Способ отбора микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в лабораториях биологического и медицинского профиля, решающих вопросы создания пробиотических препаратов медицинского или ветеринарного назначения с заранее заданными свойствами. Способ отбора микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов предусматривает, помимо оценки их биологических свойств, использовать в качестве критерия отбора способность данных микроорганизмов предупреждать нарушения минерального обмена со стороны макроорганизма, перорально получающего подобные пробиотические препараты. Изобретение обеспечивает повышение качества пробиотических препаратов за счет придания им способности предупреждать и корректировать нарушения обмена минеральных веществ. 1 табл.

 

Изобретение относится к области микробиологических технологий, а именно к способам отбора штаммов живых апатогенных микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов медицинского или ветеринарного назначения.

В частности, изобретение предназначено для отбора живых микроорганизмов, особенностью которых является их способность при пероральном применении усиливать процессы усвоения минеральных веществ.

Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования в лабораториях биологического и медицинского профиля, решающих вопросы создания новых живых пробиотических препаратов с заранее заданными свойствами.

Известен способ отбора штаммов микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов, предусматривающий отбор штаммов микроорганизмов по их способности снижать содержание холестерина в тканях животных или птиц, предусматривающий проведение следующей двухстадийной процедуры (Герасименко В.В. Обмен веществ и продуктивность гусей, выращиваемых на мясо, при использовании лактоамиловорина. Автореф. дисс.... канд. биол. наук, Боровск, 2002. - 25 с.).

На первом этапе опытной группе птиц (гусят) сразу после вылупления выпаивают изучаемый пробиотический штамм в количестве 70 г биомассы на 10 л воды при ее неограниченном потреблении, а в дальнейшем аналогичное количество микроорганизмов в дозе 70 г/т комбикорма скармливают в течение первого месяца жизни. В частности, авторами использовался апатогенный микроорганизм Lactobacillus amylovorum (коммерческое название "Лактоамиловорин") с титром 0,24-4,26*10¹⁰ колониеобразующих единиц в 1 г. Контрольную группу составляла аналогичная по численности, срокам вылупления, условиям содержания и общему уровню кормления группа гусят, сформированная методом пар-аналогов.

На втором этапе в 180-дневном возрасте был проведен убой птицы опытной и контрольных групп с последующим определением содержания различных химических веществ в мышечной ткани. При этом скармливание лактоамиловорина вело к тому, что мясо гусей опытной группы в своем составе содержало на 3,35% меньше воды и на 3,0% меньше общих жиров, но на 5,72% больше протеинов, чем мясо гусей контрольной группы. На этом фоне наиболее ярким было различие в содержании холестерина, количество которого в мясе гусей опытной группы было на 49,6% ниже, чем в контроле (Р<0,01), что было расценено авторами как достижение особых диетических свойств подобного мяса.

Наиболее вероятной причиной снижения усвоения липидов корма у гусей опытной группы является способность различных видов лактобацилл к деконъюгации желчных кислот, таких как таурохолиевая и гликохолиевая (Gilliland S.E. "Health and nutritional benefis from lactic acid bacteria" // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V.87. №1-2. P.175-188). А так как последние обеспечивают всасывание липидов, при их деконъюгации под действием пробиотических штаммов относительно большее количество жиров (в т.ч. холестерина) проходит через желудочно-кишечный тракт транзитом, не всасываясь в кровь и не аккумулируясь в тканях.

Недостатком данного способа является то, что подобный способ не позволяет оценить влияние пробиотических штаммов микроорганизмов на всасывание различных макро- и микроэлементов, что положено в основу заявляемого способа. При этом основной причиной, препятствующей получению требуемого результата при использовании способа-прототипа, является отсутствие адекватного подхода, позволяющего зарегистрировать изменения минерального обмена, происходящие в отсутствие исследуемого штамма, а также на фоне его применения. В этой связи следует также отметить, что различия по содержанию минеральных веществ в мышечной ткани описанных выше опытной и контрольной групп гусей были статистически недостоверны (Георгиевский В.И. и др. Минеральное питание животных. М.: Колос, 1979. - 471 с.).

Технический результат изобретения - повышение качества пробиотических препаратов за счет придания им способности предупреждать и корректировать нарушения обмена минеральных веществ.

