Способ заражения птиц возбудителем пастереллеза для постановки биологической пробы

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Способ заключается в том, что птицу с массой тела 300-350 г заражают на слизистую верхних дыхательных путей, и с момента гибели ее труп остывает при 20°С (оптимум) окружающей среды. Через 3 часа после смерти труп вскрывают и берут кровь из сердца. В крови обнаруживают пастереллы в виде биполярной равномерно сформированной псевдопалочки в состоянии выраженной капсуляции и сразу же их изолируют от питательного субстрата в физиологческий раствор (рН 7,0). В физиологическом растворе пастереллы хранят в течение 10 суток без доступа атмосферного воздуха в наполненных, запаянных и горизонтально расположенных пастеровских пипетках при температуре 20°С идентичными исходным по вирулентности (инвазивности), морфологически одинаковыми, капусулированными коккобактериями, обособленными поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе. Хранящиеся для использования пастереллы высевают при разведении 10^-1-10^-10 в жидкую питательную среду, имеющую также температуру 20°С, культивируют 9 часов при температуре 37°С и 1 час при температуре 20°С. Полученную при наименьшем количестве микробных клеток в посеве культуру стандартизированных пастерелл, сохраняя при температуре 20°С к моменту заражения, подтитровывают на птице определенного вида и возраста, определяя минимальную летальную дозу в 0,5 мл или же в 1,0 мл. Заражение птиц осуществляют интраназально путем нанесения на слизистую носовой и ротоглоточной полостей по полдозы в обе ноздри. Способ позволяет с высокой точностью воспроизвести природные условия заражения птиц возбудителем пастереллеза. 2 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и предназначено для стандартизации патогенных штаммов пастерелл и биологического контроля иммуногенности вакцин против пастереллеза птиц, а такие в целях эпизоотологии и эпидемиологии пастереллезов и близких к ним заболеваний.

Известно, что возбудитель пастереллеза вариабелен, в естественных условиях спонтанно ослабляет и восстанавливает свою вирулентность, вызывает заболевание птиц и млекопитающих, включая человека (Н.М.Никифорова, 1962; И.В.Домарадский, 1971; В.Л.Семиотрочев и др., 1985). Микроб проявляет себя от крайне ослабленного при пастереллоносительстве до сильновирулентного возбудителя болезни в регионах с теплым и умеренным климатом, чаще в период дождей и резких колебаний температуры воздуха, и патогенетически особенно опасен для птиц, так как обычно вызывает опустошительные эпизоотии, нанося чрезвычайный ущерб (Г.Л.Пустовит, 1965; Е.И.Буткин, 1972). От безысходности в такой ситуации большинство исследователей склонны утверждать причиной в основе развития пастереллеза различные предрасполагающие факторы, особенно метеофакторы, прежде всего - температуру и влажность окружающей среды, снижающие естественную резистентность макроорганизма. Однако в связи с естественной резистентностью птиц реальная ситуация в развитии пастереллеза совершенно противоположная. Как ни странно, с внезапным появлением и очень быстрым ("молниеносным") развитием заболевания обычно первыми гибнут самые активные, упитанные и сильные птицы. Издавна так называемый "парадокс вирулентности" возбудителя пастереллеза, когда в природе восприимчивые организмы заражаются легко и быстро, а в экспериментах при естественных путях инфицирования далеко не всегда возможно вызвать заболевание (П.В.Сизов, 1931; Е.И.Буткин, 1972), не находит точного объяснения. При этом известно, что утрата или же восстановление вирулентности и, как правило, капсулы, капсульного антигена (К-антигена), а также иммуногенности пастерелл сопровождается диссоциацией их микробной клетки, выявляемой по изменению колоний (S-, М-, R- формы и S^R- или R^S- переходные формы) (G.R.Carter, E.Annau, 1953; G.R.Garter, C.H.Rigland, 1953; G.R.Garter, 1957; A.H.Борисенкова, 1979). Условия этого процесса, особенно по части восстановления биологических свойств пастерелл, почти не изучены.

Известно, что одной из основных задач стандартизации является обеспечение единства и достоверности измерения показателей качества биопрепаратов ("Вет. энциклопед. словарь", М., 1981. С.490). С этой целью стандартизация контрольно-производственных штаммов пастерелл по морфологии и вирулентности является показателем первостепенной важности. Штаммы пастерелл пассируют через восприимчивый организм (обычно по источнику происхождения бактерий) и сохраняют лиофилизированными ("Вет. препараты", М., 1981. С.238). Но и при этом микроорганизмы значительно не соответствуют своему стандарту биологических свойств по паспорту. Из-за сложности и слабой изученности свойств возбудителя пастереллеза эта задача по-прежнему решается эмпирически, в связи с чем и безуспешно.

