Способ получения биомассы дрожжей

Изобретение относится к области микробиологии. Способ включает культивирование дрожжей на углеводсодержащем субстрате в присутствии пероксида водорода. Предварительно проводят адаптацию клеток дрожжей к пероксиду водорода. Способ с высокой эффективностью может быть использован для получения кормовых продуктов при утилизации углеводсодержащих субстратов. 1 табл.

 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к области культивирования микроорганизмов для получения пищевых продуктов, а также биомассы бактерий и дрожжей, и может быть использовано в пищевой промышленности, а также для получения пищевых дрожжей и кормовых продуктов при утилизации углеводсодержащих субстратов, получаемых в спиртовой, пивной, сахароперерабатывающей и молокоперерабатывающей промышленности, а также для получения маточной культуры производства спирта из углеводсодержащего сырья.

Известен способ управления биохимическим процессом (RU, патент 2148643 С 12 N 1/38, 2000) путем введения в культуральную жидкость вещества-антиоксиданта, причем предварительно из группы подходящих антиоксидантов опытным путем выбирают вещество, оказывающее максимальное влияние на количественные характеристики выбранного параметра биохимического процесса, определяют количественную зависимость изменения указанного параметра от количества вводимого вещества и используют полученную зависимость для управления процессом.

Известен также способ стимулирования биологического синтеза антибиотиков (RU, патент 2172344 С 12 N 1/38, 2001), согласно которому культуру-продуцент антибиотика выращивают в присутствии стимулятора роста культуры-продуцента.

Известен также способ управления культивирования микроорганизмов (RU, патент 2098482 С 12 N 1/38, 1997), согласно которому культивирование осуществляют в присутствии вещества, положительно влияющего на процесс выращивания, который вводят в культуральную жидкость на стадии, предшествующей лаг-фазе.

Недостатками вышеуказанных способов интенсификации микробиологических процессов следует признать повышенное содержание побочных продуктов биосинтеза и неутилизированных минеральных компонентов, а также ограниченные возможности по увеличению содержания клеток микроорганизмов в постферментационной среде.

Техническая задача, решаемая посредством предлагаемого изобретения, состоит в повышении эффективности ферментационного процесса по сбраживанию субстрата, продуктивности и содержанию клеток дрожжей в культуральной среде в режиме периодического культивирования при одновременном обеспечении высоких показателей ферментационного процесса по продуктивности, содержанию клеток дрожжей в постферментационной среде в режиме периодического культивирования и обеспечении их высокой физиологической активности.

Технический результат, получаемый при реализации предложенного способа, состоит в повышении концентрации биомассы дрожжей при одновременном снижении остаточного содержания компонентов питания в постферментационной среде, повышении продуктивности ферментационного процесса на 5-10% без снижения содержания белка в клетках дрожжей.

Для получения указанного технического результата предложено использовать способ получения биомассы дрожжей, согласно которому предварительно проводят адаптацию клеток дрожжей к пероксиду водорода с концентрацией не более 0,01 кг/дм³ культуральной среды с последующим проведением ферментационного процесса с подпиткой углеводсодержащим субстратом. Предварительную адаптацию проводят при последовательных пересевах суспензии дрожжей на питательную среду с внесением пероксида водорода в концентрации от 0,0001 до 0,01 кг пероксида водорода в пересчете на 100% концентрацию на 1 дм³ среды в фазе активного роста дрожжей. Однако возможно проведение процессов адаптации при разовом культивировании дрожжей на среде, содержащей пероксид водорода в количестве до 0,01 кг/дм³ культуральной среды. В предпочтительном варианте ферментационный процесс проводят в периодическом режиме, а в наиболее предпочтительном - с дробной подпиткой субстрата.

Экспериментально отмечено, что при использовании в микробиологических процессах предварительно адаптированных к пероксиду водорода микроорганизмов происходит повышение бродильной активности (до 10-20%) по скорости сбраживания, что, возможно, обусловлено вероятным повышением активности дегидрогеназ у штаммов, преадаптированных к перекиси водорода, и переключении потока НАДН в таких преадаптированных штаммах на восстановление пирувата или ацетата в анаэробных условиях.

Проводить адаптацию клеток дрожжей к пероксиду водорода с концентрацией более 0,01 кг/дм не имеет смысла, поскольку содержание пероксида водорода в культуральной среде обычно не превышает величины 0,01 кг/дм³. Использование вводимых количеств пероксида водорода менее 0,0001 кг пероксида водорода в пересчете на 100% концентрацию на 1 дм³ среды не позволяет провести процесс адаптации, поскольку используемая добавка не влияет на состояние дрожжей, а использование добавок свыше 0,01 кг пероксида водорода в пересчете на 100% концентрацию на 1 дм³ среды может привести к гибели популяции дрожжей.