Задача решается тем, что в известном способе отбора штаммов микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов путем выделения микроорганизмов из различных источников и последующей оценки их биологических свойств, отличающийся тем, что в качестве критерия отбора используют способность данных микроорганизмов предупреждать нарушения минерального обмена со стороны макроорганизма, перорально получающего подобные пробиотические препараты.

Для проведения исследований формируется необходимое количество опытных и контрольных групп лабораторных животных, идентичных по половому и возрастному составу, а также весу, и в предшествующий опыту период находившихся в условиях сбалансированного питания в соответствии с рекомендациями НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифософского (Порядков Л.Ф. Базовые модели для изучения проблем искусственного питания в эксперименте. М.: НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифософского, 2001. - С.103-131).

В ходе эксперимента сравнивали влияние на минеральный обмен двух препаратов пробиотиков: бифидумбактерина (штамм Bifidobacterium longum) и споробактерина (штамм Baccillus subtilis 534).

Исследования выполнены на 4 группах 11-месячных крыс-самцов, находившихся в предшествующий опыту период в условиях сбалансированного питания по рекомендациям НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифософского.

В ходе эксперимента подопытные животные I контрольной группы также содержались на сбалансированном рационе (полнорационный комбикорм), особи II контрольной и I, II опытных групп находились на дефицитной по минералам диете, что достигалось через выпойку дистиллированной водой и скармливание приготовленного особым способом риса (варка полированного риса в течение 15 минут с последующим удалением отвара и промывкой дистиллированной водой). С целью профилактики авитаминозных состояний у крыс в опытный рацион вводили поливитаминный комплекс, содержавший витамины A, D, С, К, Е, В₁, В₂, В₃, В₄, В₅, В₆, B_с, B₁₂.

В эти же сроки крысы I и II опытных групп перорально получали препараты пробиотиков - соответственно бифидумбактерин (в дозировке 0,3 млн. мкрб. тел/кг живой массы) или споробактерин (в дозировке 50 млн. мкрб. тел/кг).

По истечении учетного периода проводился убой лабораторных животных с последующим извлечением трубчатых костей и определением в них общего содержания микроэлементов, а также установления предельной силы сжатия с использованием "Прибора испытания на сжатие и растяжение" (ЗиП, модель МИП 100-2 №26).

В ходе исследования было установлено, что различные пробиотические препараты оказывают неоднозначное влияние на величину эндогенных потерь минеральных элементов (таблица).

В частности, бифидумбактерин демонстрировал способность к сведению к минимуму потерь минеральных веществ из организма крыс I опытной группы. Так, при оценке предельной силы сжатия трубчатых костей подопытных животных на сжатие особи на фоне минералдефицитной диеты, получавшие препарат Bifidobacterium longum, характеризовались интегральным показателем силы сжатия трубчатых костей = 19,7 Н, что на 19,4% (Р<0,05) превосходило аналогичный показатель во II контрольной группе и достоверно не отличалось от такового у крыс I контрольной группы, содержавшихся на сбалансированном пищевом рационе.

В противоположность этому крысы II опытной группы на фоне минералдефицитной диеты, получавшие пробиотик споробактерин, характеризовались наименьшими значениями предельной силы сжатия трубчатых костей (15,2 Н), которые на 18,7% (Р<0,05) уступали таковым в I контрольной группе и оказывались даже ниже, чем у особей II контрольной группы.

Показатели исследований трубчатых костей.

Измеряемые	Группы
показатели	I контроль	II контроль	I опытная	II опытная
сила	min	12,0	10,0	12,0	9,00
сжатия, н.	max	26,0	21,0	30,0	21,67
М±m	18,7±2,86	16,5±0,5	19,7±0,78	15,2±0,6

Таким образом, Bifidobacterium longum, являющийся одним из основных компонентов нормального кишечного микробиоценоза, способен свести к минимуму эндогенные потери минеральных веществ из организма крыс, что может объясняться влиянием данного микроорганизма на значения внутрикишечного рН и определяемую этим степень растворимости двух- и трехвалентных катионов.