В предыдущей работе, заключающейся в повышении точности условий выявления и выделения пастерелл (Патент РФ №2005790 от 15.01.1994 г., Патент РФ №2051970 от 10.01.1996 г.), в объяснении феномена биполярности пастерелл (Ж. "Доклады Россельхозакадемии", 1996. №5. С.32-35), в установлении условий повышения (восстановления) вирулентности пастерелл (Патент РФ №2123531 от 20.12.1998 г.), а также в разработке вакцины для профилактики пастереллеза птиц и способа ее получения (Патент РФ №2199341 от 27.02.2003 г.), показана взаимосвязанная инфекционная природа пастерелл в капсульном и бескапсульном вариантах микробной клетки в зависимости от температуры окружающей среды. Ввиду морфо- и термолабильности возбудителя пастереллеза путь заражения и температура окружающей среды играют главную роль в развитии заболевания и в восстановлении биологических свойств пастерелл. Установленное свидетельствует о реальной возможности стандартизировать патогенные штаммы пастерелл и разработать метод биологического контроля иммуногенности вакцин против пастереллеза птиц, отличающийся от существующего большей объективностью способа заражения восприимчивого организма. Исходя из этого, за прототип взят известный способ заражения путем инъекции, в частности - внутримышечно, применяемый с целью пассажа контрольно-производственных штаммов пастерелл перед тем как их лиофилизировать и с целью контроля иммуногенности противопастереллезных вакцин ("Вет. препараты", М., 1981. - Пастереллезы. С.235-251). Очевидно, что заражение по существующему способу не соответствует природному. В заражении согласно прототипу не учитывается существенная роль естественных первичных барьеров макроорганизма. Однако, например, слизистая верхних дыхательных путей, являясь обычным местом локализации естественного (спонтанного) пастереллоносительства (Е.М.Кожевников, 1971, 1973, 1974), противостоит внедрению ослабленных бактерий во внутреннюю среду организма. Такое же ее защитное свойство наблюдается, по нашим данным, и по отношению к микробной клетке патогенных (контрольно-производственных) штаммов пастерелл, регидратированной из лиофилизированного состояния. В то же время эта микробная клетка штаммов пастерелл при инъекции, минуя существенную часть защитных сил организма, выражена патогенно. Это обстоятельство и вынуждает использовать способ заражения макроорганизма путем инъекции. Однако биологическая оценка иммуногенности вакцин при таком способе заражения не может быть объективной, так как иммунитет к пастереллезу формируется и проявляется как антиинвазивный иммунитет (А.В.Масюков, 1965). Пастереллы, по нашим данным, термолабильны и их инвазивность блокируется при низкой температуре окружающей среды, как и при замораживании для последующей сублимационной сушки (лиофилизации) бактерий. Поэтому зараженные на слизистую верхних дыхательных путей обычно и остаются живыми, причем - пастереллоносителями, а если часть их и гибнет, то значительно в поздние сроки биопробы. Если же пастереллы правильно пассировать через восприимчивый организм, изолировать и хранить, то им свойственна вирулентность с выраженной инвазивностью. И тогда слизистая верхних дыхательных путей, прежде всего носовой и ротоглоточной полостей, пастереллами уязвима и является природным местом заражения ("воротами инфекции"). Ввиду изложенного, существенным недостатком способа заражения, взятого за прототип, является введение в восприимчивый организм биологически неточно подготовленных патогенных пастерелл и несоответственно природному пути инфицирования, минуя часть его естественных защитных сил.

Задачей изобретения является заражение птиц возбудителем пастереллеза в биопробе, близкое к природному, путем повышения точности условий получения и введения в восприимчивый организм стандартизированного по морфологии, вирулентности и численности микробной клетки патогенного штамма пастерелл.

