Средство, обладающее бактерицидным действием в отношении вегетативных и споровых клеток bacillus anthracis, способ профилактики и лечения сибирской язвы
Владельцы патента RU 2296576:
ФГУП Государственный Научный Центр прикладной микробиологии (RU)
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, ветеринарии и может быть использовано для ингибирования жизнеспособности вегетативных и споровых клеток Bacillus anthracis, a также для профилактики сибирской язвы. Предложенное средство, обладающее бактерицидным действием в отношении вегетативных споровых клеток Bacillus anthracis, содержит бактериолитический комплекс, продуцируемый Lysobacter sp.XL1. В способе профилактики сибирской язвы в качестве действующего средства используют бактериолитический комплекс, продуцируемый указанным штаммом бактерии. При этом для профилактики используют подкожную инъекцию средства при однократном введении не позднее чем через 3 часа после заражения или наложение на предполагаемое место проникновения возбудителя пропитанной действующим средством повязки (салфетки), также обработку возможного очага инфекции аэрозолем. Изобретение обеспечивает отсутствие побочных эффектов и сокращение сроков профилактики. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и ветеринарии и может быть использовано для профилактики и лечения сибирской язвы.
Профилактику сибирской язвы проводят как путем вакцинирования населения, так и путем продолжительной антибиотикотерапии.
1. Вакцинирование населения.
Известно, что в настоящее время для иммунизации людей против сибирской язвы используют либо живую на основе аттенуированного штамма, либо инактивированную адсорбированную на основе протективного антигена сибиреязвенные вакцины. В последние годы проводят исследования по созданию новых генно-инженерных вакцин на основе рекомбинантного летального токсина В. anthracis (Price B.M., Liner A.L., Park S., Leppla S.H., Mateczun A., Galloway D.R. Protection against anthrax lethal toxin challenge by genetic immunization with a plasmid encoding the lethal factor protein. 2001, Infect Immun, N 69, pp.4509-4515). В США и странах Западной Европы единственной вакциной, используемой для иммунизации людей против сибирской язвы, является инактивированная адсорбированная сибиреязвенная вакцина, выпускаемая компанией <BioPort Corporation> (Лансинг, Мичиган, США). Она представляет собой бесклеточный фильтрат культуры В.anthracis, выращенной в жидкой питательной среде. При производстве вакцины используется токсигенный штамм, не образующий капсулы, известный под названием V770-NR1-R. Фильтрат содержит смесь продуктов жизнедеятельности клеток В. anthracis, в том числе и протективный антиген (Turnbull P.S.B., Broster M.G., Carman J.A., Manchee R.J., Melling J. Development of antibodies to protective antigen and lethal factor components of anthrax toxin in humans and guinea pigs and their relevance to protective immunity. 1986, Infect. Immun., №52, pp.356-363). Компоненты вакцины адсорбированы на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта. Эффективность и безопасность ее подтверждена Администрацией по контролю за лекарствами и пищевыми продуктами США (FDA).
В России лицам, представляющим группу риска заражения сибирской язвой (работники предприятий по обработке продуктов животноводства), проводят плановую иммунизацию живой аттенуированной сибиреязвенной вакциной СТИ. Плановая вакцинация проводится лицам групп риска ежегодно, экстренная - по мере необходимости одновременно с превентивной антибиотикотерапией, так как введение вакцины без эффективных антибиотиков не предотвращает развития заболевания.
2. Антибиотикотерапия.
