в примере 1, но содержание в среде, (г/л): сахарозы - 300,0; КН₂PO₄ - 0,5; KCl - 0,12; ZnSO₄·7H₂O - 0,06; FeSO₄·7Н₂О - 0,07; триптофана - 5,0 мМ; 25%-ный раствор NH₄OH - до рН 4,5. Культивирование проводят 14 суток.

К концу ферментации содержание агроклавина в культуральной жидкости - 2590 мг/л. Доля агроклавина в смеси алкалоидов составляет 96±1%.

Пример 8. Выращивают штамм Claviceps sp.с 106 в ферментере АНКУМ-2 объемом 10 л на среде состава, (г/л): сахароза - 250,0; лимонная кислота - 15,0; КН₂PO₄ - 0,5; KCl - 0,24; MgSO₄·7Н₂O - 0,25; дрожжевой экстракт - 0,1; ZnSO₄·7Н₂O - 0,012; FeSO₄·7Н₂O - 0,07; триптофан - 3 мМ, 25%-ный раствор NH₄OH - до рН 5,2-5,4; вода водопроводная. Все компоненты среды, кроме сахарозы и триптофана, разводят водопроводной водой, заливают в ферментер, доводят рН среды 25%-ным раствором аммиака до 5,2-5,4. Стерилизуют при температуре 120°С, давлении 1 атм в течение 1 часа. Сахарозу и триптофан разводят отдельно водопроводной водой до получения, соответственно, 50%-го и 2%-го растворов и стерилизуют в автоклаве при температуре 110°С, давлении 0,5 атм в течение 30 мин, после чего заливают в ферментер. Объем среды в ферментере составляет 6 л. Культивирование проводят при перемешивании, температуре 23-24°С, аэрации 45% от насыщения, в течение 14 суток.

Содержание агроклавина в культуральной жидкости 1850 мг/л. Доля агроклавина в смеси алкалоидов 95%.

Пример 9. Способ осуществляют, как в примере 8, но содержание триптофана в среде 5 мМ. Культивирование проводят при аэрации 65% от насыщения в течение 13 суток.

Содержание агроклавина в культуральной жидкости к концу ферментации составляет 2350 мг/л. Доля агроклавина в смеси алкалоидов 95%.

Пример 10. Способ осуществляют, как в примере 8, культивирование проводят в течение 13 суток. К этому моменту содержание агроклавина в культуральной жидкости составляет 2250 мг/л. Затем 4,5 л культуральной жидкости сливают и используют для получения экстракта, содержащего агроклавин. В ферментер добавляют 6 л свежей питательной среды. Культивирование осуществляют в тех же условиях в течение 13 сут.

Содержание агроклавина в культуральной жидкости к концу ферментации - 2460 мг/л. Доля агроклавина в смеси алкалоидов 95%.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокое содержание агроклавина в культуральной жидкости и высокую долю его в смеси алкалоидов, что позволяет получать значительные количества препарата.

1. Способ получения агроклавина, включающий культивирование гриба Claviceps sp.с 106 в условиях аэрации и перемешивания на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, и выделение продукта известными методами, отличающийся тем, что культивирование гриба осуществляют в присутствии 1-20 мМ триптофана.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование гриба Claviceps sp.с 106 осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Сахароза	200,0-350,0
Лимонная кислота	10,0-20,0
КН2PO4	0,25-0,75
KCl	0,06-0,24
MgSO4·7Н2O	0,10-0,50
Дрожжевой экстракт	0,10-1,00
ZnSO4·7Н2O	0,001-0,06
FeSO4·7Н2О	0,001-0,07
Триптофан, мМ	1,0-20,0
рН доводят 25%-ным раствором
NH4OH	до 4,5-5,4
Вода водопроводная	до 1 л