Среда для перепрограммирования стволовых клеток человека и животных

Авторы патента:

C12N5 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

Владельцы патента RU 2260621:

Шахов Владимир Павлович (RU)
Кострикин Александр Александрович (RU)
Попов Сергей Валентинович (RU)

Изобретение относится к биологии и медицине, конкретно к средам для перепрограммирования стволовых клеток человека и животных. Среда для биохимического перепрограммирования стволовых клеток человека и животных наряду со средой DI-MEM, эмбриональной телячьей сывороткой, инсулином, 5-азацитидином, L-глютамином дополнительно содержит среду F-12, диметилсульфоксид, дексаметазон, гидрокортизон, N 6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат, этаноламид при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить эффективность перепрограммирования стволовых клеток в направлении кардиоминогенеза. 2 ил.

Изобретение относится к биологии и медицине, конкретно к средам для перепрограммирования стволовых клеток человека и животных.

Известны среды для перепрограммирования стволовых клеток человека и животных, содержащие солевую основу, аминокислоты, липиды, углеводы, витамины, микроэлементы, антибиотики, сульфаниламиды, эмбриональную телячью сыворотку, дифференцирующие факторы, например, модифицированные среды D-MEM [1, 2]. Однако данные среды содержат только один дифференцирующий фактор, например диметилсульфоксид, дексаметазон. Это приводит к тому, что перепрограммированию в направлении миогенеза и кардиомиогенеза подвержены не более 20-30% стволовых клеток [3, 4].

Наиболее близкой по составу к предлагаемой среде является среда для биохимического перепрограммирования клеток, которая содержит среду DI-MEM, 10% эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики, дифференцирующий фактор в концентрации 0,1-100 ммоль/л, 5-азацитидин и вспомогательные факторы в концентрации 1 ммоль/л инсулин или 10 нг/мл трансформирующий фактор роста [5, 6]. Данная среда, благодаря наличию дифференцирующего фактора, приводит к перепрограммированию стволовых клеток в миоциты и кардиомиоциты. Однако дозы 5-азацитидина, превышающие концентрацию 50 ммоль/л вызывают гибель более 50% клеток. Используемое в указанной среде сочетание и концентрация компонентов, а также присутствие указанного дифференцирующего фактора является причиной недостаточно высокого выхода клеток с требуемыми свойствами, таким образом способствует перепрограммированию только 30-50% стволовых клеток в направлении кардиомиогенеза.

Новая техническая задача - повышение эффективности перепрограммирования стволовых клеток в направлении кардиомиогенеза за счет повышения выхода кардиомиоцитов.

Поставленную задачу решают применением новой среды, содержащей среду DI-MEM, эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики и сульфаниламиды, инсулин, 5-азацитидин, L-глютамин, причем она дополнительно содержит среду F-12, диметилсульфоксид, дексаметазон, гидрокортизон, N6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат, этаноламид при следующем соотношении компонентов (г/л):

Эмбриональная телячья сыворотка	50-300
Среда DI-MEM	300-450
Среда F-12	300-450
Диметилсульфоксид	5-15
5-Азацитидин	0,000002-0,000001
Дексаметазон	0,00000001-0,0000001
Гидрокортизон	0,0000005-0,00015
Инсулин	0,0000005-0,00005
N6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат	0,0000005-0,000001
Этаноламид	0,00002-0,0001
L-глютамин	0,0015-0,0025
Гентамицин	0,0004-0,0008

Отличие предлагаемого изобретения от прототипа заключается в том, что среда дополнительно содержит среду F-12, диметилсульфоксид, дексаметазон, гидрокортизон, N6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат, этаноламид при следующем соотношении компонентов (г/л):

Эмбриональная телячья сыворотка	50-300
Среда DI-MEM	300-450
Среда F-12	300-450
Диметилсульфоксид	5-15
5-Азацитидин	0,000002-0,000001
Дексаметазон	0,00000001-0,0000001
Гидрокортизон	0,0000005-0,00015
Инсулин	0,0000005-0,00005
N6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат	0,0000005-0,000001
Этаноламид	0,00002-0,0001
L-глютамин	0,0015-0,0025
Гентамицин	0,0004-0,0008

Сравнение заявляемого технического решения с известными показывает, что предлагается описание композиции ингредиентов среды для перепрограммирования клеток человека и животных, позволяющей повысить эффективность перепрограммирования стволовых клеток, в направлении кардиомиогенеза, не обнаружено в известных литературных источниках. С учетом изложенного, следует считать заявляемое решение соответствующее критерию «существенные отличия».

