Бактерия е.coli, продуцирующая гетерологичный полипептид, и способ продуцирования полипептида

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой бактерию E.coli, которая является дефицитной по хромосомным генам degP и prc, кодирующим протеазы DegP и Prc соответственно, и имеет мутантный ген spr, который включает последовательность супрессора prc E.coli, с точковой мутацией в положении 148, что приводит к замене триптофана на аргинин в положении 148. Культивированием указанной бактерии получают гетерологичный полипептид. Заявленное изобретение позволяет получить гетерологичные полипептиды с высокой степенью эффективности. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 13 ил., 7 табл.

 

Предпосылки создания изобретения

1. Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к использованию дефицитных по протеолизу бактериальных штаммов-хозяев. Более конкретно, настоящее изобретение относится к указанным штаммам-хозяевам, у которых предотвращено разложение гетерологичного полипептида и увеличен выход таких полипептидов.

2. Описание прототипов изобретения

Штаммы E.coli, дефицитные по протеазам или генам, контролирующим регуляцию протеаз, являются известными. См., например, заявку Beckwith & Strauch, WO 88/05821, опубликованную 11 августа 1988; Chaudhury & Smith, J.Bacteriol., 160: 788-791 (1984); Elish et al., J.Gen.Microbiol., 134:1355-1364 (1988); Baneyx & Georgiou, "Expression of proteolytically sensitive polypeptides in Esherichia coli", Stability of Protein Pharmaceuticals, Vol.3: Chemical and Physical Pathways of Protein Degradation, Ahern and Manning, eds. (Plenum Press, New York, 1992), p.69-108.

Некоторые из этих штаммов были использованы в целях эффективного продуцирования чувствительных к протеолизу белков, в частности белков, которые, возможно, имеют лекарственное или коммерческое значение. В патенте США № 5508192 (Georgiou et al.) описано конструирование дефицитных по множеству протеаз и/или дефицитных по белкам теплового шока бактериальных хозяев. Такими хозяевами являются бактерии, дефицитные по одной, двум, трем или четырем протеазам, и бактерии с одной протеазой, которые также несут мутацию в гене rpoH. Примерами описанных штаммов, дефицитных по протеазе, являются штаммы, у которых отсутствуют гены degP, ompT, ptr3 и/или prc(tsp), при этом сообщалось, что degP, rpoH-штамм продуцирует высокие титры рекомбинантных белков в E.coli. Park et al. Biotechnol. Prog., 15:164-167 (1999) также сообщали, что штамм (НМ114), дефицитный по двум протеазам клеточной оболочки (degP, prc), растет быстрее и продуцирует больше гибридных белков, чем другие штаммы, дефицитные по большему числу протеаз. Эти авторы заявили, что за 29 часов указанный штамм растет до плотности 47,86 г/л из расчета сухой массы клеток в условиях культивирования с подпиткой и с использованием рН-стата. Продуцированным белком был гибридный белок, А-β-лактамазная активность которого на 30% превышала β-лактамазную активность, наблюдаемую у его родительского штамма кS272.

Белок Prc был сначала выделен Hara et al., J. Bacteriol., 173:4799-4813 (1991) как периплазматическая протеаза, которая расщепляет карбокси-конец периплазматического белка 3, связывающегося с пенициллином (РВР3). Затем этот белок был также идентифицирован как протеаза, которая селективно разлагает белки с неполярным С-концом, и был переименован в Tsp (Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:295-299 (1992)). Было показано, что ген prc кодирует белок размером 75 кДа, который необходим для защиты клеток от комбинированного теплового и осмотического шока (Hara et al., см. выше). Было подтверждено, что предпочтительность к субстрату определяется С-концевыми последовательностями (Keiler et al., Protein Sci. 4: 1507-1515 (1995)). Уровень протеолиза зависит от идентичности остатков или функциональных групп у С-конца белка-субстрата. Присутствие свободной δ-карбоксильной группы является важным фактором для определения эффективности расщепления близкородственных пептидов с неполярными С-концевыми последовательностями протеазой Prc.

Prc-гомологи были идентифицированы в дивергентной группе прокариотов, включая несколько цианобактерий (Brand et al., Plant Mol. Biol., 20: 481-491 (1992); Shestakov et al., J. Biol. Chem., 269:19354-19359 (1994)), Neisseria gonorrhoeae (Black et al., J. Bacteriol., 177:1952-1958 (1995)), Haemophilus influenzae (Fleischmann et al., Science, 269:496-512 (1995)) и Bartonella bacilliformis (GenBank, регистрационный номер L37094). Домен в белках семейства Prc аналогичен домену в белках, связывающихся с ретинолом, что указывает на присутствие общего домена укладки, который может образовывать "карман" связывания в этих белках для гидрофобных субстратов (Silber et al., см. выше; Shestakov et al., см. выше).

Hara и др. (см. выше) обнаружили, что терморезистентные ревертанты prc-мутантов содержат мутации экстрагенного супрессора (spr). Кроме того, они установили, что продукт гена spr дикого типа представляет собой липопротеин в оболочечной фракции. Они также высказали предположение, что ген spr дикого типа может кодировать фермент, гидролизующий пептидогликан (Hara et al., Microbiol Drug Resistance, 2:63-72 (1996)). Было установлено, что если ген spr не является функциональным в prc-плюс-окружении, то супрессором для spr-мутации является РВР7, другой связывающийся с пенициллином белок (Hara et al., см. выше). Клонирование spr и получение prc-мутанта, в котором Spr не разлагается под действием протеазы, было также описано Hara et al., в Abstract for Table Ronde Roussel Uclat no.86, Versailles, May 1997, где авторы пришли к заключению, что prc и spr являются супрессорами по отношению друг к другу.

Были также выделены три мультикопийных prc супрессора с использованием условно-летального фенотипа prc(tsp)-дефицитного штамма E.coli (Bass et al., J.Bacteriol., 178: 1154-1161 (1996)). Ни один из этих супрессоров не является родственным гену spr. Одна серия этих супрессоров представляет собой два предполагаемых тандемно расположенных гена протеазы, которые были картированы в локусе 72,5 min на хромосоме. Эти два гена являются гомологами htrA, кодирующими белки, которые на 58 и 35% идентичны соответственно сериновой протеазе HtrA (DegP). Другим типом идентифицированного супрессора является ген dksA (супрессор dnak), который также представляет собой многокопийный супрессор, дефицитный по генам теплового шока dank, dnaj и grpE. Ген dksA был также независимо выделен как многокопийный супрессор с мутацией mukB, которая необходима для хромосомного распределения. Третьим типом супрессора является ген усеченного липопротеина А (rlpA).

Очевидно, что ген degP регулирует синтез протеазы клеточной оболочки DegP (HtrA). degP-дефицитный мутант был впервые сконструирован Beckwith и Strauch (см. выше) и снова введен в хромосому E.coli. HtrA имеет большую молекулярную массу, составляющую примерно 500 кДа, и представляет собой белок теплового шока, протеолитическая активность которого играет важную роль в выживании E.coli при высоких температурах, таких как температуры выше 42°С (Skorko-Glonek et al., Gene, 163: 47-52 (1995)). Ряд обычно нестабильных белков клеточной оболочки может быть стабилизирован введением degP-мутации (Beckwith & Strauch, Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 85:1676-1570 (1988)). Недавно сообщалось, что при наблюдении под электронным микроскопом и в химическом анализе на перекрестное связывание белок HtrA ведет себя как додекамер, состоящий из двух "стэков" гексамерных колец (Kim et al., J.Mol.Biol. 294: 1363-1374 (1999)). Развертывание молекул белковых субстратов, например, под действием высоких температур или посредством восстановления дисульфидных связей имеет важное значение для их проникновения во внутреннюю полость двойного кольцеобразного HtrA, где может происходить расщепление пептидных связей (Kim et al., см. выше).

Многие гетерологичные полипептиды были продуцированы в различных дефицитных по протеазам штаммах. Однако многие из этих штаммов дают относительно низкий титр продукта и/или имеют плохой рост. Поэтому необходимо получить такой дефицитный по протеазам штамм, который не продуцирует усеченного продукта и дает высокий титр этого продукта.

Краткое описание изобретения

Для достижения вышеуказанных целей было заявлено настоящее изобретение. В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к штаммам E.coli, которые являются дефицитными по хромосомным генам degP и prc, кодирующим протеазы DegP и Prc, соответственно, и имеют или включают мутантный ген spr, продукт которого ингибирует рост штаммов, обнаруживающих фенотип, несущий prc-мутанты. Предпочтительно, чтобы этот штамм не был дефицитным по хромосомному гену ptr3, кодирующему протеазу III, и/или по хромосомному гену ompT, кодирующему протеазу OmpT. Предпочтительно этот штамм E.coli сконструируют путем введения мутантного гена spr в degPΔ-prcΔ-штамм для его выживания в стационарной фазе процесса ферментации E.coli при высокой клеточной плотности.

В другом варианте осуществления изобретения указанный штамм содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, гетерологичный для этого штамма, предпочтительно чувствительный к протеолизу полипептид, а более предпочтительно эукариотический полипептид.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу продуцирования гетерологичного полипептида, то есть полипептида, который является гетерологичным для этого штамма. Этот способ предусматривает сначала культивирование штамма E.coli, который является дефицитным по хромосомному гену prc, кодирующему протеазу Prc, и имеет или включает мутантный ген spr, продукт которого ингибирует рост штаммов, обнаруживающих фенотип, несущий prc-мутанты. Этот штамм также включает нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гетерологичный полипептид. Культивирование осуществляют так, чтобы оно приводило к экспрессии данной нуклеиновой кислоты. Во второй стадии этого способа указанный полипептид выделяют из этого штамма, либо из цитоплазмы, либо из периплазмы, либо из культуральной среды, предпочтительно из периплазмы или культуральной среды, а наиболее предпочтительно из цельного бульона для ферментации. Предпочтительно указанный полипептид представляет собой лиганд Аро2 или антитело, включая фрагмент антитела.

Краткое описание графического материала

На фигурах 1А-1Е представлены полная нуклеотидная последовательность и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1 и 2 соответственно) экспрессирующего кластера, используемого для получения рY0317, плазмиды для продуцирования анти-VEGF Fab. Остатки, обозначенные жирным шрифтом, означают CDR-остатки, происходящие от исходного мышиного антитела А.4.6.1. Остатки, обозначенные курсивом и подчеркнутые, означают каркасные мышиные остатки, которые необходимы для связывания с антигеном.

На фигурах 2А и 2В представлена карта плазмиды рY0317 (фиг. 2А), а также показано конструирование плазмиды рY0317tet20 (фиг. 2А и 2В).

На фигуре 3 представлена карта плазмиды рАРАро2-Р2RU.

На фигуре 4 представлена нуклеотидная последовательность кДНК человеческого лиганда Аро-2 (SEQ ID NO:3) и его аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4). "N" в положении нуклеотида 447 (в SEQ ID NO:3) указывает на то, что нуклеотидным основанием может быть "Т" или "G".

На фигуре 5 представлена диаграмма дериватизации штаммов E.coli 59А7, 49А5 и 43Н1.

На фигуре 6 показан двумерный гель как продукт ферментации клеточного осадка штамма 49А5 (prc-плюс-штамма), экспрессирующего гибрид анти-CD18 rhuFab'2-LZ в виде гетерологичного полипептида. Все LC-пятна обведены кружками.

На фигуре 7 показан двумерный гель как продукт ферментации клеточного осадка штамма 43Н1 (prc-минус-штамма), экспрессирующего гибрид анти-CD18 rhuFab'2-LZ в виде гетерологичного полипептида. В этом геле продукты LC-расщепления отсутствуют.

На фигуре 8 показано пять пиков, полученных в анализе с использованием АМЕ5^ТМ/обращенно-фазовых колонок, и при этом показано сравнение распределения разделенных таким образом фрагментов антитела rhuFab'2-LZ(хCD18). По оси "у" отложена площадь под конкретными пиками, 1-5. На оси "х" показаны три штамма-продуцента rhuFab'2-LZ(хCD18): 43Н11 (prc-), 49А5 (prc+) и 58Н2 (prc-репарированный 43Н1). Жирно очерченный серый столбец соответствует LC-115, черный столбец соответствует LC, белый столбец соответствует LC-димеру, серый столбец с тонкой штриховкой соответствует Fab-подобной молекуле, а столбец с жирной штриховкой соответствует Fab'2-LZ. Из графика можно видеть, что пик 1 (LC-115) отсутствует в штамме с prc-делецией.

На фигуре 9 показаны профили роста, полученные при стандартной ферментации с высокой клеточной плотностью, prc-минус-штамма без мутантного гена spr (58В3, трансформированного рS1130) (квадраты), и prc-минус-штамма с мутантным геном spr (59А7, трансформированного рS1130) (ромбы), где указанные кривые выражают зависимость OD550 от времени ферментации (часы).

На фигуре 10 показана гуманизированная последовательность LC каппа-цепи антитела против CD18 (SEQ ID NO:5), при этом были вычислены значения pI предполагаемых продуктов разложения LC. Расщепления, отмеченные косой чертой, были подтверждены масс-спектрометрией. См. ниже таблицу 3.

На фигуре 11 показан гель с семью дорожками, полученный с использованием различных хозяев и трех типов белков. Этот гель показал, что LC-"клип" (продукт расщепления) размером 20 кД (LC 182) отсутствует в клетках штамма 43Н1 (prc-), экспрессирующего анти-VEGF Fab и гибридные молекулы Fab'2-LZ против тканевого фактора. Дорожка 1 соответствует фрагменту F(ab)'2-LZ 6хHis против тканевого фактора, штамм-хозяин 33В6; дорожка 2 соответствует фрагменту F(ab)'2-LZ 6хHis против тканевого фактора, штамм-хозяин 43Н1; дорожка 3 соответствует фрагменту анти-CD18 F(ab)'2-LZ 6хHis, штамм-хозяин 49А5; дорожка 4 соответствует фрагменту анти-CD18 F(ab)'2-LZ 6хHis, штамм-хозяин 41Н1; дорожка 5 соответствует рВR322, штамм-хозяин 49А5; дорожка 6 соответствует анти-VEGF Fab, штамм-хозяин 43Н1; и дорожка 7 соответствует анти-VEGF Fab, штамм-хозяин 43Е7. Обозначения НС и Н означают тяжелую цепь, а LC и L означают легкую цепь.

На фигуре 12 показан двумерный гель, полученный в шейкерной колбе для клеточного осадка штамма 59А7 (prc-минус-штамма), экспрессирующего анти-VEGF Fab (рY0317tet20) в виде гетерологичного полипептида. В этом геле продукты расщепления LC и два фрагмента расщепления НС, обнаруженные в prc-плюс-клетках, отсутствуют. Также показаны только два отдельных НС-"клипа" (фрагмента расщепления), детектированные в 59А7, которые представляют собой продукты расщепления либо OmpT, либо Рtr3.

На фигуре 13 показан двумерный гель, полученный в шейкерной колбе для клеточного осадка штамма 60С1 (prc-плюс-штамма), экспрессирующего анти-VEGF Fab (рY0317tet20) в виде гетерологичного полипептида. В этом геле было детектировано множество фрагментов расщепления LC и два фрагмента расщепления НС.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Определения

Используемый здесь термин "полипептид" относится в основном к пептидам и к белкам, имеющим длину примерно в более чем десять аминокислот. "Гетерологичными" полипептидами считаются полипептиды, которые являются чужеродными для используемой клетки-хозяина, такие как человеческий белок, продуцируемый E.coli. Хотя указанный полипептид может быть прокариотическим или эукариотическим, однако предпочтительным является эукариотический полипептид, а более предпочтительным - полипептид млекопитающего.

Примерами полипептидов млекопитающих являются такие молекулы, как, например, ренин, гормон роста, включая человеческий гормон роста; бычий гормон роста; фактор высвобождения гормона роста; паратиреоидный гормон; тиреоидстимулирующий гормон; липопротеины; 1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин, тромбопоэтин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевый фактор и фактор фон Виллебранда; антикоагулянты, такие как Белок С; атриальный натрийуретический фактор; поверхностно-активное вещество на поверхности легких; активатор плазминогена, такой как урокиназа или активатор плазминогена человеческой мочи или тканевый активатор плазминогена (t-РА); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; фактор некроза опухоли -альфа и -бета; антитела против домена(ов) ЕrbB2, такие как 2С4 (WO 01/00245; гибридома АТСС НВ-12697), которые связываются с областью внеклеточного домена ЕrbB2 (например, любые один или несколько остатков в этой области примерно от остатка 22 до остатка 84 ЕrbB2 включительно), энкефалиназа; альбумин сыворотки, такой как альбумин сыворотки человека; фактор ингибирования мюллеровых протоков; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; пептид, ассоциированный с мышиным гонадотропином; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; ингибин; активин; васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; интегрин; белок А или D; ревматоидные факторы; нейротропный фактор, такой как нейротропный фактор головного мозга (BDNF), нейротропин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервной ткани, такой, как NGF; кардиотропины (фактор гипертрофии сердца), такие как кардиотропин-1 (СТ-1); тромбоцитпроизводный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как α-FGF и β-FGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 или TGF-5; инсулиноподобный фактор роста -I и -II (IGF-1 и IGF-II); дес(1-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга); белки, связывающиеся с инсулиноподобным фактором роста; белки CD, такие как CD-3, CD-4, CD-8 и CD-19; эритропоэтин; остеоиндуцирующие факторы; иммунотоксины; белок морфогенеза кости (ВМР); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; альбумин сыворотки, такой как альбумин человеческой сыворотки (HSA) или альбумин бычьей сыворотки (BSA); колониестимулирующие факторы (CSF), например М-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например IL-1-IL-10; антитело против HER-2; лиганд Аро2; супероксиддисмутаза; Т-клеточные рецепторы; мембранные белки клеточной поверхности; фактор, ускоряющий распад; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки вируса СПИДа; транспортные белки; "хоминг"-рецепторы; адрессины; регуляторные белки; антитела и фрагменты любого из перечисленных выше полипептидов.