Для профилактики сибирской язвы используют длительную (60-100 дней) антибиотикотерапию. Наиболее часто применяют такие препараты, как доксициклин (Centers for Disease Control and Prevention. Update: Investigation of Bioterrorism-Related Anthrax and Interim Guidelines for Exposure Management and Antimicrobial Therapy. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2001, October 24; № 50, pp.909-919) и фторхинолоны (ципрофлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, гатифлоксацин) (Ferrandiz M.J., Fenoll A., Linares J., De La Campa A. Horizontal transfer of parC and gyrA fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Streptococcus pneumoniae. 2000, Antimicrob Agent Chemother, N 44, pp.840-847). Для детей, беременных и кормящих грудью женщин оптимальной альтернативой является амоксициллин (Prophylactic treatment of anthrax with antibiotics editorial. 2001, BMJ, № 323, pp.1017-1018; Centers for Disease Control and Prevention. Updated recommendations for antimicrobial prophylaxis among asymptomatic pregnant women after exposure to Bacillus anthracis. 2001, MMWR Morb Mortal Wkly Rep., N 50, p.960), использование которого позволяет избежать развития токсических эффектов, характерных для фторхинолонов и тетрациклинов. В то же время FDA для применения в качестве целенаправленной превентивной терапии во всех возрастных группах был одобрен пенициллин G прокаин (Food and Drug Administration. Prescription drug products: doxycycline and penicillin G procaine administration for inhalational anthrax (post-exposure). Fed. Reg, 2001; N66, pp.55679-55682).
Наиболее предпочтительным для экстренной профилактики сибирской язвы считается одновременное использование антибиотиков и вакцины (Friedlander A.M., Welkos S.L., Pitt M.L.M., Ezzell J.W., Worsham P.L. et al. 1993, Postexposure prophylaxis against experimental anthrax. J Infect Dis., № 167, pp.1239-1243.; Henry L. Inhalational Anthrax: Threat, Clinical Presentation and Treatment. 2001, J Am. Acad. Nurse Pract., № 13, pp.164-168).
Однако у известных способов профилактики имеются недостатки.
Недостатки вакцинирования:
1. Аллергические реакции: отек и боль в месте введения вакцины, инфильтрация, головная боль, артралгия, астения и кожный зуд. В редких случаях - так называемые отсроченные или поздние реакции, проявляющиеся одышкой, выраженным потоотделением, бледностью кожи, уртикарной экзантемой (данные Системы регистрации нежелательных реакций, связанных с вакцинацией (VAERS - Vaccine Adverse Event Reporting System).
2. Перенесенная в анамнезе инфекция, вызванная В.anthracis, является противопоказанием для введения вакцины.
3. Применяемая в России для иммунизации лиц группы риска (работники предприятий по обработке продуктов животноводства) живая аттенуированная сибиреязвенная вакцина СТИ вызывает местные и общие реакции.
Недостатки антибиотикотерапии:
1. Длительное применение антибиотиков может привести к появлению антибиотикоустойчивых штаммов возбудителя сибирской язвы. Возбудитель сибирской язвы может приобретать устойчивость к пенициллинам, тетрациклинам (доксициклину), сульфаметоксазолу, триметоприму, котримоксазолу, азтреонаму и другим антибиотикам.
Известны случаи развития резистентности у штаммов В.anthracis при культивировании на средах, содержащих субингибирующие концентрации ряда антибиотиков (доксициклин, эритромицин, азитромицин, кларитромицин, ципрофлоксацин, алатрофлоксацин, гатифлоксацин). Так, в одном исследовании после нескольких пассажей возбудителя на среде с каким-либо фторхинолоном наблюдалось повышение МПК для всех антибиотиков этой группы.
2. Длительный прием антимикробных препаратов способствует селекции резистентности к ним и других более распространенных и клинически значимых патогенных микроорганизмов. Так, длительное применение антибиотиков способствует формированию новой популяции пневмококков, резистентных как к пенициллину, так и к фторхинолонам, кроме того, приводит к гибели нормальной микрофлоры организма человека.
3. В ходе превентивной антимикробной терапии у пациентов возникают нежелательные побочные реакции, такие как: тошнота, рвота, диарея и боли в животе, обморочные состояния, головокружение, изжога, сыпь различного характера, крапивница и зуд кожи, а также симптомы, возможно, связанные с анафилактическими реакциями (затруднения при дыхании, глотании, чувство сдавленности в области шеи, отек губ, языка или лица).
4. Длительное применение ципрофлоксацина у лиц моложе 16 лет может привести к развитию артропатии, а доксициклин приводит к нарушению роста костей у детей, кроме того, он является гепатотоксичным.
5. Длительная превентивная антибиотикотерапия приводит к ослаблению иммунной системы и возникновению вторичных микозов.