Указанная особенность выгодно отличает его от другого пробиотического штамма - Baccillus subtilis, не препятствующего или даже усиливающего эндогенные потери минеральных элементов. Последнее в какой-то степени может объясняться способностью бактерий рода Bacillus к инкорпорации и к последующему выведению из макроорганизма некоторых химических соединений или эссенциальных элементов (Журнал Сельскохозяйственная биология / Проблема слабости конечностей у цыплят мясных кроссов. Фисинин В.И., Байковская Е.Ю. - №6, 1995 г.).

Таким образом, вся совокупность полученных данных позволяет с новых позиций взглянуть на роль нормальной микрофлоры в минеральном обмене, а также констатировать неоднозначный характер подобного воздействия, заключающийся как в предупреждении эндогенных потерь минеральных веществ, так и в возможном усилении данных неблагоприятных последствий. В этой связи перспективной также представляется разработка нового поколения пробиотических препаратов, содержащих специально отобранные живые бактериальные культуры, способные предупреждать или корректировать минеральный дисбаланс в организме животных и человека, возникающий в результате воздействия неблагоприятных внешних факторов или старения.

Протективное действие бифидобактерий в отношении всасывания минеральных веществ проиллюстрировано результатами исследований цыплят-бройлеров кросса "Смена". В ходе эксперимента на фоне повышенной энергии роста подопытной птицы, обусловленной значительным содержанием протеина (21-23%) и доступной для обмена энергии (13,3 МДж/кг) в условиях дисбаланса по отношению кальций/доступный фосфор (удельная масса кальция - 0,9%, доступного фосфора - 0,55%), дача цыплятам препарата бифидумбактерина (штамм Bifidobacterium longum) сопровождалась снижением числа аномалий ног (в том числе, случаев дисхондроплазии) по сравнению с контролем на 7,25%, а сохранность поголовья повышалась на 6,7%. Кроме того, независимо от повышения интенсивности роста опытных особей пробиотик-содержащая диета способствовала увеличению массовой доли кальция в большеберцовой кости 7,7% по сравнению с контролем.

В качестве препарата, корректирующего процесс обмена кальция и, таким образом, предупреждающего развитие остеопороза, был использован кисломолочный продукт на основе живого пробиотического штамма B.longum. Назначение продукта в количестве по 200 мл один раз в день в течение 6 месяцев проводилось 48 пациентам в возрасте 65-83 лет, проживающих в доме-интернате для престарелых и инвалидов. Контрольную группу составили 52 пациента того же возрастно-полового состава, проживающие в другом отделении данного учреждения и не имеющие отличий от первой группы по количественному и качественному составу рациона питания, а также характеризующиеся сходной двигательной активностью.

Состояние костной ткани обследуемых оценивалось двукратно (до начала применения кисломолочного продукта и после его завершения) по результатам ультразвуковой денситометрии пяточной кости, а также на основе данных о статистике травматизма на примере переломов шейки бедра.

При проведении подобных исследований через 6 месяцев приема кисломолочного продукта в первой группе по данным ультразвуковой денситометрии было установлено снижение расчетной величины относительного риска перелома RRF (Relative Risk of Fracture) на 7,3% по сравнению с исходными значениями и на 9,1% по сравнению со второй (контрольной) группой, не получавшей кисломолочного продукта. Сходными результатами характеризовались изменения еще одного расчетного параметра - физиологического возраста кости РАВ (Psysiological Age of Bone) - соответственно -5,3% и -7,7% по сравнению с исходными значениями и контрольной группой. Зарегистрированные положительные сдвиги в структуре костной ткани подтвердились статистикой травматизма: в период приема продукта в первой группе был зарегистрирован только один случай перелома шейки бедра, а в последующие 6 месяцев после окончания приема продукта - ни одного случая; в то же время во второй группе аналогичные значения составили 2 и 3 случая соответственно.

Таким образом, прием кисломолочного продукта на основе живого пробиотического штамма B.longum позволил достичь замедления или прекращения потери костной массы лиц группы риска по развитию остеопороза.

Способ отбора микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов путем оценки их биологических свойств, отличающийся тем, что в качестве критерия отбора используют способность данных микроорганизмов предупреждать нарушения минерального обмена со стороны макроорганизма, перорально получающего подобные пробиотические препараты.