Способ моделирования заболевания тяжелого острого респираторного синдрома у экспериментальных животных

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к моделированию тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС), и может быть использовано для оценки эффективных средств медицинской защиты. Для этого сирийским хомячкам массой 50-60 г однократного перорально вводят вируссодержащую суспензию ТОРС, штамм СоД в дозе 1·10⁵ БОЕ. Способ обеспечивает возможность получения ТОРС для проведения доклинического изучения медицинских средств защиты in vivo для оценки влияния их на тяжесть заболевания. 4 табл.

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, конкретно к моделированию заболевания тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС) на сирийских хомячках по совокупности клинико-вирусологических, гематологических и биохимических показателей инфекционного процесса, и может найти применение при моделировании экспериментальной формы ТОРС для оценки эффективных средств медицинской защиты.

Заболевание, вызванное новым коронавирусом, отнесенным к четвертому генотипу [1], впервые зарегистрировано в Китае в ноябре 2002 г. и получило в основном распространение в странах Юго-Восточной Азии (Китай, Гонконг, Тайвань, Сингапур, Вьетнам) и Северной Америки (США, Канада). Зарегистрированы завозные случаи ТОРС и в различных странах Европы, Южной Америки и Африки [2, 3].

Возможность возникновения повторной эпидемии ТОРС обуславливает необходимость разработки способа моделирования экспериментальной формы инфекции данного заболевания у сирийских хомячков, предназначенного для поиска эффективных специфических и неспецифических медицинских средств и методов биологической защиты.

ТОРС характеризуется скоротечным течением и высокой летальностью (до 10%). Болезнь начинается с повышения температуры, иногда с ознобом, при этом наблюдается головная боль и слабость. В ряде случаев отмечены симптомы поражения верхних и нижних дыхательных путей [4, 5].

Анализ клинических показателей свидетельствует о том, что в крови в течение первых дней заболевания часто выявляются лимфопения и тромбоцитопения, отмечается увеличение ряда биохимических показателей в сыворотке крови больных (креатинфосфокиназы (КФК), аспартаттрансферазы (ACT) и аланинтрансферазы (АЛТ)) [4, 6].

Уровень нейтрофилов колебался в пределах от 500 до 11800 (в среднем 3500 на мм³), а моноцитов в большинстве случаев оставался в пределах нормы. У 69,6% больных ТОРС выявлялась умеренная лимфопения (число лимфоцитов менее 1000 на мм³). При этом количество лимфоцитов продолжало снижаться в течение первых дней с начала заболевания. В периферической крови было увеличено содержание реактивных лимфоцитов в 15,2% случаев. Увеличение АлАТ (>45 в мл) выявлялось в 23,4% случаев (средний уровень 60,4±150,4 в мл). Увеличение креатинкиназы выявлялось у 32,1% пациентов, а уровень ее колебался в пределах от 29 до 4644 л (в среднем 126 в л). Ни у одного из пациентов с повышенным уровнем креатинкиназы не имелось отклоняющихся от нормы значений креатинкиназы MB или тропонина Т, из чего следовало, что сердечная мышца скорее всего не могла быть источником повышенного уровня фермента. Увеличение ЛДГ было выявлено у 71,0% больных [4, 6].

Механизм передачи заболевания от человека к человеку - воздушно-капельный и фекально-оральный. Заражение наиболее вероятно в условиях тесного бытового общения [7, 8].

В настоящее время известны попытки моделирования заболевания ТОРС на обезьянах [9], кошках [10], домашних свиньях, птицах [11], белых мышах BALB/c [12].

