Иммуномодулирующий препарат

Изобретение относится к области фармацевтики, биохимической медицины, иммунофармакологии микроэлементов, фармакологии веществ, нормализующих показатели иммунной системы, и может быть использовано в клинической медицине для лечения заболеваний, сопровождающихся нарушениями иммунной системы человека. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью, содержит спиртовой экстракт хлорофилла, выделенный из зеленой массы донника лекарственного - Melilotus officinalis L. и донника рослого - Melilotus altissimus Thuill. семейство бобовые - Fabaceae, а также фосфолипиды, β-каротин и селен. Применение средства способствует нормализации показателей иммунной системы. 1 табл.

 

Изобретение относится к области фармацевтики, биохимической медицины, иммунофармакологии микроэлементов, фармакологии веществ, нормализующих показатели иммунной системы, и может быть использовано в клинической медицине для лечения заболеваний, сопровождающихся нарушениями иммунной системы человека.

Одним из основных принципов иммунокоррекции является то, что иммуномодуляторы не применяются самостоятельно, а дополняют традиционную этиотропную терапию (Клиническая иммунология, под редакцией А.В. Караулова. - М., Медицинское информационное агентство, 1999 - с. 428).

В настоящее время для иммунокоррекции того или иного заболевания принимают иммуномодуляторы, витаминные препараты, макро- и микроэлементы, а также другие лекарственные средства. Это экономически не выгодно как для государства, в случае лечения больных в государственных лечебных учреждениях, так и для пациентов при оказании им услуг в частных клиниках.

Известно, что современные иммуномодуляторы часто вызывают побочные действия, например, при приеме: бронхоиммунала - возможны повышение температуры тела, боль в животе, тошнота, рвота, диарея; тимактида - аллергические реакции; миелопида - головокружение, слабость, тошнота, подъем температуры тела, гиперемия; интрона А - гриппоподобный синдром. У больных с заболеваниями сердца возможны осложнения. Панцитопения, агранулоцитоз. Паралич глазодвигательных нервов, носовое кровотечение: интерферона бета-1b - депрессия, гриппоподобный синдром, лейкопения, некроз кожи (Федеральное руководство по использованию лекарственных средств. Выпуск IV, М., "ЭХО", 2003, с 698-705).

Тем не менее, проблемой современной медицины является коррекция функций иммунной системы с помощью иммуномодулирующих средств.

Задачей изобретения является создание нового высокоэффективного иммуномодулятора, не вызывающего побочного действия, привыкания к нему и применяемого самостоятельно.

Поставленная задача решается иммуномодулирующим препаратом, характеризующимся тем, что он содержит хлорофилл, представляющий собой жидкий экстракт донника лекарственного - Melilotus officinalis L., и донника рослого - Melilotus altissimus Thuill. семейство бобовые - Fabaceae, а также фосфолипиды, β-каротин и селен при следующем содержании компонентов на 1 мл препарата:

Фосфолипиды	0,1 - 0,4 мг/мл
β-каротин	3,0 - 7,0 мкг/мл
Селен	5-20 мкг/мл
Хлорофилл	10-20 мг/мл.

Полученное вещество названо Селекартен.

Получение Селекартена.

В качестве исходных продуктов используют донник лекарственный - Melilotus officinalis L., и донник рослый - Melilotus altissimus Thuill. семейство бобовые - Fabaceae. Зеленую массу предварительно высушивают и измельчают. 100 г высушенной и измельченной зеленой массы помещают в стеклянную емкость и заливают 70-96% этиловым спиртом в соотношении 1:1. Таким образом, из полученного сырья извлекают хлорофилл из расчета 10-20 мг/мл. Полученный спиртовой экстракт представляет собой прозрачную жидкость темно-зеленого цвета. Подлинность субстанции определяется методом спектрофотометрии 0,8% раствора субстанции в спирте этиловом 95%. Спектр поглощения данного раствора в диапазоне от 500 до 700 нм должен иметь характеристический максимум при 665±3 нм (хлорофилл). Наличие фенольных соединений подтверждается методом ВЭЖХ. Времена удерживания пиков на хроматограмме испытуемого раствора субстанции должны совпадать с временами удерживания пиков на хроматограмме раствора РСО (кумарин и дигидрокумарин).

