Способ прогнозирования спаечной болезни у детей, перенесших оперативные вмешательства на органах брюшной полости

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для прогнозирования спаечной болезни у детей, перенесших оперативные вмешательства на органах брюшной полости. Сущность изобретения состоит в том, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма NAT2 методом полимеразной цепной реакции и при обнаружении одного из генотипов NAN2*4/*4, NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7 прогнозируют риск развития спаечной болезни брюшины у обследуемого. Техническим результатом является повышение точности прогнозирования развития спаечной болезни.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к детской хирургии.

По данным разных авторов у 55-100% пациентов, перенесших в анамнезе абдоминальное хирургическое вмешательство, в послеоперационном периоде развивается спаечный процесс брюшной полости, который способен привести к такому грозному осложнению, как спаечная кишечная непроходимость (Ellis, 1997), а повторные операции увеличивают риск образования спаек и их осложнений (Ugur M. et al., 1996; Lundorff P. et al., 1996, Ellis et al., 1999).

До настоящего времени пока еще нет достаточно объективных методов прогнозирования возникновения послеоперационных спаек в брюшной полости. В этой связи особую актуальность представляет использование прогностических критериев.

М.Гринберг и Н.Лоэрсон (1986) выделили следующие интраоперационные факторы, способствующие образованию послеоперационных спаек: ишемия, высыхание поверхности брюшины, наложение швов, кетгутовые или хромированные швы, натяжение брюшины, сгустки крови, оставшиеся в брюшной полости, продолжительная операция, использование грубых инструментов при операциях. Наличие этих факторов, а также внешний вид и протяженность послеоперационного рубца давали возможность в некоторой степени прогнозировать возможность развития спаечных осложнений. Кроме того, использование лапароскопических методик при оперативных вмешательствах на органах брюшной полости также может рассматриваться качестве одного из факторов профилактики спаечной болезни брюшины. Это связано с тем, что травма, наносимая эндохирургическим инструментарием брюшинным покровам, минимальна, следовательно, процент развития спаечной болезни брюшины и спаечной кишечной непроходимости снижается. Но лапароскопическая методика оперирования не является панацеей от образования спаек. Снижение случаев развития спаечной болезни наиболее эффективно только при комплексном подходе к решению этой сложной проблемы.

В последние годы некоторые авторы считают, что в патогенезе развития спаек главная роль принадлежит наследственной предрасположенности, связанной с "фенотипом быстрого ацетилирования" (Р.Д.Магалашвили Диагностика предрасположенности, профилактика и лечение спаечной болезни. Автореферат дис.докт. мед. наук. Москва, 1991, 39 с.)

У людей с медленным фенотипом ацетилирования происходит накопление субстратов ацетилирования. Эти субстраты связываются с ионами меди, что ведет к снижению активности ферментов лизилоксидазы и пролилоксидазы. Вследствие этого нарушается гидроксилирование коллагена, блокируется переход растворимых форм коллагена в нерастворимые, не образуются поперечные связи, и снижается формирование коллагеновых волокон. Биодеградация коллагена преобладает над его синтезом, воспалительный процесс протекает вяло и спайки не образуются. При фенотипе быстрого ацетилирования отсутствует избыток субстратов ацетилирования. Ионы меди и железа не связываются с субстратами, активность ферментов лизилоксидазы и пролилгидроксидазы повышается, в результате чего происходит ускоренное образование коллагена. Его синтез превалирует над разрушением, воспалительный процесс протекает бурно с образованием спаек (В.Х.Хусаинова, Т.А.Федорова, Н.И.Волков., Гинекология. Т 5, №2, 2003).

Известен метод прогнозирования спайкообразования в брюшной полости, основанный на выявлении типа ацетилирования путем определения свободно ацетилированного норсульфазола в пятичасовой пробе мочи по методу Гавриловой-Пребстинга в модификации Тимофеевой (Тимофеева А.М. - Фармакология и токсикология 1944, №2, С.61-63.)

Процент ацетилирования рассчитывается по формуле:

К=(О-Г)×100%, где К - процент ацетилирования, О - показатель общего норсульфазола, Г - показатель свободного норсульфазола. К быстрым ацетиляторам относятся лица с процентом ацетилирования 76 и выше, к медленным - меньше 76%.