Наиболее близким по сущности к заявленному изобретению и оцениваемым показателям инфекционного процесса у модельного животного является использование обезьян. Так, при экспериментальном инфицировании обезьян макак резусов исследователи наблюдали развитие на 3-4 сутки интерстициальной пневмонии при гистоморфологической оценке, характерной для заболевания ТОРС человека [9]. Однако проведение исследований с данными лабораторными животными затруднено из-за сложности проведения экспериментов и дороговизны их содержания. Кроме того, использование обезьян не позволяет оценивать эффективность медицинских средств защиты из-за отсутствия статистически достоверных вирусологических, биохимических, гематологических показателей инфекционного процесса у инфицированных вирусом ТОРС животных в дозах от 5,0 lg БОЕ до 6,0 lg БОЕ/животное.

Изобретение направлено на разработку способа моделирования ТОРС с использованием патогенетических критериев оценки инфекционного процесса в организме сирийских хомячков. Патогенетические критерии моделирования основаны на том, что возбудитель ТОРС, попадая в организм человека, в первую очередь поражает органы дыхательной системы. При этом лабораторные исследования крови на ранней стадии заболевания свидетельствовали о наличии абсолютной лимфоцитопении на фоне нормального или сниженного количества лейкоцитов. На пике заболевания нередко возникала тромбоцитопения, удлинялось время свертывания крови, увеличивалось содержание реактивных лимфоцитов. Кроме того, у больных ТОРС значительно повышалась активность КФК (более 3000 МЕ/л) и аминотрасфераз (в 2-3 раза). Одновременно был повышен уровень ЛДГ. В некоторых случаях были отмечены изменения уровня мочевины и креатинина в крови.

Сущностью предлагаемого изобретения является то, что моделирование заболевания, вызванного введением сирийским хомячкам возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС), проводят путем перорального введения вируссодержащей суспензии ТОРС в дозе 1·10⁵ БОЕ/животное. В результате у животных развивается поражение легких на 4 сутки после инфицирования, на 2-10 сутки отмечается увеличение количества лейкоцитов в крови, увеличение доли содержания более юных форм нейтрофилов с одновременным уменьшением доли лимфоцитов и эозинофилов, увеличение активности аспартат- и аланинаминотрансфераз (АсАТ и АлАТ) в сыворотке крови с максимумом на 4 сутки после инфицирования, увеличение концентрации в сыворотке крови мочевины, креатинина, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и креатинфосфокиназы (КФК). Таким образом, перорально инфицированные сирийские хомячки являются лабораторной моделью, наиболее адекватно воспроизводящей характерные для больных ТОРС симптомы заболевания, и являются приемлемыми для изучения эффективности лекарственных препаратов в отношении этой инфекции.

Для технического решения поставленных задач были использованы сирийские хомячки массой от 40 до 60 г, суспензия вируса ТОРС, штамм СоД, полученная на культуре клеток Vero E-6, а также все необходимое оборудование для тестирования биологической активности вируса ТОРС в легких инфицированных животных, определения концентрации лейкоцитов в крови, лейкоцитарной формулы крови, концентрации АсАТ, АлАТ, ЛДГ, КФК, мочевины и креатинина в сыворотке крови фотометрическим методом с использованием стандартных тест-наборов для клинических исследований.

Разработка экспериментальной модели заболевания ТОРС осуществляли следующим способом: вируссодержащую суспензию вводили однократно перорально в утренние часы в дозе 1·10⁵ БОЕ на сирийского хомячка.

Животные были разделены на 5 групп:

1 группа - фоновый контроль (контроль стада).

2 группа - оценка вирусологических, гематологических и биохимических критериев на 2 сутки после инфицирования.

3 группа - оценка вирусологических, гематологических и биохимических критериев на 4 сутки после инфицирования.

4 группа - оценка вирусологических, гематологических и биохимических критериев на 6 сутки после инфицирования.

5 группа - оценка вирусологических, гематологических и биохимических критериев на 10 сутки после инфицирования.

