Способ оценки активности воспаления при бронхиальной астме
Владельцы патента RU 2277710:
Волков Вениамин Тимофеевич (RU)
Беспалова Инна Давидовна (RU)
Черногорюк Георгий Эдинович (RU)
Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для контроля течения бронхиальной астмы (БА), эффективности противовоспалительной терапии и для прогноза. Сущность изобретения состоит в том, что проводят реакцию «кожного окна», мазки, полученные через 12 и 24 часа, фиксируют метанолом и окрашивают по Нохту, определяют число нейтрофилов и макрофагов, подсчитывая от 100 до 500 клеток в каждом мазке, и при процентном содержании нейтрофилов 57,78±4,40 через 12 часов и 32,35±3,61 через 24 часа определяют первую степень активности воспалительного процесса, а при процентном содержании нейтрофилов 62,56±5,50 через 12 часов и 40,88±6,22 через 24 часа определяют вторую степень активности воспаления. Техническим результатом является создание высокоинформативного, простого и безопасного способа оценки активности воспаления при бронхиальной астме. 2 табл., 3 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике, и может быть использовано для контроля за течением бронхиальной астмы (БА), эффективностью противовоспалительной терапии и прогноза.
Известен способ, выбранный в качестве прототипа - способ оценки активности и характера воспаления дыхательных путей (Невзорова В.А., Лукьянов П.А., Кулакова Н.В. и др. G 01 N 33/487 №2152617).
Сущность способа заключается в том, что у больного получают бронхоальвеолярный лаваж, в котором определяют биологические маркеры воспаления. В качестве такого маркера используют метаболиты оксида азота: при увеличении их концентрации в период обострения более чем в два раза по сравнению с контролем судят об активности воспаления, а показатели ниже контрольных в два раза и более в период ремиссии указывают на необратимый характер воспаления дыхательных путей.
Недостаток способа заключается в том, что он трудоемок для исследователя, инвазивен и, следовательно, опасен ятрогенными осложнениями для пациента и потому не показан в период обострения БА.
Новой технической задачей изобретения является повышение безопасности способа, упрощение при сохранении высокой информативности.
Поставленную задачу решают новым способом оценки активности воспаления при БА, заключающимся в определении маркеров воспаления в биологических жидкостях организма, причем проводят реакцию «кожного окна», мазки, полученные через 12 и 24 часа, фиксируют метанолом и окрашивают по Нохту, определяют число нейтрофилов и макрофагов, подчитывая от 100 до 500 клеток в каждом мазке, и при процентном содержании нейтрофилов 57,78±4,40 через 12 часов и 32,35±3,61 через 24 часа определяют первую степень активности воспалительного процесса, а при процентном содержании нейтрофилов 62,56±5,50 через 12 часов и 40,88±6,22 через 24 часа определяют вторую степень активности воспаления.
Способ осуществляют следующим образом. На ладонной поверхности предплечий, тщательно обработанных спиртом и подсушенных стерильной салфеткой, тупым концом одноразового скарификатора соскабливают эпидермис на площади около 0,5 см 2 до появления чуть заметных красноватых точек - просвечивающих капилляров сосочкового слоя. С обнаженной поверхности удаляют стерильной салфеткой остатки эпидермиса. На каждый скарифицированный участок кожи кладут кусочек стерильного предметного стекла, равный 1/4 стандартного предметного стекла, который прикрепляют к поверхности кожи лейкопластырем. Всего 4 стекла. На липком пластыре делают отметку: порядковый номер пациента, время постановки пробы, через какой промежуток времени нужно снять стекло. Затем их поочередно снимают через 3, 6, 12, 24 часа. Такой временной диапазон выбирали потому, что он последовательно отражает все этапы воспалительной реакции. Полученные мазки фиксируют метанолом, окрашивают по Нохту и высушивают. Далее производят микроскопию с иммерсией. Оценивают активность поступления в ранку форменных элементов крови, участвующих в тканевой воспалительной реакции - нейтрофилов (Нф) и макрофагов (Мф) - путем подсчета их процентного соотношения в экссудате «кожного окна» на каждом этапе асептической воспалительной реакции (АВР).
Поскольку предложенный способ рекомендуется использовать для оценки активности воспаления у больных БА, все пациенты были предварительно исследованы по тому плану, который предусмотрен для больных этой категории. Особенности течения асептической воспалительной реакции (АВР) были сопоставлены с большим числом симптомов разного уровня исследования (клиническими, лабораторными, функциональными и эндоскопическими). По результатам клинического исследования все пациенты по степени тяжести обострения заболевания были разделены на две группы: пациенты с умеренно выраженными проявлениями и пациенты с выраженными проявлениями заболевания. Сравнения особенностей цитоморфологической картины мазков в группах больных БА и с группой здоровых позволило выделить групповые отличия, которые можно использовать как критерии активности воспаления при данной патологии.