Поставленная задача достигается тем, что птицу с массой тела 300-350 г заражают на слизистую верхних дыхательных путей, и с момента гибели ее труп остывает при 20°С (оптимум) окружающей среды. Затем, через 3 ч после смерти труп вскрывают и берут кровь из сердца. В крови обнаруживают пастереллы в виде биполярной равномерно сформированной псевдопалочки в состоянии выраженной капсуляции и сразу же их изолируют от питательного субстрата в физиологический раствор (рН 7,0). В физиологическом растворе пастереллы хранят в течение 10 суток без доступа атмосферного воздуха в наполненных, запаянных и горизонтально расположенных пастеровских пипетках при температуре 20°С в качестве идентичных исходным по вирулентности (инвазивности), морфологически одинаковых, капсулированных коккобактерий, обособленных поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе. Хранящиеся для использования пастереллы высевают при разведении 10^-1-10^-10 в жидкую питательную среду, имеющую также температуру 20°С, культивируют 9 ч при температуре 37°С и 1 ч при температуре 20°С. Полученную при наименьшем количестве микробных клеток в посеве культуру стандартизированных пастерелл, сохраняя при температуре 20°С к моменту заражения, подтитровывают на птице определенного вида и возраста, определяя минимальную летальную дозу в 0,5 мл или же в 1,0 мл. Заражение птиц осуществляют интраназально путем нанесения на слизистую носовой и ротоглоточной полостей по полдозы в обе ноздри.

Существенным отличием является то, что птицу о массой тела 300-350 г заражают на слизистую верхних дыхательных путей, и с момента гибели ее труп остывает при 20°С (оптимум) окружающей среды, через 3 ч после смерти труп вскрывают и берут кровь из сердца, в крови обнаруживают пастереллы в виде биполярной равномерно сформированной псевдопалочки в состоянии выраженной капсуляции и сразу же микробные клетки изолируют от питательного субстрата в физиологический раствор (pH 7,0), где и хранят их в течение 10 суток без доступа атмосферного воздуха в наполненных, запаянных и горизонтально расположенных пастеровских пипетках при температуре 20°С в качестве идентичных исходным по вирулентности (инвазивности), морфологически одинаковых, капсулированных коккобактерий, обособленных поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе. Пастереллы из условий хранения для использования высевают при разведении 10^-1-10^-10 в жидкую питательную среду, имеющую также температуру 20°С, культивируют 9 ч при температуре 37°С и 1 ч при температуре 20°С. Полученную при наименьшем количестве микробных клеток в посеве культуру стандартизированных пастерелл, сохраняя при температуре 20°С к моменту заражения, подтитровывают на птице определенного вида и возраста, определяя минимальную летальную дозу в 0,5 мл или же в 1,0 мл. Заражение птиц осуществляют интраназально путем нанесения на слизистую носовой и ротоглоточной полостей по полдозы в обе ноздри.

В работе целесообразно придерживаться определенного стандарта по массе тела восприимчивого организма, по способу заражения его на слизистую верхних дыхательных путей и заражающему материалу, по температурным параметрам и экспозиции.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

В исследованиях применяли типичный возбудитель пастереллеза птиц Pasteurella multocida А:1 серовара, как наиболее распространенный и повсеместно вызывающий заболевание (по нашим данным в 89% случаев эпизоотий). В частности, использовали коллекционированные в разное время и из разных регионов штаммы: Х-73 - эталонный из коллекции Хеддлестоуна, №55, №115, №712, №915, №1931 - контрольно-производственные из коллекции ВГНКИ ветпрепаратов и пять вирулентных полевых. Свойства этих микроорганизмов изучали посредством световой микроскопии, биологической пробы, изоляции в физиологическом растворе, культивирования на плотной и в жидкой питательных средах. В качестве наиболее восприимчивой к заражению пастереллами лабораторной биомодели использовали организм голубя массой тела 300-350 г. Кроме того, острые опыты ставили на курах и утках массой тела 1700-2000 г. Препараты для микроскопии окрашивали по Гинсу, Романовскому-Гимза, Граму.

Пример 1

Готовили биологически полноценную микробную клетку пастерелл для изоляции от окружающей среды. С этой целью применяемые микроорганизмы соответственно стандартизировали путем пассажа через восприимчивый организм при определенных условиях. В качестве восприимчивого организма использовали голубя массой тела 300-350 г. Организм установленной массы тела заражали остывшей бульонной культурой капсулированных пастерелл первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С, объем 5 мл) в дозе 0,3 мл интраназально - по полдозы в обе ноздри на слизистую носовой и ротоглоточной полостей. Каждого зараженного содержали, и с момента гибели его труп остывал при 15...25 (оптимум 20)°С окружающей среды. С 3 по 4 ч после смерти труп вскрывали, сразу же брали кровь из сердца и в крови выявляли выраженно капсулированные, биполярные, сильновирулентные (с выраженной инвазивностью) пастереллы. Эти результаты аналогичны описанным в предыдущих работах: Патент РФ №2051970 от 10.01.1996 г. и Патент РФ №2123531 от 20.12.1998 г. Микроорганизмы в таком качестве морфологических и вирулентных свойств в крови из сердца павшего считали стандартизированными и биологически полноценными для изоляции от окружающей среды. Полную капсуляцию пастерелл решено использовать как биологический результат их собственной изоляции, сохраняя это свойство микробной клетки факультативного анаэроба в условиях ее анабиоза.