Предпочтительными и представляющими интерес полипептидами являются такие полипептиды, как HSA, BSA, антитело против IgE, антитело против CD20, антитело против IgG, t-PA, gp120, антитело против CD11a, антитело против CD18, 2C4, антитело против VEGF, VEGF, TGF-бета, активин, ингибин, антитело против HER-2, ДНКаза, IGF-1, IGF-II, IGF-1 головного мозга, гормон роста; цепи релаксина, фактор высвобождения гормона роста; цепи инсулина или проинсулин, NGF, NT-3, BDNF, лиганд Аро2 и урокиназа. Особенно предпочтительными полипептидами млекопитающих являются антитела, включая полноразмерные антитела, фрагменты антител и лиганд Аро2. Более предпочтительными антителами являются человеческие или гуманизированные антитела. Такими антителами являются, например, анти-IgE, анти-IgG, анти-Her-2, анти-CD11а, анти-CD18, анти-CD20 и анти-VEGF антитела, антитело 2С4, BSA или HSA. Еще более предпочтительным является анти-CD18 антитело, анти-VEGF антитело, антитело против тканевого фактора, антитело 2С4, анти-Her-2 антитело, анти-CD20 антитело, анти-CD40 антитело или анти-CD11а антитело. Фрагментами антитела, входящими в определение полипептида, являются, например, Fab, Fab', Fab'2 или Fab'2-лейциновая молния (LZ), а наиболее предпочтительно такими фрагментами являются анти-CD18 Fab'2-LZ, Fab'2 против тканевого фактора-LZ-6хhis, анти-VEGF Fab, his-меченный анти-CD18 Fab'2-LZ и lys-меченный анти-CD18 Fab'2-LZ.

Термин "чувствительный к протеолизу", используемый здесь по отношению к полипептидам, относится к полипептидам, которые имеют предрасположенность к расщеплению, являются восприимчивыми к расщеплению или расщепляются одной или несколькими протеазами E.coli либо в нативном состоянии или во время секреции.

Ферментация или культивирование при "высокой плотности клеток" означает процесс, при котором обычно периодически добавляют сначала несколько микроэлементов для роста клеток, а затем для регуляции добавления глюкозы используют отношение между поглощением О₂ и поглощением глюкозы, благодаря которому можно легко измерить уровень растворенного кислорода. Для достижения более высокой клеточной плотности можно непрерывно добавлять аммиак, а для поддержания клеточного роста на некоторых стадиях ферментации могут быть добавлены дополнительные микроэлементы (например, Р, К, S и Mg), как подробно описано в примерах, приведенных ниже.

Выражение "мутантный ген spr, продукт которого ингибирует рост штаммов, обнаруживающих фенотипы, несущие prc-мутанты", означает супрессор prc (spr) E.coli (кодирующий Prc^sup), имеющий последовательность, описанную Hara et al., 1996 (см. выше), или супрессор, который является мутированным при условии, что указанный генный продукт функционирует как супрессор роста штаммов с фенотипом prc-мутантов. Предпочтительной мутацией является точковая мутация. Более предпочтительной является точковая мутация W148R, где кодон TGG заменен на CGG, что приводит к замене триптофана аргинином в положении аминокислоты 148.

Используемый здесь термин "антитело" имеет широкий смысл и конкретно означает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные, по крайней мере, из двух интактных антител, и фрагменты антител при условии, что они обладают нужной биологической активностью.

Используемый здесь термин "моноклональное антитело" означает антитело, полученное из популяции в основном гомогенных антител, то есть отдельных антител, составляющих данную популяцию, которые являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются в высокой степени специфическими, то есть они направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Помимо своей специфичности моноклональные антитела имеют то преимущество, что они могут быть синтезированы без примеси других антител. Термин "моноклональный" указывает на характер антитела, полученного в основном из гомогенной популяции антител, и не должен обязательно указывать на какой-либо конкретный способ его получения. Так, например, моноклональные антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены с использованием гибридомной техники, впервые описанной Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), либо оно может быть получено методом рекомбинантных ДНК (см, например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" могут быть также выделены из фаговых библиотек с использованием техники, описанной, например, Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol.Biol, 222:581-597 (1991).

Конкретно описанные здесь моноклональные антитела считаются "химерными" антителами, если в них часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующей последовательности в антителах, происходящих от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как другая(ие) цепь(и) идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующей последовательности в антителах, происходящих от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они обладают нужной биологической активностью (патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851-6855 (1984)). Представляющими интерес химерными антителами являются "приматизированные" антитела, содержащие вариабельные последовательности антигенсвязывающего домена, происходящие от приматов, не являющихся человеком (например, низших узконосых обезьян, человекообразных обезьян и т.п.) и последовательности человеческой константной области.

"Фрагменты антитела" содержат часть интактного антитела, а предпочтительно его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примерами фрагментов антитела являются Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv-фрагменты; диантитела, линейные антитела; одноцепочечные молекулы антитела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антитела.

"Интактным" антителом является антитело, которое содержит антиген-связывающую вариабельную область, а также константный домен легкой цепи (C_L) и константные домены тяжелой цепи, С_Н1, С_Н2 и С_Н3. Константными доменами могут быть константные домены нативной последовательности (например, константные домены нативной последовательности человека) или вариант их аминокислотной последовательности. Предпочтительным интактным антителом является антитело с одной или несколькими эффекторными функциями.

"Эффекторные функции" антитела означают биологические активности, которые приписываются Fc-области (Fc-область нативной последовательности или Fc-область с модификацией в аминокислотной последовательности) антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются связывание с С1q, комплемент-зависимая цитотоксичность, связывание с Fc-рецептором, антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, негативная регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора, BCR) и т.п.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела интактные антитела могут относиться к различным "классам". Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть, кроме того, подразделены на "подклассы" (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам антител, обозначены α, δ, ε, γ и μ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов различных классов хорошо известны.

Термины "антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" и "ADCC" означают клеточно-опосредованную реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR)(например, природные киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и тем самым вызывают лизис этой клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие ADCC, клетки - природные киллеры, экспрессируют лишь FcRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcRI, FcRII и FcRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках систематизирована в таблице 3 на странице 464 работы Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991). Для оценки представляющей интерес ADCC-активности молекулы может быть осуществлен in vitro анализ на ADCC, такой как анализ, описанный в патентах США № 5500362 или 5821337. Эффекторными клетками, подходящими для таких анализов, являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и клетки - природные киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно, ADCC-активность представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, на модели животного, как описано, например, Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95:652-656 (1998).

"Человеческие эффекторные клетки" представляют собой лейкоциты, экспрессирующие один или несколько FcR и осуществляющие эффекторные функции. Предпочтительными являются клетки, экспрессирующие, по крайней мере, FcRIII и осуществляющие эффекторную функцию ADCC. Примерами человеческих лейкоцитов, опосредующих ADCC, являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), клетки - природные киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы, при этом предпочтительными являются МКПК и NK. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природных источников, например из крови или из МКПК, как описано в настоящей заявке.

"Нативные антитела" обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины, имеющие размер примерно в 150000 дальтон и состоящие из двух идентичных легких цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (Н). Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, и число дисульфидных связей для тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулина варьируется. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет дисульфидные мостики, расположенные внутри цепи на соответствующем расстоянии друг от друга. Каждая тяжелая цепь на своем одном конце имеет вариабельный домен (V_H), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V_L), а на другом конце константный домен. Константный домен легкой цепи находится на одном уровне с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи находится на одном уровне с вариабельным доменом тяжелой цепи. Очевидно, что конкретные аминокислотные остатки образуют область контакта между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

Термин "вариабельный" означает, что некоторые части вариабельных доменов у различных антител сильно отличаются по своей последовательности, и этим фактом обусловлено связывание и специфичность каждого конкретного антитела с его конкретным антигеном. Однако такая вариабельность неравномерно распределена по вариабельным доменам антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями, находящимися в вариабельных доменах как легкой, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Каждый вариабельный домен нативной тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR, образующие, главным образом, конфигурацию β-складчатого листа, и связанные тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие часть β-складчатой структуры. Эти гипервариабельные области в каждой цепи расположены вместе в непосредственной близости от FR и вместе с гипервариабельными областями другой цепи они участвуют в образовании антиген-связывающего сайта антитела (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

Используемый здесь термин "гипервариабельная область" означает аминокислотные остатки антитела, ответственные за связывание с антигеном. Гипервариабельная область обычно содержит аминокислотные остатки из "области, определяющей комплементарность" или "CDR" (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи, и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)), и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Остатки "каркасной области" или "FR" представляют собой остатки вариабельного домена, не являющиеся остатками определенной здесь гипервариабельной области.

Гидролиз антител папаином приводит к образованию двух идентичных ангигенсвязывающих фрагментов, называемых "Fab"-фрагментами, каждый из которых имеет антигенсвязывающий сайт, и другого "Fc"-фрагмента, название которого указывает на его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином приводит к образованию F(ab')₂-фрагмента, который имеет два антигенсвязывающих сайта и который, кроме того, способен перекрестно связываться с антигеном.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт узнавания антигена и антигенсвязывающий центр. Эта область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, тесно и не-ковалентно связанных друг с другом. Указанная область имеет такую конфигурацию, при которой взаимодействие трех гипервариабельных областей каждого вариабельного домена определяет антигенсвязывающий центр на поверхности димера V_H-V_L. В целом, шесть гипервариабельных областей сообщают данному антителу специфичность связывания с антигеном. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv-фрагмента, содержащая только три гипервариабельные области, специфичные к антигену) обладает способностью распознавать антиген и связываться с антигеном, хотя и с более низкой аффинностью, чем целый сайт связывания.

Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что они имеют несколько дополнительных остатков у карбокси-конца домена тяжелой цепи СН1, включая один или несколько цистеинов шарнирной области антитела. Fab'-SH имеет то же определение, что и Fab', где цистеиновый(е) остаток(ки) константных доменов несет(ут), по крайней мере, одну свободную тиоловую группу. F(ab')₂-фрагменты антитела были сначала продуцированы как пары Fab'-фрагментов, между которыми находятся цистеиновые остатки шарнирной области. Также известны и другие типы химического связывания фрагментов антитела.

"Легкие цепи" антител, происходящих от позвоночных любого вида, могут быть отнесены к одному из двух явно выраженных типов, названных каппа (6) и лямбда (8), исходя из аминокислотных последовательностей их константных доменов.

"Одноцепочечные Fv-фрагменты" или "оцFv-фрагменты" антитела включают V_H- и V_L-домены антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Предпочтительно, чтобы полипептид Fv, кроме того, содержал полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, что позволяет оцFv образовывать нужную структуру для связывания с антигеном. Описание оцFv см. в Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg & Moore eds. (Springer-Verlag, New York, 1994), pp.269-315, оцFv-фрагменты антитела против ErbB2 описаны в WO 93/16185; в патенте США № 5571894, и в патенте США № 5587458.

Термин "диантитела" означает небольшие фрагменты антител с двумя антиген-связывающими сайтами, фрагменты которых содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в той же самой полипептидной цепи (V_H-V_L). При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы соединять эти два домена на одной и той же цепи, эти домены вынуждены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Более подробно диантитела описаны, например, в ЕР 404097; WO 93/11161; и в работе Hollinger et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 90: 6444-6448 (1993).

"Очеловеченные" (гуманизированные) формы не-человеческих антител (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую от не-человеческого иммуноглобулина. В большинстве случаев "очеловеченные" антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки от гипервариабельной области реципиента заменены остатками от гипервариабельной области не-человеческого антитела (антитела-донора), такого как антитела мышиного, крысиного, кроличьего антитела или антитела примата, не являющегося человеком, которое обладает нужной специфичностью, аффинностью и активностью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина могут быть заменены соответствующими остатками не-человеческого антитела. Кроме того, "очеловеченные" антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации вносят для улучшения свойств антитела. Вообще говоря, "очеловеченные" антитела могут включать, в основном, весь, по крайней мере, один и обычно два вариабельных домена, в которых все или почти все гипервариабельные петли являются петлями не-человеческого иммуноглобулина, и все или почти все FR являются каркасными областями последовательности человеческого иммуноглобулина. "Очеловеченное" антитело может также, но необязательно, содержать, по крайней мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), а обычно - константную область человеческого иммуноглобулина. Более подробное описание см. в работе Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 322: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

"Выделенное" антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано, выделено и/или отделено от компонента его природного окружения. Примесными компонентами его природного окружения являются материалы, которые негативно влияют на диагностическое или терапевтическое использование указанного антитела, и такими компонентами могут быть ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанное антитело может быть очищено (1) на более чем 95% по массе антитела, как определено по методу Лоури, а наиболее предпочтительно более чем на 99 мас.%, (2) до степени, достаточной для получения, по крайней мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашкой, или (3) до гомогенности посредством электрофореза в ПААГ с ДСН в восстанавливающих или в не-восстанавливающих условиях с использованием окрашивания кумасси синим или предпочтительно серебром. Выделенным антителом является антитело, полученное in situ в рекомбинантных клетках, поскольку в нем отсутствует, по крайней мере, один компонент его природного окружения. Однако обычно выделенное антитело получают с проведением, по крайней мере, одной стадии очистки.

Экспрессионные "регуляторные последовательности" представляют собой ДНК-последовательности, необходимые для экспрессии функционально присоединенной кодирующей последовательности в данном огранизме-хозяине. Такими регуляторными последовательностями, подходящими для прокариотов, являются промотор, необязательно операторная последовательность и сайт связывания с рибосомой.

Нуклеиновая кислота является "функционально присоединенной", если она находится в функциональной зависимости от другой последовательности нуклеиновой кислоты. Так, например, ДНК для пре-последовательности или секреторной лидерной последовательности является функционально присоединенной к ДНК полипептида, если она экспрессируется как пре-белок, который участвует в секреции этого полипептида; промотор является функционально присоединенным к кодирующей последовательности, если он влияет на транскрипцию данной последовательности; или сайт связывания с рибосомой является функционально присоединенным к кодирующей последовательности, если его локализация облегчает трансляцию. В общих чертах, термин "функционально присоединенный" означает, что указанные присоединенные ДНК-последовательности являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности они являются смежными и находится в одной и той же рамке считывания. Присоединение осуществляют путем лигирования в соответствующих рестрикционных сайтах. Если такие сайты отсутствуют, то в соответствии с общепринятой практикой могут быть использованы синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры.

Используемые здесь термины "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" являются взаимозаменяемыми, и все указанные определения включают потомство. Таким образом, понятия "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают первичную клетку или происходящие от нее клеточные культуры независимо от числа пересевов. Следует также отметить, что все потомство может не быть абсолютно идентичным по составу ДНК из-за специально введенных или случайных мутаций. Эти понятия включают мутантное потомство, которое обладает теми же самыми функциями или биологической активностью, выявленными для первоначально трансформированной клетки. В случае, когда указанные определения имеют другой смысл, то он будет ясен из контекста.

Способ осуществления настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к штаммам E.coli, которые являются дефицитными по хромосомным degP и prc, кодирующим протеазы DegP и Prc соответственно, и имеют мутантный ген spr, продукт которого ингибирует рост штаммов, обнаруживающих фенотип, несущий prc-мутанты. Этот штамм может быть, но необязательно, дефицитным по хромосомному гену ptr3, кодирующему протеазу III, и/или по хромосомному гену ompT, кодирующему протеазу OmpT.

В другом варианте осуществления изобретения указанный штамм содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, гетерологичный для данного штамма. Этот штамм предпочтительно трансформируют нуклеиновой кислотой, которая предпочтительно представляет собой ДНК (кДНК или геномную ДНК), путем использования рекомбинантного экспрессирующего вектора.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу продуцирования указанного гетерологичного полипептида. В этом способе вышеуказанный штамм E.coli, который также содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую данный полипептид, культивируют так, чтобы экспрессировалась указанная нуклеиновая кислота. Затем из этого штамма выделяют указанный полипептид. Такое выделение может быть осуществлено из периплазмы или из культуральной среды этого штамма. Культивирование предпочтительно осуществляют в ферментере, а более предпочтительно в условиях ферментации с высокой клеточной плотностью.

Для этого используют соответствующие параметры культивирования, и продуцирование полипептида осуществляют стандартными методами в соответствии с процедурами, описанными ниже.