К полученному жидкому экстракту добавляют селен (выделенный из натрия селенита ФСП 42-02501024-01) из расчета 5-20 мкг/мл, затем добавляют β-каротин (ФСП 42-3867-99) из расчета 3,0-7,0 мкг/мл, затем добавляют фосфолипид (ВФС 42-3051-98) из расчета 0,1-0,4 мг/мл. Полученное таким образом комбинированное вещество фильтруют посредством мембранной фильтрации, помещают во флаконы или ампулы и герметизируют.

Препарат представляет собой прозрачную жидкость темно-зеленого цвета и имеет в своем составе фосфолипиды, β-каротин, хлорофилл и селен.

Селекартен удовлетворяет требованиям РД 42-501-98 "Инструкция по контролю на механические включения инъекционных лекарственных средств".

Селекартен апирогенен. Тест-доза 0,03 мл препарата в 0,45 мл раствора натрия хлорида изотонического 0,9% на 1 кг массы животного.

При проведении испытаний сумма повышения температуры у трех кроликов +8°С.

Определение стерильности селекартена проводили методом прямого посева в соответствии с ГФ XI, вып.2, с.187 и изменением №3 (категория 1). Препарат является стерильным.

При проведении испытаний предварительно определяли антимикробную активность препарата (ГФ XI, вып.2, с.188). В результате проведенных испытаний установлено, что препарат, в разведении 1:10 (1 мл препарата в 10 мл питательной среды) обладает антимикробным действием. Для устранения антимикробного действия увеличивали соотношение объемов препарата и питательной среды. Установлено, что антимикробное действие препарата устраняется разведением 1:100.

В таблице 1 показано антимикробное действие препарата селекартен

Таблица 1
Разведение	St.aureus	E.coli	Bac.cereus	C.albicans
препарата	ATTC	ATTC	ATTC	ATTC
	6538-Р	25922	10702	885-653
1:10	-	-	-	-
1:100	+	+	+	+
1:250	+	+	+	+
1:500	+	+	+	+
Контроль	+	+	+	+
культуры
Обозначение: «-» - отсутствие роста тест-микроорганизма, «+» - наличие роста тест-микроорганизмма.

Селекартен является нетоксичным. Тест-доза 0,031 мл препарата в 0,469 мл раствора натрия хлорида изотонического 0,9% на мышь, внутривенно. Срок наблюдения - 48 часов (ГФХ1, вып.2, с.182).

Проведенные токсикологические исследования показали, что однократное внутримышечное введение субстанции селекартен мышам линии BALB/C в разведении 1:10 физиологическим раствором в дозах 0,5-1,0 мл/мышь (25-50 мл/кг) не вызывает признаков интоксикации и гибели животных. При увеличении дозы препарата (в разведении 1:10 физиологическим раствором) до 1,5-2,0 мл/мышь (75-100 мл/кг) наблюдалось снижение двигательной активности и угнетение животных, однако гибели животных при этом не отмечалось.

Внутримышечное и внутрибрюшинное введение мышам линии BALB/C субстанции селекартен в разведении 1:5 физиологическим раствором сопровождалось резким угнетением животных, наркозом и сном. Указанная интоксикация животных селекартеном на уровне ЛД50 была сходна с картиной их отравления этиловым спиртом, входящим в состав препарата.

По показателям ЛД50 при внутримышечном (мыши BALB/C, крысы Wistar) способе введения, установленным на уровне 51-66 мл/кг для субстанции препарата в разведении 1:5 физиологическим раствором, селекартен можно отнести к малотоксичным препаратам. При этом не выявлено существенных видовых и половых различий в чувствительности указанных видов лабораторных животных к токсическому действию препарата.

Изучение токсичности селекартена в условиях хронического эксперимента проведено на крысах Wistar при ежедневном 3-месячном внутримышечном введении препарата в дозах 0,07 и 0,21 мл/кг и собаках при 1-месячном внутримышечном введении препарата в дозах 0,07 мл/кг. Указанные дозы препарата перед введением ex tempore разводили стерильным физиологическим раствором 1:10. Испытанные в хронических опытах на крысах и собаках дозы селекартена превышали суточную терапевтическую дозу для человека (0,5 мл/человека или 0,007 мл/кг) в 10 и 30 раз.