Известны способы лечения сибирской язвы с использованием антимикробных препаратов.
Природные штаммы В.anthracis, в том числе и штаммы, выделенные в США осенью 2001 г., чувствительны ко многим антибиотикам, включая пенициллин, амоксициллин, доксициклин, тетрациклин, кларитромицин, клиндамицин, рифампицин, ванкомицин, хлорамфеникол и ципрофлоксацин. По данным in vitro исследований цефазолин и другие цефалоспорины I поколения также активны в отношении В.anthracis. Выделенные в США осенью 2001 г. 11 штаммов возбудителя сибирской язвы являются умеренно резистентными к эритромицину и азитромицину. Учитывая опыт лечения пациентов с ингаляционной формой сибирской язвы, вовлеченных во вспышку в США осенью 2001 г., CDC (Центр по контролю лекарственных средств) в качестве стартовой терапии пациентов с ингаляционной формой болезни, а также больных с системными проявлениями заболевания, рекомендует использовать комбинацию антимикробных препаратов (Hanter P. In response to Recent Events: Update on Bacillus anthracis. 2001, ESCMID News, N3, pp.23-26).
Комбинированная антибактериальная терапия, как правило, включает ципрофлоксацин или доксициклин в качестве препарата выбора в сочетании с одним из антибиотиков, к которому чувствительны (по результатам in vitro исследований и экспериментов на животных моделях) природные штаммы В.anthracis.
Длительность антибактериальной терапии кожной, легочной и гастроинтестинальной форм сибирской язвы при ингаляционном пути поступления инфекции в организм составляет от 60 до 100 дней (Centers for Disease Control and Prevention. Update: Investigation of Bioterrorism-Related Anthrax and Interim Guidelines for Exposure Management and Antimicrobial Therapy. 2001, MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. October 24; N50, pp.909-919). Необходимость длительного приема антимикробных препаратов обусловлена феноменом "отсроченного прорастания спор" В.anthracis.
Сущность феномена заключается в том, что ингалированные споры возбудителя сибирской язвы могут длительно, в течение нескольких недель, персистировать в неактивном состоянии в альвеолах до тех пор, пока не будут захвачены альвеолярными макрофагами. Только после этого начинается их прорастание в вегетативные формы и размножение.
Известен способ лечения с использованием иммунной сыворотки, полученной от вакцинированных лиц и содержащей антитела, преимущественно IgG, к факторам токсина возбудителя сибирской язвы. Однако этот способ нельзя считать перспективным в связи с риском инфицирования вирусом гепатита С, гепатита В, ВИЧ и другими возбудителями инфекций.
У других способов лечения сибирской язвы также отмечены недостатки.
Используемые для лечения сибирской язвы антимикробные препараты обладают активностью только в отношении прорастающих спор и размножающихся вегетативных форм, но не действуют на зрелые споры В.anthracis. После преждевременного прекращения антибиотикотерапии сохранившиеся споры возбудителя при условии, что их количество достаточно велико, чтобы преодолеть защитные силы макроорганизма, могут вызвать рецидив болезни. Однако необходимо отметить, что этот феномен никогда не наблюдался при кожной и гастроинтестинальной формах сибирской язвы.
Кроме того, известно, что назначение антибактериальных препаратов способно увеличивать продолжительность инкубационного периода.
Известно также, что возможна селекция штаммов В.anthracis, обладающих устойчивостью к различным антимикробным препаратам.
Широко известны случаи развития резистентности у штаммов В.anthracis к доксициклину, эритромицину, азитромицину, кларитромицину, ципрофлоксацину, алатрофлоксацину, гатифлоксацину, бензилпенициллину, пенициллину.
Кроме того, в ходе лечения возникают нежелательные лекарственные реакции и осложнения.
Задача данного изобретения - разработка средства и способов профилактики и лечения сибирской язвы.
Технический эффект, получаемый при использовании предлагаемых способов, заключается:
- в сокращении сроков профилактики и лечения сибирской язвы, вызванной штаммами Bacillus anthracis, в том числе антибиотикоустойчивыми,
- в отсутствие основных побочных эффектов,
- в сведении к минимуму опасности рецидива заболевания.
