Способ оценки эффективности лечения респираторного папилломатоза

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики и может быть использовано для оценки эффективности лечения респираторного папилломатоза гортани в ранние сроки. Сущность изобретения состоит в том, что проводят детекцию РНК консервативной области основного белка капсида ВПЧ, полученную из образцов ткани папилломы, отобранных до лечения и спустя 24-72 часа после начала лечения, затем с помощью ОТ-ПЦР выделяют комплементарную ДНК, определяют количество геномных эквивалентов ВПЧ и при уменьшении их количества не менее чем в 10 раз, лечение оценивают как эффективное. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего на самых ранних этапах после начала лечения определить его эффективность и провести коррекцию в случае необходимости, тем самым существенно сокращая сроки лечения.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к оториноларингологии и инфекционным заболеваниям, и может быть использовано для оценки эффективности проводимого лечения в ранние сроки.

Респираторный папилломатоз - одно из наиболее распространенных опухолевых заболеваний верхних дыхательных путей. Оно часто носит тяжелый характер из-за склонности к распространению в дыхательных путях и частым рецидивам, сопровождающимся клиникой стеноза гортани. Частые рецидивы заболевания нередко приводят к распространению процесса в дыхательных путях, длительному течению заболевания и сопутствующим осложнениям. Заболевание вызывается вирусом папилломы человека (ВПЧ) 6 и 11 типов (Elo J., Hidvegi J., Bajtai A. Papova viruses and recurrent laryngeal papillomatosis//Acta. Otolaryngol. Stockh, - 1995. - Vol.115. - #2. - P.322-325).

Известен способ определения эффективности лечения респираторного папилломатоза гортани в зависимости от частоты его рецидивирования (Ст. Чирешкина Д.Г. "Папилломатоз как причина хронической обструкции гортани у детей". Журнал "Ушные, носовые и горловые болезни", 1993, №3, с.43-50).

Недостатком данного способа является то, что рецидивы заболевания определяются по клиническим проявлениям болезни, которые могут быть растянуты во времени от нескольких месяцев до нескольких лет. В соответствии с этим однозначно определить эффективность лечения во время такого длительного периода, в течение которого постоянно проводится противорецидивная терапия, практически невозможно.

Известен способ оценки эффективности лечения респираторного папилломатоза гортани, включающий исследование образца ткани папилломы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и определение маркера специфического для данных типов ВПЧ (Нурмухаметов Р.Х. "Применение препаратов интерферона при ювенильном респираторном папилломатозе". Афтореф. диссерт. Канд. мед наук, М., 1998, с.22).

Суть известного способа заключается в том, что во время операции образец удаленного материала папилломы исследуют путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), во время которой определяют наличие в клетках образца ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) ВПЧ.

Недостатками данного способа являются его ограниченные возможности, обусловленные отсутствием возможности определения количественного содержания ДНК, что не позволяет провести оценку результатов лечения.

Кроме того, использование в качестве маркера ДНК ВПЧ может привести к получению ложноположительных результатов, так как ДНК стабильна и сохраняться в клетках значительное время, даже при эффективно проводимой терапии.

Нами была поставлена задача разработать способ, позволяющий достоверно оценить эффективность проводимого лечения респираторного папилломатоза в ранние сроки от начала терапии, что позволит своевременно провести адекватную коррекцию лечения, в случае его малой эффективности.

Эта задача достигается тем, что в способе оценки эффективности лечения респираторного папилломатоза гортани, включающем исследование образца ткани папилломы с помощью полимеразной цепной реакции и определение маркера специфического для данных типов ВПЧ, предложено в качестве маркера специфического для данных типов ВПЧ использовать РНК (рибонуклеиновую кислоту) консервативной области основного белка капсида ВПЧ, которую получают из образцов ткани папилломы, отобранных до лечения и спустя 24-72 часа после начала лечения, затем для полученных РНК с помощью реакции обратной транскрипции выделяют комплиментарную ДНК, и определяют количество геномных эквивалентов вирусов ВПЧ и при уменьшении их последующего количества по сравнению с первоначальным не менее чем в 10 раз, определяют эффективность лечения.