Обычно предварительную адаптацию проводят при последовательных пересевах суспензии дрожжей на питательную среду в течение 1-2 недель с однократным или многократным внесением пероксида водорода в концентрации от 0,0001 до 0,01 кг пероксида водорода (в пересчете на 100% пероксид водорода) на 1 дм³ среды в фазе активного роста дрожжей. Процесс проводят в периодических условиях в колбах объемом 0,250 дм³ на термостатируемой качалке с числом оборотов 180 об/мин при температуре, оптимальной для роста дрожжей. В колбы вносят по 0,095 дм³ питательной среды и по 0,005 дм³ суспензии дрожжей с предыдущего пассажа или исходной. Пересев осуществляют на новую порцию питательной среды через 8-12 ч. Серию последовательных пересевов осуществляют в течение 1-2 недель, при этом дозу вносимого пероксида водорода постепенно повышают, начиная с разового внесения 0,0001 кг/дм³, до 0,01 кг/дм³. В результате к концу адаптации получают дрожжи, устойчивые к разовому внесению пероксида водорода в концентрации не более 160 кг/дм³.

Периодический процесс культивирования с дробным внесением органического субстрата проводили в биореакторах объемом не менее 1 дм³. Используются питательные среды на основе углеводсодержащего сырья с исходным содержанием углеводов (по редуцирующим веществам) от 001 до 0,2 кг/дм³ и необходимые минеральные компоненты питания - источники азота, фосфора, серы, калия, магния. По мере культивирования и исчерпания компонентов питания осуществляют подпитку ферментационной среды концентрированным органическим субстратом (в виде концентрированного раствора или сухой сыпучей формы с содержанием углеводов от 30 до 100%) и минеральными компонентами (также в виде раствора или сухой сыпучей формы). По ходу ферментации пероксид водорода вносят не более четырех раз порциями по 0,0002-0,01 кг (в пересчете на 100% пероксид водорода) на 1 дм³ культуральной среды.

Показатели культивирования оценивали по содержанию биомассы дрожжей и остаточных углеводов в культуральной среде и содержанию белка (сырого протеина) в сухом продукте, дыхательной и бродильной активности.

В дальнейшем изобретение будет рассмотрено с использованием следующих примеров реализации.

Пример 1. Культивировали дрожжи Candida tropicalis на сахарозе в качестве источника углерода и энергии. Использовали питательную среду следующего состава, кг/дм³: (NH₄)₂SO₄ - 0,003, MgSO₄·7H₂O - 0,0014, K₂SO₄ - 0,0003, КН₂PO₄ - 0,003, (NH₄)₂HPO₄ или NH₄H₂PO₄ - 0,005, NaH₂PO₄·2H₂O - 0,01, а также внесли микроэлементы в количестве, кг/л: FeSO₄·7H₂O - 50·10^-6, MnSO₄·7H₂O - 30·10^-6, ZnSO₄·7H₂O - 30·10^-6, NaCl - 20·10^-6, CuSO₄·3H₂O - 10·10^-6. Процесс проводили при рН 3,5-5,5 и температуре 32-34°С. Дрожжи, адаптированные к пероксиду водорода, получали путем последовательного пересева (пассажа) на минеральную среду указанного состава с содержанием сахарозы 0,005 кг/дм³. В ходе каждого цикла выращивания однократно вносят пероксид водорода в момент экспоненциальной фазы роста дрожжей. В первом пассаже вносят 0,0002 кг/дм³ пероксида водорода. По ходу пересевов увеличивают дозу вносимого пероксида водорода и к 15-му пассажу дозу вносимого пероксида водорода доводят до 0,01 кг/дм³.

Полученные после 15-го пассажа дрожжи используют в качестве посевного материала для культивирования в биореакторе объемом 5 дм³. Исходная концентрация сахарозы в среде - 0,05 кг/дм³, биомассы дрожжей (по абсолютно сухим веществам - АСВ) - 0,001 кг/дм³. Культивирование ведут в периодическом режиме при аэрации и интенсивном перемешивании, с поддержанием рН в диапазоне 3,5-4,5 и использованием гидроксида аммония в качестве титрующего агента. После потребления исходного количества сахарозы культивирование продолжают в режиме с подпиткой субстратом, при котором сахарозу вносят в сухой сыпучей форме порциями по 0,02-0,050 кг/дм³. Компоненты минерального питания вносят по необходимости в зависимости от суммарного количества потребленной сахарозы и в соответствии со стехиометрией процесса. Пероксид водорода вносят в культуральную среду 3 раза за весь цикл культивирования, каждый раз по 0,002 кг/дм³.

Показатели культивирования в сравнении с вариантом без использования пероксида водорода приведены в таблице.

Таблица
Показатели процесса	Предложенный способ с дробным внесением субстрата	Аналог с дробным внесением субстрата
Концентрация биомассы дрожжей (по абс. сух. дрожжам), кг/дм3	130	40
Количество суммарно внесенной	260	85
сахарозы за цикл ферментации, кг/дм3
Выход биомассы кг асд/кг сахарозы	0,5	0,47
Содержание белка в биомассе	50,0	50,0
дрожжей (по сырому протеину), %
Остаточное содержание сахарозы в	1,0	5,0
постферментационной среде, %
Доля жизнеспособных клеток, %	98,5	90
Продолжительность ферментации, ч	30	15
Продуктивность биореактора, в среднем за цикл, кг/дм3.ч	4,3	2,5

Пример 2. Культивирование проводят на спиртовой барде аналогично процессу в примере 1. В качестве подпитки используют упаренную спиртовую барду или сусло спиртового производства с содержанием углеводов (по редуцирующим веществам) 15-50%. В качестве выращиваемых микроорганизмов - дрожжевые культуры - продуценты кормового белка, преадаптированные к пероксиду водорода. В конце культивирования (через 20-30 ч) получают суспензию с содержанием биомассы дрожжей (по сухому весу) от 0,05 до 0,12 кг/ дм³ при выходе дрожжевых клеток 0,0005 кг в пересчете на абсолютно сухое вещество на 1 кг редуцирующих веществ и содержанием в них 45-55% белка (по сырому протеину), остаточным содержанием углеводов не более 0,002 кг/дм³.