Пример 2

Биологически полноценную по морфологии и вирулентности микробную клетку пастерелл, подготовленную согласно примеру 1, изолировали от окружающего питательного субстрата и атмосферного воздуха. Для этого трупы зараженных голубей, остывшие при 20°С окружающей среды, вскрывали через 3 ч после смерти, сразу же брали кровь из сердца и изолировали от питательного субстрата выраженно капсулированные, биполярные, сильновирулентные (с выраженной инвазивностью) пастереллы на равный по температуре физиологический раствор (2С°С; рН 7,0). Брали 0,2 мл (4 капли) инфицированной крови и вносили в 1,8 мл физраствора, содержимое встряхивали в течение 1 мин и центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость считали изолятом биологически полноценных пастерелл из крови в разведении 10^-1 и использовали для приготовления последующих 10-кратных разведений его на физрастворе в рабочем объеме 5 мл. Пастереллы в разведениях 10^-2, 10^-3 и 10^-4 на физрастворе соответственно изолировали по 0,5-1,0 мл в пастеровские пипетки (предварительно оплавленные по форме ампул с истонченными промежутками или концами в виде капилляров), заполняя по объему, насасывая резиновой грушей, герметично запаивая концы над пламенем огня, дополнительно парафинируя конец последней пайки, после чего горизонтально располагая при 20°С окружающей среды для сохранения микробной клетки, идентичной исходной к моменту использования в течение 10 суток (установленный срок хранения изолята биологически полноценной микробной клетки пастерелл). Морфологически это были грамотрицательные, капсулированные, одинаковые коккобактерии, обособленные поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе, как и описано в предыдущих работах: Патент РФ №2005790 от 15.01.1994 г. и Патент РФ №2051970 от 10.01.1996 г. Все изолированные микроорганизмы сохранялись идентичными исходным соответственно по вирулентности (с выраженной инвазивностью) и культурально-морфологическим свойствам. При этом изоляты пастерелл в посевах на плотной питательной среде давали рост колоний только S-формы. Микроорганизмы в качестве остывшей бульонной культуры бактерий первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С, объем 5 мл), приготовленной путем посева 0,5 мл изолята пастерелл из разведения 10^-3 (около 10 тыс. м.к.) в жидкую питательную среду объемом 4,5 мл, в дозе 0,3 мл (около 300 млн. м.к.) соответственно при введении внутримышечно и интраназально, вызывали гибель голубей в течение 10-14 ч.

Таким образом, биологически полноценная микробная клетка пастерелл, герметично изолированная на физиологическом растворе в ампуле при 20°С (оптимум) окружающей среды, сохраняется в виде обособленной поодиночке, одинаковой, капсулированной коккобактерии, идентичной исходной по культурально-морфологическим и вирулентным свойствам, в течение 10 суток (срок наблюдений).

Результаты культурально-морфологических и биологических исследований микроорганизмов, установленные на дату изоляции, обозначены исходными (контрольными) по отношению к определяемым при последующем изучении изолятов бактерий.

Пример 3

Готовили стандартизированную заражающую культуру пастерелл для постановки острых опытов. Изолят биологически полноценной микробной клетки пастерелл, подготовленной согласно примерам 1 и 2, высевали в равную по температуре жидкую питательную среду (20°С) при разведении в ней 10^-1-10^-10 в рабочем объеме 5 мл и культивировали при 37°С окружающей среды. Исходя из результатов культивирования, работу продолжали с характерно растущей культурой пастерелл в наибольшем титре разведения в посеве микробной клетки изолята бактерий, то есть с культурой пастерелл, растущей в жидкой питательной среде при наименьшем количестве в посеве биологически полноценной микробной клетки изолята бактерий. Бактериологически установили, что при минимальном количестве биологически полноценной микробной клетки посева изолята пастерелл в 5 мл используемой жидкой питательной среды через 9 ч с момента культивирования накапливается около 1 млрд. м.к./мл и наступает фаза замедления роста культуры бактерий. Культуру пастерелл 9-часового возраста, подготовленную по качеству и численности микробной клетки, половинили по объему, одну часть ее продолжали непрерывно культивировать при 37°С, а другую - при 20°С окружающей среды. В результате снижения температуры культивирования пастерелл с 37°С до 20°С происходила полная капсуляция их микробной клетки в течение 1 ч (оптимум). В то же время такая же микробная клетка пастерелл при 37°С окружающей среды так и культивировалась бескапсульной. Ввиду этого, культуру пастерелл 10-часового возраста соответственно в капсульном варианте микробной клетки (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С) и в бескапсульном варианте микробной клетки (все 10 ч при 37°С) апробировали на вирулентность при заражении голубей на слизистую ротоглоточной полости. Результаты изучения культуры пастерелл на вирулентность в зависимости от варианта полученной микробной клетки и техники выполнения способа заражения птиц путем аппликации на слизистую ротоглоточной полости в области небной щели приведены в табл.1.