Как показали проведенные исследования, селекартен в испытанных дозах 0.07 и 0.21 мл/кг в 3-месячном хроническом эксперименте на крысах и в дозе 0,07 мл/кг в 1-месячном хроническом опыте на собаках хорошо переносится животными и не влияет на гематологические показатели, функциональное состояние основных органов и систем организма подопытных животных (по данным использованных биохимических тестов и ЭКГ). Отсутствие токсических повреждений внутренних органов, общих и местных токсико-аллергических реакций, связанных с действием селекартена, было подтверждено результатами патоморфологических исследований, проведенных после окончания хронических экспериментов. Не установлено местнораздражающего действия препарата в хронических опытах на крысах и собаках в испытанных дозах 0,07 и 0,21 мл/кг при длительном внутримышечном введении в разведении 1:10 стерильным физиологическим раствором.

В соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета МЗ России проведено исследование мутагенных свойств селекартена.

При этом изучена способность препарата вызывать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium в тесте Эймса, вызывать хромосомные абберации в клетках костного мозга мышей-гибридов Fl(CBAxC57BI6), влиять на количество доминантных леталей в зародышевых клетках мышей и систему репарации ДНК у Е.Coli PQ 37 в SOS-хромотесте.

В результате проведенных исследований установлено, что селекартен не обладает мутагенными свойствами и не является потенциальным канцерогеном.

В испытанной дозе 0,21 мл/кг (30-кратная высшая суточная доза, рекомендованная для человека) селекартен при внутримышечном введении с 1 по 20 день гестации замедлял прибавку массы тела беременных крыс, уменьшал продолжительность беременности, количество живых плодов, мест имплантации, желтых тел и массу тела эмбрионов. При этом индекс предимплантационной гибели в группе крыс, подвергавшихся во время беременности воздействию селекартена в испытанной дозе 0,21 мл/кг, был значительно выше, чем в контроле, а показатели постиплатационной гибели ниже.

При макроскопическом осмотре и микроскопическом исследовании на стандартных срезах по Вильсону-Дибану плодов, подвергавшихся в пренатальном периоде воздействию селекартена в дозе 0,21 мл/кг, выявлено недоразвитие плода в 6,7% случаев. Данный эффект может быть расценен как порок развития плода.

Анализ препаратов, окрашенных ализарином, для изучения развития костной системы у крысиных плодов, подвергавшихся в пренатальном периоде воздействию селекартена в испытанной дозе 0,21 мл/кг, не выявил пороков развития скелета. Однако при этом наблюдалась задержка оссификации по большинству исследуемых точек окостенения.

Под влиянием внутримышечного введения селекартена в дозе 0,21 мл/кг с 1 по 20 день беременности крысам установлено достоверное по сравнению с контролем уменьшение количества родившихся крысят и увеличение процента мертворожденных. Масса тела крысят, подвергавшихся в пренатальный период развития воздействию селекартена, была ниже показателей в контрольной группе. Развитие потомства в опытной группе в течение всего периода наблюдения по другим принятым показателям проходило без отклонения от сроков, характерных для нормального физиологического развития животных этого вида.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что внутримышечное введение селекартена в дозе 0,21 мл/кг (30-кратная высшая суточная доза, рекомендованная для человека) с 1 по 20 день беременности оказывает эмбриотоксическое и тератогенное (недоразвитие плода) действие. В связи с этим беременность следует считать противопоказанием для назначения препарата.

При ежедневном внутримышечном введении селекартена в дозе 0,21 мл/кг крысам-самцам в течение 10 недель и крысам-самкам в течение 2 недель не установлено влияния препарата на репродуктивную функцию животных.

При изучении аллергизирующих свойств селекартена на морских свинках установлено, что при 5-кратном внутримышечном введении препарата в сенсибилизирующих дозах 0,07 и 0,14 мл/кг и внутрибрюшинном введении разрешающей дозы препарата 0,14 мл/кг на 14 и 21 дни после сенсибилизации селекартен не вызывает анафилактического шока.

Селекартен в испытанных дозах и схемах сенсибилизации не проявляет аллергизирующего действия в реакции гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок и в реакции подколенного лимфоузла у мышей.