Прототипом изобретения является способ прогнозирования спаечной болезни брюшины путем определения фенотипа ацетилирования методом D.Evans в модификации Л.Н.Буловской (Evans D.A.P. // J. Med. Genet. - 1969 - Vol.6, N 4.- Р.405-407; Л.Н.Буловская // Лабораторная диагностика в клинической практике. - Л., 1982 - С.128-132). В этом случае процент ацетилированного сульфадемизина определяют через 5 часов после приема препаратов в крови или моче. Быстрыми ацетиляторами считаются лица, у которых за пять часов ацетилируется 50% сульфадемизина и более, а медленными - менее 50%. При этом соотношение медленных и быстрых ацетиляторов в европейской популяции у людей составляет 40:60. Другой вариант предусматривает сбор крови или мочи через 6 часов вместо 5. По этой методике к медленным ацетиляторам относятся лица, ацетилирующие менее 70% сульфадемизина, а к быстрым - более 76%, при этом быстрые и медленные ацетеляторы распределяются поровну в здоровой популяции детей. Таким образом, фенотипирование детей с аппендицитом по активности ацетилирования сульфадимезина дает возможность прогнозировать спаечную болезнь в послеоперационном периоде. Метод доступен по реактивам и оборудованию.

Однако данные методы имеют следующие недостатки:

- Необходимость приема больными лекарственных препаратов в ходе обследования

- Возможность выявления только двух фенотипов ацетилирования

- Применение перед обследованием или во время обследования других лекарственных форм влияет на достоверность полученных данных.

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования развития спаечной болезни брюшины.

Способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 6 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса, используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; -1984. - V.1. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4 000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0, суспензируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисHCl до рН 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂O; раствор хранят при -20°С.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента промоторной области гена NAT-2. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров приведены в работе Fishman и сотр. (Fishman D., Faulds, G., Jeffery, R. et al. The effect of novel polymorphisms in the interleukin-6 on IL-6 transcription and plasma levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis // J. Clin. Invest. - 1998. - V.102. Р.1369-1376). Состав реакционной смеси для ПЦР следующий: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера:

NAT2 праймеры

5'-GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC-3'

5'-TTGGGTGATACATAGACAAGG-3'

NAT2*7 (G857A) (490, 57, 547) Rocha et. al., 1999.

1. в 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещают в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, рН 8.8, 6.7 mM MgCl₂, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 940°С, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 940°С - 45 секунд, 550°С - 45 секунд, 720°С - 45 секунд. Однонуклеотидные замены гена NAT2 в позициях 481, 590 и 857 идентифицировали по утратам сайтов узнавания для рестриктаз Крп[, TaqI и BamHI, соответственно (Rocha L., Garcia С., Mendonca A. et al. 1999. N-acetyltransferase (NAT2) genotype and susceptibility to sporadic Alzheimer's disease. Pharmacogenetics. 9, 9-15).

Рестрикцию проводили при 37°С в течение 10-12 часов. Индентификацию результатов осуществляли после электрофореза в 7% полиакриламидном геле. Для этого 7 мкл ПЦР-продукта смешивают 5 ед. фермента, смесь выдерживают при 37°С в течение 10 часов. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl рН 7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с рН 8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят в при постоянном напряжении 10 В/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.

2. Согласно общепринятой в мире номенклатуре (Vatsis К.Р., Weber W.W., Bell D.A., et al. 1995. Nomenclature for N-acetyltransferases. Pharmacogenetics. 5, 1-17) определялись следующие типы аллелей NAT2: NAT2*4 (отсутствие замен), NAT2*5 (481T), NAT2*6 (590A), NAT2*7 (857A). Идентификацию фенотипов быстрых и медленных ацетиляторов проводили с учетом генотипических вариантов: быстрые ацетиляторы (R) имели не более одного медленного аллеля (генотипы NAT2*4/*4, NAT2*4/*5, NAT2*4/*6 и NAT2*4/*7), тогда как медленные ацетиляторы (S) характеризовались наличием двух и более медленных аллелей.

Нами были исследованы образцы ДНК у 57 детей, перенесших оперативные вмешательства на органах брюшной полости, с развитием в послеоперационном периоде спаечной болезни брюшины. Контрольная группа включала 154 здоровых добровольных доноров без спаечной болезни после оперативных вмешательств на органах брюшной полости. При этом исследовании было выявлено два фенотипа быстрого и медленного ацетилирования, которые генетически детерминированы. Так, у детей со спаечными осложнениями в 52,6% случаев был выявлен фенотип быстрого ацетилирования N-ацетилтрансферазой против 36,4% в контрольной группе, что в конечном итоге, вызвало развитие спаек. Частота очень медленных ацетиляторов в группе больных спаечной болезнью брюшины оказалась в 5,4 раза ниже, чем в контрольной группе (1,8% и 9,8%, соответственно).

Пример 1. Девочка X. 12 лет поступила в детское хирургическое отделение с жалобами на приступообразные боли в животе, тошноту.

Из анамнеза выяснено, что девочка 2 года назад оперирована по поводу острого гангренозного аппендицита доступом по Волковичу-Дьяконову. Через 2 месяца после этого появились тянущие боли в области послеоперационной раны. После госпитализации и обследования выставлен диагноз: спаечная болезнь брюшины. Произведен лапароскопический адгезиолизис. После выписки из стационара через 1 год вновь появились боли в животе приступообразного характера, тошнота, рвота. Лечилась амбулаторно.