К представленному в табл.1 следует дополнить, что культура капсулированных пастерелл, остывшая после 9 ч культивирования с 37°С до 20°С в течение 1 ч, вызывала гибель голубей после аппликации через 24-36 ч, а после аппликации и сразу же легкого втирания по слизистой увлажненным ватным тампоном - через 15-24 ч. При этом неостывшая такая же культура бескапсульных пастерелл, так и культивирующаяся при 37°С, вызывала гибель голубей после аппликации с втиранием через 24-36 ч, тогда как после аппликация без последующего втирания не вызывала гибель птиц в течение 72 ч (срок наблюдений).

Таким образом, заразить птиц на слизистую ротоглоточной полости остывшей культурой капсулированных пастерелл первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°C - оптимум) более вероятно, чем такой же культурой бескапсульных пастерелл, непрерывно растущей при 37°С в течение 10 ч. Воспроизвести и даже ускорить заражающий эффект можно, если после аппликации патогенных пастерелл в области небной щели сразу слегка втереть по слизистой увлажненным ватным тампоном.

Исходя из полученных результатов исследований, в качестве стандартизированной заражающей культуры пастерелл для постановки острых опытов решено избрать остывшую культуру капсулированных бактерий первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С), выращенную при наименьшем количестве биологически полноценной микробной клетки изолята пастерелл в посеве в 5 мл жидкой питательной среды.

Пример 4

Устанавливали наиболее близкий к природному (вероятно реальный) путь заражения птиц пастереллезом, уточняя самое уязвимое место внедрения возбудителя болезни в восприимчивый организм. С этой целью стандартизированной заражающей культурой капсулированных пастерелл первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С, объем 5 мл), приготовленной на основе установленного в примерах 1, 2 и 3, в дозе 0,3 мл (около 300 млн. м.к.) инфицировали по 5 голубей следующими способами: 1) интраназально - на слизистую носовой и ротоглоточной полостей; 2) орально - на слизистую ротоглоточной полости в области небной щели путем аппликации; 3) орально - на слизистую ротоглоточной полости в области небной щели путем аппликации с последующим трехкратным легким втиранием увлажненным ватным тампоном; 4) интратрахеально - на слизистую путем впрыскивания в просвет трахеи; 5) перорально - путем введения через зонд в полость зоба. В целях объективной постановки биопроб применяемую культуру пастерелл контролировали на патогенность путем заражения 5 голубей внутримышечно в той же дозе. Результаты опыта оценивали по количеству павших птиц в течение 72 ч (срок наблюдений). При этом трупы птиц подвергали патолого-анатомическому вскрытию, тщательно анатомировали верхние дыхательные пути и пищеварительный тракт, место аппликации пастерелл изучали визуально и бактериологически, а кровь из сердца, паренхиматозные органы и костный мозг исследовали бактериологически.

Стандартизированная заражающая культура капсулированных пастерелл существенно отличалась вирулентностью в зависимости от способа или же пути инфицирования птиц. Результаты исследований приведены в табл.2.

Таблица 2 Биологическая оценка пути и способов заражения птиц возбудителем пастереллеза в опыте на голубях
Путь (способ) заражения	Заражающая доза культуры бактерий, мл	К-во птиц в биопробе	Пало/выжило, гол.	% гибели
Интраназально (на слизистую носовой и ротоглоточной полостей)	0,3	5	5/0	100
Орально (на слизистую в области небной щели)	0,3	5	3/2	60
Орально (на слизистую в области небной щели с легким втиранием)	0,3	5	5/0	100
Интратрахеально (через зияющий просвет на слизистую трахеи)	0,3	5	3/2	60
Перорально (через зонд в полость зоба)	0,3	5	0/5	0
Внутримышечно (инъекция в грудную мышцу)	0,3	5	5/0	100
Примечание: внутримышечно зараженные голуби служили в опыте контрольными.