Сущность изобретения заключается в применении бактериолитического комплекса, продуцируемого штаммом бактерии Lysobacter sp. XL1, в качестве средства, обладающего бактерицидным действием в отношении вегетативных и споровых клеток Bacillus anthracis, вызывающих сибиреязвенную инфекцию.
Сущность способа профилактики сибирской язвы состоит в том, что в качестве действующего средства используют бактериолитический комплекс, продуцируемый штаммом бактерии Lysobacter sp. XL1, при этом используют инъекции препарата, а также повязки или салфетки, пропитанные действующим средством, или обработку возможного очага инфекции аэрозолем.
Сущность способа лечения сибиреязвенной инфекции состоит в том, что в качестве действующего средства используют бактериолитический комплекс, продуцируемый штаммом бактерии Lysobacter sp. XL1, при этом для лечения генерализованных форм сибирской язвы используют инъекции действующего средства, в случае кожной формы болезни используют обкалывание очага поражения или обработку аэрозолем.
Для лечения и профилактики экспериментальной сибирской язвы используют раствор бактериолитического комплекса в фосфатном буфере, который готовят непосредственно перед применением. Исходная концентрация раствора составляет 10 мг/мл. Животным вводят 0,1 мл раствора бактериолитического комплекса, что составляет дозу 1 мг/мышь.
Раствор бактериолитического комплекса вводят подкожно во внутреннюю поверхность бедра в ту же конечность, в которую проводят заражение возбудителем сибирской язвы. Профилактику и лечение сибиреязвенной инфекции проводят либо путем однократного введения раствора бактериолитического комплекса не позже чем через три часа после заражения (профилактика), либо введением препарата не позже чем через 24 часа (лечение).
В состав бактериолитического комплекса входят следующие компоненты, мас.%:
| Бактериолитические ферменты | |
| (мурамидаза, мурамоилаланинамидаза, | |
| эндопептидаза, бактериолитический | |
| фермент, имеющий молекулярную | |
| массу около 22 кДа) | 2-5 |
| Протеаза | 1-2 |
| Балластные компоненты | 2-4 |
| Полисахарид | Остальное |
[Международная заявка WO 02/44352, C 12 N 9/00, 2002 г. или патент RU № 2193063, C 12 N 9/00, 2002 г.].
В указанных материалах штамм - продуцент бактериолитического комплекса носит наименование Xanthomonas campestris X1 L. При этом в международной заявке отмечено, что идентификация, проведенная на основании определителя Берги (Bergey's manual of systematic bacteriology. Eds. Noel R. Krieg, John G. Holt. Baltimore; London, Williams & Wilkins. 1984, v.1), позволила отнести данную бактерию к виду Xanthomonas campestris или к роду Lysobacter.
После установления нуклеотидной последовательности гена, кодирующего 16-S РНК бактерии, и анализа этой последовательности, проведенной при помощи компьютерных программ анализа ДНК и РНК, представленных в базе данных "Ribosomal Database Project" (http://rdp.cme.msu.edu/html/), штамм был отнесен к роду Lysobacter sp. X1 L.
Авторами предлагаемого изобретения установлено, что бактериолитический комплекс лизирует вегетативные клетки грамположительных бактерий, в частности, Bacillus anthracis, Bacillus cereus 217, Bacillus subtilis W23, Bacillus subtilis 168 и обладает спороцидным действием по отношению к зрелым спорам указанных микроорганизмов.
Способ профилактики и лечения осуществляют следующим образом: зараженным животным с помощью инъекций подкожно вводят бактериолитический комплекс, продуцируемый штаммом бактерии Lysobacter sp. XL1.
Возможность осуществления способа подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.
Пример. 1. Лизис вегетативных клеток В.anthracis.