Кровь для подсчета лейкоцитов, лейкоцитарной формулы и получения сыворотки забирали у животных из подключичной вены. Биологическую активность вируса ТОРС определяли в 10% гомогенате легких сирийских хомячков, забитых декапитацией, методом образования негативных колоний под агаром на культуре клеток Vero Е-6. Количество лейкоцитов подсчитывали по стандартной методике в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу подсчитывали в мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимзе в модификации Паппенгейма со ×100 увеличением под иммерсией. Концентрацию АсАТ, АлАТ, ЛДГ, КФК, мочевины и креатинина в сыворотке крови определяли фотометрическим методом по изменению интенсивности окраски.

Согласно результатам проведенных исследований у сирийских хомячков развивается поражение легких на 4 сутки после инфицирования, ткани легких имеют точечные коричневые очаги поражения и кровоизлияния. На 6-10 сутки наблюдается выраженная гепатизация до красной стадии легочной ткани; пораженные легкие имеют мраморную окраску, рядом с нормальной по виду легочной тканью находятся пораженные участки (2-8 мм). Здоровые части легкого ясно отечны. Уровень накопления вируса ТОРС в легких на пике инфекции (4 сутки после инфицирования) достигает 7,6 lg БОЕ/г (таблица 1).

Таблица 1 Результаты изучения вирусологических, гематологических и биохимических показателей у инфицированных вирусом ТОРС сирийских хомячков
Критерий моделирования инфекционного заболевания	У инфицированных животных на... сут. наблюдения	У контрольных животных на... сут. наблюдения
2	4	6	10	2	4	6	10
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Вирусологические показатели
Накопление вируса ТОРС в легких, х±σх, lg БОЕ/мл	5,38±0,11	6,60±0,04	4,02±0,16	3,47±0,15	-	-	-	-
Гематологические показатели
Кол-во лейкоцитов, (x±σx)·103, кл/мкл	11,15±0,81	10,85±0,93	10,93±0,63	9,45±0,15	6,45±0,15	6,35±0,05	6,40±0,10	6,15±0,15
Биохимические показатели
АсАТ, х±σх, мМ/л	1,91±0,11	2,49±0,08	1,77±0,11	2,20±0,03	0,71±0,00	0,73±0,01	0,68±0,04	0,69±0,05
АлАТ, х±σх, мМ/л	1,21±0,11	2,18±0,15	2,13±0,15	2,24±0,08	0,65±0,01	0,67±0,01	0,71±0,02	0,72±0,02
Коэффициент де Ридиса, АсАТ/АлАТ, х±σх	1,60±0,08	1,16±0,09	0,85±0,10	0,98±0,05	1,10±0,01	1,09±0,02	0,95±0,08	1,20±0,14
КФК, х±σх, мккат/л	1,28±0,03	2,09±0,02	0,95±0,10	1,27±0,05	0,44±0,01	0,39±0,00	0,50±0,01	0,50±0,00
ЛДГ, х±σх, МЕ/л	1504,75±226,61	1427,50±60,77	1643,75±109,18	1831,00±28,00	403,50±1,50	401,50±0,50	411,00±2,00	406,00±7,00

Продолжение таблицы 1
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Мочевина, х±σх, мМ/л	8,95±0,32	10,83±0,96	9,33±0,85	11,83±0,02	5,60±0,30	5,55±0,15	5,45±0,15	3,20±2,50
Креатинин, х±σх, мкМ/л	204,05±3,78	222,95±15,08	222,28±12,98	206,25±3,72	182,60±1,40	184,65±0,15	182,65±2,45	182,80±2,30

Количество лейкоцитов в крови увеличивается на 2...6 сутки на 71%...73%, с увеличением доли содержания более юных форм нейтрофилов при одновременном уменьшении доли лимфоцитов и эозинофилов. Также на пике инфекционного процесса увеличивается активность АсАТ и АлАТ в сыворотке крови на 243% и 227%, соответственно, концентрация в сыворотке крови мочевины на 95%, креатинина на 21%, ЛДГ на 351% (10 сутки) и КФК на 435% (4 сутки) после инфицирования (таблица 1).

