Штамм бактерий shigella sonnei, используемый в качестве индикатора для типирования колицинов группы е3 (е3 , е4, е5, е6) у энтеробактерий

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к поиску индикаторного штамма для идентификации колицинов группы Е₃ (Е₃, Е₄, E₅, Е₆). Получен штамм, обладающий чувствительностью к колицинам группы Е₃ (r.Е₃), пригодный для колициногенотипирования энтеробактерий - их дифференцировки по типам продуцируемых колицинов. Штамм Shigella sonnei получен путем генетико-селекционных приемов, чувствительный к колицинам группы Е₃ (Е₃, Е₄, Е₅, Е₆) - мутант типового штамма Sh.sonnei P₉ Фредерика. Штамм депонирован в коллекции Хабаровского НИИЭМ под №24. Использование штамма Sh.sonnei №24 позволяет выявлять единичные колицины группы Е₃ или их комбинации с другими колицинами у энтеробактерий. 5 табл.

 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к поиску индикаторного штамма для идентификации колицинов группы Е₃ (Е₃, E₄, Е₅, Е₆).

Существующие в мировой науке системы типирования основаны на выявлении колицинопродукции (col-факторов) с помощью универсальных индикаторов, а затем на типизации колицинов путем тестирования с индикаторами, чувствительными или резистентными к определенным колицинам или их сочетаниям. Известны несколько систем или схем колициногенотипирования энтеробактерий (4, 5, 6). В каждой из систем существует свой набор эталонных типовых культур-продуцентов колицинов и индикаторов к ним В России в разные годы использовали схемы Фредерика, Эббота и Шеннона, ряд авторских схем. За рубежом используется схема В.Горака.

Схема Фредерика (5) включает 17 типовых тест-культур, имеющих буквенное обозначение продуцируемых колицинов - группа Е (E₁, E₂, Е₃), I, В, D, K и т.д. Коллекция тест-культур имеется в ГИСК им. Тарасовича. Однако авторской коллекции индикаторов к этому набору ГИСК не имеет. Не зарегистрирована такая коллекция индикаторов в Каталоге штаммов Чехословацкой национальной коллекции типовых культур, имеющей международный статус (9). Набор индикаторов, позволявший идентифицировать ограниченное число типов колицинов, использовался рядом авторов (1-3). Коллекция под названием индикаторов Н.В.Давыдовой, имевшаяся в распоряжении лаборатории кишечных инфекций Хабаровского НИИЭМ, позволяла диагностировать колицины группы Е (E₁, E₂), I, В, K, D, V и отдельные их сочетания.

В коллекции не было индикаторов для выявления колицина Е₃.

В схеме Эббота и Шеннона (4) колицины имеют условное цифровое обозначение (1а, 1в, 2, 3 и т.д. до 15). ГИСК им. Тарасовича располагает коллекцией типовых тест-культур 17 наименований и 15 индикаторов. Схема достаточно громоздка, типы колицинов обозначены условно цифрами, они до недавнего времени не были соотнесены с общепринятым буквенным обозначением типов колицинов. Система контроля индикаторов не была разработана.

Разработанная новая система типирования колицинов В.Горака методически хорошо обеспечена (6, 7, 8). Состав коллекции типов и индикаторов содержится в Чехословацком каталоге культур (9). Коллекция типов тест-культур, основанная первоначально на наборе Эббота и Шеннона, включает 67 наименований от 1а до 67 типов. Определены соответствующие схеме Фредерика буквенные аналоги колицинов. Число индикаторов включает свыше 60 наименований, что позволяет определять множество различных комбинаций колицинов у поликолициногенных штаммов, в том числе колицины Е₄, E₅, Е₆. Схема может быть использована только в специализированных исследовательских лабораториях, обеспечивающих поддержание многочисленной коллекции в рабочем состоянии.

Хабаровский НИИЭМ с 1971 г. ведет слежение за циркуляцией возбудителей дизентерии Зонне на территории Дальнего Востока, используя колициновый маркер шигелл. Для получения сопоставимых результатов пользуется единой методикой, усовершенствуя и дополняя ее, с применением ограниченного числа индикаторов. В основе методики - схема Фредерика. Для типизации колицинов используют группы индикаторов различного механизма действия.