В колбу с L-бульоном вносят споровую суспензию В.anthracis штамма СТИ-1 до конечной концентрации 106-107 спор/мл. Колбу инкубируют при 37°С 18 часов. Клетки концентрируют центрифугированием, промывают физиологическим раствором и затем суспендируют в 0,01М фосфатном буфере рН 8,0-8,5 таким образом, чтобы конечная концентрация вегетативных клеток сибиреязвенного микроба составляла около 108 клеток/мл по стандарту мутности ГКИ 10 единиц. Суспензию клеток разливают в одинаковые биологические пробирки по 5 мл и в каждую пробирку вносят свежеприготовленный раствор бактериолитического комплекса в конечной концентрации от 50 до 2500 мкг/мл. Пробирки инкубируют при 37°С и через равные промежутки времени проводят визуальный контроль мутности опытных образцов по сравнению с контрольным образцом.
Данные, представленные в таблице 1, позволяют сделать вывод о том, что бактериолитический комплекс в концентрации 50-2500 мкг/мл оказывает лизирующее действие на вегетативные клетки В.anthracis.
Пример 2. Спороцидное действие бактериолитического комплекса на зрелые споры В.cereus 217, В.subtilis 168, W23 и В.anthracis СТИ-1 с выявлением результатов в жидкой среде и контролем на плотной питательной среде.
К 2 мл зрелых спор в 10 мМ трис HCl буфере, рН 8,0 (ОД600˜0,02) добавляют 2,5 мг бактериолитического комплекса, инкубируют на качалке при 37°С 8 часов. Затем добавляют в опытную пробирку еще 2,5 мг бактериолитического комплекса, инкубируют 12 часов на качалке при 37°С. В контрольный вариант вместо фермента добавляют 10 мМ трис HCl буфера, рН 8,0. Споры отмывают 2 раза 0,1 М NaCl, затем 2 раза водой. Для активации прорастания спор, инактивации фермента (бактериолитического комплекса) и нарушения жизнеспособности вегетативных клеток смесь прогревают при 85°С 20 мин, затем переносят в 5 мл жидкой среды LB для прорастания. Прорастание проводят при 37°С. Делают высевы из жидкой среды на чашки с плотной питательной средой в 0; 1,5; 3; 7; 9; 24 ч. Рост контролируют в жидкой среде по ОД600; на чашках - визуально.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что бактериолитический комплекс ингибирует жизнеспособность 100% зрелых спор В.subtilis, В.cereus и 85% зрелых спор В.anthracis.
Пример 3. Действие бактериолитического комплекса на прорастающие споры B.anthracis СТИ-1.
Готовят взвесь спор в воде в концентрации 3×108 спор/мл. Споры активируют прогреванием при 70°С в течение 30 минут, затем засевают колбу с L-бульоном с начальной оптической плотностью 0,1. Из этой колбы отбирают пробы через 30; 60; 120 мин. Образцы проб в объеме 5 мл осаждают, отмывают водой, ресуспендируют в рабочем буфере для фермента, содержащем 1 мг бактериолитического комплекса/мл 10 мМ трис HCl буфера, рН 8,0. Пробы инкубируют в термостате при 37°С 18 часов. По окончании инкубации споры центрифугируют, дважды отмывают водой, раститровывают в физиологическом растворе и высевают на чашки с L-агаром для определения количества проросших спор.
Данные, представленные в таблице 2, показывают, что бактериолитический комплекс в концентрации 1 мг/мл оказывает бактерицидное действие на прорастающие споры сибиреязвенного микроба, причем сила этого действия зависит от стадии прорастания спор.
Пример 4. Способ лечения бактериолитическим комплексом экспериментальной сибиреязвенной инфекции.
Опыт проводят на беспородных белых мышах весом 18-20 г. 50 мышам вводят подкожно по 5×102 спор штамма 71/12 (II вакцины Ценковского) Bacillus anthracis на мышь, а затем делят на 10 экспериментальных групп, каждая по 5 мышей (таблица 3). Экспериментальным мышам вводят подкожно лекарственные препараты.
Наблюдение за мышами проводят в течение 14 дней.
В контрольной группе, а также группах 8 и 9, в которых проводят лечение мышей бычьим сывороточным альбумином (1 мг/мышь) наблюдают 100% смертность экспериментальных животных на шестой день после заражения. В группе 10 (лечение мышей лизоцимом) отмечают 80% смертность. При лечении мышей бактериолитическим комплексом в концентрации 0,1 мг/мышь (группы 5, 6) выживаемость составляет 80 и 60% соответственно. Введение препарата в неинфицированную лапу (группы 4, 7) оказывается неэффективным: выживаемость 20 и 0% соответственно. При использовании бактериолитического комплекса в концентрации 1 мг/мышь (группы 2, 3), введенного экспериментальным животным в ту же конечность, выжило 100% животных.