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что у сирийских хомячков изучены параметры инфекционного процесса ТОРС, являющиеся критериями тяжести течения заболевания. В отличие от обезьян использование сирийских хомячков позволяет оценивать эффективность медицинских средств защиты по совокупности вирусологических, биохимических, гематологических показателей патогенетических проявлений инфекционного процесса у инфицированных вирусом ТОРС животных в дозе 5,0 lg БОЕ/животное. Кроме того, пероральное введение сирийским хомячкам вируса ТОРС в дозе 6,0 lg БОЕ/животное вызывает у 20% животных специфическую гибель, в отличие от инфицированных обезьян, кошек, белых мышей, домашних свиней и птиц [9, 12].

Следовательно, на описанной лабораторной модели можно проводить оценку эффективности лекарственных средств в отношении возбудителя ТОРС in vivo по снижению тяжести течения заболевания.

Пример 1. Моделирование заболевания ТОРС у сирийских хомячков.

Экспериментальных сирийских хомячков перорально инфицируют вирусом ТОРС, штамм СоД в дозе 1·10⁵ БОЕ, в результате чего на 2-6 сутки развивается инфекционное заболевание, тяжесть течения которого оценивают по вирусологическим (накопление вируса в легких инфицированных животных), гематологическим (количество лейкоцитов в крови, лейкоцитарная формула) и биохимическим (концентрация в сыворотке крови больных животных креатинина, мочевины, КФК и ЛДГ, активности аминотрасфераз) показателям (таблица 2). Так, на 2-6 сутки заболевания достоверно увеличивается количество лейкоцитов в крови больных животных. Увеличиваются концентрация в сыворотке крови больных животных креатинина, мочевины, КФК и ЛДГ и активность аминотрасфераз.

Таблица 2 Результаты выявления коррелятивной зависимости между показателями инфекционного процесса у заболевших ТОРС людей и сирийских хомячков
№ п/п	Показатели...	Значение показателей...	Коэффициент корреляции, г
		у больных ТОРС		у инфицированных сирийских хомячков
абс.	%	абс.	%
1	2	3	4	5	6	7
1	количество лейкоцитов, (клх109/л)	3,1±2,1	-3,4	11,15±0,81	73,0	0,960
2	количество лимфоцитов, (клх109/л)	0,6±0,4	-1,5	5,2±2,7	27,9	0,984
3	количество нейтрофилов, (клх109/л)	7,2±4,7	45,0	2,5±1,5	127,0	0,908
4	мочевина, мМ/л	6,3±7,2	28,0	11,8±0,1	127,0	0,737
5	креатинин, мкМ/л	99,0±111,8	12,5	204,1±3,8	12,0	-0,216
6	лактатдегидрогеназа, мМ/л	310,0±151,8	29,2	130,0±1,2	351	0,979
7	аланинаминотрансфераза, мМ/л	89,8±104,0	130,0	2,24±0,08	227	0,659
8	креатининфосфокиназа, мккат/л	126,0±319,5	110,0	2,09±0,02	435	н.д.

Продолжение таблицы 2
1	2	3	4	5	6	7
Примечания. 1. Абсолютные значения показателей инфекционного процесса у больных ТОРС людей изложены в первоисточнике [13]. 2. Коэффициент корреляции между показателем креатинфосфокиназы у больных людей и инфицированных вирусом ТОРС сирийских хомячков не удается рассчитать из-за отсутствия значений КФК в динамике [13].

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что у сирийских хомячков, инфицированных вирусом ТОРС, наблюдали лейкоцитоз за счет увеличения количества лимфоцитов, которое не всегда регистрируется у больных ТОРС людей. В то же время наблюдалось увеличение количества нейтрофилов, мочевины, лактатдегидрогеназы и аланинаминотрансферазы, характерное для показателей инфекционного процесса у людей, госпитализированных на первые-седьмые сутки с диагнозом ТОРС [13]. Об этом свидетельствует тесная коррелятивная связь между показателями лейкоцитов, мочевины, лактатдегидрогеназы, аланинаминотрансферазы у больных ТОРС людей и инфицированных вирусом ТОРС сирийских хомячков.