По особенностям изменения клеточного состава мазков во времени судят о характере течения асептического воспаления в коже, который соответствует активности воспалительного процесса в бронхах, определенной клинически. При процентном содержании нейтрофилов 57,78±4,40 через 12 часов и 32,35±3,61 через 24 часа определяют первую степень активности воспалительного процесса, а при процентном содержании нейтрофилов 62,56±5,50 через 12 часов и 40,88±6,22 через 24 часа определяют вторую степень активности воспаления. Преимуществом заявленного способа является его безопасность для пациента, и поэтому его можно проводить неоднократно независимо от фазы заболевания, он не требует предварительной подготовки в отличие от прототипа: воздержания в течение 18 часов от приема пищи, проведения премедикации, анестезии, что, в конечном счете, сопровождается дискомфортом для исследуемого.
Высокая информативность его обусловлена тем, что он позволяет оценить провоспалительную активность клеток, участвующих в тканевой воспалительной реакции, а именно хемотаксис и степень его угнетения, без которого воспаление как реакция организма вообще невозможна.
Было обследовано 50 больных бронхиальной астмой: 33 женщины (средний возраст 47,39±2,27 лет) и 17 мужчин (средний возраст 45,88±4,02 лет).
Больные находились на стационарном лечении в клинике пропедевтики внутренних болезней Сибирского государственного медицинского университета в период обострения заболевания. Диагноз БА ставился на основании жалоб на характерные приступы удушья, данных анамнеза, где учитывался также аллергологический анамнез, объективных методов исследования, а также лабораторных и инструментальных методов. При формулировке диагноза использовалась Международная статистическая классификация болезней Х пересмотра.
Контрольную группу составили 20 практически здоровых молодых людей, средний возраст 20 лет. Лица, которые согласно критерию ВОЗ не имели хронических заболеваний, не были освобождены от работы по поводу острого заболевания и не имели жалоб на момент исследования [Устюжанинова Н.В. Функциональное состояние внешнего дыхания здоровых студентов /Н.В.Устюжанинова, Г.С.Шишкин, Н.Д.Уманцева // Бюл. СО РАМН. - 2004. - №1. - С.134-136].
В соответствии с целями и задачами исследования при расспросе и объективном исследовании больных выделялись и анализировались параметры, в значительной степени отражающие степень активности местного и общего воспалительного процесса и тяжесть обострения заболевания. К этим параметрам нами были отнесены следующие: частота и тяжесть приступов удушья, выраженность одышки, интенсивность кашля, физические свойства мокроты, наличие таких симптомов как слабость и потливость, характеристика основного дыхательного шума и дополнительных дыхательных шумов при аускультации. Каждый клинический признак оценивался в баллах. Для количественной оценки симптомов была разработана диагностическая таблица (табл.1), где отражены диагностические коэффициенты (ДК), соответствующие градациям каждого признака. Так, для интенсивности кашля выделены следующие градации и соответствующие им диагностические коэффициенты: кашля нет - 1 балл, редкий - 2 балла, периодический - 3 балла, постоянный - 4 балла; для количества мокроты: нет мокроты - 1 балл, до 5 мл одномоментно - 2 балла, более 5 мл - 3; для характера мокроты: слизистый - 1, слизисто-гнойный - 2, гнойный - 3; для выраженности одышки: нет одышки - 1 балл, одышка при значительной физической нагрузке - 2 балла, при умеренной физической нагрузке - 3, в покое - 4 балла; для симптома общей воспалительной реакции слабости: нет слабости - 1 балл, есть - 2; для потливости: нет потливости - 1 балл, есть - 2 балла; для частоты приступов удушья и, соответственно, потребности в ингаляциях β2-агонистов короткого действия указываются количество в сутки. Объективные симптомы, характеризующие аускультативную картину, также оценивались в баллах. Для основного дыхательного шума: физиологическое везикулярное дыхание - 1 балл, жесткое - 2, ослабленное - 3; для дополнительных дыхательных шумов (хрипов): отсутствуют - 1 балл, единичные сухие - 2, масса сухих хрипов - 3, сухие и единичные влажные хрипы - 4, влажные и сухие хрипы в большом количестве - 5 баллов.
С целью интегрирующей оценки выраженности клинических симптомов воспаления использовался индекс воспаления клинического (ИВК). Для его вычисления баллы всех симптомов суммировались, и сумма делилась на количество оцениваемых признаков.