При поступлении состояние средней тяжести. Кожные покровы чистые, бледно-розовые. Тургор тканей сохранен. Дыхание проводится по всем полям, везикулярное. Тоны сердца ясные, ритмичные. Язык влажный, обложен белым налетом. Живот умеренно вздут, мягкий, болезненный в мезогастрии, в области послеоперационного рубца. Положителен симптом Кноха. Печень и селезенка не увеличены. Стул и мочеиспускание без нарушений.

Данные обследования. Ультразвуковое исследование органов брюшной полости. Выявлен конгломерат петель кишечника, не смещающийся при изменении положения тела больного.

Обзорная рентгенография органов брюшной полости. Патологии не выявлено. Чаш Клойбера нет. Произведен пассаж бария. Задержки эвакуации контрастного вещества нет.

На основании жалоб больной, анамнеза, объективного осмотра, данных дополнительных методов обследования выставлен диагноз: Спаечная болезнь брюшины с преобладанием болевого синдрома.

По срочным показаниям произведена лечебно-диагностическая лапароскопия. Операционная находка: плоскостные висцеро-висцеральные и висцеро-париетальные спайки в правой подвздошной области с вовлечением слепой кишки, подвздошной кишки и большого сальника. Спайки рассечены.

Больная получила курс консервативной противоспаечной терапии. Выписана с выздоровлением на 12-е сутки.

Проведено исследование по предложенной методике. Установлено:

является носителем генотипа NAT2*4/*4, т.е. относится к быстрым ацетиляторам. Прогноз неблагоприятный.

Пример 2. Ребенок К. 10 лет поступил с жалобами на боли в животе постоянного характера, тошноту, рвоту, повышение температуры тела до фибрильных цифр.

Из анамнеза: Болен в течении 3-х суток. Заболел остро. Заболевание началось с болей в животе, которые постепенно локализовались в правой подвздошной области. За медицинской помощью не обращались. На третьи сутки состояние ребенка ухудшилось, повысилась температура тела, появилась рвота. Машиной скорой медицинской помощи больной доставлен в стационар.

При поступлении состояние ребенка тяжелое. Положение вынужденное. Кожные покровы бледные. Тургор тканей снижен. Дыхание проводится по всем полям, везикулярное. Тоны сердца приглушены, ритмичные. Тахикардия до 110 в минуту. Язык сухой, обложен белым налетом. Живот умеренно вздут, напряжен, болезненный больше в нижних отделах. Положительные симптомы раздражения брюшины. Аускультативно перистальтика кишечника ослаблена.

В приемно-диагностическом отделении произведено обследование:

ультразвуковая сонография органов брюшной полости - выявлено повышенная пневмотизация петель кишечника, свободная жидкость в брюшной полости объемом до 300 мл. Парез кишечника.

Лейкоциты крови - 14,0×10⁹/л.

На основании жалоб больного, анамнеза, объективного осмотра, дополнительных методов исследования выставлен диагноз: острый аппендицит, перитонит.

По тяжести состояния ребенок госпитализирован в детское реанимационное отделение. После проведения предоперационной подготовки произведена операция - лапаротомия, аппендэктомия, санация и дренирование брюшной полости.

Операционная находка: гангренозно измененный аппендикс. В дистальной трети перфорация до 0,2 см. В брюшной полости до 350 мл жидкого гноя.

В послеоперационном периоде в течении 3-х суток находился на лечении в реанимационном отделении. По стабилизации состояния ребенок переведен в детское хирургическое отделение. Получил курс консервативной терапии. Выписан на 20-е сутки с выздоровлением.

Через 2 месяца произведен контрольный осмотр ребенка. За это время боли в животе не беспокоили, тошноты, рвоты нет, аппетит не нарушен. Стул ежедневный.

Послеоперационный рубец без признаков воспаления, бледного цвета. Живот не вздут, мягкий, безболезненный во всех отделах.

На контрольном ультразвуковом исследовании органов брюшной полости патологии не выявлено. Данных за спаечную болезнь брюшной полости нет.

Проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем генотипа NAT2*5/*6, т.е. относится к медленным ацетиляторам. Прогноз благоприятный.

Таким образом, полученные данные указывают на несомненную связь между полиморфизмом гена NAT2 с вариантами клинического послеоперационного течения и подверженностью к спаечному процессу, что дает возможность прогнозирования риска развития спаечных осложнений и течения раннего и позднего послеоперационного периода и проведения превентивной противоспаечной терапии.

Способ прогнозирования спаечной болезни брюшины у детей, перенесших оперативные вмешательства на органах брюшной полости путем исследования крови, отличающийся тем, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма NAT2 методом полимеразной цепной реакции и при обнаружении одного из генотипов NAN2*4/*4, NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7 прогнозируют риск развития спаечной болезни брюшины у обследуемого.