Пример 2. Оценка противовирусного действия рибавирина в отношении вируса ТОРС, штамм СоД.

Сирийским хомячкам массой от 40 до 60 г, инфицированным перорально вирусом ТОРС, штамм СоД в дозе 1·10⁵ БОЕ, введен внутримышечно химиопрепарат рибавирин по схеме экстренной профилактики (через 1 час после инфицирования, затем один раз в сутки в течение 6 суток).

Оценка противовирусного действия рибавирина в отношении вируса ТОРС представлена в таблицах 3 и 4.

Данные, представленные в таблицах 3 и 4, свидетельствуют о подавлении размножения вируса в легких, уменьшении количества лейкоцитов, нормализации показателей концентрации АсАТ, АлАТ, ЛДГ, КФК, мочевины и креатинина в сыворотке крови на пике инфекции по сравнению с контрольной группой инфицированных животных.

Таблица 3 Результаты оценки эффективности экстренной профилактики и лечения рибавирином инфицированных вирусом ТОРС сирийских хомячков по вирусологическим показателям
Критерий моделирования инфекционного заболевания	Сутки наблюдения...
2	4	6
Подавление накопления вируса ТОРС в легких, х±σх, Δlg БОЕ/мл	4,3	2,4	1,4
Коэффициент ингибирования, х, процент	99,99	99,60	93,50
Таблица 4 Результаты оценки эффективности экстренной профилактики и лечения рибавирином инфицированных вирусом ТОРС сирийских хомячков по гематологическим и биохимическим показателям
Критерий моделирования инфекционного заболевания	У леченых животных, на... сут. наблюдения	У инфицированных животных на... сут наблюдения	У контрольных животных на... сут. на блюдения
2	4	6	2	4	6	2	4	6
Кол-во лейкоцитов, (х±σх)·103, кл/мкл	5,50±1,20	6,00±0,50	8,20±0,30	11,15±0,81	10,85±0,93	10,93±0,63	6,45±0,15	6,35±0,05	6,40±0,10
АсАТ, х±σх, мМ/л	0,78±0,02	0,90±0,04	0,52±0,04	1,91±0,11	2,49±0,08	1,77±0,11	0,71±0,00	0,73±0,01	0,68±0,04
АлАТ, х±σх, мМ/л	0,54±0,07	0,75±0,02	0,67±0,04	1,21±0,11	2,18±0,15	2,13±0,15	0,65±0,01	0,67±0,01	0,71±0,02
Коэффициент де Ридиса, АсАТ/АлАТ, х±σх	1,44±0,09	1,20±0,10	0,78±0,09	1,60±0,08	1,16±0,09	0,85±0,10	1,10±0,01	1,09±0,02	0,95±0,08
КФК, х±σх, мккат/л	0,45±0,03	0,94±0,08	0,39±0,01	1,28±0,03	2,09±0,02	0,95±0,10	0,44±0,01	0,39±0,00	0,50±0,01
ЛДГ, х±σх, МЕ/л	545,00±14,00	1090,00±20,00	715,00±10,00	1504,75±226,61	1427,50±60,77	1643,75±109,18	403,50±1,50	401,50±0,50	411,00±2,00
Мочевина, х±σх, мМ/л	5,60±1,00	7,70±0,70	6,50±0,50	8,95±0,32	10,83±0,96	9,33±0,85	5,60±0,30	5,55±0,15	5,45±0,15
Креатинин, х±σх, мкМ/л	183,00±0,40	190,40±0,30	180,40±0,40	204,05±3,78	222,95±15,08	222,28±12,98	182,60±1,40	184,65±0,15	182,65±2,45

Предлагаемый способ апробирован на 800 сирийских хомячках. Высокая медико-социальная эффективность предлагаемого способа заключается в возможности проведения доклинического изучения медицинских средств защиты in vivo для оценки влияния их на тяжесть течения заболевания. Это особенно актуально при отсутствии на современном этапе разработанных эффективных лекарственных средств в отношении ТОРС. Проведение экспериментальных испытаний, имеющихся в отечественной клинической практике, а также вновь синтезированных лекарственных средств с использованием предлагаемой модели может найти применение в системе Минздрава РФ.

