Способ получения антисыворотки против пептидов каудальной нейросекреторной системы (кнсс) млекопитающих
Изобретение относится к биологии, медицине, в частности иммунологии, и касается способа получения антисыворотки против пептидов КНСС млекопитающих. Способ осуществляется путем иммунизации пептидами КНСС млекопитающих (человека, кота и свиньи) в сочетании с полным адьювантом Фрейнда при подкожном и подконьюктивном введении и в чистом виде при внутривенном введении. Антиген вводят млекопитающим: кроликам, морским свинкам, ослу в три этапа с перерывом между каждым из них в двое суток. Спустя двое суток после последнего введения антигена получают из сердца живого фиксированного животного антисыворотку против пептидов КНСС позвоночных с титром 1:256. Хранят ее в нативном и лиофилизированном виде при 4-5°С. Способ позволяет получать антисыворотку с высоким содержанием специфических антител в короткие сроки, нетрудоемок и экономичен, стерильная антисыворотка сохраняется в активном виде до 2-3 лет.
Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к иммунологии, и касается способа получения антисыворотки против пептидов КНСС млекопитающих, которые по своей природе является гаптенами или полными антигенами. В.С.Бахтинова (1986) определила молекулярный вес пептида КНСС человека, который приблизительно равен 10200.
Для получения специфичной сыворотки А.Е.Вершигора (1990) цитирует способ внутривенной иммунизации кроликов преципитатами растворимых белков с гидроксидом алюминия. Начиная с дозы 0,5 мг белка, антиген вводят несколькими циклами по 3-5 инъекций в неделю с недельными перерывами. Максимальная доза на инъекцию для кролика 5-10 мг. Общая доза 30-40 мг белка. Иммунизацию продолжают 4-6 недель. Спустя 5-6 дней после последней инъекции берут кровь для анализа. Если титры недостаточны, иммунизацию повторяют.
Недостатком данного способа является большой расход ценных иммунногенных препаратов. Так как для растворимых белков и пептидов, в том числе, на наш взгляд, и пептидов КНСС млекопитающих, в присутствии адьюванта концентрация должна составлять от 1 до 100 мкг (Джон Ф.Кирней, 1989). Более того, при больших дозах иммуногена часто образуется некоторое количество примесей, которые могут вызывать выработку неспецифичных антител.
Другим недостатком выбранного нами аналога является использование только лишь внутривенного введения антигена. Естественно, что при этом способе введения удается получить более высокие титры антител. Однако при подкожном и внутримышечном введении антигена происходит более медленный процесс всасывания и длительного воздействия на иммунокомпетентные органы, что приводит к лучшему иммунному ответу и образованию большого титра антител в организме (Вершигора А.Е., 1990).
Способ иммунизации животных с целью получения от них иммунной антисыворотки против пептидов КНСС млекопитающих осуществляется следующим образом.
В качестве антигена используют пептид КНСС млекопитающих, полученный по оригинальной методике Бахтинова А.П. (Патент РФ №93029222/14), который используют для первых двух этапов иммунизации в дозе по 10 мкг/кг для каждой подкожной инъекции, предварительно растворенной в 2 мл физраствора и гомогенизированной с полным адьювантом Фрейнда. На третьем этапе иммунизации антиген вводят внутривенно, при этом его растворяют в 20 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Спустя 2 суток от иммунизированного животного получают кровь, из которой готовят сыворотку. Определяют титр антител в ней и хранят от 2 недель до 2 лет.
Пример 1. Кролику-самцу, массой 2800 г, первый раз делают одновременно пять инъекций. Ему вводят по 10 мкг пептида КНСС человека в 2 мл 0,9% раствора хлорида натрия совместно с 0,25 мл полного адьюванта Фрейнда под коньюктиву правого глаза, в подушечку задней правой лапы и три подкожных введения проводят по правой стороне спины вдоль позвоночника. Спустя двое суток процедуру иммунизации повторяют в том же объеме и по той же схеме под коньюктиву левого глаза, с левой стороны позвоночника и подушечку задней левой лапы. Через двое суток кролик получает внутривенно 100 мкг пептида КНСС человека, растворенного в 20 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Спустя двое суток из сердца живого фиксированного кролика шприцем отсасывают 30 мл крови. Ее помещают в стерильные пробирки, которые ставят на 30 минут в термостат при температуре 37°С, а затем на ночь в холодильную камеру при 5-8°С для дальнейшей ретракции сгустка. После этого сыворотку осторожно отсасывают пастеровской пипеткой над огнем и переносят в другие стерильные пробирки. Ее центрифугируют в течение 10 мин при 7000 оборотов/мин, для отделения клеточных компонентов. В отцентрифугированной сыворотке определяют титр антител. По окончанию центрифугирования полученную антисыворотку разливают в ампулы, часть ее лиофилизируют, другую часть оставляют в нативном виде и хранят в камере холодильника при температуре 4-5°С.
