Способ отбора клеток растения диоскореи дельтовидной (dioscorea deltoidea wall) in vitro с повышенным содержанием стероидов
Владельцы патента RU 2288575:
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности, сельском хозяйстве и в исследовательских целях. Клетки диоскореи дельтовидной культивируют на агаризованной среде в присутствии 25-оксихолестерина. Сначала культивирование осуществляют при концентрации 25-оксихолестерина 0,04-0,06 мкМ в течение 4-5 недель до получения колоний размером не менее 1 мм, а затем клетки пересаживают на среду с концентрацией 25-оксихолестерина 0,09-0,11 мкМ и культивируют в течение 5-6 месяцев до получения желтоокрашенного каллуса массой не менее 200 мг. После этого каллус переводят в жидкую питательную среду без 25-оксихолестерина и культивируют 2-3 месяца. 1 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности, сельском хозяйстве и для фундаментальных исследований в физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений.
Известен способ получения диосгенина путем обработки клеток диоскореи дельтовидной, штамма ИФР Д1, химическим мутагеном N-нитрозо-N-метилмочевиной (N-HMM) в концентрации 0,25-30 мМ (Авт. Свид. №440404, от 25.08.1974 г.).
Отбирают штаммы с ускоренным темпом роста и накопления биомассы и, как следствие, с большей общей продуктивностью.
Подход, представленный в вышеназванном способе, недостаточен, так как подразумевает отбор случайных продуктивных вариантов.
Известен способ отбора штамма культивируемых клеток растения диоскореи дельтовидной ИФР ДМ0.5. Получен после обработки клеток исходного штамма ИФР Д1 стимулирующей рост дозой N-HMM 0,5 мМ в час, и отбора интенсивно растущего каллуса, используемого для получения стероидных сапонинов с агликоном диосгенином (Каранова С.Л., Носов А.М., Пауков В.Н., Шамина З.Б. Продуктивность различных клеточных линий диоскореи дельтовидной. В кн.: "Культура клеток растений и биотехнология", М.: Наука, 1986, стр.83-87). Образец для сравнения представлен в табл.1.
Однако селекция штаммов этим способом неудовлетворительна.
В настоящее время, помимо мутагенеза и клеточной селекции, может быть использован генно-инженерный подход. Однако, во-первых, трансформация старой дедифференцированной культуры клеток растений затруднена. Кроме того, в работе (Поройко В.А., Рукавцевой Е.Б., Орловой И.В., Бурьянова Я.И. Фенотипические изменения трансгенных растений табака с антисмысловой формой гена hmgI // Генетика, 2000, т.36, 39, стр.1200-1205) были получены трансгенные растения табака после введения гетерологичного гена hmgI (один из генов, контролирующий активность ОМГКоАРе) в нормальной и антисмысловой ориентации. Введение гена в нормальной ориентации привело к увеличению количества суммарных стеринов всего на 21% по сравнению с контролем. Введение гена в антисмысловой ориентации отрицательно сказывалось на росте, развитии, репродуктивной сфере растений.
Задачей изобретения является разработка нового способа отбора клеток растения диоскореи дельтовидной in vitro с повышенным содержанием изопреноидов, в частности, стероидов: агликона диосгенина и его предшественников-стеринов.
Эта задача решается новым способом отбора клеток растения диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea Wall) in vitro с повышенным содержанием стероидов, заключающимся в том, что клетки растения диоскореи дельтовидной культивируют на агаризованной питательной среде в присутствии химического вещества, причем в качестве химического вещества используют 25-оксихолестерин, культивирование проводят ступенчатым образом: сначала при концентрации 25-оксихолестерина 0,04-0,06 мкМ в течение 4-5 недель до получения жизнеспособных колоний размером не менее 1 мм, затем пересаживают их на среду с концентрацией 25-оксихолестерина 0,09-0,11 мкМ и культивируют в течение 5-6 месяцев до получения желтоокрашенного каллуса массой не менее 200 мг, после чего каллус переводят в жидкую питательную среду без 25-оксихолстерина и культивируют не менее 2-3 месяцев.