Пример 5. Способ лечения бактериолитическим комплексом легочной формы сибирской язвы.
Для определения лечебного эффекта бактериолитического комплекса при лечении легочной формы сибирской язвы по 10 мкл споровой суспензии Bacillus anthracis, содержащей 109 спор/мл штамма 71/12 (II вакцины Ценковского) интраназально вводят беспородным белым мышам. Бактериолитический комплекс вводят как интраназально - 1 мг лизоамидазы в 20 мкл буфера (таблица 4, группы 2, 3), так и подкожно, также из расчета 1 мг/мышь (таблица 4, группа 4). Наблюдение за мышами проводят в течение 14 дней. Из таблицы 4 следует, что без лечения бактериолитическим комплексом (группа 1) наблюдается 100% смертность зараженных животных. В случае лечения легочной формы сибирской язвы выявляется большая эффективность подкожного введения бактериолитического комплекса (группа 5 - выживаемость 60%) по сравнению с интраназальным (группы 3 и 4 - выживаемость 20%).
Пример 6. Способ лечения сибирской язвы бактериолитическим комплексом при внутрибрюшинном введении спор Bacillus anthracis.
Опыт проводят по следующей схеме:
Беспородным белым мышам вводят внутрибрюшинно споры возбудителя сибирской язвы штамма 71/12 (II вакцины Ценковского) в дозе 1,2×103 спор. Затем всех животных делят на три группы: 1 группа - нелеченые животные, 2 группа - внутрибрюшинное введение раствора бактериолитического комплекса, 3 группа - лечение раствором бактериолитического комплекса путем введения его подкожно во внутреннюю поверхность бедра. При этом на фоне гибели контрольных животных наблюдается 90 и 100% лечебный эффект соответственно (табл.5).
Пример 7. Способ лечения бактериолитическим комплексом животных, зараженных вегетативными клетками Bacillus anthracis.
Беспородным белым мышам вводят подкожно во внутреннюю поверхность бедра вегетативные клетки штамма Bacillus anthracis СТИ-1, выращенные на L-агаре, в дозе 108 клеток/мышь. Через 1 час в это же место вводят подкожно раствор бактериолитического комплекса. Нелеченые мыши гибнут через 24 часа в 100%, тогда как в группе леченых животных гибель составляет лишь 10%.
Пример 8. Способ лечения бактериолитическим комплексом сибирской язвы, вызванной Bacillus anthracis штаммом СТИ-ПРТС (устойчивый к рифампицину, ампициллину, тетрациклину, доксициклину).
Мышей линии СВА подкожно заражают споровыми суспензиями штаммов СТИ-1 и СТИ-ПРТС. Характеристика штаммов представлена в таблице 6.
Заражающие дозы для обоих штаммов - 107, 106 и 105 спор. Лечение животных проводят доксициклином или бактериолитическим комплексом. Доксициклин вводят мышам per os из расчета 100 мкг/мышь; лечение доксициклином начинают через 3 часа после заражения путем введения препарата 1 раз в сутки в течение 7 дней. Бактериолитический комплекс вводят подкожно во внутреннюю поверхность бедра в ту же лапу, в которую проводили заражение, в дозе 1 мг/мышь; лечение проводят однократно через 3 часа после заражения (табл.7).
Показан лечебный эффект доксициклина и бактериолитического комплекса при лечении мышей, зараженных спорами Bacillus anthracis СТИ-1 (исходный) в зависимости от заражающей дозы. Применение бактериолитического комплекса в качестве лечебного препарата при лечении мышей, зараженных штаммом Bacillus anthracis СТИ-ПРТС, приводит к 100% выживаемости животных при заражающей дозе 105 и 106 спор, при этом лечение доксициклином животных, зараженных этим же штаммом, при всех заражающих дозах было неэффективно.