Использование в качестве маркера РНК ВПЧ позволяет установить изменение количества геномных эквивалентов во времени, то есть осуществить мониторинг в клиническом материале, полученном от больных, что позволит оценить эффективность лечебных мероприятий на самых ранних стадиях и в случае необходимости вовремя провести адекватную коррекцию лечения.

Способ осуществляют следующим образом.

До начала лечения у больного берут образец ткани папилломы и помещают его в лизирующий раствор для сохранения (поскольку РНК быстро разрушается). Далее отобранный материал в количестве строго 50-100 мг ресуспендируют в 1 мл раствора, который в итоге дальнейших манипуляций переводят в 50 мкл. В реакцию обратной транскрипции берут 10 мкл. В ходе реакции исходные 10 мкл разводят в 30 мкл буферной смеси. В ПЦР берут 10 мкл из пробирки четвертого этапа работы и выделяют комплиментарную ДНК (кДНК).

Количество кДНК определяют визуальным сравнением исследуемой пробы с известными пробирками внутреннего стандарта от №1 до №6, которые содержат №1-10, №2-10² №3-10³ №4-10⁴ №5-10⁵, №6-10⁶ количества копий вирусов положительного внутреннего контроля.

Затем по формуле ГЭ=1×10^{№пробирки}×100×N, где N=9 (разведение исходной РНК) определяют эквимолярное количество копий вируса исследуемого образца. Затем после начала лечения в течение 24-72 часов дополнительно отбирают образец ткани папилломы и определяют эквимолярное количество копий ВПЧ данного образца. Сравнивают первоначальное и последующее количества копий ВПЧ и при уменьшении его не менее чем в 10 раз определяют эффективность лечения.

Необходимым условием для определения эквимолярного количество копий РНК ВПЧ является ее транскрипция в комплиментарную ДНК, поскольку для реакции обратной транскрипции методом конкурентной ПЦР матрицей служит только ДНК, в частности комплиментарная ДНК (кДНК). Поэтому первым этапом является выделение РНК ВПЧ с помощью ПЦР. Затем проводят реакцию обратной транскрипции методом конкурентной ПЦР. Метод конкурентной ПЦР позволяет провести амплификацию ДНК с раститрованным внутренним контролем (конкурентом), имеющим аналогичные сайты отжига для используемых специфических праймеров. ПЦР продукты от специфической матрицы и внутреннего контроля отличаются приблизительно на 50-200 пар нуклеотидов. Реакцию одновременной амплификации специфической матрицы и внутреннего контроля проводят в серии из 6 пробирок с раститрованным от 10¹ до 10⁶ копий матрицы внутреннего контроля и одинаковым количеством (объемом) ДНК из анализируемой пробы. Детекцию ПЦР продукта проводят электрофорезом в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, под УФ светом с длиной волны 310 нм. В конкурентных условиях реакции амплификации количество матрицы в анализируемой пробе определяют относительно известного количества копий внутреннего контроля в каждой пробирке из серии (Chomczynski P., Sacchi N. Anal. Biochem., #162, Р.156-157, 1987).

Пересчет количества геномных эквивалентов вирусов ВПЧ (ГЭ/мл) основан на соблюдении строгих пропорций и объемов на всех этапах работы, результатом которых явилась формула пересчета ГЭ/мл, которая является унифицированной единицей измерения количества кДНК, РНК в ПЦР диагностике (Chomczynski Р. BioTechniques, #15, Р.532-537, 1993).

Конкретные примеры выполнения способа.

1. Больной С., 9 лет, находился в ЛОР отделении МОНИКИ с 29 мая по 5 июня 2002 года, история болезни №9349 с диагнозом: Ювенильный респираторный папилломатоз гортани, стеноз гортани 4 степени, трахеальное канюленосительство. Поступил с жалобами на затрудненное дыхание через естественные дыхательные пути, афонию, наличие трахеостомы. Болен около 6 месяцев, когда появились затруднения дыхания, противовоспалительная терапия эффекта не принесла, дважды производилось удаление папиллом без улучшения, в связи с нарастанием явлений стеноза гортани трахеотомирован, рекомендовано лечение в ЛОР клинике МОНИКИ. При поступлении общее состояние удовлетворительное. Ребенку произведена прямая ларингоскопия с удалением папиллом, интраоперационно: в области черпалов, черпалонадгортанных складок, вестибулярных и голосовых складок, передней комиссуры. 70 мг удаленного материала в консервирующем растворе сразу же (во время операции) направлена в лабораторию, и определеноэквималярное количество РНК ВПЧ, составившее 3×10⁹ ГЭ/мл.