1. Индикаторы, чувствительные к отдельным колицинам или их сочетаниям. Удобны для выявления множественных колицинов. Индикатор работает на определенный колицин в любом сочетании.

2. Индикаторы, резистентные к отдельным колицинам или их сочетаниям (отсутствие рецепторов фиксации у индикатора для соответствующего колицина - внешнее исключение действия колицина на индикатор). Непригодны без дополнительных индикаторов для типирования множественных колицинов: мутанты, резистентные к одному колицину, подавляются другими колицинами.

3. Индикаторы, иммунные к действию определенного колицина вследствие носительства одноименной col-плазмиды (внутреннее исключение действия одноименного колицина типируемого штамма на индикатор, обеспеченное иммунитетом индикатора). Наиболее специфичны.

Типирующие способности индикаторов (спектр) определяют по их взаимодействию с набором тест-культур продуцентов колицинов.

Идентификация колицинов группы Е (Е₃, E₄, E₅, Е₆) затруднена вследствие отсутствия в отечественных коллекциях индикаторов различного механизма действия. Нет четких представлений и о классификации этой группы колицинов. В дальнейшем эта группа колицинов обозначена символом Е₃.

Цель изобретения - получение штамма, обладающего чувствительностью к колицинам гр. Е₃ (ч. Е₃), что позволяет выполнять колициногенотипирование энтеробактерий - их дифференцировку по типам продуцируемых колицинов.

Цель достигается тем, что путем генетикоселекционных приемов разработан штамм Shigella sonnei, чувствительный к колицинам группы Е₃ (Е₃, E₄, E₅, Е₆) - мутант типового штамма Sh.sonnei P₉ Фредерика, используемый в качестве чувствительного индикатора для типирования колицинов группы Е₃ (Е₃, E₄, E₅, Е₆) у энтеробактерий.

Штамм Sh.sonnei, чувствительный к колицинам группы Е₃ (Е₃, E₄, E₅, Е₆), хранится в коллекции индикаторных культур для типирования колицинов в лаборатории кишечных инфекций Хабаровского НИИЭМ под №24.

Культурально-морфологические признаки.

г - неподвижные палочки, спор и капсул не образуют. На МПА - рост S и переходных форм колоний сероватого цвета, умеренно выпуклых, без запаха. На среде Эндо - бесцветные, S и переходная форма.

На МПБ - равномерная муть. Пленок не образует. Оптимум роста +37° в течение 18-24 часов.

Биохимические признаки.

а) характеристики, позволяющие отнести штамм микроорганизма, чувствительного к колицину Е₃ (ч. Е₃), к семейству Enterobacteriacea, роду Shigella.

нитратный бульон	+	метил, рот	+
оксидаза	-	Фогес-Проскауэра	-
мочевина	-	индол	-
цитрат Симмонса	-	ацетат натрия	-
малонат натрия	-	подвижность	-
фенил-аланин	-
сероводород	-

б) отношение к углеводам, аминокислотам:

глюкоза	+	дульцит	-
лактоза	-	сорбит	-
маннит	+	инозит	-
сахароза	-	лизин	-
рамноза	-	орнитин	+
ксилоза	-	аргинин	-
мальтоза	-

Штамм хранится в столбике 0,6% полужидкого агара под слоем вазелинового масла при комнатной t° в течение 1 года без пересева или на МПА (чашки Петри или пробирки) в холодильнике с пересевом 1 раз в 15 дней.

Индикаторные свойства штамма ч.Е₃ установлены при испытании его с набором стандартных тест-штаммов продуцентов колицинов из коллекции Фредерика и Горака (таблицы 1, 2).

В основе методики -

а) выявление колициногенной активности штаммов-продуцентов с помощью универсального индикатора Е.coli K₁₂;

б) типирование колицинов - т.е. выявление среди колициногенных штаммов продукции колицинов гр. Е₃ с помощью специфических штаммов - индикаторов.

Эти два этапа выполняются одновременно.

Определение колициногенной активности и колициногенотипирование проводят двуслойным методом отсроченного антагонизма Фредерика (5).