А. Выбор нуклеиновой кислоты и ее модификация

Нуклеиновой кислотой, кодирующей представляющий интерес полипептид, обычно является РНК, кДНК или геномная ДНК, происходящая от любого источника, при условии, что она кодирует нужный(е) полипептид(ы). Методы отбора нуклеиновой кислоты, подходящей для экспрессии гетерологичных полипептидов (включая их варианты) в E.coli, хорошо известны.

При продуцировании моноклональных антител ДНК, кодирующая моноклональные антитела, может быть легко выделена и секвенирована в соответствии со стандартными процедурами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Предпочтительным источником такой ДНК могут служить клетки гибридомы. После выделения ДНК может быть встроена в экспрессирующие векторы, которые затем трансформируют в описанные здесь бактериальные клетки-хозяева для синтеза моноклональных антител в указанных рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантная экспрессия ДНК, кодирующей антитело, в бактериях описана в обзорных статьях Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

Методы "очеловечивания" (гуманизирования) не-человеческих антител описаны в литературе. "Очеловеченное" антитело предпочтительно имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в это антитело из источника, не являющегося человеческим антителом. Эти не-человеческие аминокислотные остатки часто называют "импортными" остатками, которые обычно происходят от "импортного" вариабельного домена. "Очеловечивание" антитела может быть осуществлено в основном методом, описанным Winter и сотрудниками (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)) путем замены последовательностей гипервариабельной области соответствующими последовательностями человеческого антитела. В соответствии с этим такие "очеловеченные" антитела представляют собой химерные антитела (патент США № 4816567), где в основном участок, меньший чем интактный человеческий вариабельный домен, заменен соответствующей последовательностью, происходящей от не-человеческого антитела. На практике "очеловеченные" антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельной области, а возможно и некоторые остатки FR (каркасной области) заменены остатками от аналогичных участков антител грызунов.

Выбор человеческих вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепи, используемых для получения "очеловеченных" антител, имеет очень важное значение для снижения антигенности. В соответствии с так называемым "методом наилучшего приближения" последовательность вариабельного домена антитела грызунов скринируют по всей библиотеке известных последовательностей вариабельного домена человека. Человеческая последовательность, которая является наиболее близкой последовательности грызунов, далее будет называться человеческой каркасной областью (FR) для "очеловеченного" антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Другой метод предусматривает использование конкретной каркасной области, происходящей от "консенсусной" последовательности для всех человеческих антител с легкой или тяжелой цепями конкретной подгруппы. Та же самая каркасная область может быть использована для некоторых других "очеловеченных" антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).

Кроме того, важно, чтобы "очеловеченные" антитела сохраняли высокую аффинность по отношению к антигену и обладали другими предпочтительными биологическими свойствами. Для достижения этой цели в соответствии с предпочтительным методом "очеловеченные" антитела получают посредством анализа родительских последовательностей и различных концептуальных "очеловеченных" продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и "очеловеченных" последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина являются общедоступными и известны специалистам. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и представляют возможные трехмерные конформационные структуры отобранных иммуноглобулиновых последовательностей-кандидатов. Исследование этих представлений позволяет проанализировать возможную роль этих остатков в функционировании иммуноглобулиновой последовательности-кандидата, то есть позволяет проанализировать остатки, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связываться со своим антигеном. Таким образом, от последовательности-реципиента и "импортной" последовательности могут быть отобраны и объединены FR-остатки так, чтобы полученное антитело обладало нужными свойствами, такими как повышенная аффинность по отношению к антигену-мишени. В основном непосредственно связываются с антигеном, а в большинстве случаев влияют на связывание с антигеном остатки гипервариабельной области.

В данном описании рассматриваются различные формы "очеловеченного" антитела или "аффинно-зрелые" антитела. Так, например, такое "очеловеченное" антитело или "аффинно-зрелое" антитело может представлять собой фрагмент антитела Fab, который может быть, но необязательно, конъюгирован с одним или несколькими "нацеливающими" агентами для генерирования иммуноконъюгата. Альтернативно, "очеловеченным" антителом или "аффинно-зрелым" антителом может быть интактное антитело, такое как интактное антитело IgG1. Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно выделены из E.coli и химически связаны с образованием F(ab')₂-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). В соответствии с другим методом F(ab')₂-фрагменты могут быть непосредственно выделены из культуры рекомбинантной клетки-хозяина. Другие методы получения фрагментов антител известны специалистам. В других вариантах осуществления изобретения выбранным антителом является одноцепочечный Fv-фрагмент (оцFv)(WO 93/16185; патент США № 5571894 и 5587458). Фрагмент антитела может быть также "линейным антителом", например, описанным в патенте США № 5641870. Такие фрагменты линейного антитела могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые специфически связываются, по крайней мере, с двумя различными эпитопами. Примерами биспецифических антител могут служить антитела, которые связываются с двумя различными эпитопами белка Dкк-1. Биспецифические антитела могут быть получены в форме полноразмерных антител или в форме фрагментов антител (например, F(ab')₂-фрагмента биспецифических антител).

В соответствии с другим методом вариабельные домены антител с желательными специфичностями связывания (сайтами связывания антитела с антигеном) присоединяют к последовательностям константного домена иммуноглобулина. Такое присоединение предпочтительно осуществляют с использованием константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, включающего, по крайней мере, часть шарнирной, СН2- и СН3-области. При этом предпочтительно, чтобы этот домен включал первую константную область тяжелой цепи (СН1), содержащую участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий, по крайней мере, в одном из таких гибридов. ДНК, кодирующую гибриды тяжелой цепи иммуноглобулина, и, если необходимо, легкую цепь иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы и ко-трансфицируют в подходящий бактериальный организм-хозяин. Это обеспечивает значительную гибкость с точки зрения коррекции соотношений трех полипептидных фрагментов, осуществляемую для достижения оптимальных выходов в тех вариантах осуществления изобретения, в которых при конструировании используются неравные количества указанных трех полипептидных цепей. Однако кодирующие последовательности двух или всех трех полипептидных цепей могут быть встроены в один экспрессирующий вектор в том случае, если экспрессия, по крайней мере, двух полипептидных цепей, взятых в равных количествах, дает высокие выходы или если эти количества не имеют особого значения.

В предпочтительном варианте осуществления этого способа биспецифические антитела состоят из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече и пары "тяжелая цепь - легкая цепь" гибридного иммуноглобулина, представляющего собой пару (обеспечивающую вторую специфичность связывания) на другом плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновых цепей, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы облегчает его отделение. Этот метод описан в WO 94/04960. Более подробное описание генерирования биспецифических антител см., например, в работе Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986).

В соответствии с другим методом, описанным в патенте США № 5731168, может быть сконструирована область стыка между парой молекул антитела для максимизации процентного соотношения гетеродимеров, выделенных из рекомбинантной клеточной культуры. Предпочтительная область стыка содержит, по крайней мере, часть домена С_Н3 константной области антитела. В этом методе одна или несколько боковых цепей небольшой аминокислоты в области стыка первой молекулы антитела заменены боковыми цепями более крупной аминокислоты (например, тирозина или триптофана). В области стыка второй молекулы антитела создают компенсирующие "полости", имеющие размер, идентичный или приблизительно аналогичный размеру крупной боковой цепи(ей), путем замены боковых цепей крупной аминокислоты боковыми цепями более мелкой аминокислоты (например, аланина или треонина). Это дает возможность увеличивать выход гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифическими антителами являются перекрестно-сшитые антитела или антитела-"гетероконъюгаты". Так, например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое - с биотином. Использование таких антител было предложено, например, для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089). Антитела-гетероконъюгаты могут быть получены любыми подходящими методами перекрестного сшивания. Подходящие перекрестно-сшивающие агенты хорошо известны специалистам и описаны в патенте США № 4676980 вместе с методами перекрестного сшивания.

Методы продуцирования биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Так, например, биспецифические антитела могут быть получены посредством химического связывания. В работе Brennan et al., Science, 229: 81(1985) была описана процедура, в которой интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению с продуцированием F(ab')₂-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего комплекс с дитиолом, т.е. арсенита натрия, для стабилизации смежных дитиолов и предупреждения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Затем полученные Fab'-фрагменты превращают в производные тионитробензоата (TNB). После этого одно из этих Fab'-TNB-производных снова превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого Fab'-TNB-производного с продуцированием биспецифического антитела. Эти продуцированные биспецифические антитела могут быть использованы в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.

Кроме того, Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно выделены из E.coli и химически связаны с образованием биспецифических антител (Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)).

Были также описаны различные методы продуцирования и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Так, например, биспецифические антитела были продуцированы с использованием "лейциновых молний" (Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1533 (1992)). Пептиды лейциновой молнии, происходящие от белков Fos и Jun, были присоединены к Fab'-частям двух различных антител путем лигирования генов. Гомодимеры антител восстанавливают в шарнирной области с образованием мономеров, а затем их повторно окисляют с образованием гетеродимеров антител. Этот метод может быть также использован для продуцирования гомодимеров антител. Техника получения "диантител", описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:6444-6448 (1993), представляет собой альтернативный метод получения фрагментов биспецифических антител. Эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) посредством линкера, который является слишком коротким для того, чтобы образовывать пары между двумя доменами на одной и той же цепи. В соответствии с этим домены V_H и V_L одного фрагмента вынуждены объединяться для создания пары с комплементарными доменами другой цепи, в результате чего образуются два антигенсвязывающих сайта. Была также описана и другая стратегия получения фрагментов биспецифических антител с использованием одноцепочечного Fv (оцFv)-димера (Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)).

Рассматриваются также антитела с более чем двумя валентностями. Так, например, могут быть получены триспецифические антитела (Tutt et al., J. Immunol., 147:60(1991)).

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептидные варианты, получают различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотной последовательности) или мутагенез с использованием олигонуклеотидов (или сайт-направленный мутагенез), ПЦР-мутагенез или мутагенез с использованием кластеров для ранее полученного вариантной или невариантной версии данного полипептида.

Может оказаться желательным модифицировать антитело настоящего изобретения в отношении его эффекторной функции, например, для усиления его связывания с Fc-рецептором. Это может быть достигнуто путем введения одной или нескольких аминокислотных замен в Fc-область указанного антитела. Альтернативно, или дополнительно, в данную Fc-область может быть введен цистеиновый остаток(ки), что способствует образованию в этой области межцепочечных дисульфидных связей.

Для увеличения времени полужизни антитела в сыворотке в данное антитело (особенно во фрагмент антитела) может быть введен рецептор-связывающий эпитоп "спасения", как, например, описано в патенте США № 5739277. Используемый здесь термин "рецептор-связывающий эпитоп "спасения"" означает эпитоп Fc-области молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который ответственен за увеличение времени полужизни in vivo молекулы IgG в сыворотке.

В настоящем описании рассматриваются также другие модификации антитела. Так, например, указанное антитело может быть связано с одним из не-белковых полимеров, например с полиэтиленгликолем, пропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля.

В. Встраивание нуклеиновой кислоты в реплицируемый вектор

Гетерологичнную нуклеиновую кислоту (например, кДНК или геномную ДНК) соответствующим образом встраивают в реплицируемый вектор для осуществления экспрессии в бактерии, находящийся под контролем подходящего промотора. Многие векторы являются подходящими для этих целей, и выбор соответствующего вектора зависит, главным образом, от размера нуклеиновой кислоты, встраиваемой в данный вектор, и от конкретного хозяина, трансформируемого этим вектором. Каждый вектор содержит различные компоненты в зависимости от конкретной клетки-хозяина, с которой он должен быть совместимым. В зависимости от конкретного типа хозяина вектор обычно включает, но не ограничивается ими, один или несколько из следующих компонентов: сигнальную последовательность, сайт инициации репликации, один или несколько маркерных генов и последовательность терминации транскрипции.

В основном, в комбинации с клетками-хозяевами E.coli используют плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, происходящие от видов, совместимых с хозяином. Обычно этот вектор несет сайт репликации, а также маркерные последовательности, способные обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Так, например, E.coli обычно трансформируют с использованием плазмиды рВR322, происходящей от вида E.coli (см., например, Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)). рВR322 содержит гены резистентности к ампициллину и тетрациклину, а поэтому эта плазмида позволяет легко идентифицировать трансформированные клетки. Плазмида рВR322 или другая бактериальная плазмида или фаг также обычно содержат или являются модифицированными так, чтобы они содержали промоторы, которые могут быть использованы хозяином E.coli для экспрессии селективных маркерных генов.

(i) Компонент: сигнальная последовательность

ДНК, кодирующая нужный полипептид, может быть экспрессирована не только в чистом виде, но также в виде гибрида с другим полипептидом, предпочтительно с сигнальной последовательностью или с другим полипептидом, имеющим специфический сайт расщепления у N-конца зрелого полипептида. В общих чертах, сигнальная последовательность может быть компонентом вектора, либо она может быть частью ДНК полипептида, встроенной в этот вектор. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность должна распознаваться и подвергаться процессингу (т.е. отщепляться сигнальной пептидазой) в клетке-хозяине.

Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют нативную или эукариотическую сигнальную последовательность полипептида, эту сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из лидерных последовательностей щелочной фосфатазы, пенициллазы, 1рр или термостабильного энтероксина II.

(ii) Компонент: сайт инициации репликации

Экспрессирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, позволяющую этому вектору реплицироваться в одной или нескольких выбранных клетках-хозяевах. Хорошо известно, что ряд бактерий имеет такие последовательности. Сайт инициации репликации от плазмиды рВR322 является подходящим для большинства грамотрицательных бактерий, таких как E.coli.

(iii) Компонент: ген для отбора

Экспрессирующие векторы обычно содержат ген для отбора, называемый также селективным маркером. Этот ген кодирует белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, культивируемых в селективной культуральной среде. Клетки-хозяева, не трансформированные вектором, содержащим ген для отбора, не выживают в данной культуральной среде. По своему использованию и по определению в настоящем изобретении этот селективный маркер отличается от генетических маркеров. Типичные гены для отбора кодируют белки, которые (а) сообщают резистентность к антибиотикам или другим токсинам, например к ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (b) комплементируют ауксотрофный дефицит, отличающийся от дефицита, обусловленного присутствием генетического(их) маркера(ов) или (с) поставляют важные микроэлементы, отсутствующие в комплексных средах; например ген, кодирующий D-аланин-рацемазу Bacilli.

Одним из примеров схемы отбора является использование лекарственного средства, ингибирующего рост клетки-хозяина. В этом случае указанные клетки, которые были успешно трансформированы нужной нуклеиновой кислотой, продуцируют полипептид, сообщающий этим клеткам резистентность к лекарственному средству, а поэтому они выживают в данных условиях отбора. Примерами такого доминантного отбора является использование в качестве лекарственных средств неомицина (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982)), микофеноловой кислоты (Mulligan et al., Science, 209:1422 (1980)) или гигромицина (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5:410-413 (1985)). Три вышеуказанных примера, приведенных выше, иллюстрируют применение бактериальных генов, находящихся под эукариотическим контролем, для сообщения данной клетке резистентности к соответствующему лекарственному средству G418 или неомицину (генитицину), xgpt (микофеноловой кислоте) или к гигромицину соответственно.

(iv) Компонент: промотор

Экспрессирующий вектор, используемый для продуцирования нужного полипептида, содержит подходящий промотор, распознаваемый организмом-хозяином и функционально присоединенный к нуклеиновой кислоте, кодирующей нужный полипептид. Промоторами, подходящими для использования в прокариотических хозяевах, являются системы промоторов бета-лактамазы и лактозы (Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), система промоторов арабинозы (Guzman et al., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992)), система промоторов щелочной фосфатазы и триптофана (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980) и ЕР 36776) и гибридные промоторы, такие как промотор tac (deBoer et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 80:21-25 (1983)). Однако могут быть использованы и другие известные бактериальные промоторы. Их нуклеотидные последовательности были опубликованы, что позволяет специалистам осуществлять их функциональное лигирование с ДНК, кодирующей нужный полипептид (Siebenlist et al., Cell, 20:269 (1980)), с использованием линкеров или адапторов для введения нужных рестрикционных сайтов.

Промоторы, используемые в бактериальных системах, обычно также содержат последовательность Шайна-Дальгарно (S.D.), функционально присоединенную к ДНК, кодирующей нужный полипептид. Этот промотор может быть выделен из ДНК бактериального источника путем гидролиза рестриктирующим ферментом и встроен в вектор, содержащий нужную ДНК.

(v) Конструирование и анализ векторов

Конструирование подходящих векторов, содержащих один или несколько вышеперечисленных компонентов, осуществляют стандартными методами лигирования. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК расщепляют, сшивают и снова лигируют так, чтобы в результате образовывались нужные плазмиды.

Для анализа на подтверждение присутствия "правильных" последовательностей в сконструированных плазмидах используют смеси для лигирования в целях трансформации штамма 294 E.coli К12 (АТСС 31446) или других штаммов и успешно трансформированные штаммы отбирают по их резистентности к ампициллину и тетрациклину, если это необходимо. Затем из этих трансформантов получают плазмиды, анализируют их путем рестрикционного гидролиза эндонуклеазой и/или секвенируют методом Сэнгера (Sanger et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463-5467 (1977) или Мессинга (Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)), либо методом Максама (Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980)).