В биопробах зараженные голуби гибли через 10-48 ч. Скорость гибели птиц отличалась по способу их заражения. Зараженные интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей гибли через 10-14 ч, зараженные орально путем аппликации на слизистую в области небной щели с последующим легким втиранием увлажненным ватным тампоном - через 15-24, а зараженные внутримышечно (контрольные) - через 10-12 ч на 100%. Зараженные орально путем аппликации на слизистую в области небной щели без последующего втирания и зараженные интратрахеально через зияющий просвет на слизистую трахеи гибли через 24-48 ч и причем только на 60%, в связи с чем оба способа признаны менее эффективными и менее значимыми для последующих исследований. Совершенно неэффективным и непредставляющим значения по цели исследований обозначен способ заражения перорально через зонд в полость зоба, так как все птицы в биопробе были живы и клинически здоровы в течение 72 ч (срок наблюдений). В последующих повторных биопробах воспроизводились приблизительно такие же результаты. Следует отметить, что в случае заражения птиц интраназально по полдозы (по 0,15 мл) культуры пастерелл в обе ноздри они гибли обычно через 10-11 ч, то есть также быстро, как и гибли зараженные внутримышечно (контрольные). Очевидно, что таким приемом сразу инфицировали всю слизистую носовой и, по продолжению, ротоглоточной полостей как наиболее уязвимых в случае локализации и последующего внедрения пастерелл. При этом у интраназально зараженных птиц бактериологически выявляли пастереллы в крови уже через 3-4 ч, тогда как у зараженных другими способами - через 8-10 и даже через 24 ч. У зараженных перорально через зонд в полость зоба бактериемия не установлена. В результате патолого-анатомического вскрытия трупов павших в биопробах голубей констатировали серозное воспаление слизистой полостей верхних дыхательных путей и верхней части трахеи. Во всех случаях вскрытия трупов отмечали катарально-геморрагический дуоденит. Из крови сердца, паренхиматозных органов, костного мозга, соскобов слизи с места аппликации микроорганизма во всех случаях бактериологических исследований выделены патогенные пастереллы. У зараженных перорально через зонд в полость зоба и затем по истечении срока наблюдений вынужденно убитых патолого-анатомических изменений не выявлено. В этом случае результаты бактериологических исследований внутренних органов были отрицательными. При анатомировании верхних дыхательных путей птиц отмечали, что носовая полость свободно соединена через хоаны с ротоглоточной полостью, содержит мелкие железы и их секрет, а также большое количество кровеносных капилляров, выполняющих, в частности, функцию очистки и согрева поступающего в дыхательные пути организма атмосферного воздуха. Очевидно, что носовая полость в связи с анатомо-топографическими и физиологическими особенностями является благоприятным местом для локализации пастерелл и внедрения бактерий во внутреннюю среду макроорганизма, в связи с чем значительно уязвима. Причем в заражении интраназально инфицируется слизистая носовой и затем, по продолжению, ротоглоточной полостей, в связи с чем для локализации пастерелл конкретно в этой области применяемая доза этих бактерий должна быть в минимально умеренном количестве жидкости (например, в 0,3, 0,5 или же в 1,0 мл физраствора в зависимости от вида и возраста птицы).

Вышеизложенные результаты исследований свидетельствуют, что верхние дыхательные пути являются природным местом внедрения патогенных пастерелл в организм птиц. Заражение птиц наиболее вероятно, если их инфицировать интраназально, особенно - в обе ноздри. Носовая полость в силу определенных анатомо-топографических и физиологических особенностей, предрасполагающих для локализации и внедрения пастерелл во внутреннюю среду макроорганизма, является наиболее уязвимым местом верхних дыхательных путей. Поскольку носовая полость свободно соединяется через хоаны с ротоглоточной полостью, птицы заражаются и орально вследствие инфицирования слизистой в области небной щели. Однако воспроизвести и даже ускорить заражение птиц при аппликации патогенных пастерелл на слизистую в области небной щели является более вероятным, если после инфицирования сразу же слегка втереть бактерии по слизистой увлажненным ватным тампоном. Напротив, при заражении птиц интраназально эта манипуляция в инфицировании исключается. Заражение птиц чисто орально без втирания по слизистой или же интратрахеально в такой же дозе пастерелл в минимально умеренном количестве жидкости (например, в 0,3 мл) менее вероятно, а перорально через зонд в полость зоба - практически не удается. Поэтому для проведения последующих биологических исследований избран в качестве наиболее эффективного и близкого к природному способ заражения птиц интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей путем введения по полдозы в обе ноздри.