Односуточные тест-штаммы продуценты колицинов засевают уколом петли в слой 1,5% МПА (агар-агар+бульон Хоттингера, либо коммерческий питательный агар+мясо-пептонный бульон), разлитого в чашки Петри. На одну чашку одновременно засевают 8-9 испытуемых культур. Каждый штамм засевают параллельно на несколько чашек, соответственно числу используемых индикаторов, при этом колицины, продуцируемые штаммами, диффундируют в среду. После двухсуточной инкубации при 37° выросшие колонии стерилизуют парами хлороформа в течение 2-х часов. Для этого хлороформ (0,5 мл) наносят на квадраты фильтровальной бумаги, размещенные в крышках чашек Петри, затем чашки с засеянной средой закрывают для экспозиции. При этом крышки с хлороформом располагаются снизу, а чашки со средой накрывают их сверху. Через 2 часа пары хлороформа удаляют, оставляя чашки открытыми в течение 30 мин. Фильтровальную бумагу также удаляют, а поверхность агара засевают культурой индикатора. Одну чашку - универсальным индикатором Е.coli K₁₂, вторую - индикатором, чувствительным к колицинам гр. Е₃, третью - индикатором, чувствительным к колицину E₁ (для контроля).

Для этого 0,1 мл суточной или 6-часовой бульонной культуры индикаторного штамма вносят в пробирку с 3-4 мл расплавленного и охлажденного до 45 полужидкого 0,6% агара и после перемешивания содержимое пробирки выливают (наслаивают) на поверхность первого агарового слоя. Через 18-20 часов инкубирования посевов в термостате проводят учет результатов опыта. Определяют наличие или отсутствие зон подавления роста индикаторных культур под действием колицинов, величину зон и их характер, получая дополнительную информацию о сходстве или различиях типов колицинов.

Наличие зон подавления роста универсального индикатора Е.coli K₁₂ означает, что тест-штаммы действительно продуцируют колицины и можно приступить к оценке действия типирующих индикаторов.

При испытании индикаторного штамма с набором культур-продуцентов колицинов Фредерика (табл.3) установлено, что индикаторный штамм действительно выявляет только колицин Е₃ типового штамма Са 38 Фредерика (знак «плюс» в схеме). Индикатор остается инертным к воздействию колицинов, продуцируемых остальными тест-штаммами этой коллекции.

Взятый для контроля индикатор, чувствительный к колицину Е₁, выявляет только колицин Е₁ (синоним S₅) и не выявляет колицин Е₃.

Как следует из таблицы 4, все тест-культуры Горака, кроме типа 7, продуцируют колицины, выявляемые универсальным индикаторным штаммом Е.coli K₁₂. Испытуемый индикаторный штамм ч. Е₃ выявляет все колицины группы Е₃ (E₄, Е₅, Е₆) как одиночные, так и в сочетаниях с другими колицинами (без дифференциации на подтипы). Чувствительный индикатор действует строго специфично, выявляя только колицины группы Е₃ и оставаясь инертным ко всем другим колицинам.

Таким образом, сравнение предлагаемого штамма Sh.sonnei ч. Е₃ с известными индикаторами (ч. E₁) показывает, что штамм Sh.sonnei ч.Е₃ чувствителен только к колицинам Е₃ (Е₃, E₄, Е₅, Е₆) типовых штаммов коллекции Фредерика и Горака и позволяет выявлять единичные колицины группы Е₃ или их комбинации с другими колицинами у энтеробактерий. При этом не дифференцирует их на типы Е₃, E₄, Е₅, Е₆.

Пример конкретного использования индикаторного штамма ч. Е₃.

Для индикации колицинов Е₃ у энтеробактерий - одиночных или в сочетании с другими колицинами, индикаторный штамм ч. Е₃ используют как самостоятельно, так и в комплексе с другими индикаторными штаммами.

Испытуемые штаммы энтеробактерий (Sh. sonnei №1 и №2) засевают уколом в среду для накопления колицина [метод отсроченного антагонизма Фредерика (5)]. Наличие колициногенной активности устанавливается с помощью универсального индикатора Е.coli K₁₂. Для установления типа колицинов применили два типирующих индикатора - чувствительный к колицинам группы Е₃ (предмет изобретения) и чувствительный к колицину E₁.