В испытанных дозах 0,07 и 0,18 мл/кг (10- и 25-кратные высшие суточные дозы, рекомендованные для человека) селекартен не влияет на число антителобразующих и ядросодержащих клеток в селезенке, а также на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Полученные данные свидетельствую об отсутствии негативного влияния селекартена на гуморальный и клеточный иммунитет и, следовательно, об отсутствии у препарата иммунотоксичности.

Селекартен обладает иммуномодулирующим эффектом, особенно четко проявляющимся в опытах in vivo.

Селекартен в опытах in vivo повышает устойчивость мышей к смертельной стафилококковой инфекции (74,9% выживаемость мышей при 16% выживаемости в контроле), повышает способность клеток перитонеального экссудата мышей убивать поглощенный ими стафилококк, усиливает продукцию антител к тимусзависимому антигену и усиливает специфический клеточный иммунный ответ.

Селекартен в опытах in vitro и in vivo снижает продукцию лейкоцитами периферической крови мышей и человека и спленоцитами мышей активных форм кислорода: супероксидного аниона и перекиси водорода. В этом проявляется антиоксидантная активность Селекартена.

Доза вводимого препарата зависит от клинического состояния больного, его возраста, веса, а также способа введения. Эффективная терапевтическая суточная доза для больного составляет от 0,02 мг до 2,0 мг активного вещества, которое вводят одномоментно или дробно.

Способ иммуномодуляции осуществляют следующим образом.

Полученный препарат селекартен представляет собой раствор активного вещества в 70-96% этиловом спирте, 1 мл которого содержит 0,22-0,63 мг лекарственной субстанции. Селекартен вводят перорально, внутримышечно, внутривенно, внутриартериально, а также в виде мази с масляно-спиртовым наполнителем.

Введение препарата селекартен в неразбавленном виде недопустимо.

При пероральном введении необходимую дозу рассчитывают следующим образом:

в 30 каплях раствора (1 мл) содержится 0,22-0,63 мг лекарственной субстанции;

в 15 каплях (1/2 мл) содержится 0,11-0,32 мг препарата;

в 7 каплях (7/30) содержится 0,05-0,15 мг препарата;

в 3 каплях (1/10) содержится 0,02-0,06 мг препарата.

При внутримышечном, внутривенном или внутриартериальном введении препарат растворяют в 9% растворе натрия хлорида или воде для инъекций для лучшей диссоциации в соотношении 1:10 при внутримышечном введении или 1:15 при внутривенном и внутриартериальном введении.

Вводят медленно шприцом.

Например, детям до 7 лет при клинической патологии средней тяжести препарат вводят однократно в виде инъекции от 0,05 мл до 0,2 мл в день, при тяжелой степени патологии указанную дозу вводят два раза в день. При проведении интенсивной терапии препарат вводят внутримышечно или внутривенно (внутриартериально) по 0,3-0,5 мл соответственно с добавлением 3,0 мл или 5,0 мл физиологического раствора при внутримышечном введении или с добавлением 4,5 мл или 7,5 мл физиологического раствора при внутривенном и внутриартериальном введении. В случае перорального введения в зависимости от возраста, веса и степени поражения - от 0,1 мл до 2,0 мл за 30 минут до еды, при этом препарат селекартен растворяют в 30-50 г кипяченой теплой воды (30-38°С).

Продолжительность курса лечения составляет 15-20 дней, в зависимости от состояния больного. Проведение повторных курсов лечения до выраженного клинического эффекта возможно по рекомендации врача. В период проведения лечения контролируют иммунологический статус больного по клиническому анализу крови, биохимии крови и иммунограмме.

При применении препарата селекартен наблюдается относительная нормализация показателей крови, проявляющаяся улучшением клинического самочувствия больных.

Примеры способа лечения больных с нарушениями иммунной системы.

Пример 1. Больная 18 лет. Диагноз: острый бронхит.

Больная жаловалась на общее недомогание, чувство разбитости, сильный сухой кашель с затруднением дыхания и одышкой. Температура была высокой. Аппетит отсутствовал. С согласия родителей больной было проведено лечение селекартеном. Использовался препарат следующего состава:

фосфолипиды - 0,1 мг/мл, β-каротин - 4,0 мкг/мл, селен - 19 мкг/мл, хлорофилл - 15 мг/мл.