Пример 2. Морской свинке-самцу одновременно делают пять инъекций. Животному вводят по 10 мкг пептида КНСС кота в 0,05 мл физиологического раствора хлорида натрия совместно с 0,05 мл полного адьюванта Фрейнда под коньюктиву правого глаза, в подушечку задней правой лапы и делают три подкожных введения по правой стороне спины вдоль позвоночника. Спустя двое суток процедуру иммунизации повторяют в том же объеме и по той же схеме, но с другой стороны тела. Через двое суток морская свинка получает внутривенно 100 мкг пептида КНСС кота, растворенного в 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. По прошествии 2-х суток из сердца живой фиксированной морской свинки стерильным шприцем берут 10 мл крови. Ее помещают в стерильные пробирки, которые ставят на 45 минут в термостат при температуре 37°С, а затем на 10 часов в холодильную камеру при температуре 5-8°С для дальнейшей ретракции сгустка. Затем сыворотку осторожно отсасывают пастеровской пипеткой над огнем и переносят в другие стерильные пробирки. Антисыворотку после этого центрифугируют в течение 15 мин при 8000 оборотов/мин, для отделения клеточных компонентов. Осадок отбрасывают, определяют титр антител и разливают сыворотку в стерильные ампулы, часть ее лиофилизируют, другую часть оставляют в нативном виде и хранят в запаянном виде в холодильной камере при температуре 4-5°С.
Пример 3. Ослу-самцу трехлетнего возраста одновременно делают пять инъекций. Животному вводят по 10 мкг пептида КНСС свиньи в 10 мл физиологического раствора хлорида натрия совместно с 0,25 мл полного адьюванта Фрейнда под коньюктиву правого глаза, в мякоть заднего копыта и делают три подкожных введения по правой стороне вдоль позвоночника на спине. Спустя двое суток процедуру иммунизации осла повторяют в том же объеме и по той же схеме, но инъекции пептида КНСС свиньи проводят в соответствующие части тела с другой стороны. Через двое суток осел получает внутривенно 100 мкг пептида КНСС свиньи, растворенного в 25 мл 0,9% раствора хлорида натрия. По прошествии 2-х суток из сердца неподвижно фиксированного живого стерильным шприцем отсасывают до 300 мл крови. Ее помещают в стерильные пробирки, которые ставят на 60 минут в термостат при температуре 37°С, а затем на 18 часов в холодильную камеру при температуре 5-8°С для дальнейшей ретракции сгустка. Сыворотку осторожно отсасывают пастеровской пипеткой над огнем и переносят в другие стерильные пробирки. Их центрифугируют в течение 10 мин при 6000 оборотов/мин, для отделения клеточных компонентов, осадок отбрасывают. В отцентрифугированной сыворотке определяют титр антител. Антисыворотку против пептидов КНСС свиньи разливают в стерильные ампулы. Часть ее лиофилизируют, другую оставляют в нативном виде и хранят в запаянных ампулах в холодильном шкафу при температуре 4-5°С.
Способ позволяет сократить время получения антисыворотки, время содержания животного, экономию кормов, трудовых и энергетических ресурсов. При этом получают высокоиммунную антисыворотку против пептидов КНСС млекопитающих, имеющую значительное количество антител и небольшое количество примесей, эффект которых не будет выявляться в иммунологических реакциях при двух-, трехкратном ее разведении. Кроме того, способ позволяет экономить ценный биологически активный препарат.
Источники информации
1. Бахтинов А.П. Способ получения биологически активного вещества, обладающего антиандрогенной и антиэстрогенной активностью (Патент РФ №93029222/14).
2. Бахтинова В.С. О биологической активности пептида из спинного мозга человека. Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Владивосток. - 1986.
3. Вершигора А.Е. Динамика образования антител. В кн.: Общая иммунология: Учеб. Пособие. - К.: Выща Шк., 1990. С. 148-156.
4. Кирней Джон Ф. Гибридомы и моноклональные антитела. В кн. Иммунология / Под ред. У.Пола, пер. с англ. М.: Мир, 1989, т.3, с.255-256.
Способ получения антисыворотки против пептидов каудальной нейросекреторной системы (КНСС), характеризующийся тем, что пептид КНСС млекопитающих используют в качестве антигена для иммунизации животных, при этом пептид в количестве по 10 мкг/кг с полным адъювантом Фрейнда вводят животному однократно под конъюктиву глаза, мякоть пяточной области конечности и три подкожные инъекции по ходу позвоночника с одной стороны позвоночника животного, через двое суток повторно осуществляют введение пептида в той же дозе под конъюктиву глаза, в мякоть пяточной области конечности и вдоль позвоночника с другой стороны тела животного, через следующие двое суток вводят внутривенно животному 100 мкг/кг пептида в 0,9%-ном растворе хлорида натрия и через двое суток после внутривенного введения пептида из сердца живого фиксированного животного берут стерильно кровь, отделяют сыворотку, определяют в ней титр антител и стерильно укупоривают.