Как следует из таблицы 5, оба штамма продуцируют колицины (знак + на универсальном индикаторе Е.coli K₁₂).

Штамм Sh.sonnei №1 продуцирует колицины Е₃, так как специфический чувствительный индикатор реагирует на «свой» колицин зоной задержки роста (знак + в таблице). Индикатор ч. E₁ остается инертным. У штамма Sh.sonnei №2, напротив, колицин гр. Е₃ не выявлен, т.к. индикатор ч. Е₃ остается инертным; выявлен колицин Е₁.

ЛИТЕРАТУРА

1. Давыдова Н.В. Селекция индикаторных штаммов для типирования колицино генных культур E.coli. Сообщение I. Получение резистентных к определенным колицинам и их сочетаниям мутантов для типирования колициногенных культур E.coli. // Журн. микробиол. - 1965. - №7. - с.12-16.

2. Давыдова Н.В., Кудлай Д.Г., Петровская В.Г. Селекция индикаторных штаммов для типирования колициногенных культур E.coli. Сообщение II. Использование колициногенных рекомбинантов для дифференциации колицинов с групповой специфичностью. // Журн. микробиол. - 1965. - №8. - с.96-99.

3. Давыдова Н.В., Кудлай Д.Г. Селекция индикаторных штаммов для типирования колициногенных культур E.coli. Сообщение III. Использование моно- и дичувствительных культур для типирования штаммов с множественной колициногенностью. // Журн. микробиол. - 1966. - № 7. - с.91-93.

4. Abbott J.A., Shannon R. A method for typining Sh.sonnei using colicin production as a marker // J. Clin. Path. - 1958. - n.11. - p.71-77.

5. Fredericq P. Colicins. // Ann. Rev. Microbiol. - 1957. n.11. - p.7-22.

6. Horak V. Typing of Shigella Sonnei Colicins by means of specific Indicators // Zbl. Bakt. Hyg. - 1975. - Abt. 1. Orig. - A 233 - p.58-63.

7. Horak V. Colicin typing of Shigella Sonnei by means of specific indicator strains. An enlarged scheme // Zbl. Bakterial., Parasitenk., Infectionskrankn und Hyg. - 1980, Abt. 1 Orig. - A246. - n.2. - p.191-196.

8. Horak V. Fifty four Shigella Sonnei colicin types and their typing by specific indicator strains. // Folia microbiol. - 1985. - n.30. - p.76-79.

9. Catalogue of Pathogenic Microorganisms. The Czechoslovak National Collection of Type Cultures. Fifth Edition. Prague, 1990. - 125 p.

Таблица 1 Перечень индикаторных штаммов и тест-культур продуцентов колицинов, использованных в работе
Индикаторы
Наименование	Спектр чувствительности
1. Универсальный индикаторный штамм	а) Ко всем колицинам Фредерика
Е.coli K12	б) Ко всем колицинам Горака
Получен из ГИСКа в 1970 г.	(кроме т.7)
2. Sh.sonnei P9, чувствительный к	а) Колицины схемы Фредерика.
колицинам группы Е3 (Е3, Е4, E5, Е6).	Е3 (штамм Е.coli Са 38)
Предмет изобретения.	б) Колицины схемы Горака
	Е4 (т.т.3,9)
	Е5 (т.т.32, 33)
	Е6 (т.т.9а, 12, 14, 18, 24, 28, 30, 36)
3. Е.Coli,	а) Колицины схемы Фредерика
чувствительный к колицину E1	E1, Ia (штамм Е.coli Са 62)
Прототип	S5 (штамм Р14)
	б) Колицины схемы Горака
	E1 (т.т.6, 11, 13, 18, 20, 24,
	25, 27, 30, 31, 34,35, 37)
Продуценты колицинов
1. Набор тест-культур продуцентов	15 типов
колицинов Фредерика.	А, В, С...
Получен из ГИСКа в 1970 г.
2. Набор тест-культур продуцентов	38 типов
колицинов В.Горака.	от 1a до 37 типа
Получен от д-ра Идиной М.С.,
Ленинградский НИИЭМ им. Пастера, 1987 г.

