Способ индукционной гипертермии плотных опухолей в эксперименте

Изобретение относится к медицине и предназначено для индукционной гипертермии в эксперименте Магнитоуправляемый препарат смешивают с цитостатическим средством алкераном. Полученную смесь вводят в зону локализации плотных опухолей. Одновременно с нагревом тела млекопитающего, преимущественно нагревают опухоль. Способ позволяет уменьшить объем плотных опухолей при отсутствии токсических проявлений. 3 табл.

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в онкологии для лечения плотных опухолей различной локализации в эксперименте.

Известен способ индукционной гипертермии злокачественных опухолей животных в переменном магнитном поле: после внутриопухолевого введения магниговосприимчивых частиц млекопитающее, покрытое электроизолирующим материалом, индукционно нагревают, мыши выдерживают 9 минутные процедуры лечения, после 15 минутных процедур они гибнут [1].

Недостатки:

- животные страдают от токсикоза, вызванного искровыми электрическими разрядами и перегревом, неконцентрированный и нефиксированный в опухоли (рассеянный в организме) магнитоуправляемый препарат концентрируется в печени от 12 до 14%, в селезенке, почках и других органах ретикулоэндотелиальной системы, что ведет к токсикозу и понижению терапевтического эффекта, после недельной ремиссии наступает рецидив.

Известен также способ индукционной гипертермии в эксперименте, включающий регионарное введение магнитной жидкости в зону локализации опухоли, при котором мышь помещают в болюс (кювета с двумя створками), болюс с мышью располагают между полюсами сердечника (частота 500 кГц, напряженность от 1 до 10 кА/м) и индукционно нагревают. Температура среды, окружающей млекопитающее, поддерживается на уровне +35°С, температура опухоли 42-45°С [2].

Недостатки:

- неконцентрированное и нефиксированное в опухоли (рассеянное в организме) состояние магнитной жидкости ведет к токсикозу и понижению терапевтического эффекта, после недельной ремиссии наступает рецидив.

Известны способы терапии опухолей с применением цитостатических средств, в частности, сарколизина и алкерана. Алкеран является оптически активным аналогом (L-изомером) сарколизина. Параллельно с сарколизином алкеран применяется при терапии большинства сарком и асцитических форм других опухолей. По противоопухолевой активности эти препараты практически неразличимы [3, 4].

Однако алкеран слабо влияет на плотные формы опухолей: карциномы, меланомы, гепатомы, лейкозы [3, 4]. Неконцентрированный и нефиксированный в опухоли (рассеянный в организме) алкеран концентрируется в печени от 20 до 40%, в селезенке, костном мозге, почках и других органах ретикулоэндотелиальной системы. Это ведет к токсикозу и понижению терапевтического эффекта. При применении алкерана для терапии плотных форм карциномы Эрлиха, существует опасность развития острой и хронической форм миелодепрессии, приводящей к ранней гибели экспериментальных животных.

Наиболее близким к предлагаемому способу (прототип), является способ индукционной гипертермии опухолей в эксперименте [5], при котором мышь, после внутриопухолевого введения магнитной жидкости размещают в постоянном магнитном поле для концентрирования и фиксации магнитной жидкости. После этого млекопитающее ориентируют так, чтобы опухоль находилась в пространстве максимальной напряженности переменного магнитного поля, прошедшего через слой воды с постоянной температурой, и выдерживают заданное время с последующими повторениями процедуры от 3 до 12 сеансов с 3-6 дневными перерывами. Температура среды, окружающей млекопитающее, поддерживается на уровне +36°С, температура опухоли 42-45°С.

При этом способе терапии карциномы Эрлиха полная регрессия опухолей наблюдается у 11% мышей, удлинение продолжительности жизни (УПЖ) 120%; при терапии саркомы МХ11 полная регрессия опухолей наблюдается у 40% мышей, УПЖ 150%; при терапии саркомы S180 полная регрессия опухолей наблюдается у 36% мышей, УПЖ 163% [5].