Все клинические симптомы анализировались в стандартных условиях в утренние часы, до использования бронхолитиков.
Анализ клинических симптомов и подсчет индекса воспаления клинического (ИВК) позволил разделить всех больных (БА) по степени выраженности воспаления на две группы. ИВК у всех больных представлял собой диапазон от 1,25 до 4,37 баллов. Первую группу составили 24 человека больных с умеренными проявлениями воспалительной реакции, ИВК которых от 1,25 до 2,49 баллов, во второй группе 26 больных с выраженными симптомами воспаления, их ИВК составлял от 2,5 до 4,37 баллов. Такое разделение позволило выяснить информативность различных клинических симптомов в оценке степени воспалительного процесса в трахеобронхиальном дереве у больных БА. Пациенты 1-ой группы отмечали редкий или периодический кашель сухой или с небольшим количеством слизистой мокроты, одышку лишь при значительной физической нагрузке, приступы удушья не чаще одного раза в день, с необходимостью в использовании β2-агонистов не более двух раз в сутки. У большинства больных при аускультации выслушивалось жесткое везикулярное дыхание и сухие хрипы в небольшом количестве. Для больных 2-ой группы, с выраженными признаками воспалительной реакции в организме, было характерно: наличие постоянного кашля с отделением слизисто-гнойной, а у некоторых больных с гнойной мокротой свыше 5 ml одномоментно, одышка при незначительной физической нагрузке и даже в покое, приступы удушья несколько раз в день и необходимость в β2-агонистах короткого действия превышала 3-4 раза в сутки, кроме того, пациентов беспокоила общая слабость и повышенная потливость. Аускультативно у большинства больных отмечалось ослабленное везикулярное дыхание и большое количество сухих низких и высоких хрипов.
Всем - и больным, и здоровым - производили пробу «кожного окна», описанную выше. Результаты микроскопического исследования мазков отражены в табл.2. Были обнаружены особенности течения асептической воспалительной реакции в каждой из исследуемых групп и найдены статистически достоверные различия.
Исследования показали, что у здоровых и больных миграция клеточных элементов на нижнюю поверхность стекол в течение первых 3 часов была одинаково незначительна, у части исследуемых мазки, снятые через 3 часа, клеток вообще не содержали, поэтому различия в группах, обнаруженные в этот период времени, диагностического значения не имеют. К 6 часам у здоровых количество клеточного экссудата увеличивалось с преобладанием нейтрофилов в среднем 80,54%. Они имели целую оболочку, четко выраженные ядра, зернистую цитоплазму. Макрофаги в среднем составляли 20,46%, имели правильную форму, не содержали вакуолей и не имели псевдоподий. В более поздние сроки возрастала миграция мононуклеаров, и к 12 часу количество этих клеток составляло приблизительно половину клеток экссудата (49,79%). К 24 часам в клеточном экссудате преобладали макрофаги (71,19%). Они имели крупные размеры, псевдоподии и вакуоли. Нейтрофилы на этом этапе АВР составляли в среднем 29,84% и имели признаки дегенерации, что согласуется с результатами, полученными другими исследователями (фиг.1). То есть в группе контроля прослеживается четкая смена клеточных фаз воспалительной реакции: на 6 - нейтрофильная, на 12 часов - смена клеточных фаз, на 24 часа - макрофагальная.
У больных с умеренными клиническими проявлениями бронхиальной астмы значительно угнетена нейтрофильная фаза асептического воспаления в коже. Об этом свидетельствуют статистически достоверные различия клеточного состава экссудата на 6 часов АВР с контролем: нейтрофилы на 6 часов составляли в среднем 65,63±2,28% макрофаги - 34,37±2,28% соответственно (Р<0,05). Отмечается также замедление смены клеточных фаз и угнетение макрофагальной фазы воспаления. Макрофаги на 24 часа АВР составляют 32,35±3,61%, нейтрофилы - 67,65±3,61% (фиг.2). Поскольку достоверных различий с контролем в клеточном составе экссудата через 12 и 24 часа нет, можно думать, что эти изменения в течение асептической воспалительной реакции у больных с умеренно выраженными симптомами обострения БА незначительны.