С. Отбор и трансформация клеток-хозяев

E.coli-хозяевами, подходящими для использования в качестве источников экспрессирующих плазмид, являются E.coli W3110 (ATCC 27325), E.coli 294 (АТСС 31446), E.coli В и E.coli Х1776 (АТСС 31537). Эти примеры приводятся лишь для иллюстрации и не ограничивают объема изобретения. Мутантные клетки всех вышеупомянутых штаммов могут быть использованы в качестве исходных штаммов, которые затем подвергают мутации таким образом, чтобы они содержали, по крайней мере, минимальную часть требуемого генотипа. Предпочтительным хозяином-источником является штамм W3110 E.coli, поскольку он представляет собой наиболее распространенный штамм, обычно используемый для ферментации продукта рекомбинантной ДНК. Примеры исходных E.coli-хозяев, используемых в качестве хозяев-источников, а также их генотипы приводятся в нижеследующей таблице 7.

Источниками, подходящими для получения штамма 36F8, также являются промежуточные штаммы, то есть 27В4 (патент США № 5304472) и 35Е7 (изолят спонтанной терморезистентной колонии, растущий лучше, чем 27В4). Кроме того, подходящим штаммом является штамм E.coli, имеющий мутантную периплазматическую протеазу и описанный в патенте США № 4946783, выданном 7 августа 1990).

Штаммы настоящего изобретения могут быть продуцированы путем интеграции в хромосому родительского штамма или другими методами, включая методы, описанные в нижеприведенных примерах.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, вводят в клетки-хозяева. Это осуществляют предпочтительно путем трансформации клеток-хозяев вышеописанными экспрессирующими векторами с последующим культивированием в подходящих питательных средах, модифицированных для индуцирования различных промоторов, если это необходимо.

Термин "трансформация" означает введение ДНК в организм, так, чтобы эта ДНК реплицировалась либо как внехромосомный элемент, либо как хромосомный интегрант. В зависимости от используемой клетки-хозяина трансформацию осуществляют стандартными методами, подходящими для таких клеток. Обработка кальцием, с использованием хлорида кальция, как описано в разделе 1.82 руководства Sambrook et al.,(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), обычно применяется для прокариотических клеток или других клеток, которые содержат значительные барьеры в виде клеточной стенки. Другой метод трансформации предусматривает использование полиэтиленгликоля/ДМСО, как описано Chung & Miller, Nucl. Acids Res., 16: 3580 (1988). Еще одним методом является использование такой техники, как электропорация.

D. Культивирование клеток-хозяев

Прокариотические клетки, используемые для продуцирования нужного полипептида, культивируют в подходящих средах, описанных, в общих чертах, в руководстве Sambrook et al., см. выше. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., аналогичны условиям, которые использовались ранее для экспрессии выбранных клеток-хозяев, и известны каждому специалисту. При использовании промотора щелочной фосфатазы клетки E.coli, применяемые для продуцирования нужного полипептида настоящего изобретения, культивируют в подходящих средах, в которых этот промотор щелочной фосфатазы может быть частично или полностью индуцирован, как описано, в общих чертах, в руководстве Sambrook et al., см. выше. Такое культивирование необязательно всегда происходит в отсутствие неорганического фосфата или при очень низких уровнях фосфата. Во-первых, среда содержит неорганический фосфат в количестве, превышающем уровень индуцирования синтеза белка и достаточном для роста бактерии. Поскольку клетки растут и утилизуют фосфат, то уровень фосфата в данной среде снижается, что приводит к индуцированию синтеза полипептида.

Помимо источников углерода, азота и неорганического фосфата могут быть также включены и любые другие необходимые ингредиенты сред в соответствующих концентрациях, которые могут быть введены отдельно или в смеси с другим ингредиентом или средой, такой как комплексный источник азота. рН среды может иметь любое значение, составляющее примерно от 5 до 9 в зависимости, главным образом, от организма-хозяина.

Если промотор является индуцибельным промотором, то для его индуцирования клетки обычно культивируют то тех пор, пока не будет достигнута определенная оптическая плотность, например А₅₅₀=200 при осуществлении процесса, протекающего при высокой клеточной плотности, в котором инициируется индукция промотора (например, посредством добавления индуктора, истощения компонента среды и т.п.) с индуцированием экспрессии гена, кодирующего нужный полипептид.

Е. Детекция экспрессии

Экспрессия гена может быть оценена непосредственно в образце, например, с помощью стандартного Саузерн-блоттинга, Нозерн-блоттинга для количественной оценки транскрипции мРНК (Thomas, Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 77:5201-5205 (1980)), дот-блот-анализа (анализа ДНК) или in situ-гибридизации с использованием соответствующим образом меченного зонда, полученного на основе последовательностей полипептида. При этом могут быть использованы различные метки, а в основном радиоизотопы, в частности ³²Р. Однако могут быть также использованы и другие методы, такие как методы с применением модифицированных биотином нуклеотидов для введения в полинуклеотид. Указанный биотин, кроме того, служит в качестве сайта связывания с авидином или с антителами, которые могут быть помечены метками широкого ряда, такими как радионуклиды, флуоресцентные вещества, ферменты или т.п. Альтернативно, для детекции белка могут быть использованы анализы или гели.

Для секреции экспрессированного генного продукта клетку-хозяина культивируют в условиях, достаточных для секреции данного генного продукта. Такими условиями являются, например, температура, микроэлементы и условия клеточной плотности, позволяющие этим клеткам осуществлять секрецию. Кроме того, такими условиями являются условия, при которых данная клетка может осуществлять свои основные клеточные функции, известные специалистам, а именно: транскрипцию, трансляцию и перенос белков из одного клеточного компартмента в другой.

F. Очистка полипептидов

Примерами подходящих процедур очистки являются следующие процедуры, проводимые, отдельно или в комбинации, конкретным методом в зависимости от типа полипептида, а именно: фракционирование на иммуноаффинных или ионообменных колонках; преципитация этанолом; обращенно-фазовая ВЭЖХ; гидрофобная хроматография; хроматография на двуокиси кремния; хроматография на ионообменной смоле, такой как S-сефароза^тм и DEAE; хроматофокусирование; электрофорез в ПААГ с ДСН; преципитация сульфатом аммония и гель-фильтрация с использованием, например, Сефадекса^тм G-75.

Моноклональные антитела могут быть соответствующим образом выделены из культуральной среды стандартными методами очистки антител, такими как, например, хроматография на комплексе белок А-Сефароза, хроматография на гидроксиаппатитах, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводятся конкретные примеры. Однако эти примеры не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения. Все указания на литературу и патенты вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Пример 1

Материалы и методы

А. Экспрессирующие плазмиды

1. Плазмиды для экспрессии rhuFab'2 LZ(хCD18) и меченные производные

рS1130

Плазмиду рS1130 получали из плазмиды рВR322, описанной в патентах США № 6180367 и 6258560. Синтез rhuFab'2 LZ(хCD18) регулируется промотором щелочной фосфатазы (ЩФ) E.coli. Если промотор ЩФ индуцируется путем истощения фосфата, то он образует дицистронную матричную РНК, содержащую в следующем порядке: последовательность, кодирующую сигнальную последовательность STII легкой цепи каппа; последовательность, кодирующую сигнальную последовательность STII тяжелой цепи; а затем последовательность "лейциновой молнии". Возле кодона терминации трансляции находится терминатор транскрипции лямбда.

рсус34

Плазмида рсус34 представляет собой аналог рS1130 с промотором tacII.

рхCD18-7Т3

Плазмида с двойным промотором, содержащая две отдельные трансляционные единицы, рхCD18-7Т3, обеспечивает временной интервал между транскрипцией легкой цепи и транскрипцией тяжелой цепи. Как и в рS1130, легкая цепь находится под контролем промотора phoA. Однако, в рхCD18-7Т3 терминатор транскрипции λt₀ следует за кодирующей последовательностью легкой цепи. Ниже от этого терминатора присоединяют промотор tacII для регуляции транскрипции фрагмента тяжелой цепи/С-концевой лейциновой молнии (DeBoer et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 80:21-25 (1983)). За этой кодирующей последовательностью следует второй терминатор транскрипции λt₀. Для прямой секреции обеих цепей используются варианты с молчащим кодоном сигнальной последовательности STII (Simmons & Yansura, Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996)). В частности, нуклеотиды в сигнальной последовательности STII были модифицированы так, чтобы легкая цепь имела относительную встречаемость TIR, равную 7, а тяжелая цепь имела относительную встречаемость TIR, равную 3, а последними тремя нуклеотидами сигнальной последовательности, предшествующими легкой и тяжелой цепи, были GCT. В этой двухпромоторной системе последовательность промотора phoA и ДНК для легкой и тяжелой цепей антитела являются такой же, как и в рS1130.

рАВ3

Была сконструирована плазмида рАВ3, экспрессирующая анти-CD18 F(ab')2 в периплазме под контролем промотора щелочной фосфатазы (Kikuchi et al., Nucleic Acids Res., 9 (21): 5671-5678 (1981)) и содержащая "лейциновую молнию" и His-метку. За сигнальной последовательностью термостабильного энтеротоксина II (Picken et al., Infect. Immun., 42:269-275 (1983)) находятся легкая и тяжелая цепи, и к С-концу тяжелой цепи присоединена "лейциновая молния" дрожжей GСN4, за которой следует шесть гистидиновых остатков. Последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепи, находятся в полицистронной конфигурации с терминатором транскрипции λ₀ (Scholtissek & Grosse, Nucleic Acids Res., 15:3185 (1987)), расположенным за геном тяжелой цепи.

Плазмида рАВ3 была сконструирована путем лигирования трех ДНК-фрагментов, первым из которых является вектор рS1130, из которого был удален небольшой KpnI-SphI-фрагмент. Второй частью в этом лигировании был KpnI-HindIII-фрагмент, состоящий примерно из 645 пар нуклеотидов и происходящий от рS1130. Последней частью в этом лигировании был синтетический ДНК-дуплекс, имеющий следующую последовательность:

рАВ21

Плазмида рАВ21 представляет собой производное плазмиды рАВ3, в которой шесть гистидиновых остатков на С-конце тяжелой цепи были заменены шестью лизиновыми остатками. Эта плазмида была сконструирована так же, как и рАВ3, за исключением того, что синтетическая ДНК, используемая в лигировании, имела следующую последовательность:

2. Плазмида для экспрессии анти-TF Fab'2 LZ-6хhis

Плазмида D3Н44-F(ab')2 (также известная как рD3h44f2), сконструированная для прямого продуцирования гибрида "F(ab')2 против тканевого фактора - лейциновая молния - 6хhis", имеет точно такую же каркасную ДНК-последовательность, как и рАВ3, за исключением того, что вариабельные области хCD18 VL/VH для НС и LC были заменены на xTF VL/VH. Конструирование этой плазмиды описано в заявке WO 01/70984, опубликованной 27 сентября 2001.

Более конкретно, сначала получали плазмиду для экспрессии анти-TF Fab (D3Н44-F(ab)), как описано ниже. Плазмида рЕМХ1, используемая для мутагенеза и экспрессии F(ab) в E.coli, была описана Werther et al., J. Immunol., 157: 4986-4995 (1996). Вкратце, эта плазмида содержит ДНК-фрагмент, кодирующий консенсусную последовательность легкой цепи k подгруппы I антитела человека (VLkI-CL), консенсусную последовательность легкой цепи подгруппы III антитела человека (VHIII-CН1) и промотор щелочной фосфатазы. Использование консенсусных последовательностей для VL и VH было описано Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992); Carter et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285-4289 (1992).

Сайт-направленный мутагенез (Kunkel, Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 82:488-492 (1985)) осуществляли на дезоксиуридин-содержащей матрице рЕМХ1. Шесть CDR были заменены на мышиную последовательность D3; а остатки, включенные в каждую CDR, были получены на основе определений последовательностей для CDR (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, Ed. 5, Public Health Service (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), за исключением последовательности CDR-Н1, которая была определена с использованием комбинации определений для CDR-Н1, взятых у Kabat et al. (см. выше) и Chothia et al., Nature, 342:877-833 (1989), то есть, CDR-Н1 была определена как область, простирающаяся от остатков Н26-Н35 в тяжелой цепи. Поэтому D2Н44-F(ab) кодировал F(ab), состоящий из полной человеческой каркасной области (VLk подгруппы I и VH подгруппы III) и шести полноразмерных мышиных последовательностей CDR.

D2Н44-F(ab')2 была сконструирована путем присоединения шарнирной области тяжелой цепи (CPPCPAPELLGG; SEQ ID NO:10) к С-концу D3H44-F(ab), за которой следует лейциновая молния GCN4 и (his)6-метка, вводимая для очистки (см. выше описание рАВ3 для лейциновой молнии и метки hisx6).

3. Плазмиды для экспрессии анти-VEGF Fab

рY0317

Плазмида рY0317, экспрессирующая аффинно-зрелый белок анти-VEGF Fab, описана Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Вкратце, для конструирования плазмиды, продуцирующей этот белок, рY0317, экспрессирующий кластер клонировали в каркасную область плазмиды рВR322 E.coli в EcoRI-сайте (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90 (1978)). Экспрессирующий кластер содержал, по крайней мере, следующие основные компоненты: (1) промотор phoA для регуляции транскрипции; (2) терминатор λt₀ для прекращения транскрипции; и (3) последовательность Шайна-Дальгарно гена trp E.coli или ген термостабильного энтеротоксина II (STII), либо комбинацию того и другого для облегчения трансляции. Основные компоненты бактериальных экспрессирующих кластеров известны специалистам и описаны, например, Kikuchi et al., Nucleic Acids Res., 9(21):5671-5678 (1981) (для промотора phoA); Scholtissek & Grosse, Nucleic Acids Res., 15:3185 (1987) (для терминатора λt₀); Yanofsky et al., Nucleic Acids Res., 9:6647-6668 (1981) (для trp); Picken et al., Infect. Immun. 42:269-275 (1983) (для STII) и Chang et al., Gene, 55:189-196 (1987) (для комбинации trp и последовательности Шайна-Дальгарно STII). Кроме того, сигнальная последовательность STII или ее варианты с молчащим кодоном расположены перед кодирующей последовательностью как легкой, так и тяжелой цепей в рY0317, для продуцирования анти-VEGF Fab и направляют секрецию белка в периплазму. Picken et al., Infect. Immun., 42:269-275 (1983); Simmons & Yansura, Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности для экспрессирующего кластера, состоящего из 1952 пар нуклеотидов и встроенного в EcoRI-сайт для продуцирования рекомбинантного белка, показаны на фигуре 1 (SEQ ID NO:1 и 2 соответственно).

rhuFab V2 Y0317 конструировали путем "очеловечивания" моноклонального мышиного антитела А.4.6.1 (Presta et al., Cancer Res., 57: 4593-4599 (1997) способом, описанным ранее для других антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:4285-4289 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993); Werther et al., J.Immunol.157:4986-4995 (1996)). Вкратце, кДНК, кодирующие вариабельные легкую и тяжелую цепи muMAb А.4.6.1, выделяли посредством ОТ-ПЦР из клеток гибридомы, продуцирующей мышиное моноклональное антитело. Эти кДНК клонировали и лигировали с человеческими доменами CL и СН1 (Werther et al., J. Immunol., 157:4986-4995 (1996)), в результате чего получали химерный Fab "мышь-человек". Шесть определяющих комплементарность областей (CDR) (обозначенных на фигуре 1 жирным шрифтом) трансплантировали в вектор с предварительно "очеловеченным" антителом, кодирующий человеческую консенсусную последовательность легкой цепи k подгруппы I и человеческую консенсусную последовательность тяжелой цепи подгруппы III (Carter et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285-4289 (1992)). Перенос в человеческую каркасную область лишь остатков CDR приводил к 1000-кратному снижению уровня связывания с антигеном VEGF. Некоторые остатки каркасной области, расположенные возле CDR (обозначенные на фигуре 1 курсивом и подчеркнутые), были также заменены для улучшения связывания с мишенью (Presta et al., Cancer Res., 57:4593-4599 (1997)). Во всех случаях семь остатков тяжелой цепи и один остаток легкой цепи были заменены на участках, находящихся вне CDR. Затем тяжелая и легкая цепи были перенесены в вектор фагового представления (Baca et al., J. Biol. Chem., 272:10678-10684 (1997)), что приводило к замене гена hGH в phGHam-g3 (Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)). Сайт-направленный мутагенез использовали для замены Met4Leu в VL в целях предотвращения окисления метионина и замены Thr231Leu в VH для облегчения клонирования в целях лигирования гена III. Этот вектор обозначали Y0101 и использовали как исходный материал для оптимизации CDR в связывании с антигеном VEGF (Muller et al., Structure, 6:1153-1167 (1998)). Было обнаружено, что к увеличению уровня связывания приводят лишь мутации в CDR Н1 и Н3, а поэтому они были внесены в конечный вариант рY0317. Заменами в плазмиде рY0101, осуществляемыми для получения плазмиды рY0317, являются Thr28Asp, Asn31His, His101Tyr, Ser105Thr. Все эти замены были осуществлены в вариабельной области тяжелой цепи. Плазмида рY0317 представляет собой вектор фагового представления Fab. Схема конструирования этой плазмиды представлена на фигуре 2А.