Прототип имеет следующие недостатки:

- наблюдается лишь частичная деструкция опухолевых клеток, это ведет к низкому терапевтическому эффекту, после 2-3 месячной ремиссии наступает рецидив, на поздних стадиях канцерогенеза у мышей наблюдаются рецидивы карциномы Эрлиха, как результат инвазии и метастазирования первичных опухолей.

Задачей изобретения является устранение указанных недостатков, обеспечение безопасности лечения млекопитающего и повышение терапевтического эффекта.

Указанная задача решается тем, что перед введением магнигоуправляемого препарата в опухоль его золь смешивают с золем цитостатического средства. После регионарного введения магнигоуправляемого препарата, содержащего цитостатаческое средство в зону локализации плотных опухолей, млекопитающее размещают в неоднородном постоянном магнитном поле таким образом, чтобы препарат концентрировался и фиксировался в опухоли по ходу силовых линий. После этого млекопитающее ориентируют так, чтобы опухоль находилась в пространстве максимальной напряженности переменного электромагнитного поля, чтобы одновременно с индукционным нагревом тела млекопитающего преимущественно нагревалась опухоль.

Способ осуществляется следующим образом: на 6-9 день после инокуляции опухолевых клеток под кожу правой лопатки мыши, когда объем опухоли достигает 30-50 мм³, вводят с четырех сторон в опухоль от 30 до 300 мкл раствора магнитоуправляемого противоопухолевого препарата: (содержание γ-Fe₂О₃ от 3,6 до 36 мг, содержание цитостатического средства от 1 до 4 мкг). Ориентируют опухоль в неоднородном постоянном магнитном поле индукцией 0,2-4 Тл, градиент 0,015-0,3 Тл/см так, чтобы она была коаксильна силовым линиям неоднородного постоянного магнитного поля, и выдерживают 3-6 мин для концентрации и фиксации феррита и цитостатического средства в опухоли. Далее опухоль ориентируют в переменном магнитном поле (частота 50-1000 кГц, напряженность 7,2 кА/м - 12 кА/м, мощность 0,15-15 кВт), пропущенном через слой воды толщиной 1,2-21 мм с постоянной температурой (магнитотермостатирование), введенный феррит индукционно нагревается, при этом одновременно активируется цитостатическое средство. Через 3-15 минут температура опухоли повышается до +42-+45°С, выдерживают 6-45 мин (в зависимости от мощности). Сразу после завершения нагрева измеряют температуру в прямой кишке (обычно не превышает +40°С). Через каждые 3-6 суток процедуру индукционной гипертермии повторяют, всего от 3 до 9 раз. Полученные результаты лечения представлены в примерах.

Все процедуры проводят в соответствии с рекомендациями по терапии злокачественных опухолей [3]. Все полученные данные обрабатывают статистически по рекомендованным критериям, за достоверные принимают различия при ρ<0,05 [3]. Температуру определяют с помощью спиртового и электрического термометров. В предварительных опытах in vitro определяют оптимальные параметры постоянного и переменного магнитных полей при концентрации, фиксации и индукционном нагреве магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатическое средство в фантоме опухоли и in vivo на экспериментальных животных: мыши, крысы, кролики, собаки.

Предлагаемый способ иллюстрируется примером 1 и таблицей 1 "Противоопухолевый эффект разрабатываемого способа на подкожную форму карциномы Эрлиха, в зависимости от вида терапевтических процедур, включающих: внутриопухолевые инъекции в 1 группе - 0,9% NaCl; во 2 группе - алкеран; в 3 группе - декстранферрит; в 4 группе - декстранферрит + алкеран; фиксацию в неоднородном постоянном магнитном поле с последующим нагревом в переменном магнитном поле".