Больная принимала 0,5 мл селекартена два раза, утром и вечером, за 30 минут до еды, при этом препарат растворяла в 50 г кипяченой теплой воды. Продолжительность курса лечения составила 20 дней. Температура тела нормализовалась на вторые сутки, появился аппетит. Через 5 суток после начала лечения кашель стал влажным и начала отходить мокрота. Через 15 суток кашель прекратился. После нормализации показателей иммунной системы больная жалоб не предъявляет.

Показатели иммунной системы до лечения: Т-хелперы - 22; Т-супрессоры - 24: Т-хелперы/Т-супрессоры - 0,92.

Показатели иммунной системы после лечения: Т-хелперы - 41; Т-супрессоры - 22: Т-хелперы/Т-супрессоры - 1,86.

Пример 2. Больной 41 год. Диагноз: хронический бронхит.

Больной на протяжении 7 лет периодически болел острым бронхитом. Жалобы на общее недомогание, сильный сухой кашель с затруднением дыхания, кашель особенно усиливался в холодную и сырую погоду. Больной курит.

С согласия больного было проведено лечение селекартеном следующего состава:

фосфолипиды - 0,2 мг/мл, β-каротин - 7,0 мкг/мл, селен - 6 мкг/мл, хлорофилл - 20 мг/мл.

Лечение проводилось по следующей схеме: 0,5 мл селекартена три раза, утром, в полдень и вечером, за 30 минут до еды, при этом препарат растворяли в 50 г кипяченой теплой воды. Было проведено два курса лечения по 20 дней каждый. Перерыв между курсами лечения составил 5 дней. Через 7 суток после начала лечения кашель стал влажным. Через 14 суток начала отходить слизисто-гнойная мокрота со рвотой. Этот процесс длился 1 день. Кашель прекратился через 34 дня. После лечения больной жалоб не предъявляет.

Показатели иммунной системы до лечения: Т-хелперы - 27; Т-супрессоры - 26: Т-хелперы/Т-супрессоры - 1,04.

Показатели иммунной системы после лечения: Т-хелперы - 34; Т-супрессоры - 19: Т-хелперы/Т-супрессоры - 1,79.

Пример 3. Больная 47 год. Диагноз: хронический колит.

Больная на протяжении 6 лет болела хроническим колитом с периодическими обострениями, которые начинались в следствии общего переутомления. Жалобы на боль в животе, носящую схваткообразный характер, частые запоры, потерю аппетита, слабость. Несколько раз доставлялась врачами скорой помощи в больницу с подозрением на аппендицит.

С согласия больной было проведено лечение селекартеном следующего состава:

фосфолипиды - 0,4 мг/мл, β-каротин - 3,0 мкг/мл, селен - 12 мкг/мл, хлорофилл - 10 мг/мл.

Лечение проводилось по следующей схеме: однократное введение в виде внутримышечной инъекции 0,3 мл селекартена в день, с добавлением 3,0 мл физиологического раствора. Был проведен один курс лечения в течение 15 дней. На вторые сутки после начала лечения произошло опорожнение кишечника, появился аппетит. На пятые сутки больная жалоб на боль в животе не предъявляла. Появилось желание заняться физическими упражнениями. Больная инъекции переносила хорошо. Показатели иммунной системы до лечения: Т-хелперы - 27; Т-супрессоры - 16: Т-хелперы/Т-супрессоры - 1,69.

Показатели иммунной системы после лечения: Т-хелперы - 48; Т-супрессоры - 23: Т-хелперы/Т-супрессоры - 2,1.

Иммуномодулирующий препарат, характеризующийся тем, что содержит спиртовой экстракт хлорофилла, выделенный из зеленой массы донника лекарственного - Melilotus officinalis L. и донника рослого - Melilotus altissimus Thuill. семейство бобовые - Fabaceae, а также фосфолипиды, β-каротин и селен при следующем содержании компонентов на 1 мл препарата:

Фосфолипиды	0,1-0,4 мг
β-Каротин	3,0-7,0 мкг
Селен	5,0-20,0 мкг
Хлорофилл	10,0-20,0 мг