рY0317tet20

Плазмида рY0317tet20 была сконструирована для прямого продуцирования rhuFab V2 в E.coli. На фигурах 2А и 2В представлена схема конструирования этой плазмиды из плазмиды рY0317. Плазмида рY0317tet20 представляет собой модифицированный вариант хорошо охарактеризованной плазмиды рВR322. AvaI-PvuI-фрагмент, состоящий из 639 пар нуклеотидов, выделяли из части плазмиды рВR322. Эта делеция приводила к удалению гена rop, который обеспечивает контроль за числом копий (Cesareni et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 79: 6313-6317 (1982)). Следовательно, эта плазмида имела несколько большее число копий, чем рВR322. Экспрессирующий кластер, состоящий из 1952 пар нуклеотидов (фигура 1), был встроен в EcoRI-сайт для продуцирования рекомбинантного белка. Плазмида рY0317tet20 несет резистентность к антибиотикам тетрациклину и β-лактаму. Этот экспрессирующий кластер содержит одну копию легкой цепи и тяжелой цепи, тандемно связанных друг с другом. Транскрипция каждого гена в одну дицистронную мРНК регулируется промотором phoA E.coli (Chang et al., Gene, 44:121-125 (1986)). Сигналы инициации трансляции для каждой цепи обеспечивались последовательностями Шайна-Дальгарно (STII, термостабильный энтеротоксин) E.coli. Трансляция каждой цепи начинается с 23-остатка сигнального пептида STII (Picken et al., Infection and Immunity., 42:269-275 (1983)), который регулирует транслокацию пептидов через цитоплазматическую мембрану в периплазматическую область. Затем сигнальный пептид STII удаляется с помощью лидерной пептидазы E.coli. После секреции в периплазму легкая и тяжелая цепи подвергаются укладке с образованием их нативной конформации и ковалентно соединяются посредством межмолекулярной дисульфидной связи.

Резистентность к тетрациклину вносили в конечный вектор посредством модификаций рY0317 (см. фигуры 2А и 2В). 3642-п.н.-SapI/ApaI-фрагмент рY0317, который включает сайт инициации репликации рВR322, ген β-лактамазы, промотор phoA, всю легкую цепь и амино-концевую половину тяжелой цепи (VH), лигировали с 2738-п.н.-SapI/ApaI-фрагментом р6G4V11N35A.PEG. Этот второй фрагмент содержит область СН1 тяжелой цепи и ген резистентности к тетрациклину от рВR322. Этот фрагмент также содержит четыре дополнительные аминокислоты у карбоксильного конца тяжелой цепи для сайт-специфической модификации указанного белка. Область, содержащую четыре дополнительных остатка, и область СН1 удаляли путем гидролиза BssHII/HpaI и заменяли BssHII/XbaI-фрагментом рY0317, что позволило восстановить исходную последовательность тяжелой цепи и делетировать область сайт-специфической модификации. Сначала осуществляли гидролиз ферментом XbaI и выступающие концы достраивали фрагментом Кленова и дезоксинуклеотидами. Затем после гидролиза ферментом BssHII осуществляли гель-очистку фрагмента, состоящего из 433 п.н. Конечную модификацию этой плазмиды осуществляли путем замены NheI-NdeI-фрагмента рВR322 NheI-NdeI-фрагментом рВR322, имеющим AvaI-PvuI-делецию из 639 пар нуклеотидов. Эта конечная плазмида, рY0317tet20, несет резистентность к антибиотикам тетрациклину и β-лактаму и содержит промотор phoA и гены, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела против VEGF.

4. Плазмида для экспрессии Аро21

Плазмида рАРАро2-Р2RU описана в заявке WO 01/00832, опубликованной 4 января 2001. Вкратце, эта плазмида, конструкция которой представлена на фигуре 3, кодирует ко-экспрессию Аро-2L (аминокислотные остатки 114-281) и тРНК, кодируемых генами pro2 и argU, где указанная ко-экспрессия регулируется промотором щелочной фосфатазы. Для продуцирования Аро-2L в E.coli использовали плазмиду, полученную на основе рВR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90 (1978)), рАРАро2-Р2RU. Транскрипционные и трансляционные последовательности, необходимые для экспрессии Аро-2L, находились под контролем промотора щелочной фосфатазы и последовательности Шайна-Дальгарно trp, как описано для плазмиды phGН1 (Chang et al., Gene, 55:189-196 (1987)). Кодирующая последовательность Аро-2L (от 114 до 281) была расположена ниже промотора и последовательности Шайна-Дальгарно и выше инициирующего метионина. Эта кодирующая последовательность включала нуклеотиды (показанные на фигуре 4), кодирующие остатки 114-281 Аро-2L (фигура 4 (SEQ ID NO:3 и 4 соответственно для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей)), за исключением того, что кодон, кодирующий остаток Pro119, был заменен кодоном "CCG", вместо "ССТ", для элиминации возможной вторичной структуры. Последовательность, кодирующая терминатор транскрипции лямбда-t₀ (Scholtissek et al., Nucleic Acids Res., 15:3185 (1987), находилась за последовательностью, кодирующей Аро-2L.

Кроме того, эта плазмида также включала последовательности для экспрессии тРНК pro2 (Komine et al., J. Mol. Biol., 212:579-598 (1990)) и argU/dnaY (Garcia et al., Cell, 45:453-459 (1986)). Эти гены были клонированы посредством ПЦР из W3110 E.coli и находились ниже последовательности терминатора транскрипции лямбда-t₀. При продуцировании хозяина эти плазмиды сообщали ему резистентность к тетрациклину и ампициллину.

В. Трансформация клеток

Компетентные клетки соответствующего штамма получали и трансформировали с использованием подходящей плазмиды в соответствии со стандартными процедурами, и успешно трансформированные клетки отбирали и культивировали в культуре. Для плазмид, несущих резистентность к тетрациклину, трансформанты собирали с LB-планшетов, содержащих 20 мкг/мл тетрациклина (LB+Теt20), выделяли путем посева штрихом и культивировали в бульоне LB, содержащем 20 мкг/мл тетрациклина, в шейкере/инкубаторе при 30°С, а затем хранили в ДМСО при -80°С.

В случае плазмид рхCD18-7Т3 и рсус34, вместе с рхCD18-7Т3 и рсус34 трансформировали дополнительную плазмиду, рМS421. Плазмида рМS421 представляла собой плазмиду, полученную на основе рSC101 и сверхэкспрессирующую супрессор lac1q, который ингибировал индукцию промотора tacII до тех пор, пока не был добавлен IPTG для отмены такого ингибирования, и который также сообщал резистентность к спектиномицину и стрептомицину. Эта плазмида давала дополнительные копии хромосомного гена lac1q, находящегося под контролем своего собственного промотора от lac1q-штамма, ген которого был введен в совместимую плазмиду рSC1010.

С. Экстракция антитела

Растворимую фракцию клеток E.coli получали путем суспендирования 20 OD-мл осадка в 500 мкл 200 мМ Трис-HCl (рН 8,0) с 20 мкл 0,1М EDTA (рН 8,0) и 10 мкл лизоцима (6 мг/мл). Эту смесь интенсивно перемешивали, обрабатывали ультразвуком путем подачи 7-10 импульсов, а затем центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 минут при 4°С. Фракцию супернатанта, полученную после центрифугирования, называли экстрактом с высокой концентрацией соли (HSE). Оставшийся осадок использовали для анализа нерастворимой фракции.

D. Идентификация белка

Электрофорез в одномерном ДСН-ПААГ осуществляли в линейном градиенте 4-12% акриламида от Novex. В частности, была использована система NuPage^TM NOVEX®, состоящая из гелей NuPAGE Bis-TRIS Pre-Cast (для белков с низкой и средней молекулярной массой).

Электрофорез в двумерном геле осуществляли, как описано Champion et al., Electrophoresis, 20 (4-5):994-1000 (1999)) с фиксированными градиентами рН (рН 3-10) в первом измерении и линейным градиентом акриламида (9-18%) во втором измерении размерности, закупленного у Amersham Pharmacia Biotech. Идентификацию белка осуществляли посредством комбинированного окрашивания серебром/кумасси, NH₂-концевого секвенирования и масс-спектрометрического анализа. Для аналитических гелей клеточные лизаты E.coli (˜40 мкг белка) объединяли с раствором для повторной гидратации, как описано Champion et al., см. выше. 18-см полосы геля (с нелинейным фиксированным градиентом рН 3-10 (IPG) (Amersham Pharmacia Biotech) использовали для изоэлектрического фокусирования для всех 50000 Vh.

Препаративно нагруженный гель блотировали на поливинилиденовые дифторидные мембраны (PVDF) (ProBlott; Applied Biosystems), как описано производителем. NH₂-концевое секвенирование осуществляли с использованием 20-минутного цикла Эдмана и горизонтального проточного реактора для множества образцов в целях проведения анализа PVDF-электроблотированных белков (Henzel et al., Analytical Biochemistry, 267:148-160 (1999)). Молекулярную массу пятен, специфичных для легкой цепи, оценивали с помощью масс-спектрометрии MALDI-NOF и капиллярной ЖХ-МС образцов, элюируемых с гелей (Champion et al., см.выше).

Е. Измерение молекул белков-мишеней

Анализ с использованием AMES^TM - двух обращенно-фазовых колонок (анализ AMES^TM/на двух ОФ-колонках) проводили для определения титра анти-CD18 F(ab')2LZ.

F. Анализ с использованием AMES^TM/двух ОФ-колонок

1. Контрольно-измерительная аппаратура и оборудование

Рабочая станция INTEGRAL^TM (от PerSeptive Biosystems) была смонтирована в виде конфигурации с двумя колонками для градиентного элюирования. Аффинную колонку, содержащую антитело Fab против легкой цепи (каппа) (AMES^TM), иммобилизованное на стекле с регулируемым размером пор (CGP), использовали для иммобилизации белка-мишени. Обращенно-фазовую колонку с постоянной регулируемой температурой 60°С использовали для дополнительного выделения иммобилизованных молекул антитела. Активированная альдегидная иммуноаффинная смола (AL-20), обращенно-фазовые смолы POROS (R220) и устройство для упаковки колонки были получены от PerSeptive Biosystems (Cambridge, MA, USA). Пустые CPG колонки РЕЕК, 30х2,1 мм (100 мкл) были закуплены у Upchurch Scientific (Oak Harbor, WA, USA). Образцы E.coli фильтровали с использованием 5-микронных фильтров для шприца ACRODISC^TM PF (от Gelman Sciences).

2. Очистка AMES^TM Fab(his-gly)₄his-(lys) против каппа цепи человека

Забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,2 (PBS), содержащий 9,4 мМ фосфата натрия, 136,9 мМ хлорида натрия и 2,7 мМ хлорида калия, использовали в качестве загрузочного буфера. Для указанных целей моноклональные антитела получали из мышиного Fab, AMES^TM Fab(his-gly)₄his-(lys)₃ против человеческой цепи каппа, которое было очищено из пасты E.coli и обозначено AMES^TM Fab hgk. Пасту из E.coli получали в результате 10-литровой ферментации клеток 27С7. Для гомогенизации клеток после получения суспензии в 20 мМ фосфата натрия, 0,25 М хлорида натрия, 10 мМ хлорида магния и 2 мМ имидазола при рН 7,0 использовали микрофлюидизатор. Экстракт E.coli осветляли путем добавления 0,2% полиэтиленимина (PEI) и центрифугирования. Осветленный экстракт очищали с использованием комбинации стадий ионообменной хроматографии и хроматографии на иммобилизованной смоле, образующей хелатный комплекс с ионами металла (IMAC). Хелатообразующие смолы SEPHAROSE FAST FLOW^TM и SP SEPHAROSE FAST FLOW^TM были закуплены у Amersham Pharmacia.

3. Иммобилизация AMES^TM Fab hgk на CPG, покрытом активированным глицерином

Очищенный Fab иммобилизовали на стекле с регулируемым размером пор (CPG), активированном периодатом и покрытом глицерином, и получали аффинную смолу. Антитело AMES^TM Fab hgk иммобилизовали на активированном CPG, покрытом глицерином, с использованием модификации метода Roy et al., J. Chromatography, 303: 225-228 (1984). Сухое CPG смачивали очищенной водой, упаковывали в хроматографическую колонку и активировали в течение 30 минут путем рециркуляции 1% метапириодата натрия (Sigma S-1878^тм) через колонку. Затем активированную смолу промывали в 20 мМ фосфата натрия, 0,15 М хлорида натрия, рН 7,2 (буфером для связывания).

Антитело AMES^TM Fab hgk при концентрации примерно 5 мг/мл в буфере для связывания, содержащем 1 мкг/мл восстановителя цианоборогидрида натрия (Sigma S8628), снова пропускали через слой активированной смолы. Связывание антитела со смолой контролировали по снижению абсорбции при 280 нм. Если снижения абсорбции больше не наблюдалось, то оставшееся антитело вымывали буфером для связывания и выделяли. Плотность связывания определяли по различию между исходным количеством и количеством, выделенным после осуществления реакции, и регистрировали количество Fab в мг на один мл смолы.

Затем все оставшиеся активные сайты на смоле подвергали реакции путем рециркуляции 1М этаноламина, рН 8,0 (ICN, catalog # 151078) в присутствии 1 мкг/мл цианоборогидрида натрия в течение 2 часов. Затем смолу промывали в буфере для связывания, содержащем 0,01% тимерозаля (GDL International), для хранения. Между уравновешиванием эту смолу три раза подвергали предварительной обработке и перед нанесением любого белка использовали элюирующие буферы.

4. Реагенты и метод анализа

Резервуары для растворителя содержали: растворитель 1А, буфер для загрузки в аффинную колонку; растворитель 1В, водный буфер для обращенно-фазовой колонки и буфер для аффинного элюирования, 0,1% TFA в воде; растворитель 2А, вода; растворитель 2В, органический буфер для обращенно-фазового элюирования, 0,09% TFA/80% ацетонитрила. Затем вводили 50 мкл HSE E.coli (разведенного 1:2) или супернатант ферментационного бульона в загрузочном буфере. Все формы анти-CD18 антитела, обнаруживаемые при ферментации клеточных экстрактов, захватывались указанным антителом AMES^TM, как было определено путем сравнения двумерных гелей: контрольного геля, "продукционного" геля и аффинно-иммобилизованного материала (AMES^TM) из "продукционного" геля. После снижения уровня неспецифической адсорбции (путем промывки PBS) аффинную колонку подключали к обращенно-фазовой колонке и перенос иммобилизованных компонентов осуществляли путем элюирования разбавленной кислотой. Затем эти компоненты разделяли путем элюирования на обращенно-фазовой колонке с использованием пологого градиента ацетонитрила. Детекцию осуществляли путем измерения оптической плотности при 280 нм, и интактное антитело количественно оценивали путем сравнения площадей под пиками с аналогично обработанными стандартами.

G. Идентификация пиков на хроматограмме

Этот анализ позволил разделить фрагменты анти-CD18 антитела на пять относящихся к антителам пиков, которые представляли следующие фрагменты антитела:

Пик 1: LC-115 (продукт расщепления 115 аминокислот легкой цепи каппа)

Пик 2: несобранная свободная легкая цепь и глутатионированная легкая цепь

Пик 3: димер легкой цепи

Пик 4: Fab-подобный фрагмент

Пик 5: Fab'2-LZ или Fab'2-фрагмент.

Очищенную массу выделенного материала анти-CD18 F(ab')₂ (5 мг/мг) использовали в качестве стандарта. Экстракт E.coli, полученный в результате ферментации 49А5/рS1130 с высокой клеточной плотностью, замораживали при -70°С и использовали в качестве позитивного контроля. Для всех сравниваемых образцов использовали равную клеточную массу.

Н. Общий анализ обращенно-фазовой ВЭЖХ POROS^TM

Для оценки всего количества фрагментов легкой цепи и тяжелой цепи, продуцированных в процессе ферментации, проводили альтернативный анализ с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ). Для общей экспрессии антител добавляли 100 мкл цельного бульона со 100 мкл 0,2 М Триса, рН 8,0. После обработки ультразвуком путем подачи 10 импульсов добавляли 650 мкл гуанидина-HCl/50 мМ Триса, рН 9 и 50 мкл 2М DTT и смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Перед нанесением смеси на колонку добавляли 200 мкл ацетонитрила и фильтровали через эксклюзионную вращающуюся колонку (Pharmacia). Пять мкл этой суспензии анализировали с помощью анализа на обращенно-фазовой колонке со смолой POROS^TM.

Для метода с применением обращенно-фазовой хроматографии применяли HEWLETT-PACKARD^TM 1100 ВЭЖХ с использованием обращенно-фазовой колонки Perseptive POROS^ТМ R-1. Анализы проводили с использованием колонки, нагретой до 60°С, и проводили мониторинг УФ-поглощения при 278 нм. Колонку уравновешивали 28% раствором ацетонитрила в воде с 0,1% трифторуксусной кислотой. После этого на колонку наносили 25 мкл образца и элюировали в линейном градиенте 28-38% ацетонитрила в течение 20 минут с последующей 17-минутной регенерацией в присутствии 95% ацетонитрила и снова уравновешивали в присутствии 28% ацетонитрила. Пики для молекул легкой и тяжелой цепи идентифицировали путем сравнения со стандартами и для подтверждения проводили анализ с использованием масс-селективного детектора HEWLETT-PACKARD^TM 1100. Аналогичным образом были получены контрольные образцы для ферментации, в которой были использованы те же самые образцы за исключением того, что плазмида не содержала последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи, и эти образцы были проанализированы для определения соответствующих базовых параметров для анализов. Интегрирование с получением площадей под пиками осуществляли с использованием программного обеспечения HEWLETT-PACKARD^TM 1100, и в контрольные образцы вводили стандарты для генерирования калибровочной кривой в целях определения относительного количества различных молекул в образце.