На 2 сутки (через 48 часов) после начала противорецидивной терапии (анцикловир по 0,2 по 5р/д) отобран образец ткани попиломы.

Проведено исследование, в результате которого установлено, что количество РНК ВПЧ составило - 3·10⁸ ГЭ/мл, то есть уменьшилась в 10 раз, что свидетельствует об эффективности лечения.

2. Больной Н., 34 лет, находился в ЛОР отделении МОНИКИ с 10.11.02 по 26.11.02, история болезни №19452, с диагнозом: рецидивирующий папилломатоз гортани. Жалобы на охриплость. При поступлении состояние удовлетворительное, дыхание через естественные пути свободное, при осмотре ротоглотки - uvula отсутствует, в этом месте папилломы розового цвета небольшого размера, при непрямой ларингоскопии: конгломераты папиллом, суживающие голосовую щель в области голосовых, вестибулярных, черпалонадгортанных складок, черпалов, гортанной поверхности надгортанника (верхушки его). Произведена прямая ларингоскопия с лазерным фотодинамическим воздействием на папилломы и частичным их удалением. 100 мг удаленного материала в консервирующем растворе направлено в лабораторию, где определено эквимолярное соотношение количества копий исследуемого образца от пациента и внутреннего стандарта, которое соответствует пробирке №5 с количеством внутреннего стандарта 1·10⁵. Следуя по формуле пересчета количество копий ВПЧ составило 1·10⁵×100×9=9×10⁷ ГЭ/мл.

После 1,5 суток (36 часов) от начала проведения лечения дополнительно отобран образец ткани папилломы и определено количество РНК ВПЧ, которое составило 9×10⁶ ГЭ/мл, что в 10 раз меньше первоначального. Проведенное лечение эффективно.

Использование данного способа позволит на самых ранних этапах в течение 24-72 часов от начала лечения определить его эффективность и во время провести коррекцию в случае необходимости, что существенно сократит сроки лечения.

Больной С., 45 лет, ист. болезни №18552, диагноз: рецидивирующий папилломатоз гортани. Жалобы на частые боли в горле, охриплость. При поступлении состояние удовлетворительное, дыхание через естественные пути свободное, при осмотре ротоглотки - uvula отсутствует, в этом месте папилломы розового цвета небольшого размера, при непрямой ларингоскопии: конгломераты папиллом, суживающие голосовую щель в области голосовых, вестибулярных, черпалонадгортанных складок, черпалов, гортанной поверхности надгортанника (верхушки его). Произведена прямая ларингоскопия с лазерным фотодинамическим воздействием на папилломы и частичным их удалением. 100 мг удаленного материала в консервирующем растворе направлено в лабораторию, где определено эквимолярное соотношение количества копий исследуемого образца от пациента и внутреннего стандарта, которое соответствует пробирке №6 с количеством внутреннего стандарта 1·10⁶. По формуле пересчета количество копий ВПЧ составило 1·10⁶×100×9=9×10⁸ ГЭ/мл.

На 3 сутки (после 60 часов) от начала проведения лечения дополнительно отобран образец ткани папилломы и определено количество РНК ВПЧ, которое составило 9×10⁷ ГЭ/мл, что в 10 раз меньше первоначального. Проведенное лечение эффективно.

Способ оценки эффективности лечения респираторного папилломатоза гортани, включающий исследование образца ткани папилломы, детекцию РНК вируса папилломы человека (ВПЧ), проведение обратнотранскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), отличающийся тем, что проводят детекцию РНК консервативной области основного белка капсида ВПЧ, полученную из образцов ткани папилломы, отобранных до лечения и спустя 24-72 ч после начала лечения, затем с помощью ОТ-ПЦР выделяют комплементарную ДНК, определяют количество геномных эквивалентов ВПЧ и при уменьшении их количества не менее чем в 10 раз лечение оценивают как эффективное.