Применение данной среды в эксперименте на клетках животных и человека показало, что она соответствует критерию «промышленно применимо» при проведении процедуры перепрограммирования стволовых клеток.

Технология приготовления среды для перепрограммирования стволовых клеток включает следующие операции:

Получение культуры in vitro стволовых клеток человека по общепринятой технологии [7];

- смешивание ингредиентов среды для перепрограммирования стволовых клеток до полного растворения веществ в количествах согласно предлагаемой формуле изобретения,

- добавление перепрограммируемой среды в культуру ткани стволовых клеток и инкубация в ней в течение 1-14 суток при 37°С, 100% влажности, 5% СО₂;

- определение доли мышечных клеток в культуре и использование клеток в соответствии с поставленными задачами (клеточный банк, клеточная терапия и т.п.).

Полученная среда для перепрограммирования стволовых клеток содержит (г/л):

Эмбриональная телячья сыворотка	- 50-300,
Среда DI-MEM	- 300-450,
Среда F-12	- 300-450,
Диметилсульфоксид	- 5-15,
5-Азацитид	- 0,000002-0,000001,
Дексамеазон	- 0,00000001-0,0000001,
Гидрокортизон	- 0,0000005-0,00015,
Инсулин	- 0,0000005-0,00005,
N6-2'-дибутирил 3'5 циклический
монофосфат	- 0,0000005-0,000001,
Этаноламид	- 0,00002-0,0001,
L-глютамин	- 0,0015-0,0025,
Гентамицин	- 0,0004-0,0008

Концентрации компонентов в предлагаемой среде для перепрограммирования стволовых клеток человека и животных подобраны на основании интерпретации данных экспериментальных исследований.

В качестве среды для сравнения (прототипа) использовали известный состав, предложенный Р.Zuk с соавт. (2001) [8]. При этом содержание эмбриональной сыворотки, 5-азацитидина, инсулина, антибиотиков и L-глютамина в каждом из экспериментов соответствовало их содержанию в предлагаемой среде для перепрограмирования стволовых клеток.

Пример 1

Культуру стволовых клеток из костного мозга крыс породы «Вистар» получали по стандартной методике путем культивирования кариоцитов в 50 мл культуральных флаконах в течение 14 суток при 37°С, 100% влажности, 5% СО₂. Использовали среду состоящую из 80% среды D-MEMLG, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, 200 мг/мл L-глютамина [8]. Через 14 суток наблюдался рост колоний, состоящих из мезенхимальных фибробластоподобных клеток (рис.1) (эффективность клонирования 1-4×10⁵ клеток на мл). На Фиг.1 (см. приложение) представлен фрагмент колонии фибробластоподобных стволовых клеток, выросших на 14 сутки из клеток костного мозга крыс породы «Вистар». Окраска азур-II эозин, ув. 40х.

На 14 сутки удалили надосадочную жидкость и заменяли средой для биохимического перепрограммирования стволовых клеток, содержащей (г/л):

Эмбриональная телячья сыворотка	- 50,
Среда DI-MEM	- 300,
Среда F-12	- 300,
Диметилсульфоксид	- 5,
5-Азацитидин	- 0,000002,
Дексаметазон	- 0,00000001,
Гидрокортизон	- 0,0000005,
Инсулин	- 0,0000005,
N6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат	- 0,0000005
Этаноламид	- 0,00002
L-глютамин	- 0,0015
Гентамицин	- 0,0004

Через 1-14 суток после культивирования материал фиксировали, окрашивали азур-II эозином или проводили электронно-микроскопическое исследование для определения доли мышечных клеток.

В контроле использовали среду-прототип, содержащую (г/л):

Эмбриональная телячья сыворотка	- 50,
Среда DI-MEM	- 600,
5-Азацитидин	- 0,000002
Инсулин	- 0,0000005
L-глютамин	- 0,0015
Гентамицин	- 0,0004.

Структурно-функциональный анализ культуры полученных клеток показал, что количество перепрограммируемых клеток в прототипе составило 33,34±2,7%, а в предлагаемой среде 47,5±3,3 (Pu<0,05), что достоверно выше, чем у прототипа.

На фиг.2. представлена электронная микроскопия культуры стволовых клеток, обработанных средой для культивирования, дифференцирующихся в кардиомиоциты на 28 сутки культивирования in vitro (см. приложение).

Пример 2

Культуру стволовых клеток из костного мозга крыс породы «Вистар» получали по стандартной методике путем культивирования кариоцитов в 50 мл культуральных флаконах в течение 14 суток при 37°С, 100% влажности, 5% CO₂. Использовали среду, содержащую 80% среды D-MEMLG, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, 200 мг/мл L-глютамина [8]. Через 14 суток наблюдался рост колоний (эффективность клонирования 1-4×10⁵ клеток на мл), состоящих из мезенхимальных фибробластоподобных клеток.