Пример 3. Культивирование проводят на молочной сыворотке аналогично процессу в примере 1. В качестве подпитки используют сгущенную или сухую молочную сыворотку с содержанием лактозы 10-80%. В качестве выращиваемых микроорганизмов - дрожжевые культуры Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxsianus - продуценты кормового белка, преадаптированные к пероксиду водорода. В конце культивирования (через 20-30 ч) получают суспензию с содержанием биомассы дрожжей (по сухому весу) от 0,04 до 0,14 кг/дм³ при выходе дрожжевых клеток 0,5 кг в пересчете на абсолютно сухое вещество на 1 кг редуцирующих веществ и содержанием в них 45-60% белка (по сырому протеину), остаточным содержанием лактозы не более 1,5 кг/дм³.

Пример 4. Культивирование проводят на зерновом сусле спиртового производства аналогично процессу в примере 1. В качестве подпитки используют сусло спиртового производства или ферментолизаты крахмалсодержащего сырья с содержанием углеводов (по редуцирующим веществам) 15-70%. В качестве выращиваемых микроорганизмов - промышленные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, осуществляющие спиртовое брожение, преадаптированные к пероксиду водорода. В конце культивирования (через 25-40 ч) получают суспензию с содержанием биомассы дрожжей (по сухому весу) от 0,05 до 0,120 кг/дм³ при выходе дрожжевых клеток 0,45-0,5 кг асд/кг редуцирующих веществ и остаточным содержанием углеводов не более 0,002 кг/дм³. Преадаптированные к пероксиду водорода дрожжи используют для получения маточной культуры путем последовательных пересевов с доведением объема среды до производственной дрожжанки, далее передают в бродильный чан и осуществляют спиртовое брожение.

Пример 5. Процесс проводят аналогично примеру 1, но при последовательных пересевах суспензии дрожжей на питательную среду с внесением пероксида водорода используют максимальную концентрацию 0,005 кг/дм³. При этом получают результаты, отличающиеся от результатов по концентрации биомассы дрожжей и производительности биореактора, приведенных в примере 1, примерно 9-11%.

Пример 6. Процесс проводят аналогично примеру 1, но при последовательных пересевах суспензии дрожжей на питательную среду с внесением пероксида водорода используют максимальную концентрацию 0,0001 кг/дм³. При этом получают результаты, по концентрации биомассы дрожжей и производительности биореактора, отличающиеся от результатов, приведенных в примере 1, примерно 11-13%.

Пример 7. Процесс проводят аналогично примеру 1, но при последовательных пересевах суспензии дрожжей на питательную среду с внесением пероксида водорода используют максимальную концентрацию 0,00005 кг/дм³. При этом получают результаты, по концентрации биомассы дрожжей и производительности биореактора отличающиеся от результатов использования способа - ближайшего аналога на 4-5%.

Пример 8. Процесс проводят аналогично примеру 1, но при последовательных пересевах суспензии дрожжей на питательную среду с внесением пероксида водорода используют максимальную концентрацию 0,015 кг/дм³. При этом получают результаты, по концентрации биомассы дрожжей и производительности биореактора отличающиеся от результатов использования способа - ближайшего аналога на 6-7%.

Предлагаемый способ позволяет в 2-5 раз увеличить концентрацию биомассы микроорганизмов и снизить остаточное содержание компонентов питания в постферментационной среде, значительно повысить продуктивность ферментационного процесса, а также повысить выход биомассы из субстрата на 5-10% без снижения содержания белка в клетках микроорганизмов.

Способ получения биомассы дрожжей, включающий культивирование дрожжей на углеводсодержащем субстрате в присутствии вещества, положительно влияющего на процесс выращивания, отличающийся тем, что процесс проводят в присутствии пероксида водорода, причем предварительно проводят адаптацию клеток дрожжей к пероксиду водорода с концентрацией не более 0,01 кг/дм³ питательной среды путем последовательных пересевов суспензии дрожжей на питательную среду с внесением пероксида водорода в концентрации от 0,0001 до 0,01 кг пероксида водорода в пересчете на 100%-ную концентрацию на 1 дм³ среды в фазе активного роста дрожжей, а процесс культивирования проводят с подпиткой углеводсодержащим субстратом при внесении пероксида водорода порциями по 0,0002-0,01 кг в пересчете на 100%-ный пероксид водорода на 1 дм³ ферментационной среды.