Пример 5

Определяли влияние температуры окружающей среды на вирулентность капсулированных пастерелл при наиболее близком к природному заражении птиц. С этой целью стандартизированной заражающей культурой капсулированных пастерелл 10-часового возраста (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С, объем 5 мл), приготовленной согласно примерам 1, 2 и 3, в дозе 0,3 мл (около 300 млн. м.к.) инфицировали интраназально 15 голубей - по полдозы в обе ноздри на слизистую носовой и ротоглоточной полостей - и сразу же размещали по 5 зараженных птиц при 6...10, 18...22 и 28...32°С окружающей среды. Результаты острого опыта свидетельствовали о выраженной заражающей способности культуры капсулированных пастерелл, подготовленной в оптимальном температурном режиме (20°С) капсуляции микробной клетки и введенной интраназально. Зараженные птицы, содержащиеся в биопробе при изучаемых диапазонах температуры окружающей среды, пали на 100%. Так, в условиях содержания при 6...10°C окружающей среды зараженные гибли не ранее чем через 18 ч, а при 18...22 и, почти также, при 28...32°С - еще быстрее - через 10-15 ч. В повторных биопробах получали приблизительно такие же результаты. Однако в тех случаях, когда приготовленная стандартизированная культура пастерелл по непредвиденной причине была охлаждена на 2 и более °С, то это сказывалось отрицательно на ее заражающей способности - у птиц удлинялся период инфекционного процесса, и даже некоторые из числа зараженных оставались живыми в течение 72 ч (срок наблюдений). Поэтому в целях заражения птиц интраназально необходимо стандартизированную культуру пастерелл и также разведение ее в физрастворе сохранять при стабильной оптимальной температуре (например, при 20°С) к моменту заражения. Влияние температуры окружающей среды на проявление биологических свойств возбудителя пастереллеза подтверждено многократно.

Пример 6

Способ заражения птиц возбудителем пастереллеза для постановки биопробы, включающий получение и введение в восприимчивый организм стандартизированного по морфологии, вирулентности и численности микробной клетки патогенного штамма пастерелл, разрабатывали на основе результатов исследований в пяти вышеизложенных примерах и апробировали в острых опытах на курах и утках. В целях исследований применяли контрольно-производственные штаммы пастерелл ВГНКИ №55 и №712. Для работы готовили стандартизированную культуру пастерелл первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С, в количестве 5 мл) и ее разведение в физиологическом растворе с 10-кратным шагом 10^-1-10^-10 в рабочем объеме 5 мл или же 10 мл, которые сохраняли в водяной бане при температуре 20°С к моменту заражения птиц. В биопробе на птице определенного вида и возраста подтитровывали культуру штамма пастерелл из расчета на каждое ее 10-кратное разведение по 4 птицы и определяли минимальную летальную дозу (МЛД) в 0,5 мл или же в 1,0 мл, устанавливая в ней бактериологически количество микробных клеток. При этом птиц заражали интраназально путем закапывания или же введения в каждое носовое отверстие, удерживая голову клювом вверх, по полдозы (по 0,25 мл или же по 0,5 мл в обе ноздри). Доза распределялась на слизистой носовой и, по продолжению, ротоглоточной полостей. Для сравнения, контрольным было внутримышечное заражение 4 птиц МЛД штамма пастерелл согласно паспортным данным и методике ВГНКИ ветпрепаратов. Острые опыты проходили при 15...25°С окружающей среды. Результаты каждого опыта оценивали по количеству павших и выживших птиц в течение 10 суток биопробы. При этом трупы птиц подвергали патолого-анатомическому вскрытию и бактериологическим исследованиям, тщательно анатомировали верхние дыхательные пути, место аппликации пастерелл изучали визуально и бактериологически.