На 14 сутки удалили надосадочную жидкость и заменяли средой для перепрограммирования стволовых клеток, содержащей (г/л):

Эмбриональная телячья сыворотка	- 200,
Среда DI-MEM	- 400,
Среда F-12	- 400,
Диметилсульфоксид	- 10,
5-Азацитидин	- 0,0000015,
Дексамеазон	- 0,000000015,
Гидрокортизон	- 0,000002,
Инсулин	- 0,000001,
N6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат	- 0,00000025
Этаноламид	- 0,00005
L-глютамин	- 0,002
Гентамицин	- 0,0006

Структурно-морфологический анализ выросших культур показал, что количество перепрограммируемых клеток в прототипе составило 42,6±3,5%, в предлагаемой среде 61,54±2,3% (Pu<0,05), что достоверно выше, чем у прототипа.

Пример 3

Культуру стволовых клеток из костного мозга человека, взятого во время операции из бедренной кости получали по стандартной методике путем культивирования кариоцитов в 50 мл культуральных флаконах в течение 14 суток 37°С, 100% влажности, 5% СО₂. Использовали среду, состоящую из 80% среды D-MEMLG, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, 200 мг/мл L-глютамина [8]. Через 14 суток наблюдался рост колоний (эффективность клонирования 1-4×10⁵ клеток на мл), состоящих из мезенхимальных фибробластоподобных клеток.

Эмбриональная телячья сыворотка	- 300,
Среда DI-MEM	- 450,
Среда F-12	- 450,
Диметилсульфоксид	- 15,
5-Азацитидин	- 0,000001,
Дексамеазон	- 0,0000001,
Гидрокортизон	- 0,00015,
Инсулин	- 0,00005,
N6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат	- 0,000001,
Этаноламид	- 0,0001,
L-глютамин	- 0,0025,
Гентамицин	- 0,0008

В контроле использовали среду-прототип, содержащую (г/л):

Эмбриональная телячья сыворотка	- 300,
Среда DI-MEM	- 900,
5-Азацитидин	- 0,000001,
Инсулин	- 0,00005,
L-глютамин	- 0,0025,
Гентамицин	- 0,0008

Структурно-морфологический анализ выросших культур показал, что количество перепрограммируемых клеток в прототипе составило 45,3±1,1%, в предлагаемой среде 55,3,5±1,9 (Pu<0,05), что достоверно выше, чем у прототипа.

Обоснование выбора ингредиентов

Диметилсульфоксид является стабилизатором внутриклеточной воды в клетках, а также фактором, способствующим мышечной дифференцировке стволовых клеток. Патогенетический механизм действия на родоначальные клетки не известен [4, 5].

Дексаметазон и гидрокортизон являются глюкокортикоидами, принимающими участие в процессах пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Существуют внутриядерные рецепторы в клетках-мишенях к данным гормонам. В дозах более 0,001 г/л вызывают угнетение клеточных функций [1, 6].

N 6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат является внутриклеточным мессенджером, принимающим участие в экспрессии генов, ответственных за миогенез [1, 7].

Этаноламид - кофактор, способствующий кардиомиогенезу [1, 8].

Среда F-12 используется в сочетании со средой D-MEM или DI-MEM для выращивания клеток мезенхимальной природы [1].

Таким образом, применение предлагаемой среды для перепрограммирования стволовых клеток человека и животных позволяет увеличить выход образования мышечных клеток за счет взаимного усиления дифференцировочного воздействия в сторону кардиомиогенеза.

Список используемой литературы

1. Культура животных клеток. Методы/ Р.Фрешни. - М.: Мир. - 1989.

2. Биология развития млекопитающих. Методы/ М.Манк. - М.: Мир, 1990.

3. Leiden J.M. Beating the odds: a cardiomyocytes cell line at last// J. clin. Invest. - 199. - V.103. - P.591-592.

4. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult mesen-chymal cells// Science. - 1999. - V.284. - P.143-147.

5. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro//J. Clin. Invest. - 1999. - V.103. - P.697-705.

6. Wang J., Shum-Tim D., Galipeau J. et al. Marrow stromal cell for cellular cardiomyoplasty: fasibility and potential clinical advantages // J. Thoracic and Cardiovascular Surgery. - V.120. - P.999-1007.

7. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, ТГУ, 1992.

8. Zuk P., Zyu A., Mizido H. et al. Multilineage cell from human adipose tissue implicactions for cell-based therapies// Tissue engineering. - 2001. - V.7. - P.211-228.

