Способ получения клещевого аллергена для постановки диагностической пробы

Изобретение относится к фармакологии и медицине. В качестве исходного сырья используют культуру клещей домашней пыли. Экстрагирование проводят в течение 45 часов 0,125 М раствором гидрокарбоната аммония. Надосадочную жидкость сливают и центрифугируют в течение 45 минут. Экстракт фильтруют, подвергают диализу в течение 52 часов при температуре 6±2°С, дважды по 24 часа против 0,002 М раствора гидрокарбоната аммония и один раз в течение 4 часов против дистиллированной воды. Диализованный экстракт центрифугируют 1 час, фильтруют его через бумажный фильтр и проводят лиофильное высушивание до остаточной влажности не более 4%. Сухой остаток растворяют в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,5. Добавляют 1%-ный раствор формальдегида, проводят стерилизующую фильтрацию. Формалинизированный аллергоид выдерживают 32 суток при температуре 32°С. Затем проводят диализ при температуре 6±2°С против 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 7,5. Результатом способа является создание аллергена, обладающего сниженной аллергенной активностью.

 

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения лечебного аллергена.

Известен способ получения лечебного аллергена, включающий водно-солевую экстракцию пыльцы растений: амброзии и тимофеевки, и обработку водно-солевых экстрактов из пыльцы растений формальдегидом.

Техническим результатом изобретения является создание высокоэффективного лечебного аллергена, обладающего сниженной аллергенной активностью.

Для достижения указанного технического результата в способе получения лечебного аллергена, включающем водно-солевую экстракцию исходного сырья и обработку его формальдегидом, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют культуру клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус, экстрагирование проводят в течение 45 часов 0,125 М раствором гидрокарбогата аммония, после экстрагирования надосадочную жидкость сливают и осуществляют центрифугирование в течение 45 минут, фильтруют экстракт, подвергают диализу в течение 52 часов при 6±2°С дважды по 24 часа против 0,002 М раствора гидрокарбоната аммония и один раз в течение 4 часов против дистиллированной воды, диализованный экстракт центрифугируют в течение 1 часа, фильтруют его через бумажный фильтр и проводят лиофильное высушивание до остаточной влажности не более 4%, сухой остаток в стерильных условиях растворяют в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,5, добавляют 1%-ный раствор формальдегида, проводят стерилизующую фильтрацию, а после проведения стерилизующей фильтрации формалинизированный аллергоид выдерживают в течение 32 суток при температуре 32°С с последующим проведением диализа при 6±2°С против 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 7,5 до получения готовой формы лечебного аллергена.

Изобретение иллюстрируется на следующем примере.

Пример. Для получения лечебного аллергена используют культуру клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус. Культуру клещей в количестве 105 г растирали порциями со стеклянным порошком (в соотношении 1:2 по объему) в фарфоровой ступке. Растертую смесь переносили в емкость, куда осторожно переливали охлажденный буфер - 0,125 М раствора гидрокарбоната аммония. Соотношение исходного сырья и буфера составляло 7:100. В течение трех часов сырье оставляли для намачивания в холодильнике, затем экстрагировали в следующем режиме: 30 минут на встряхивателе при комнатной температуре, 1 час без встряхивания. На ночь емкость оставляли в холодильной камере при температуре 6°С. Общее время экстракции 45 часов. Это время необходимо для полного высвобождения растворимых компонентов исходного сырья.

После окончания экстрагирования надосадочную жидкость сливают и осуществляют центрифугирование при 5000 об/мин в течение 45 минут. Затем фильтруют экстракт через бумажный фильтр.

Полученный экстракт подвергают диализу в течение 52 часов при 6±2°C дважды по 24 часа против 0,002 М раствора гидрокарбоната аммония и один раз в течение 4 часов против дистиллированной воды при следующем соотношении: на 2 мл экстракта 90 мл диализующей жидкости. Снижение аминного азота в конце диализа по сравнению с исходным уровнем не менее чем в 5 раз являлось показателем окончания диализа.

Диализованный экстракт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 1 часа и фильтруют через бумажный фильтр. После чего проводят лиофильное высушивание до остаточной влажности не более 4%.

Сухой остаток в стерильных условиях растворяют в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,5 из расчета 1 мл буфера на 3 мг сухого остатка. Добавляют 1%-ный раствор формальдегида.

Проводят стерилизующую фильтрацию.

После проведения стерилизующей фильтрации формалинизированный аллергоид выдерживают в термостате в течение 32 суток при температуре 32°С. Для удаления остаточного формальдегида проводят диализ в холодильной камере при 6±2°С против 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 7,5 до получения готовой формы аллергена.

Полученный препарат специфически активен, обладает сниженной аллергенной активностью. Вызывает у лиц, чувствительных к клещам домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус, положительные реакции кожи, выраженность которых в 1,5 и более раз меньше по размеру волдыря, чем на одноименный аллерген.

Определение проводят методом постановки кожных проб прик-тестом у лиц старше 15 лет с повышенной чувствительностью к клещам домашней пыли, у которых зарегистрирована положительная реакция кожи на одноименный аллерген выраженностью на 3 или 4 креста. В условиях одномоментной постановки кожных проб с аллергоидом и одноименным аллергеном при равнозначных концентрациях белкового азота - 5000 PNU/мл зарегистрированы положительные реакции на аллергоид не менее чем у трех из пяти и у 5 из 10 обследованных лиц, выраженность которых в 1,5 и более раз меньше (по размеру волдыря), чем на аллерген.

Способ получения клещевого аллергена для постановки диагностической пробы, включающей водно-солевую экстракцию исходного сырья и обработку его формальдегидом, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют культуру клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус, экстрагирование проводят в течение 45 ч 0,125 М раствором гидрокарбоната аммония, после экстрагирования надосадочную жидкость сливают и осуществляют центрифугирование в течение 45 мин, фильтруют экстракт, подвергают диализу в течение 52 ч при температуре 6±2°С, дважды по 24 ч против 0,002 М раствора гидрокарбоната аммония и один раз в течение 4 ч против дистиллированной воды, диализованный экстракт центрифугируют в течение 1 ч, фильтруют его через бумажный фильтр и проводят лиофильное высушивание до остаточной влажности не более 4%, сухой остаток в стерильных условиях растворяют в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,5, добавляют 1%-ный раствор формальдегида, проводят стерилизующую фильтрацию, затем формалинизированный аллергоид выдерживают в течение 32 суток при температуре 32°С с последующим проведением диализа при температуре 6±2°С против 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 7,5 до получения готовой формы аллергена для диагностики.