Для растворимых лизатов образцы получали таким же способом, как и для ионообменного анализа. Обычно 100 мкл образца разводили в 650 мкл 6М гуанидин-HCl, 50 мМ Трис-HCl, рН 9. После этого добавляли 50 мкл 2М дитиотреитола (свежеоттаянного), а затем добавляли 200 мкл ацетонитрила, после чего фильтровали через 0,2 мкм-фильтр, и смесь наносили на ВЭЖХ-колонку.

Образцы нерастворившихся лизатов были также проанализированы путем ресуспендирования PBS-промытых нерастворившихся осадков, полученных после экстракции клеток в 100 мкл 0,2 М Триса, рН 8,0, и тщательного смешивания. Затем добавляли 650 мкл 6М гуанидина-HCl/50 мМ Трис-HCl, рН 9, 50 мкл 2М DTT и 200 мкл ацетонитрила. После этого образцы фильтровали и 10 мкл отфильтрованных образцов анализировали методом, описанным для образцов растворимого лизата.

I. Анализ с использованием CSX

Гидролиз анти-CD18 Fab'2-LZ анализировали с помощью катионообменной ВЭЖХ. Более конкретно, образцы разводили, по крайней мере, 1:1 и 250 мкл наносили на колонку, 50х4,6 мм, с карбоксисульфоном (CsX) BAKERBONDJ^TM (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), поддерживаемую при 55°С на ВЭЖХ-системе Hewlett-Packard 1090. Образцы элюировали с использованием градиента примерно 5-50 мМ фосфата натрия (рН 7,0) в течение 14 минут и мониторинг пиков проводили по УФ-поглощению при 278 нм. Пик, содержащий фрагмент "анти-CD18 Fab'2-лейциновая молния", идентифицировали и количественно оценивали путем сравнения с очищенными стандартами.

J. Конструирование клеточной линии

Хозяевами, используемыми для ферментации rhuFab'2 LZ (xCD18), являются производные W3110 E.coli (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp.1190-1219) и эти производные были обозначены: 49А5, 58В3, 59А7, 43Н1, 58Н2, 45F8, 41H1 и 33D3. На фигуре 5 представлена диаграмма дериватизации штаммов 59А7, 49А5 и 43Н1 E.coli.

1. Штамм 49А5

Полный генотип 49А5 представляет собой ΔfhuA phoA ΔE15Δ(argF-lac)169 deoC2 degP41 (Δpst1-Kan^r) IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Val^r) ΔfucP ΔmalE. Исходный штамм W3110 E.coli представляет собой производное К-12 E.coli, то есть F'- и лямбда-минус. Было показано, что оно несет инверсию хромосомы между rrnD и rrnE (Bachmann, см.выше; Hill & Harnish, Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 78:7069-7072 (1981)). Ген fhuA (ранее обозначаемый tonA) был делетирован из W3110 путем неточного исключения Tn10 после его инсерции в ген fhuA. Полученный штамм, 1А2, является резистентным к бактериофагу Т1, Т5 и ⊘80.

Две делеционные мутации, phoA ΔЕ15 (Sarthy A, et al., J. Bacteriol., 145:288-292 (1981)) и Δ(arg-lac)169 (Schweizer et al., Mol. Gen. Genet., 192: 293-294 (1983)) были одновременно внесены в штамм 1А2 путем ко-трансдукции Р1 вместе с Tn5-сцепленной инсерцией в гене proC. Точное исключение транспозона приводило к сохранению гена proC. Мутация phoA ΔЕ15 приводила к отмене экспрессии щелочной фосфатазы, а мутация Δ(argF-lac)169 ответственна за lac^--фенотип этого штамма, который был обозначен 7С1.

Мутацию deoC2, которая предотвращает экспрессию дезоксирибозо-фосфатальдолазы, вводили путем ко-трансдукции Р1. Локус deoC2 генетически сцеплен с биосинтетическим локусом треонина. Ауксотроф по треонину был получен путем инсерции Tn10 и неточного исключения. Ауксотроф по треонину был затем превращен в прототроф по треонину с использованием фага Р1, выращенного в deoC2-мутанте. Присутствие deoC2-мутации подтверждали по неспособности полученного штамма, 19С9, расти на среде с 0,2% тимидином, используемым в качестве источника углерода.

Мутация degP41(ΔPst1-Kan^r), то есть мутация в гене периплазматической протеазы, была введена путем трансдукции. Эту мутацию конструировали in vitro путем замены участка гена degP геном резистентности к канамицину (Strauch & Beckwith, J. Bacteriol., 171: 2689-2696 (1989)). Этот ген не является транспозоном, но позволяет проводить отбор делеции с использованием резистентности к канамицину. Полученный штамм обозначали 23Е3.

Мутацию ilvG2096 (Val^r) (Lawther et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78:922-925 (1981)) вводили путем гомогенотизации. Эта мутация восстанавливала сдвиг рамки считывания, что приводило к образованию штамма К-12 E.coli дикого типа, чувствительного к валину. Штамм 23Е3 трансформировали плазмидой рАН29 (Lawther et al., см. выше), содержащей маркер ilvG2096 (Val^r) и ген резистентности к ампициллину. Штамм, обозначенный 33В6, который спонтанно терял плазмиду и который приобретал нужный аллель, был идентифицирован путем скрининга чувствительных к ампициллину клонов на резистентность к валину.

И, наконец, в путь утилизации углеводов были внесены две мутации, что позволяло идентифицировать этого хозяина от других рекомбинантных хозяев путем простого теста на утилизацию углеводов. Делеционные мутации fucP и malE конструировали посредством ПЦР и отдельно вводили в плазмидный вектор, содержащий бета-лактамазу и леван-сахаразу (Bass et al., см.выше). Все целые плазмиды снова объединяли в хромосоме производного штамма W3110, который не должен поддерживать независимую репликацию плазмидного вектора (Bass et al., см.выше). Затем штамму 33В6 сообщали резистентность к карбенициллину с использованием фага Р1, выращенного на производном штамме, полученном из W3110, несущем плазмиду с fucP-делецией, интегрированную в его хромосому. Производные, которые больше не экспрессировали леван-сахаразу, а поэтому были резистентными к сахарозе, отбирали и скринировали на потерю резистентности к карбенициллину и неспособность к утилизации фукозы. С помощью ПЦР было подтверждено, что полученный штамм 49В2 несет нужную fucP-делецию.

Эти стадии повторяли для введения malE-делеции. Штамм 42В2 превращали в штамм, резистентный к карбенициллину, с использованием фага Р1, выращенного на штамме W3110, несущем плазмиду с malE-делецией, интегрированную в его хромосому. Затем резистентные к сахарозе производные отбирали и скринировали на потерю резистентности к карбенициллину и неспособность к утилизации мальтозы, и присутствие malE-делеции было подтверждено с помощью ПЦР.

Штамм 49А5 имеет следующие важные свойства:

• Он является резистентным к фагу Т1.

• Он не обладает способностью к сверхпродуцированию щелочной фосфатазы при истощении фосфата (которое является условием для индуцирования синтеза продукта).

• Он не содержит протеазу.

• Он не чувствителен к токсичности валина.

• Его можно легко идентифицировать от других хозяев в тесте на утилизацию углевода.

2. Штамм 58В3

Штамм 58В3 был также получен из штамма 33В6. Генотип Δprc::pS1080 (Bass et al., см.выше; Metcalf et al., Gene, 138:1-720 (1994)) вводили в kan^s-производное штамма 33В6 (56G4) путем Р1-трансдукции, что позволяло проводить отбор колоний, которые плохо растут на среде LB с половинной концентрацией ингредиентов и с низким содержанием соли при 42°С. kan^s-Штамм несет degP-делецию, происходящую от рКS16 ((Strauch & Beckwith, см. выше), и имеет фенотип чувствительности к канамицину. Поэтому штамм 58В3 представляет собой kan^s-штамм, несущий degP- и prc-делецию.

Полный генотип штамма 58В3 представляет собой W3110 ΔfhuA phoAΔE15Δ(argF-lac)169deoCdegP41 IN(rrD-rrE)1 Kan^s ilvG2096 (Val^r)Δprc.

3. Штамм 59А7

Этот штамм конструировали путем введения супрессора Prc (мутант Spr) в штамм 58В3. Р1-фаговый лизат штамма 51В9 (tonA prc sup zeg722::Tn10) переносили в штамм 58В3 для отбора на tet-резистентные колонии и скрининга на супрессор фенотипа Prc (который хорошо растет на среде LB с половинной концентрацией ингредиентов и с низким содержанием соли при 42°С). Новый штамм был назван 58F1. Мутант Δprc не может выживать при 42°С. Гены резистентности к тетрациклину выделяли из штамма 59F1 путем его посева на планшеты Malloy, в результате чего получали tet^s-чувствительный штамм, обозначенный 59А7. Полный генотип штамма 59А7 представляет собой W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)1 Kan^s ilvG2096 (Val^r)Δprc sprW148R.

Исходный штамм 51В9 имеет Prc-супрессор Spr, несущий точковую мутацию W148R, как и Spr в штаммах 43Н1 и 59А7.

4. Штамм 43Н1

Полный генотип штамма 43Н1 почти аналогичен генотипу штамма 49А5: W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 degP41 (Δpst-Kan^r) IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Val^r) prc3 Δ ompT prc::kan^r spr W148R. Он несет на три протеазных маркера больше, чем штамм 49А5, то есть Ptr3, OmpT и Prc. Этот штамм имеет точковую мутацию (W148R) в Spr. Этот штамм является резистентным к канамицину (Kan^r).

5. Штамм 58Н2

Штамм 43Н1 был трансформирован в tet^r-штамм с использованием фага Р1, выращенного на штамме 42Е3. Этот штамм (58F9) был репарирован в отношении мутации prc::kan^r; а поэтому он стал восприимчивым к kan (kan^s). Затем этот штамм высевали на минимальную среду с глюкуроновой кислотой для удаления eda::Tn10. Этот новый сконструированный штамм, 58Н2, является kan^r и представляет собой мутант по трем протеазам, содержащий prc дикого типа. Полный генотип штамма 58Н2 представляет собой: W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 degP41 (Δpst-Kan^r) IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Val^r) ptr3 ΔompT spr W148R.

6. Штамм 45F8

Полный генотип штамма 45F8 представляет собой: W3110 ΔfhuA Δ(argF-lac)169 degP41 Kan^s ΔompT ptr3 ilvG2096 (Val^r) phoS*(Т104). Этот штамм представляет собой phoS-штамм с тремя протеазными маркерами.

7. Штамм 41Н1

Полный генотип штамма 41Н1 представляет собой: W3110 ΔfhuA phoS*(Т104) Δ(argF-lac)169 degP41 (Δ pstI-Kan^s) ptr3 ilvG2096 (Val^r), термоадаптированный при 37°С. Этот штамм представляет собой phoS-штамм с двумя протеазными маркерами.

8. Штамм 33D3

Полный генотип штамма 33D3 представляет собой: W3110 ΔfhuA ptr3 lacIq lacL8 ΔompT degP41 (ΔpstI-Kan^r). Описание этой конструкции можно найти, например, в патенте США № 5789199.

К. Шейкерные колбы и сбраживаемые культуры

Для проведения эксперимента в шейкерных колбах использовали бульон Лурье-Бертани (LB) и минимальную среду C.R.A.P. с 5 мкг/мл антибиотика ампициллина, AMPICILLINE^TM. Минимальную среду C.R.A.P. получали следующим образом: 3,57 г (NH₄)₂SO₄, 0,71 г цитрата Na-2H₂O, 1,07 г KCl, 5,36 г дрожжевого экстракта и 5,36 г HYCASE SF-SHEFFIELD^TM смешивали, рН корректировали до 7,3 добавлением КОН и объем доводили до 872 мл добавлением деионизованной воды. Затем смесь автоклавировали и охлаждали до 55°С. После этого добавляли 110 мл 1М буфера MOPS при рН 7,3, 11 мл 50% глюкозы и 7,0 мл 1М MgSO₄.

Используемый здесь способ ферментации E.coli представляет собой процесс с высокой клеточной плотностью, описанный выше. Для достижения более высокой клеточной плотности непрерывно добавляли аммиак, а для поддержания клеточного роста на некоторых стадиях ферментации могут быть добавлены дополнительные микроэлементы (например, Р, К, S и Mg). Снижение количества микроэлементов приводило к другому процессу, протекающему с более низкой конечной оптической плотностью бульона с таким же качеством продукта, который был назван процессом с низкой клеточной плотностью.

Один сосуд, содержащий 1,5 мл культуры в 10-15% ДМСО, оттаивали на 1-литровой шейкерной колбе, содержащей 500 мл среды LB, в которую было добавлено 0,5 мл раствора тетрациклина (5 мг/мл) и 2,5 мл 1М раствора фосфата натрия. Эту посевную культуру культивировали в течение примерно 16 часов при 30°С, а затем использовали для инокуляции 10-литрового ферментера.

Этот ферментер сначала содержал примерно 6,5 л среды, включающей приблизительно 4,4 г глюкозы, 100 мл 1М сульфата магния, 10 мл раствора микроэлементов (100 мл соляной кислоты, 27 г гексагидрата хлорида железа, 8 г гептагидрата сульфата цинка, 7 г гексагидрата хлорида кобальта, 7 г дигидрата молибдата натрия, 8 г пентагидрата сульфата меди, 2 г борной кислоты и 5 г моногидрата сульфата марганца в конечном объеме 1 литр), 20 мл раствора тетрациклина (5 мг/мл в этаноле), 10 мл FERMAX ADJUVANT 27^TM (или несколько эквивалентов противовспенивающего агента), 1 упаковка HCD-соли (37,5 г сульфата аммония, 19,5 г двухосновного фосфата калия, 9,75 г дигидрата одноосновного фосфата натрия, 7,5 г дигидрата цитрата натрия и 11,3 г одноосновного фосфата калия) и 200 г NZ Амина А (гидролизат белка). Ферментацию осуществляли при 30°С со скоростью потока воздуха 10 мл/мин, а рН регулировали так, чтобы его величина составляла 7,0±0,2 (хотя в некоторых случаях она может выходить за пределы этого значения. Обратное давление в ферментере и скорость перемешивания варьировалась для регуляции скорости поступления кислорода, а следовательно, и частоты клеточного дыхания.

После инокуляции ферментера клеточной средой, взятой из шейкерной колбы, эту культуру культивировали в ферментере до достижения высокой клеточной плотности с использованием компьютерных алгоритмов, разработанных для подачи концентрированного раствора глюкозы в ферментер. Для коррекции рН, если это необходимо, в ферментер также подавали гидроксид аммония (58% раствор) и серную кислоту (24% раствор). В некоторых случаях для предотвращения пенообразования добавляли противовспенивающий агент для предотвращения пенообразования. После достижения клеточной плотности культуры примерно OD550=40 в ферментер добавляли еще 100 мл 1М сульфата магния. Кроме того, когда OD550 культуры достигала приблизительно 20, в ферментер при начальной скорости 2,5 мл/мин добавляли концентрированную соль (состоящую приблизительно из 10 г сульфата аммония, 26 г двухосновного фосфата калия, 13 г одноосновного дигидрата фосфата натрия, 2 г дигидрата цитрата натрия и 15 г одноосновного фосфата калия в 1 л воды), и это добавление продолжали до тех пор, пока объем ферментации не достигал 1250 мл. Ферментацию обычно осуществляли за 72-80 часов.

В процессе ферментации после того, как уровень растворенного кислорода достигал заданного значения, для регуляции концентрации растворенного кислорода на этом заданном уровне подавали концентрированный раствор глюкозы, исходя из зондирующего сигнала, указывающего на уровень растворенного кислорода. Следовательно, в этой схеме регуляции изменение рабочих параметров ферментера, таких как скорость перемешивания или обратное давление, которые влияют на объем переноса кислорода при ферментации, приводит соответственно к изменению скорости поглощения кислорода или скорости метаболических процессов в клетке.

Для мониторинга состава отходящего газа из ферментера использовали масс-спектрометр, что позволяло вычислять поглощение кислорода и скорость выделения двуокиси углерода в процессе ферментации.

Когда культура достигала клеточной плотности приблизительно OD550=220, то начальную скорость перемешивания 1000 об/мин снижали до примерно 725 об/мин в течение приблизительно 12 часов.