Среда для перепрограммирования стволовых клеток человека и животных, содержащая среду DI-MEM, эмбриональную телячью сыворотку, инсулин, 5-азацитидин, L-глютамин, гентамицин, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит среду F-12, диметилсульфоксид, дексаметазон, гидрокортизон, N 6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат, этаноламид при следующем соотношении компонентов, г/л:

Эмбриональная телячья сыворотка	50-300
Среда DI-MEM	300-450
Среда F-12	300-450
Диметилсульфоксид	5-15
5-Азацитидин	0,000002-0,000001
Дексаметазон	0,00000001-0,0000001
Гидрокортизон	0,0000005-0,00015
Инсулин	0,0000005-0,00005
N 6-2'-дибутирил 3'5 циклический монофосфат	0,0000005-0,000001
Этаноламид	0,00002-0,0001
L-глютамин	0,0015-0,0025
Гентамицин	0,0004-0,0008

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Штамм гибридных клеток с3/s-3e5 животных mus musculus l., продуцирующих моноклональные антитела к коксиеллам бернета // 2257414

Изобретение относится к гибридомной технологии и представляет собой новый штамм гибридных клеток C3/S-3E5 животных Mus musculus L., продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (далее МКАт) к коксиеллам Бернета (штамм “Грита”).

Штамм культивируемых клеток мышиной гибридомы и4, используемый для получения моноклональных антител к антигену микротрубочек ядерных клеток // 2256702

Изобретение относится к биотехнологии, биологии и медицине и может быть использовано для идентификации фазы митотической активности клеток. .

Способ выявления вируснейтрализующих антител при вирусной диарее - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота // 2255976

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способам серологической диагностики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота, в частности вирусной диареи - болезни слизистых (ВД КРС), а также оценке напряженности иммунитета у вакцинированных животных.

Питательная среда для выращивания клеточной культуры ajuga reptans l // 2252957

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания растительных тканей, и может быть использована для получения биологически активных веществ, в частности экдистероидов.

Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток // 2252252

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно, к выделению мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека, и может быть использовано для лечения широкого круга заболеваний.

Способ получения и выделения белка, обладающего активностью фактора viii, линия клеток нкв, экспрессирующая белок, обладающий активностью фактора viii (варианты) // 2249041

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения белка, обладающего активностью фактора VIII, в промышленных масштабах. .

Способ размножения/поддержания недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников (варианты), способ приготовления кондиционированной среды стромальных клеток, способ трансплантации недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников (варианты) // 2249039

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. .

Конструирование и применение генов, кодирующих патогенные эпитопы, для лечения аутоиммунного заболевания // 2248807

Выделенная молекула днк, кодирующая эритропоэтин человека, (варианты), экспрессирующий плазмидный или вирусный днк-вектор, гликопротеид эритропоэтин (варианты) и способ его получения, фармацевтическая композиция (варианты), линия клеток млекопитающего (варианты) // 2261276

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в медицине

Способ оптимизации клонального микроразмножения винограда in vitro // 2264706

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к способам размножения винограда in vitro

Способ стимуляции фагоцитарной активности макрофагов // 2265050

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в клинической практике для стимулирования биологических процессов в клетках и тканях

Способ стимуляции фагоцитарной активности макрофагов // 2265050

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. pkkk (п) 679d-продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену yersinia enterocolitica о3 и о9 сероваров // 2265051

Изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной технологии, и может быть использовано при создании диагностических тест-систем для идентификации штаммов Y.enterocolitica О3 и О9 сероваров в целях лабораторной диагностики в здравоохранении, ветеринарии и для проведения научных исследований

Штамм гибридных клеток животного mus musculus l. 9e2, используемый для получения моноклональных антител к белку e вируса западного нила штамм wnv/leiv-vig99-27889 // 2265658

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии и касается получения нового штамма гибридных клеток Mus musculus L

Способ регулирования биохимических процессов (варианты) // 2265660

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, в частности может применяться как в самых широких областях биопроизводства для ускоренного роста биопродуктов, например в микробиологии, растениеводстве и животноводстве, так и в медицине для коррекции биохимических процессов определенных функций организма человека с целью его оздоровления, профилактики и лечения заболеваний, а также в послеоперационный период

Способ получения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном, способ тестирования вещества на применимость для лечения болезни альцгеймера (варианты), плазмида (варианты), способ получения первичной культуры клеток или субкультивируемой клетки // 2266002

Изобретение относится к области генетической инженерии

Среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки // 2266325

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при культивировании клеток млекопитающих, а также для получения белка из клеток млекопитающих

Среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки // 2266325