Пример 1. Определение зависимости противоопухолевого эффекта от качества и полноты исполнения процедуры лечения по заявленному способу. 40 Мышам под кожу правой лопатки вводят суспензию 10⁶ клеток лимфоцитарной лейкемии Р388, делят мышей на 4 равные группы: 1, 2, 3 и 4. Лечение начинают на 3-4 сутки после прививки, когда средний объем опухоли достигает 45 мм³:

- мышам 1 группы в опухоль вводят с четырех сторон 300 мкл 0,9% раствора NaCl;

- мышам 2 группы в опухоль вводят 300 мкл золя цитостатического средства (содержание алкерана 4 мкг);

- мышам 3 группы в опухоль вводят с четырех сторон 300 мкл золя магнигоуправляемого противоопухолевого препарата (содержание γ-Fe₂О₃ 36 мг);

- мышам 4 группы в опухоль вводят с четырех сторон 300 мкл золя магнигоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатическое средство (содержание γ-Fe₂О₃ 36 мг, содержание алкерана 4 мкг).

Мышей 1, 2, 3 и 4 групп помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см. После этого каждую мышь 1, 2, 3 и 4 групп магнитотермостатируют и помещают в переменное магнитное поле. Температура опухоли у мышей 1 и 2 групп под действием переменного магнитного поля в течение 10 мин поднимается выше +38°С. Температура в прямой кишке и опухоли мышей 1 и 2 групп в течение 30 минут поддерживается между +38-+40°С.

Температура опухоли у мышей 3 и 4 групп под действием переменного магнитного поля в течение 10 мин поднимается выше +43°С. Далее у мышей 3 и 4 групп температура опухоли продолжает повышаться и через 15 мин достигает +44-+45°С, температура тела +40°С.

В 1 группе проводят до 5 процедур индукционной гипертермии (табл.1).

Во 2, 3 и 4 группах проводят по 9 процедур (табл.1).

В результате получают:

- в 1 группе мышей объем опухоли у каждой мыши устойчиво увеличивается без признаков регрессии, за это время все мыши гибнут от прогрессирования опухолей;

- во второй группе средний объем опухолей резко уменьшается, все мыши гибнут от развития миелодепрессии;

- в третьей группе средний объем опухолей значительно уменьшается, полная регрессия опухоли наблюдается у одной из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 120%:

- в четвертой группе средний объем опухолей с первого дня лечения резко уменьшается, после завершения терапии полная регрессия опухолей наблюдается у 3 из 10 мышей, опухоли не обнаруживаются в течение 3 месяцев, увеличение продолжительности жизни мышей 170%, как следует из таблицы 1.

Таким образом, одновременное индукционное нагревание тела с преимущественным нагревом тканей опухоли, содержащих магнитоуправляемый препарат и цитостатическое средство, приводит к быстрому уменьшению объема опухолей, их полной регрессии и удлинению продолжительности жизни млекопитающих. Предпочтительна индукционная гипертермия опухоли при +45°С 9×30 мин с интервалом 3 суток, при которой получен максимальный терапевтический эффект.

Предлагаемый способ илюстрируется примером 2, и таблицей 2 "Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму лимфоцитарной лейкемии Р388 в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличении средней продолжительности жизни (УШК) мышей".