При ферментации клеток, трансформированных рМS421 и рсус34 (где для регуляции экспрессии тяжелой и легкой цепей использовали промотор tacII), или клеток, трансформированных рМS421 и плазмидой с двумя промоторами рхCD18-7Т3 (где для регуляции экспрессии тяжелой цепи использовали промотор tacII), приблизительно в течение 12 часов, после того, как данная культура достигала клеточной плотности OD550=220, добавляли 50 мл 200 мМ IPTG в целях индуцирования синтеза тяжелой и легкой цепей для рсус34 и синтеза тяжелой цепи для рхCD18-7Т3.

Результаты

А. Обнаружение и идентификация продуктов расщепления легкой цепи каппа

Растворимые экстракты E.coli (см. HSE в разделе "Материалы и методы") и оставшиеся осадки, суспендированные в буфере для ДСН-образцов (коммерчески доступный продукт для электрофореза в ДСН-геле), анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Эти образцы получали из 20 OD-мл-осадков, собранных в процессе ферментации E.coli с высокой клеточной плотностью (HCD) для штамма 49А5, несущего плазмиду рS1130, продуцирующую rhuFab'2 LZ(хCD18). В растворимой фракции был идентифицирован фрагмент расщепления LC каппа, имеющий длину в 115 аминокислот. В нерастворимой фракции был идентифицирован фрагмент расщепления LC каппа, имеющий длину в 182 аминокислот. Все фрагменты переносили на мембрану PVDF и секвенировали. Оба эти фрагмента имели "правильные" N-концы в виде процессированной формы каппа-LC. Массы определяли с помощью масс-спектрометрического анализа, и эти массы составляли 12488,5 и 19857,2 Да соответственно. Сайты протеолитического расщепления находились между остатками Val115 и Phe116 для LC-115 и между остатками Ser182 и Lys183 для LC-182. Лишь один сайт имел вид, аналогичный типичному сайту расщепления Prc.

Другой 20 OD-мл-осадок, полученный в конце этой ферментации, анализировали с помощью электрофореза в двумерном геле. Лизат клеточного осадка E.coli (˜40 мкг белка) объединяли с раствором для повторной гидратации, как описано Champion et al. (см. выше). На образцах клеток в двумерном геле, полученных после ферментации 49А5/рS1130, были идентифицированы пятна, соответствующие легкой цепи каппа, путем сравнения "продукционного" геля с контрольным двумерным гелем, полученным после ферментации клеточных осадков (49А5/рВR322) в тот же самый момент времени. Эти осадки отбирали в одно и то же время от двух партий ферментации, в предположении, что эти клетки должны находиться в сравнимых метаболических фазах. Все пятна для LC каппа были идентифицированы посредством иммуноблоттинга с использованием антитела против человеческой LC-каппа, конъюгированной со щелочной фосфатазой.

Помимо двух главных "клипов" (фрагментов расщепления), идентифицированных путем анализа в одномерном геле, анализ в двумерном геле обнаруживал интактную LC, изоформу интактной LC и, по крайней мере, 5 более мелких LC-клипов (см. фигуру 6). Соответствующие пятна элюировали и секвенировали. Все LC-специфические пептиды имели "правильный" N-конец, что указывало на то, что они были надлежащим образом процессированы, то есть сигнальная последовательность STII была отщеплена. Все эти пептиды были проанализированы на масс-спектрометре для измерения их приблизительной массы. Из-за присутствия следовых количеств мелких клипов не могло быть получено точное значение массы, необходимое для определения сайтов расщепления этих фрагментов.

Три небольших клипа образовывали кластер с клипом LC-115 каппа при значении pI, равном примерно 9. Четвертый клип имел значение pI примерно 6,5, а пятый клип имел то же самое значение pI, как и клип LC-182, равное примерно 6. Для оценки растворимости этих LC-фрагментов на двумерный гель наносили HSE идентичного осадка. Фрагмент LC182 присутствовал только в нерастворимой фракции.

В. Prc представляет собой единственную протеазу, ответственную за расщепление легкой цепи каппа

Проводили сравнение одномерных гелей ДСН-ПААГ, нагруженных нерастворимой фракцией клеток, происходящих от четырех различных партий ферментации протеазных мутантов E.coli, 49А5, 45F8, 41Н11 и 43Н1, экспрессирующих молекулу анти-CD18 Fab'2-LZ. Протеолитическое расщепление LC-182 наблюдалось в трех из четырех образцов (но не в штамме 43Н1 с prc-делецией, что указывало на то, что протеаза Prc может участвовать в расщеплении LC каппа. Пик 1, который соответствовал клипу LC-115, присутствующему в образцах, полученных от штамма 49А5 (prc-плюс), также исчезал из образцов 43Н1, как было определено из сравнения хроматограмм, полученных с помощью анализа с использованием AMES^TM/двух ОФ-колонок. Этот анализ позволяет селективно адсорбировать молекулы антитела, содержащие LC каппа, а затем проводить их разделение на пять пиков, как описано в разделе "Материалы и методы".

При проведении анализа двумерного геля с клеточным осадком, происходящим от штамма 43Н1, было обнаружено, что в этом геле отсутствовали не только фрагменты LC-115 и LC-182, но также и другие небольшие молекулы, относящиеся к LC (см. фигуру 7). Этот результат точно подтвердил, что Prc является ферментом, ответственным лишь за расщепление LC каппа. Клеточный осадок 43Н1 был получен в результате ферментации с низкой клеточной плотностью.

С. Конструирование штамма для подтверждения того, что Prc является ферментом, участвующим лишь в расщеплении легкой цепи каппа

1. Преобразование штамма с prc-делецией в prc-плюс-штамм

Подтверждение того, что Prc является ферментом, участвующим лишь в расщеплении LC каппа, было получено путем репарации штамма 43Н1 (prc-минус-хозяина с четырьмя протеазными маркерами) с образованием prc-плюс-штамма, то есть штамма с тремя протеазами (58Н2). Штамм 43Е3 несет eda-51::Tn10 и является ко-трансдуцибельным prc. Штамм 43Н1 был трансформирован в tet^r-штамм посредством фага Р1, выращенного на штамме 42Е3. Полученный штамм (58F9) был репарирован в отношении мутации prc::kan^r, а поэтому он становился kan^s-штаммом. Затем этот штамм высевали на минимальную среду с глюкуроновой кислотой для удаления eda::Tn10. Этот новый сконструированный штамм, 58Н2, становился мутантом с тремя протеазами и prc дикого типа. Этот изолят является либо трансдуктантом, либо спонтанным Eda⁺-изолятом. prc-плюс-генотип подтверждали с помощью ПЦР. Этот штамм 58Н2, кроме того, несет prc-супрессор (spr^W148R), происходящий от 43Н1, и является kan-чувствительным (kan^s). Повторное появление LC-клипов в этом штамме 58Н2 было обнаружено посредством анализа с использованием AMES^TM/двух ОФ-колонок (см. фиг. 8).

2. Ген prc был делетирован из нативного штамма и превращался в prc-минус-штамм

Штамм 49А5 представляет собой prc-штамм дикого типа, описанный выше. После внесения prc-делеции в этот штамм, используемый как основа для создания штамма 58В3, и после проведения анализа клеточных экстрактов методом с использованием AMES^TM/двух ОФ-колонок было обнаружено, что фрагмент LC-115 (пик 1) исчез. Штамм 58В3 был получен из штамма 33В6, который несет только протеазный маркер DegP. Δprc::pS1080 (Bass et al., см.выше; Metcalf et al., Gene, 138:1-720 (1994)) вводили в kan^s-производное штамма 33В6 (56G4) путем трансдукции с использованием Р1, в результате чего получали штамм с двумя протеазами degP- и Δprc, 59А7.

Результаты расщепления всех семи штаммов систематизированы в таблице 1.

D. Увеличение выхода rhuFab'2 LZ(хCD18) в prc-минус-хозяевах

1. Результаты культивирования в шейкерной колбе

Три штамма (49А5, 43Н1 и 58Н2), экспрессирующие rhuFab'2 LZ(хCD18) сначала культивировали в бульоне LB+Amp в течение ночи при 30°С. Затем все культуры были одинаково инокулированы в шейкерные колбы, содержащие 25 мл минимальной среды С.R.А.Р.+Amp и продолжали культивировать со встряхиванием в течение ночи при 30°С. Затем 20 OD-мл-осадок собирали и получали растворимые лизаты (HSE). 25 мл из 530 мкл наносили на AMES^TM/обращенно-фазовые колонки.

На фигуре 8 представлена гистограмма, иллюстрирующая пять пиков, полученных с помощью указанного анализа. По оси Y отложена площадь под конкретными пиками, 1-5 (см. "Материалы и методы"). На оси Х показаны штаммы-продуценты rhuFab'2 LZ(хCD18). Оба prc⁺-штамма, 49А5 и 58Н2, продуцировали почти равные количества продукта и оба они обнаруживали почти равные количества фрагмента LC-115 (пик 1) по сравнению с Δprc-штаммом (43Н11), который почти не продуцировал продукта с пиком 1 и продуцировал большее количество продукта с пиком 5. На этом графике показано распределение фрагментов антител. У хозяина 43Н1 наблюдались более высокие количества растворимой интактной LC и димера LC, чем у хозяев 49А5 и 58Н2. В шейкерных колбах prc-хозяин продуцировал почти в 5 раз больше продукта rhuFab'2 LZ(хCD18), чем нативные prc-штаммы.

2. Результаты ферментации

Средний титр rhuFab'2 LZ(хCD18), полученный при стандартной ферментации с высокой клеточной плотностью (HCD), составлял 893 мг/л у prc-хозяина дикого типа (495А5, n=6), как показал анализ с использованием AMES^TM/двух ОФ-колонок. При ферментации 43Н1/рS1130 наблюдалось почти двухкратное увеличение титра. Не претендуя на какую-либо конкретную теорию, резкое различие между титрами при культивировании в шейкерной колбе (5х) и при ферментации (< или =2х) у хозяев 43Н1 и 49А5 соответственно можно, вероятно, объяснить различием в эффективности секреции продуктов. При анализе всех лизатов осадков в шейкерной колбе было установлено, что лишь 50% фрагментов антител было правильно процессировано в исходном prc-плюс-штамме, тогда как лизат, происходящий от клеток 43Н1, культивированных в шейкерной колбе, или от всех клеток, полученных в процессе ферментации (prc-плюс и -минус-штаммы), обнаруживал 100% процессинг. Было установлено, что процессинг белка Prc был secY-, secA-зависимым (Hara et al., 1991, см. выше). Не претендуя на какую-либо конкретную теорию, можно сделать вывод, что результаты, полученные при культивировании в шейкерной колбе, указывают на то, что белок Prc конкурирует с фрагментами антитела за транслокацию.

3. Измерение общей экспрессии фрагментов антитела

Анализ с использованием колонки POROS^TM всех образцов в бульоне для ферментации был разработан, как описано в разделе "Материалы и методы" для оценки эффективности укладки и сборки антитела. При сравнении равных инжекций всех образцов бульона для трех анти-CD18 фрагментов, полученных в результате HCD-ферментации в различных хозяевах, было установлено, что при ферментации 43Н1 экспрессировалось такое же количество НС, как при ферментации 49А5, но большее количество интактной каппа-LC (см. таблицу 2). При этом для 43Н1 титр rhuFab'2 LZ(хCD18) составлял 1830 мг/л, а для 49А5 этот титр составлял 887,8 мг/л. В результате ферментации 59А7 продуцировались не только дополнительные фрагменты антитела, но также был получен самый высокий титр rhuFab'2 LZ(хCD18), составляющий 2403 мг/л.

Таблица 2 Общая экспрессия фрагментов антител и титры Fab'2-LZ для различных штаммов, экспрессирующих rhuFab'2 LZ(хCD18), в стандартном процессе HCD-ферментации
Образцы фермен- тации	Хозяин	Общее количество LC (г/л)	Общее количество НС (г/л)	Общее количество НС+LC (г/л)	Fab'2-LZ (мг/л)	Время (часы)
1	49A5	2,23	2,27	4,5		40
2	"	4,75	3,96	8,71	887,8	72
3	43H1	6,57	4	10,57		62
4	"	7,38	4,18	11,56	1830	72
5	59A7	12,49	6,87	19,36		68
6	"	13,76	7,46	21,22	2403	72

Е. Prc-суппрессор необходим для выживания в стационарной фазе

Было обнаружено, что штамм 58В3, несущий делеции degP и prc, подвергался лизису во время пролонгированной стационарной фазы роста при HCD-ферментации, при которой экспрессируются молекулы анти-CD18 Fab'2-LZ. Лизис клеток начинался через 50 часов после инокуляции. Эти клетки продуцировали лишь 320 мг/л rhuFab'2 LZ(хCD18), тогда как при ферментации 59А7/рS1130 поддерживался их хороший рост в стационарной фазе на протяжении почти 72 часов HCD-ферментации, в результате чего достигалась высокая клеточная плотность (примерно 300 OD₅₅₀-мл). На фигуре 9 представлено сравнение роста клеток в двух указанных процессах ферментации. В этом исходном штамме наблюдалась также очень высокая экспрессия фрагментов НС и LC, которая приводила к увеличению выхода молекулы rhuFab'2 LZ(хCD18), составляющего 2403 мг/л. И в этом случае, в образцах, происходящих от штаммов 58В3 и 59А7 с prc-делецией, каких-либо каппа-LC-клипов обнаружено не было.

prc-Супрессор (spr) (кодирующий Prc^sup) был предварительно выделен из штамма 40А6 (prc::kan spr) в виде спонтанной мутации, то есть в виде терморезистентного ревертанта мутанта с prc-делецией. После секвенирования гена и картирования конъюгата было обнаружено, что он локализован приблизительно в локусе 48 min на хромосоме E.coli. Нуклеотидная последовательность его ПЦР-продукта соответствует последовательности гена spr E.coli, описанной Hara et al., 1996, см., выше, за исключением одной точковой мутации в аминокислоте 148, где кодон TGG был заменен кодоном CGG, что привело к замене триптофанового остатка на аргинин (W148R). Этот prc-супрессор при его введении в штамм 59А7 несет мутацию W148R. Сообщалось, что ген spr дикого типа кодирует липопротеин оболочечной фракции, которая, как предполагается, представляет собой фермент, гидролизующий пептидогликан (Hara et al., 1996, см., выше).

Супрессор Prc вводили в штамм 59А7 путем присоединения к этому супрессору Tn10 и ко-трансдуктанты отбирали по их резистентности к тетрациклину и по их способности расти на планшетах со средой LB, содержащей половинную концентрацию ингредиентов и низкое количество соли при 42°С. Новая точковая мутация возникала во время удаления Tn10 из планшетов Malloy.

Исходя из результатов ферментации штамма 58В3 и штамма 59А7 для анти-CD18 Fab'2, было показано, что супрессор Prc необходим для успешного роста ΔPrc-мутанта, а особенно при ферментации E.coli с высокой клеточной плотностью. Штамм, обозначенный 58В3, имеет точно такой же генотип, как и 59А7 за исключением spr (W148R), и становится нежизнеспособным через 50 часов стандартной HCD-ферментации.

F. Мутант с Prc-делецией может иметь повышенные уровни продуцирования различных антител, обусловленные присутствием сайтов расщепления Prc

На фигуре 10 представлена "очеловеченная" последовательность LC каппа (SEQ ID NO:5). В таблице 3 также приводятся вычисленные значения pI возможных Prc-клипов.

Таблица 3 Вычисленные значения pI потенциальных Prc-клипов
Вычисленное значение pI	Сайт расщепления	Тип протеазы	LC-клипы
5,97	S/K	Серин-специфическая	LC-182
9,14	V/F	Prc	LC-115
9,14	S/V	Серин-специфическая	LC-114
9,14	V/A	Prc	LC-110

Не претендуя на какую-либо теорию, исходя из фиг.10 и таблицы 3, можно предположить, что протеаза Prc начинает расщеплять каппа LC с ее С-конца, 9 или 18 аминокислоты LC-последовательности, а затем постепенно гидролизует ее по направлению к N-концу, делая S/К-сайт доступным для действия серин-специфической протеазы. Возможно также, что другая молекула LC каппа (возможно в другом состоянии укладки) расщепляется, главным образом, до 115 аминокислот. Множество возможных продуктов расщепления имеют молекулярную массу и вычисленные значения pI, которые почти полностью соответствуют пятнам LC каппа, обнаруженным в двумерном геле.

На фиг.11 показано, что в штамме с prc-делецией (43Н1) отсутствует LC-182-клип, который присутствовал в клетках, экспрессирующих молекулы анти-VEGF Fab, анти-CD18 Fab'2-LZ, анти-CD18 Fab'2-LZ-6хHis и молекулы Fab'2-LZ-6хHis против тканевого фактора. Образцы для ферментации, происходящие от саb2826 (33В6/D3Н44-F(ab')2 и саb2826 (43Н1/D3Н44-F(ab')2), были подвергнуты ферментации с высокой плотностью клеток в целях осуществления экспрессии молекулы Fab'2-LZ-6хHis против тканевого фактора. Процесс ферментации проводили так же, как стандартный HCD-процесс, описанный выше для ферментации анти-CD18 Fab'2-LZ. Саb2793 был получен для ферментации 49А5/рАВ3 в целях экспрессии молекулы анти-CD18 Fab'2-LZ-6хHis. Саb2846 был получен для ферментации 41Н1/рS1130 в целях экспрессии молекулы анти-CD18 Fab'2-LZ. Ферментация JJ81 (43Н1/рY0317) и JJ67 (43Е7/рY0317) была проведена для получения анти-VEGF Fab. Саb2814 (49А5/рВR322) был получен для контрольной ферментации и содержал аналогичный плазмидный остов без генов, экспрессирующих антитело.