Сущность изобретения состоит в том, что отбор клеток осуществляют с использованием 25-оксихолестерина - специфического ингибитора одного из ключевых ферментов биосинтеза изопреноидов -3-окси-3-метилглутарил-коэнзимА-редуктазы (ОМГКоАРе), который контролирует первый этап ацетатно-мевалонатного пути биосинтеза изопреноидов - необратимое восстановление мевалоновой кислоты, а затем метаболизм направлен в сторону изопреноидного биосинтеза.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Сначала клетки диоскореи дельтовидной высевают на агаризованную питетельную среду, содержащую 0,05 мкМ 25-оксихолестерина. Через 4 недели единичные выжившие и подросшие колонии, размером не менее 1 мм, пересаживают на агаризованную питательную среду, содержащую 25-оксихолестерин в концентрации 0,1 мкМ. При этом образуются жизнеспособные, хорошо растущие более окрашенные колонии (желтоватые). Через 5 месяцев культивирования (5 пассажей) каллусы достигают массы (около 200 мг), и их переводят на жидкую питательную среду без 25-оксихолестерина и культивируют 2 месяца. В результате получают клеточную линию ИФР ДМ0.5ОХР(О).
Пример 2. Сначала клетки диоскореи дельтовидной высевают на агаризованную питательную среду, содержащую 0,04 мкМ 25-оксихолестерина. Через 4,5 недели единичные выжившие и подросшие колонии, размером не менее 1 мм, пересаживают на агаризованную питательную среду, содержащую 25-оксихолестерин в концентрации 0.0 мкМ. При этом образуются жизнеспособные, хорошо растущие колонии окрашенные (желтоватые). Через 5,5 месяцев культивирования (5 пассажей) каллусы достигают массы (около 200 мг), и их переводят на жидкую питательную среду без 25-оксихолестерина и культивируют 2,5 месяца. В результате получают клеточную линию ИФР ДМ0.5ОХР(О).
Пример 3. Сначала клетки диоскореи дельтовидной высевают на агаризованную питетельную среду, содержащую 0,05 мкМ 25-оксихолестерина. Через 5 недель единичные выжившие и подросшие колонии, размером не менее 1 мм, пересаживают на агаризованную питательную среду, содержащую 25-оксихолестерин в концентрации 0.11 мкМ. При этом образуются жизнеспособные, хорошо растущие колонии, которые были более окрашенные (желтоватые). Через 6 месяцев культивирования (5 пассажей) каллусы достигают массы около 200 мг, и их переводят на жидкую питательную среду без 25-оксихолестерина и культивируют 3 месяца. В результате получают клеточную линию ИФР ДМ0.5ОХР(О)
Анализ образцов проводят методом хромато-масс-спектрометрии в стандартных условиях анализа стероидов. Сравнительные результаты исследования приведены в таблице.
| Табл. | ||
| Стероид | Абсолютное содержание в пробе, мас.% | Относительное содержание % |
| ИФРДМ 0,5 ОХР (0) | ||
| Диосгенин | 1,150 | 55,31 |
| Ямогенин | 0,131 | 6,30 |
| Ситостерин | 0,164 | 7,88 |
| Ангидро-диосгенин | 0,259 | 12,45 |
| Кампестерин | 0,338 | 16,24 |
| Холестерин | 0,038 | 1,81 |
| Итого | 2,08 | 100 |
| ИФРДМ 0,5 | ||
| Диосгенин | 0,680 | 51,22 |
| Ямогенин | 0,343 | 25,89 |
| Ситостерин | 0,102 | 7,65 |
| Ангидро-диосгенин | 0,150 | 11,28 |
| Кампестерин | 0,047 | 3,55 |
| Холестерин | 0,0055 | 0,42 |
| Итого | 1,33 | 100 |
Результаты таблицы показывают, что линия ИФРДМ 0,5 ОХР(0), отселектированная на 25-оксихолестерине, характеризуется изменением уровня биосинтеза стероидных соединений, по сравнению с исходным для селекции штаммом ИФРДМ 0,5: в 1,7 раза больше диосгенина; в 2,6 раза меньше ямогенина, в 1,6 раза больше ситостерина; в 7,2 раза больше кампестерина; в 6,9 раза больше холестерина.
Способ отбора клеток растения диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea Wall) in vitro с повышенным содержанием стероидов, заключающийся в том, что клетки растения диоскореи дельтовидной культивируют на агаризованной питательной среде в присутствии химического вещества, отличающийся тем, что в качестве химического вещества используют 25-оксихолестерин, культивирование проводят ступенчатым образом: сначала при концентрации 25-оксихолестерина 0,04-0,06 мкМ в течение 4-5 недель до получения жизнеспособных колоний размером не менее 1 мм, затем пересаживают их на среду с концентрацией 25-оксихолестерина 0,09-0,11 мкМ и культивируют в течение 5-6 месяцев до получения желтоокращенного каллуса массой не менее 200 мг, после чего каллус переводят в жидкую питательную среду без 25-оксихолестерина и культивируют 2-3 месяца.