Новизна способа заключается в том, что впервые показана возможность экспериментального воспроизведения инфекционного процесса, вызываемого вирусом ТОРС, у сирийских хомячков и разработаны патогенетические критерии оценки течения данного заболевания у выбранного вида лабораторных животных.

Изобретательский уровень предложения обосновывается его неочевидностью. Авторам изобретения неизвестно использование предлагаемого способа для создания экспериментальной модели заболевания ТОРС.

Воспроизводимость способа не вызывает сомнения и не требует дополнительных доказательств.

Источники информации

1. Marra М.А., Jones S.J., Astell C.R. et al. The genome sequence of the SARS-associated coronavirus // Science. - 2003. - Vol.300, N 5624. - P.1399-1404.

2. Синопальников А.И., Воробьев А.В., Белоцерковская Ю.Г., Андреева И.В. Тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС, SARS) // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2003. - Т.5, № 3. - С.225-242.

3. Summary of probable SARS cases with onset of illness from 1 November 2002 to 31 July 2003 // WHO sites - revised 26 September 2003.

4. Tsang К.W., Но P.L., Oi G.C. et al. A Cluster of Cases of Severe Acute Respiratory Syndrome in Hong Kong // N. Engl. J. Med. - 2003. - Vol.348, N.20. - P.1977-1985.

5. Booth С.М., Matukas L.M., Tomlinson G.A. et al. Clinical Features and Shortterm Outcomes of 144 Patients With SARS in the Greater Toronto Area // JAMA. - 2003. - Vol.289, №21. - P.2801-2809.

6. Liu Z.Y., Li T.S., Wang Z., et al. Clinical features and therapy of 106 cases of severe acute respiratory syndrome // Zhonghua Nei Ke Za Zhi. - 2003. - Vol.42. - P.373-377.

7. Riley S., Fraser C., Donnelly C. A. et al. Transmission Dynamics of the Etiological Agent of SARS in Hong Kong: Impact of Public Health Interventions // Science. - 2003. - Vol.300. - P.5627.

8. Ignatius T.S. Yu, M.B., Yuguo Li. et al. Evidence of Airborne Transmission of the Severe Acute Respiratory Syndrome Virus // N. Engl. J. Med. - 2004. - Vol.350, N 17. - P.1731-1739.

9. Fouchier R.A., Kuiken Т., Schutten M. et al. Aetiology: Koch's postulates fulfilled for SARS virus // Nature. - 2003. - №423, Vol.6937. - P.240.

10. Abbott A. Pet theory comes to the fore in fight against SARS // Nature. - 2003. - №423. - P.576.

11. Weingartl H.M., Copps J., et al. Susceptibility of Pigs and Chickens to SARS Coronavirus // Emeg. Inf. Dis. - 2004. - Vol.10, No.2.

12. Wentworth D.E., Gillim-Ross L., Espina N. and Bernard K.A. Mice Susceptible to SARS Coronavirus // Emerg. Infect. Dis. - 2004. - Vol.10, N.7.

13 Lee N., Hui D., Wu A. et al. A Major Outbreak of Severe Acute Respiratory Syndrome in Hong Kong // N. Engl. J. Med. - 2003. - Vol.348, N 20. - P.1986-1994.

Способ моделирования тяжелого острого респираторного синдрома-ТОРС путем введения модельному животному вируссодержащей суспензии ТОРС, отличающийся тем, что в качестве модельного животного используют сирийских хомячков массой 50-60 г, которым однократного перорально вводят вируссодержащую суспензию ТОРС, штамм СоД в дозе 1·10⁵ БОЕ.