У больных второй группы нейтрофильная фаза, по нашим данным, угнетена несколько меньше: нейтрофилы через 6 часов АВР в среднем составляют 70,63±5,72%, макрофаги - 28,37±5,72%, однако в этот период отмечаются признаки ранней дегенерации нейтрофилов у большинства больных. Они у части больных мелкие, неправильной формы, полисегментарные, отмечаются также явления цитолиза и пикноза. К 12-му часу значительно преобладают нейтрофилы над макрофагами, соответственно 62,56±5,50% и 37,44±5,50%, разница при сравнении с контрольными показателями статистически достоверна (Р<0,05). Макрофагальная фаза у этой группы больных угнетена, макрофаги к 24-му часу незначительно преобладают над нейтрофилами: Нф 24 - 42,88±6,22%, Мф 24 - 52,12±6,22% (фиг.3). Статистический анализ обнаружил достоверные отличия со значениями в группе здоровых (Р<0,05). Таким образом, очевидно наличие взаимосвязи активности воспалительного процесса в организме у больных БА и особенностей течения асептического воспаления в коже, определенных методом «кожного окна». Чем больше активность воспалительного процесса в бронхах, тем больше выражено замедление смены клеточных фаз и угнетение макрофагальной фазы в «кожном окне».
Проведенный корреляционный анализ позволил установить достоверную прямую взаимосвязь между интегральным клиническим показателем - индексом воспаления и нейтрофилами через 12 часов (r=0,309, р<0,05) и нейтрофилами через 24 часа (r=0,459, р<0,05). Таким образом, предлагаемый способ позволяет при высокой информативности провести на клеточном уровне безопасную для здоровья пациента диагностику активности воспалительного процесса при бронхиальной астме.
Способ оценки активности воспаления при бронхиальной астме
| Таблица 1 | ||
| Признаки | Градации признака | Диагностический коэффициент |
| Интенсивность кашля | *Нет | 1 |
| *Редкий | 2 | |
| *Периодический | 3 | |
| *Постоянный | 4 | |
| Количество мокроты | *Нет | 1 |
| *До 5 мл | 2 | |
| *>5 мл | 3 | |
| Характер мокроты | *Слизистый | 1 |
| * Слизисто-гнойный | 2 | |
| *Гнойный | 3 | |
| Одышка | *Нет | 1 |
| *При значит. физ. нагрузке | 2 | |
| *При умеренной физ. нагрузке | 3 | |
| *В покое | 4 | |
| Слабость | *Нет | 1 |
| *Есть | 2 | |
| Потливость | *Нет | 1 |
| *Есть | 2 | |
| Основной дыхательный шум | *Везикулярное дыхание | 1 |
| *Жесткое | 2 | |
| *Ослабленное | 3 | |
| Хрипы в легких | *Отсутствуют | 1 |
| *Единичные сухие | 2 | |
| *Масса сухих хрипов | 3 | |
| *Единичные влажные хрипы | 4 | |
| *Влажные и сухие хрипы в большом количестве | 5 | |
| Частота приступов уд. | *Количество в сутки | |
| Потребность в ингаляц. | *Количество в сутки | |
| Индекс воспаления клинический (ИВК) |
Способ оценки активности воспаления при бронхиальной астме
| Таблица 2 | |||
| Показатели | здоровые (М±m) | 1 группа (М±m) | 2 группа (М±m) |
| Нф 3% | 75,84±2,73 | 56,08*±9,06 | 63,70±9,23 |
| Мф 3% | 24,27±2,73 | 43,43*±9,06 | 36,30±9,23 |
| Нф 6% | 80,54±1,83 | 65,63*±2,28 | 70,63±5,72 |
| Мф 6% | 20,46±1,83 | 34,37*±2,28 | 28,37±6,21 |
| Нф 12% | 50,21±1,51 | 57,78±4,40 | 62,56*±5,50 |
| Мф 12% | 49,79±1,51 | 42,22±4,40 | 37,44*±5,50 |
| Нф 24% | 28,81±2,56 | 32,35±3,61 | 40,88*±6,22 |
| Мф 24% | 71,19±2,56 | 67,65±3,61 | 57,12*±6,22 |
| Примечание: Нф - нейтрофилы, Мф - макрофаги; * - статистически достоверные различия (Р<0,05). |
Способ определения степени активности воспаления при бронхиальной астме, заключающийся в определении маркеров воспаления в биологических жидкостях организма, отличающийся тем, что проводят реакцию «кожного окна», мазки, полученные через 12 и 24 ч, фиксируют метанолом и окрашивают по Нохту, определяют число нейтрофилов и макрофагов, подсчитывая от 100 до 500 клеток в каждом мазке и при процентном содержании нейтрофилов 57,78±4,40 через 12 ч и 32,35±3,61 через 24 ч, определяют первую степень активности воспалительного процесса, а при процентном содержании нейтрофилов 62,56±5,50 через 12 ч и 40,88±6,22 через 24 ч, определяют вторую степень активности воспаления.