Пример 2. Определение зависимости противоопухолевого эффекта заявленного способа от числа сеансов. 60 Мышам под кожу правой лопатки вводят суспензию 10⁶ клеток лимфоцигарной лейкемии Р388, делят мышей на 6 равных групп: 1, 2, 3, 4, 5 и 6. На 3-4 сутки после прививки, когда средний диаметр опухоли достигает 2,1 мм, мышам 1 группы в опухоль вводят с четырех сторон 300 мкл 0,9% раствора NaCl. Мышам 2, 3, 4, 5 и 6 групп в опухоль вводят с четырех сторон 100 мкл золя магнигоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатическое средство (содержание γ-Fe₂O₃ 36 мг, содержание алкерана 4 мкг). Мышей 1, 2, 3, 4, 5 и 6 групп помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см. Каждую мышь 2, 3, 4, 5 и 6 групп магнитотермостатируют и помещают в переменное магнитное поле. Температура опухоли у мышей 2, 3, 4, 5 и 6 групп под действием переменного магнитного поля в течение 10 мин поднимается выше +42°С. Температура в прямой кишке и опухоли мышей 1 группы (без магнитоуправляемого противоопухолевого препарата) остается между +38-+39°С. У мышей 2, 3, 4, 5 и 6 групп температура опухоли продолжает повышаться и через 15 мин достигает +44°С. Процедуру индукционной гипертермии у мышей 2 группы проводят 1 раз, 3 группы - 2 раза, 4 группы - 6 раз, 5 группы - 9 раз, 6 группы - 12 раз с интервалом 3 суток (табл.2).

В результате получают:

- в 1 (контрольной) группе мышей объем опухоли у каждой мыши устойчиво увеличивается без признаков регрессии;

- во второй группе средний объем опухолей уменьшается медленно, увеличение продолжительности жизни 117%;

- в третьей группе средний объем опухолей значительно уменьшается, полная регрессия опухоли наблюдается у одной из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 120%;

- в четвертой группе средний объем опухолей с первого дня лечения уменьшается и, наконец, их признаки не проявляются в течение 3 месяцев, полная регрессия опухоли наблюдается у 3 из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 140%;

- в пятой группе после 9 терапевтических воздействий значительно увеличивается продолжительность жизни мышей 180%;

- в шестой группе после 12 терапевтических воздействий наблюдается увеличение продолжительности жизни мышей до 120%.

Таким образом, в соответствие с таблицей 2 "Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму лимфоцитарной лейкемии Р388 в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличении средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей", максимальный терапевтический эффект дает индукционная гипертермия опухоли при +45°С 9×30 мин с интервалом 3 суток.

Предлагаемый способ илюстрируется примером 3 и таблицей 3, "Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму карциномы Эрлиха, в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей".

Пример 3. Определение увеличения средней продолжительности жизни мышей при заявленном способе терапии карциномы Эрлиха. 50 Мышам подкожно вводят суспензию 10⁶ клеток карциномы Эрлиха Р388 и делят их на 5 равных групп. Когда средний диаметр опухоли достигает 3 мм (около 5 суток), у мышей измеряют температуру в прямой кишке. Мышам 1 (контрольной) группы в опухоль вводят 300 мкл 0,9% раствора NaCl. Мышам 2, 3, 4 и 5 групп в опухоль вводят 300 мкл золя магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатическое средство, (содержание γ-Fe₂О₃ 36 мг, содержание алкерана 4 мкг) и мышей помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см. Мышей 1, 2, 3, 4, 5 и 6 групп помещают на 5 минут в постоянное магнитное поле индукцией 0,2 Тл, градиент 0,015 Тл/см. Каждую мышь 2, 3, 4, 5 и 6 групп магнитотермостатируют и помещают в переменное магнитное поле. Температура опухоли у мышей 2, 3, 4, 5 и 6 групп, под действием переменного магнитного поля в течение 10 мин поднимается выше +42°С. В то же время, температура в прямой кишке и опухоли мышей 1 группы (без магнитоуправляемого противоопухолевого препарата) остается между +38-+39°С. У мышей 2, 3, 4 и 5 групп температура опухоли продолжает повышаться и через 15 мин достигает +44°С. Процедуру индукционной гипертермии проводят:

- мышам 2 группы 1 раз;

- мышам 3 группы 5 раза;

- мышам 4 группы 9 раз;

- мышам 5 группы 15 раз с интервалом 3 суток (табл.3).