Таблица 2 Перечень колициногенотипов-продуцентов колицинов группы Е3 из схем Фредерика и Горака
Колицины группы Е3	Продуценты колицинов	Колицины, продуцируемые тест-штаммами
Схема Фредерика	Е3	Е.coli Ca 38	Е3Iв
Схема Горака	Е4	3 9	XIaE4 E4Ia
	Е5	32 33	E5Ia E5Js
Е6	9а 12 14 18 24 28 30 36	Е6Ia Е6 Е6Iв Е1Е6Х E1Е6Ia Е2E6 E1Е6 KE6

Таблица 3 Характеристика спектра чувствительности универсального индикатора Е.coli K12 и штамма, чувствительного к колицинам гр. Е (Е3) по отношению к колицинам тест-штаммов Фредерика
Наименование тест-штаммов	Тип продуцируемого колицина	Индикаторы х
Универсальный Е.coli К12	Заявляемый чувств. Е3	Прототип чувств. E1
1. E.coli Ca 18	В	+	-	-
2. E.coli K-235	K	+	-	-
3. E.coli Ca 46	D	+	-	-
4. Е.coli Са 57	С	+	-	-
5. E.coli Ca 38	Е3+I	+	+	-
6. E.coli Ca 53	I	+	-	-
7. E.coli Ca 42	F	+	-	-
8. Paracoli Ca 62	F+I	+	-	+
9. E.coli Ca 7	V	+	-	-
10. E.coli Ca-23	D	+	-	-
11. Sh.dispar P15	S4	+ слабо	-	-
12. Sh.dispar P14	S5	+	-	+
13. E.freundii Ca 31	А	+	-	-
14. Sh boydii P1	SI	+	-	-
15. Sh. sonnei P9	E2+I	+	-	-
X + наличие зоны торможения роста индикаторного штамма (чувствительность к действию колицина); - отсутствие зоны (устойчивость к действию колицина).

Таблица 4 Характеристика индикаторных способностей универсального индикатора Е.coli K12 и штамма Sh.sonnei, чувствительного к колицинам гр.Е3 по отношению к продуцентам колицинов коллекции Горака (E4, E5, Е6)
Колицины	Индикаторы
Колицино-генотип по Гораку	Продуцируемый колицин по Фредерику	E.coli K12	Заявляемый чувств. Е3	Прототип чувств. E1
1а	К	+	-	-
1в	KIa	+	-	-
2	Ia	+	-	-
3	XIaE4	+	+ сл.	-
3а	D	+	-	-
4	Ib	+	-	-
5	KIb	+	-	-
6	E1	+	-	+
7	Js	-	-	-
8	E2	+	-	-
9	E4Ia	+	+	-
9а	Е6Ia	+	+	-
10	KIaE2	+	-	-
11	E1	+	-	+
12	Е6	+	+	-
13	E1Ia	+	-	+
14	Е6Ib	+	+	-
16	Bm	+	-	-
17	BmIb	+	-	-
18	E1E6X	+	+	+
19	E2Ia	+	-	-
20	E1Ib	+	-	+
21	E2Ib	+	-	-
22	E2mB	+	-	-
23	E2IaBm	+	-	-
24	E1E6Ia	+	+	+
25	E1Bm	+	-	+
27	E1E2	+	-	+
28	Е2Е6	+	+	-
29	BmIa	+	-	-
30	E1E6	+	+	+
31	E1E2Ia	+	-	+
32	E5Ia	+	+	-
33	E5Js(7)	+	+	-
34	E1D	+	-	+
35	KE1	+	-	+
36	KE6	+	+	-
37	mE1	+	-	+

Таблица 5 Применение индикаторного штамма ч. Е3 для типирования колицинов у «диких» штаммов шигелл
Испытуемые «дикие» штаммы шигелл	Индикаторы для выявления колицинов	Тип колицина
E.coli K12	ч. E1	ч. Е3
Sh.sonnei № 1	+	-	+	Е3
Sh.sonnei № 2	+	+	-	E1

Штамм бактерий Shigella sonnei, депонированный в коллекции лаборатории кишечных инфекций Хабаровского НИИЭМ под №24, используемый в качестве индикатора для типирования колицинов группы Е₃ (Е₃, Е₄, Е₅, Е₆) у энтеробактерий.