Осадки, полученные при 20-OD-ферментации, экстрагировали смесью Трис/EDTA/лизоцима для удаления растворимых HSE. Оставшийся осадок суспендировали в 400 мкл 1хДСН-буфере для образца и 20 мкл бетамеркаптоэтанола, а затем нагревали при 95°С на термоблоке в течение 5 минут. Затем 5 мкл загружали на 4-12% NUPAGE^тм гель. Штаммы 33В6, 41Н1, 49А5 и 43Е7 представляют собой prc-плюс-штаммы. Штамм 43Н1 представляет собой prc-минус-штамм. Все образцы, происходящие от нативного prc-штамма, имели 19,8-кД-продукт расщепления LC. Образец для ферментации саb2829 (33В6/рD3Н44ТВ), который экспрессировал анти-TF Fab, также обеспечивал детекцию фрагмента расщепления LC того же размера. Все эти фрагменты представляли собой секвенированные аминокислоты и было обнаружено, что они имеют "правильные" N-концевые последовательности LC.

G. Штамм 59А7 обнаруживает очень высокую степень экспрессии анти-CD18 His- и Lys-меченного Fab'2-LZ и цитоплазматического белка Аро2L в шейкерных колбах

Дополнительные данные, полученные в шейкерных колбах и представленные в таблице 4, показали, что штамм 59А7 экспрессировал рАВ3 (анти-CD18 His-меченный Fab'2-LZ) лучше, чем штаммы 43Н1 и 49А5. Штамм 59А7 экспрессировал рАВ21 (Lys-меченный Fab'2-LZ) в 2,4 раза лучше, чем штамм 33В6. Штаммы 59А7 и 43Н1 экспрессировали рS1130 (Fab'2-LZ без метки) в 2,9 раз лучше, чем штамм 49А5. Однако все результаты ферментации показали, что штамм 59А7 экспрессирует более высокие уровни рS1130, чем штамм 43Н1.

Для цитоплазматического белка, Аро2L, не являющегося антителом, удельная активность при экспрессии в штамме 59А7 примерно на 20-30% выше, чем в штамме 43Е7 (в шейкерных колбах). Поскольку штамм 43Е7 растет до более высокой оптической плотности OD550, то общий уровень экспрессии был аналогичным. Штамм 43Е7 представляет собой ompT ptr3 degP-штамм без prc и spr.

Н. Штамм 59А7 обнаруживает очень высокий уровень экспрессии при ферментации анти-CD18 Fab'2-LZ

В таблице 5 показано, что штамм 59А7 является более эффективным, чем 33D3 в отношении экспрессии анти-CD18 Fab'2-LZ из плазмиды с двойным промотором рхCD18-7Т3 и является более эффективным, чем 49А5 в отношении экспрессии анти-CD18 Fab'2-LZ из плазмиды рсус34.

Обсуждение

В настоящей работе были проведены исследования по деградации каппа-LC в клетках E.coli, экспрессирующих молекулу анти-CD18 Fab'2-LZ. Предыдущие исследования позволили, в лучшем случае, выявить множество потенциальных субстратов Prc, но ни в одном из них не сообщалось о каких-либо фрагментах антитела, которые могут служить субстратами для этой протеазы. В настоящей работе было показано, что Prc представляет собой лишь протеазу, участвующую в расщеплении каппа LC в клетках E.coli. Очевидно, что белок Prc селективно расщепляет LC каппа на дискретных участках, что приводит к образованию двух главных "клипов" (LC-115 и LC-182) и пяти более мелких продуктов расщепления, на что указывали результаты, полученные с использованием двумерного геля. Поскольку наиболее крупными клипами был продукт S/К-расщепления, который не соответствовал характеристикам сайтов вырезания для Prc (Keiler et al., см. выше), то были проведены более тщательные исследования. В соответствии с настоящими исследованиями было обнаружено, что за деградацию легкой цепи каппа в клетках E.coli ответственна периплазматическая протеаза E.coli (Prc/Tsp). Продукты расщепления легкой цепи каппа были идентифицированы аналитическими методами (электрофореза в одномерном/двумерном ПААГ с ДСН, масс-спектрометрии и анализа посредством N-концевого секвенирования), осуществляемыми для экстрактов E.coli, полученных от различных дефицитных по протеолизу штаммов, экспрессирующих молекулу анти-CD18 F(ab)'2-LZ-лейциновая молния, в целях подтверждения того, что Prc/Tsp является единственной протеазой, ответственной за расщепление легкой цепи каппа.

Было обнаружено, что конкретная комбинация degP prc-делеции с prc-супрессором (spr-мутант) приводит к созданию уникального штамма E.coli, способного продуцировать очень высокие количества рекомбинантного белка или обеспечивать более высокую удельную активность этого белка, как было проиллюстрировано с использованием лиганда Аро2 и активного антитела.

Ферментация с использованием описанного здесь degP prc spr-штамма приводила к его росту до высокой клеточной плотности (до 300 OD или более) и к получению высоких выходов продукта rhuхCD18Fab'2-лейциновая молния по сравнению с экспрессией антител в штамме дикого типа или в других дефицитных по протеолизу штаммах.

Описанный здесь процесс ферментации позволяет продуцировать 100-200 г клеток/л из расчета сухой массы за 72 часа, при этом уровень активного антитела, продуцируемого в одном предпочтительном штамме 59А7, имеющем комбинацию degP prc spr, увеличивался на более чем 200%. Полный генотип штамма 59А7 представляет собой W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoCdegP41 IN(rrD-rrE)1 kan^s ilvG2096 (Val^r)Δprc spr^W148R. Его родительским штаммом является 58В3, который имеет генетические маркеры, идентичные маркерам штамма 59А7 за исключением того, что в нем отсутствуют prc-супрессор, spr. Штамм 58В3 неспособен сохранять рост в стационарной фазе процесса ферментации E.coli с высокой клеточной плотностью. Он продуцировал более низкий уровень продукта антител, чем нативный prc-штамм (49А5), который также несет маркер degP-делеции и другие генотипы, идентичные генотипам штамма 59А7, за исключением того, что 49А5 представляет собой резистентный к канамицину нативный prc-штамм, тогда как 59А7 представляет собой чувствительный к канамицину Δprc-штамм.

Таким образом было обнаружено, что присутствие prc-супрессора (spr) имеет важное значение для хорошего роста и продуцирования высокого уровня антитела в штамме с degP prc-делецией, особенно в процессе ферментации с высокой клеточной плотностью, а также в процессе ферментации с низкой клеточной плотностью.

Мутант по одной протеазе DegPΔ и другие штаммы, дефицитные по множеству протеаз, которые включают degPΔ, не продуцируют очень высокие уровни рекомбинантных продуктов. Эти два вышеупомянутых штамма, degP rhoA и degP prc, экспрессируют большее количество продукта, чем многие другие штаммы, с которыми было проведено сравнение, но все же не такое большое количество, как штамм 59А7. Более конкретно, штамм, в котором отсутствует супрессор spr, то есть штамм 58В3 с комбинацией degP prc не обнаруживает какого-либо улучшения в продуцировании фрагментов антитела, как это было продемонстрировано молекулой анти-CD18 Fab'2-LZ.

Результаты анализа подтвердили, что за расщепление LC каппа в клетках E.coli, экспрессирующих "очеловеченную" молекулу анти-CD18 F(ab)'2-лейциновая молния, ответственен периплазматический С-концевой подвергающийся процессингу белок (Prc). Этот белок Prc является единственной протеазой, ответственной за расщепление легкой цепи каппа, что было подтверждено электрофорезом в двумерном геле и генетической модификацией штаммов, продуцирующих это антитело. Подтверждение того, что протеаза Prc действительно является единственным ферментом, участвующим в расщеплении LC каппа, было получено путем репарации Δprc-штамма с образованием нативного prc-штамма, в результате чего снова появлялись продукты расщепления LC каппа. Аналогичным образом, при делеции гена prc из нативного prc-штамма продукты расщепления LC исчезали. Конструирование обоих штаммов осуществляли путем Р1-трансдукции.

Дополнительное подтверждение давало сравнение титров молекул анти-CD18 Fab'2-лейциновая молния, происходящих от протеолитических мутантов E.coli, содержащих или не содержащих prc-делецию. Эти данные показали, что штамм 59А7 экспрессирует более высокие уровни антитела. Описаны различные нуклеиновые кислоты, сконструированные для экспрессии молекулы анти-CD18 Fab'2-лейциновая молния; при этом все экспрессирующие плазмиды, трансформированные в штамм 59А7, продуцировали более высокие уровни фрагментов антитела по сравнению с мутантом по одной протеазе degPΔ или degP prc-мутантом без spr. Другой штамм 43Н1, который имеет генотип degP prc spr, помимо ompT и ptr3-мутаций, был также неспособен к хорошему росту, как и штамм 59А7, хотя штамм 43Н1 имеет такую же spr-мутацию, как и штамм 59А7, то есть в положении 520 он имеет замену Т на С, что приводит к замене аминокислоты W на R в положении 148. Этот штамм продуцировал анти-CD18 Fab'2-LZ с более высоким титром, чем degP-штамм (49А5), но все же не таким высоким, как титр, продуцированный штаммом 59А7 в ферментере.

Сообщалось, что протеаза Prc расщепляет свои субстраты в ряде дискретных сайтов, но с довольно широкой специфичностью последовательности (Keiler et al., см. выше). Было обнаружено, что сайты расщепления Prc во фрагменте каппа-LC локализованы в константной области, которая составляет каркасную последовательность, обычно используемую для конструирования различных плазмид, экспрессирующих "очеловеченное" антитело. Исходя из полученных данных, можно предположить, что мутант с Prc-делецией должен давать более высокий титр фрагментов различных антител, таких как Fab, Fab', Fab'2 (с лейциновой молнией или без нее), включая полноразмерное антитело, экспрессируемое клетками Escherichia coli. При этом предполагается, что фрагмент антитела, фланкированный последовательностью His-метки или Lys-метки у С-конца НС, может также оказаться эффективным.

Было обнаружено, что штамм 59А7 является более эффективным, чем штамм 49А5, в отношении экспрессии рАВ3 и более эффективным, чем штамм 43Е7, в отношении специфической экспрессии цитоплазматического белка Аро2L в шейкерных колбах, а также более эффективным, чем штаммы 43Н1 и 49А5, в отношении экспрессии рS1130 и рсус34 (аналог рS1130 с промотором tacII) при ферментации. Кроме того, в отношении экспрессии плазмиды с двойным промотором рхCD18-7Т3 этот штамм является более эффективным, чем штамм 33D3.

Пример 2

Материалы и методы

А. Экспрессирующие плазмиды

Плазмида D344-F(ab')2 описана в примере 1. Плазмида рY0317tet20 описана в примере 1.

В. Штаммы

Штамм, используемый для экспрессии xVEGF Fab, был аналогичен другим штаммам, описанным в примере 1. Он представляет собой производное W3110 E.coli и был обозначен 60С1. Полный генотип штамма 60С1 представляет собой: W3110 ΔfhuA Δ(argF-lac)169 ptr3 degP41 Kan^s ΔompT ilvG2096 (Val^r) Δ(nmpc-fepE)ΔssrA. Этот штамм аналогичен штамму 45F8 и несет три протеазных маркера без prc.

Все штаммы 43Н1, 59А7 и 33В6 описаны в примере 1.

С. Метод культивирования.

Культивирование в шейкерных колбах осуществляли, как описано в примере 1. Рост культур, экспрессирующих молекулу xTF Fab'2-LZ-6хhis, в шейкерной колбе продолжался до 42 часов при 30°С, и на различных стадиях этого роста брали две серии образцов для сравнения. Для сравнения экспрессии xVEGF-Fab культивировали дубликаты культур и образцы брали лишь через 24 часа.

D. Идентификация белка

Электрофорез в двумерном геле проводили, как описано в примере 1.

Результаты

Данные, полученные для культур в шейкерной колбе, представлены ниже в таблице 6. Как очевидно из примера 1, где описано продуцирование rhuFab'2 LZ(хCD18), Prc-штаммы 43Н1 и 59А7 были более продуктивными, чем Prc⁺-штаммы 60С1 и 33В6, в отношении количеств продуцируемых продуктов (анти-VEGF Fab' и Fab'2-LZ-6хhis против тканевого фактора).

На фиг.12 представлен двумерный гель, показывающий, что в штамме с prc-делецией (штамм 59А7, prc-минус-штамм), экспрессирующем анти-VEGF Fab (рY0317tet20), отсутствовали расщепленная анти-VEGF LC и два расщепленных xVEGF-НС-фрагмента (обнаруживаемые в prc-плюс-штамме), хотя в 59А7 были обнаружены два отдельных НС-клипа, которые представляли собой либо OmpT-, либо Рtr3-расщепленные продукты. На фиг.13 представлен двумерный гель, показывающий, что штамм 60С1 (prc-плюс-штамм), экспрессирующий анти-VEGF Fab (рY0317tet20) в виде гетерологичного полипептида, содержал множество расщепленных анти-VEGF LC-фрагментов и два расщепленных НС-фрагмента.

1. Бактерия E.coli, продуцирующая гетерологичный полипептид, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид, дефицитная по хромосомным генам degP и prc, кодирующим протеазы DegP и Prc соответственно, и имеющая мутантный ген spr, который включает последовательность супрессора ргс (spr) E.coli (кодирующий Prc^sup), с точковой мутацией W148R, где кодон TGG заменен на CGG, что приводит к замене триптофана на аргинин в положении аминокислоты 148.

2. Бактерия по п.1, которая не является дефицитной по хромосомному гену ptr3, кодирующему протеазу III, и/или по хромосомному гену ompT, кодирующему протеазу OmpT.

3. Бактерия по п.1, где указанный гетерологичный полипептид является чувствительным к протеолизу.

4. Бактерия по п.1, где указанным гетерологичным полипептидом является эукариотический полипептид.

5. Бактерия по п.4, где указанным гетерологичным полипептидом является полипептид млекопитающего.

6. Бактерия по п.1, где указанная нуклеиновая кислота включена в бактерию путем трансформации бактериальной клетки.

7. Способ продуцирования гетерологичного полипептида, предусматривающий (а) культивирование бактерии E.coli, которая является дефицитной по хромосомным генам degP и prc, кодирующим протеазы DegP и Prc соответственно, и имеющая мутантный ген spr, который включает последовательность супрессора ргс (spr) E.coli (кодирующий Prc^sup), с точковой мутацией W148K, где кодон TGG заменен на CGG, что приводит к замене триптофана на аргинин в положении аминокислоты 148, где указанная бактерия включает нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, являющийся гетерологичным для данной бактерии, так, чтобы указанная нуклеиновая кислота могла экспрессироваться, и (b) выделение указанного гетерологичного полипептида из этой бактерии.

8. Способ по п.7, где указанный гетерологичный полипептид является чувствительным к протеолизу.

9. Способ по п.8, где указанное культивирование осуществляют в ферментере.

10. Способ по п.9, где указанное культивирование осуществляют в условиях ферментации с высокой клеточной плотностью.

11. Способ по п.9, где указанное культивирование осуществляют в условиях ферментации с низкой клеточной плотностью.

12. Способ по п.7, где указанный гетерологичный полипептид выделяют из периплазмы или из культуральной среды указанной бактерии.

13. Способ по п.7, где указанным гетерологичным полипептидом является антитело или лиганд Аро2.

14. Способ по п.13, где указанным гетерологичным полипептидом является антитело.

15. Способ по п.14, где указанным антителом является «очеловеченное» антитело.

16. Способ по п.14, где указанным антителом является полноразмерное антитело.

17. Способ по п.14, где указанным антителом является анти-CD18 антитело, анти-VEGF антитело, антитело против тканевого фактора, антитело 2С4, анти-Her-2 антитело, анти-СD20 антитело, анти-СD40 антитело или анти-СD11а антитело.

18. Способ по п.14, где указанным антителом является фрагмент антитела.

19. Способ по п.18, где указанный фрагмент антитела имеет легкую цепь.

20. Способ по п.19, где указанной легкой цепью является легкая цепь каппа.

21. Способ по п.18, где указанным фрагментом антитела является Fab, Fab', Fab'2 или гибрид «Fab'2-лейциновая молния».

22. Способ по п.21, где указанным фрагментом антитела является гибрид «анти-СD18 Fab'2-лейциновая молния», гибрид «Fab'2 против тканевого фактора - лейциновая молния» или анти-VEGF Fab, где указанные фрагменты имеют или не имеют гистидиновую или лизиновую метку.

23. Способ по п.21, где указанным фрагментом антитела является гибрид анти-CD18 Fab'2-лейциновая молния, гибрид «Fab'2 против тканевого фактора - лейциновая молния» с 6-гистидиновой меткой, анти-VEGF Fab, гибрид «анти-СD18 Fab'2-лейциновая молния» с 6-гистидиновой меткой или гибрид анти-СD18 Fab'2-лейциновая молния с 6-лизиновой меткой.