В результате получают:

- в 1 (контрольной) группе мышей объем опухоли у каждой мыши устойчиво увеличивается без признаков регрессии;

- во второй группе средний объем опухолей уменьшается медленно, увеличение продолжительности жизни 102%;

- в третьей группе средний объем опухолей значительно уменьшается, полная регрессия опухоли наблюдается у одной из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 110%:

- в четвертой группе средний объем опухолей, с первого дня лечения уменьшается и, наконец, их признаки не проявляются в течение 3 месяцев, полная регрессия опухоли наблюдается у 3 из 10 мышей, увеличение продолжительности жизни мышей 170%;

- в пятой группе после 15 терапевтических воздействий значительно увеличивается число мышей с полной регрессией опухолей, но снижается увеличение продолжительности жизни до 110%.

Таким образом, в соответствие с примером 3 и таблицей 3 "Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму карциномы Эрлиха, в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей, и увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей", предпочтительна индукционная гипертермия опухоли при +45°С 9×30 мин с интервалом 3 суток, при которой получен максимальный терапевтический эффект.

Приведенные экспериментальные результаты подтверждают высокий противоопухолевый эффект индукционной гипертермии плотных опухолей, включающей регионарное введение магнитоуправляемого препарата, содержащего алкеран, при одновременном нагреве тела до 40°С с преимущественным по скорости нагревом опухоли до 45°С.

Технический результат.

Заявленный способ является новым и эффективным при лечении плотных опухолей в эксперименте. Способ позволяет усилить терапевтический эффект, который проявляется в быстром уменьшении объема плотных опухолей при отсутствии токсических проявлений. Применение заявленного способа приводит к полной регрессии опухолей с увеличением продолжительности жизни до 180% и обеспечивает безопасность млекопитающих.

Источники информации

1. Брусенцов Н.А., Порубова Г.М., Евелев Ю.К., Шумаков Л.И., Чулков А.В., Килимник И.В., Разумовский В.А. Индукционная радиочастотная гипертермия опухолей и тепловой эффект декстранферрита в переменных электромагнитных полях/ 4-я Всесоюзная конференция по применению магнитных жидкостей в биологии и медицине. Сухуми 1991, с.27-30.

2. A.Jordan, R.Scholz, P.Wust, H.Schirra, T.Schiestel, H.Schmidt and R.Felix., Endocytosis of dextran and silan-coated magnetite nanoparticles and the effect ofintracellular hyperthermia on human mammary carcinoma cells in vitro. J. Magn. Magn. Mat. 194 (1999), рр.185-196.

3. Ларионов Л.Ф. Химиотерапия злокачественных опухолей. Мед. лит. M., 1962.

4. Брусенцов Н.А. От сарколизина к алкерану // Ж. Всес. хим. о-ва им. Д.И.Менделеева. 1991, т.36, №3, с.353-355.

5. Н.А.Брусенцов, А.Ю.Барышников, Т.Н.Брусенцова и др. Способ индукционной гипертермии в эксперименте. Патент РФ №2203111, 27.04.(2003). Бюл. Изобр. №12.

Таблица 1. Противоопухолевый эффект разрабатываемого способа на подкожную форму карциномы Эрлиха, в зависимости от вида терапевтических процедур, включающих: внутриопухолевые инъекции в 1 группе - 0,9% NaCl; во 2 группе - алкеран; в 3 группе - декстранферрит; в 4 группе - декстранферрит + алкеран; фиксацию в неоднородном постоянном магнитном поле с последующим нагревом в переменном магнитном поле.
Группа	Число процедур	Средний объем опухоли до лечения (мм3)	Средний объем опухоли после завершения лечения (мм3)	Полная регрессия опухоли (%)	УПЖ* (%)
1 (контроль)	5	45,00±15	130,00±43,2	0	0
2 (алкеран)	9	45,00±15	1,6+0,5	0	0
3 (магнитоуправляемый препарат)	9	45,00±15	4,00±1,3	10	120
4 (магнитоуправляемый препарат с алкераном)	9	45,00±15	0,30±0,1	30	170
* средняя продолжительность жизни (СПЖ) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ), вычисленное по формуле: УПЖ=[(СПЖопыт-СПЖконтр)/СПЖконтр]×100%.