В результате 4-кратной постановки острого опыта при интраназальном заражении кур и уток установлена идентичная МЛД контрольно-производственных штаммов пастерелл ВГНКИ №55 и №712 по 5000 колониеобразующих единиц (КОЕ) при соответственно положительном результате в контроле (при внутримышечном заражении птиц МЛД - по 50 КОЕ/0,5 мл). В семи острых опытах при определении иммуногенности живых вакцин против пастереллеза птиц установлено, что зараженные интраназально в контрольной группе (невакцинированные) пали на 100%, а в группах вакцинированных в зависимости от способа прививки выжили на 60-100%. Зараженные куры и утки гибли в биопробах через 24-72 ч с характерными клиническими признаками и патолого-анатомическими изменениями для сверхострого течения пастереллеза. Во всех случаях бактериологических исследований от павших птиц выделены вирулентные пастереллы. В итоге было очевидно, что способ заражения птиц возбудителем пастереллеза, выполняемый на основе установленного принципиально близко к природному их заражению, может быть использован в качестве метода биологического контроля иммуногенности вакцин, отличающегося большей объективностью.

Вышеизложенные результаты исследований в шести приведенных примерах, подтверждающих возможность осуществления изобретения, многократно воспроизведены и использованы в целях стандартизации контрольно-производственных штаммов пастерелл, при определении МЛД этих микроорганизмов и иммуногенности противопастереллезных вакцин. Установленные биологические свойства пастерелл представляют существенное значение в целях эпизоотологии и эпидемиологии пастереллезов и близких к ним заболеваний. Морфо- и термолабильность пастерелл, путь заражения восприимчивого организма и температура окружающей среды играют главную роль в проявлении патогенных свойств микроба и в развитии заболевания. Верхние дыхательные пути птиц являются основным природным местом внедрения патогенных пастерелл во внутренюю среду восприимчивого организма. Носовая полость в силу определенных анатомо-топографических и физиологических особенностей, предрасполагающих для локализации и внедрения пастерелл, является наиболее уязвимым местом верхних дыхательных путей. Поскольку носовая полость свободно соединена через хоаны с ротоглоточной полостью, птицы заражаются и орально, но реже - интратрахеально. Заражение пастереллезом через пищеварительный тракт маловероятно, так как заразить восприимчивый организм перорально через зонд не удается. Инфективность (заразительность) умеренно остывшей культуры капсулированных пастерелл (с 37°С до 20°С в течение 1 ч, оптимум), содержащих в капсуле, как известно, фермент инвазивности - гиалуронидазу, выражена сильнее, чем у аналогичной растущей в жидкой питательной среде культуры бескапсульных пастерелл (при 37°С). Однако охлаждение стандартизированной заражающей культуры капсулированных пастерелл на 2 и более °С от оптимального режима (20°С) сказывается отрицательно на инвазивности микробной клетки и, следовательно, на реализации патогенности этих бактерий. Исходя из установленного, предлагаемый способ заражения птиц для постановки биологической пробы содержит существенные отличия научно-практического значения и может быть использован в микробиологии, эпизоотологии, эпидемиологии, биотехнологии и в условиях современной биологической промышленности.

Способ заражения птиц возбудителем пастереллеза для постановки биологической пробы, включающий получение и введение в восприимчивый организм стандартизированного по морфологии, вирулентности и численности микробной клетки патогенного штамма пастерелл, отличающийся тем, что птицу с массой тела 300-350 г заражают на слизистую верхних дыхательных путей и с момента гибели ее труп остывает при 20°С (оптимум) окружающей среды, через 3 ч после смерти труп вскрывают и берут кровь из сердца, в крови обнаруживают пастереллы в виде биполярной равномерно сформированной псевдопалочки в состоянии выраженной капсуляции и сразу же их изолируют от питательного субстрата в физиологческий раствор (рН 7,0), где и хранят в течение 10 суток без доступа атмосферного воздуха в наполненных, запаянных и горизонтально расположенных пастеровских пипетках при температуре 20°С идентичными исходным по вирулентности (инвазивности), морфологически одинаковыми, капусулированными коккобактериями, обособленными поодиночке вследствие распада биполярной структуры микробы в жидкой фазе, которые для использования высевают при разведении 10^-1-10^-10 в жидкую питательную среду, имеющую также температуру 20°С, культивируют 9 ч при температуре 37°С и 1 ч при температуре 20°С и полученную при наименьшем количестве микробных клеток в посеве культуру стандартизированных пастерелл, сохраняя при температуре 20°С к моменту заражения, подтитровывают на птице определенного вида и возраста, определяя минимальную летальную дозу в 0,5 мл или же в 1,0 мл, а заражение птиц осуществляют интраназально путем нанесения на слизистую носовой и ротоглоточной полостей по полдозы в обе ноздри.