Таблица 1 показывает:

- в 1 группе мышей (контроль) после 5 процедур, имитирующих заявленный способ, средний объем опухоли увеличивается до 130±43,2 мм³, все мыши пали от прогрессирования опухолей;

- во 2 группе мышей после 9 процедур, имитирующих заявленный способ, средний объем опухоли уменьшается до 1,6±0,5 мм³, все мыши пали от развившейся в процессе терапии миелодепрессии;

- в 3 группе мышей после 9 процедур, имитирующих заявленный способ, средний объем опухоли уменьшается до 4±1,3 мм³, у 10% мышей наблюдается полная регрессия опухолей и увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей возрастает до 120%.

- в 4 группе мышей после 9 процедур, проведенных по заявленному способу, средний объем опухоли уменьшается до 0,3±0,1 мм³, у 30% мышей наблюдается полная регрессия опухолей и увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ), мышей возрастает до 170%.

Таблица 2 Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму лимфоцитарной лейкемии Р388; в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличении средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей.
Группа	Число процедур	Средний объем опухоли (мм3)	Относительный* объем опухоли (MM3)	Полная регрессия опухоли (%)	УПЖ** (%)
1 (контроль)	1	50,108±17,0	1,000	0	0
2 (γ-Fe2О3 36 мг, алкерана 4 мкг).	1	20,070±7,0	0,400	0	110
3 (γ-Fe2О3 36 мг, алкерана 4 мкг).	2	10.242±3,2	0,204	10	120
4 (γ-Fe2О3 36 мг, алкерана 4 мкг).	6	1,210±0,3	0,024	20	140
5 (γ-Fe2О3 36 мг, алкерана 4 мкг).	9	0,300±0,10	0,006	30	180
6 (γ-Fe2О3 36 мг, алкерана 4 мкг).	12	0,100±0,03	0,002	60	120
* Относительный объем опухоли = (средний объем опухоли в каждой группе)/(средний объем опухоли в 1 группе). ** средняя продолжительность жизни (СПЖ) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ), вычисленное по формуле: УПЖ=[(СПЖопыт-СПЖконтр)/СПЖконтр]×100%.

Таблица 3 Противоопухолевый эффект заявленного способа на подкожную форму карциномы Эрлиха, в зависимости от числа терапевтических процедур, выраженный в полной регрессии опухолей и увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей.
Группа	Число процедур	Средний объем опухоли (мм3)	Относительный* объем опухоли (мм3)	Полная регрессия опухоли (%)	**УПЖ (%)
1 (контроль.)	1	36,000	1,000	0	0
2 (γ-Fe2О3 36 мг, алкерана 4 мкг).	1	18,300	0,510	0	102
3 (γ-Fe2O3 36 мг, алкерана 4 мкг).	5	1,304	0,040	10	110
4 (γ-Fe2О3 36 мг, алкерана 4 мкг).	10	0,220	0,006	30	170
5 (γ-Fe2О3 36 мг, алкерана 4 мкг).	15	0,100	0,003	60	110
* Относительный объем опухоли = (средний объем опухоли в каждой группе)/(средний объем опухоли в 1 группе). ** средняя продолжительность жизни (СПЖ) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ), вычисленное по формуле: УПЖ=[(СПЖопыт-СПЖконтр)/СПЖконтр]×100%.

Способ индукционной гипертермии в эксперименте, включающий регионарное введение магнитоуправляемого препарата в зону локализации опухоли с его последующей концентрацией и фиксацией в постоянном магнитном поле и нагревом в переменном магнитном поле, отличающийся тем, что магнитоуправляемый препарат смешивают с цитостатическим средством алкераном, полученную смесь вводят в зону локализации плотных опухолей и одновременно с нагревом тела млекопитающего преимущественно нагревают опухоль.