Эффективность препарата была оценена в заключительных экспериментах при заражении золотистых хомяков вирулентным штаммом Bacillus anthracis. Животным подкожно во внутреннюю поверхность бедра вводят споровую суспензию штамма 4-7 в дозе 100 ЛД50. Первой группе животных через 3 часа подкожно вводят бактериолитический комплекс в дозе 5 мг/хомяка в ту же конечность, в которую проводили заражение. Второй группе животных препарат в той же дозе вводят через 3 и 24 часа в ту же конечность. Третьей группе животных препарат в той же дозе вводят через 3 и 24 часа в другую конечность. Наблюдение за животными проводят 14 дней.
Анализ данных, приведенных в таблице 8, показывает, что при различных режимах введения препарата эффективность его применения при лечении и профилактике составляет 60-100% и зависит от места аппликации.
Приведенные выше результаты по оценке эффективности препарата in vitro в отношении возбудителя сибирской язвы и данные по эффективности лечения острой сибиреязвенной инфекции, протекающей с картиной инфекционно-токсического шока у экспериментальных животных, позволяют заключить, что препарат может применяться для лечения сибирской язвы у людей и сельскохозяйственных животных.
Таким образом, предложены:
- средство, обладающее бактерицидным действием в отношении вегетативных и споровых клеток бактерий Bacillus anthracis;
- новый способ профилактики и лечения сибирской язвы, который обеспечивает сокращение сроков профилактики и лечения сибирской язвы, вызванной штаммами бактерий Bacillus anthracis, в том числе антибиотикоустойчивыми;
- отсутствие основных побочных эффектов;
- сведение к минимуму опасности рецидива заболевания.
| Таблица 1 Лизис вегетативных клеток В.anthracis в присутствии бактериолитического комплекса | ||||||
| Штамм | Концентрация бактериолитического комплекса в мкг/мл | |||||
| 50 | 100 | 250 | 500 | 1000 | 2500 | |
| СТИ-1 | + | + | + | + | + | + |
| Таблица 2 Количество колоний В.anthracis на чашках с L-агаром | ||||||
| Время отбора проб из L-бульона | Количество колоний, выросших при высеве разведения пробы | |||||
| 3 | 4 | 5 | ||||
| 0 | Сплошной рост | Сплошной рост | 300 | |||
| 30 мин | Сплошной рост | Сплошной рост | 120 | |||
| 1 час | 270, 250, 220 | 28, 34, 32 | 0 | |||
| 2 часа | 5,4,7 | 1,2,1 | 0 |
| Таблица 3 Эффективность лечения экспериментальной сибирской язвы бактериолитическим комплексом | ||||||
| Группа животных | Количество животных | Гибель животных на ... сутки | Кол. павших/кол. зараженных | |||
| 2 | 3 | 6 | 7 | |||
| 1 - контроль заражающей дозы | 5 | 2 | 1 | 2 | 5/5 | |
| 2 - лечение бактериолитическим комплексом 1 мг/мышь через 3 часа | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0/5 |
| 3 - лечение бактериолитическим комлексом 1 мг/мышь через 24 часа | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0/5 |
| 4 - лечение бактериолитическим комплексом 1 мг/мышь через 24 часа в другую лапу | 5 | 0 | 3 | 0 | 1 | 4/5 |
| 5 - лечение бактериолитическим комплексом 0.1 мг/мышь через 3 часа | 5 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1/5 |
| 6 - лечение бактериолитическим комплексом 0.1 мг/мышь через 24 часа | 5 | 1 | 0 | 0 | 1 | 2/5 |
| 7 - лечение бактериолитическим комплексом 0.1 мг/мышь через 24 часа в другую лапу | 5 | 1 | 2 | 2 | 0 | 5/5 |
| 8 - лечение бычьим сывороточным альбумином 1 мг/мышь через 3 часа | 5 | 2 | 1 | 1 | 1 | 5/5 |
| 9 - лечение бычьим сывороточным альбумином 1 мг/мышь через 24 часа | 5 | 1 | 2 | 2 | 0 | 5/5 |
| 10 - лечение лизоцимом 1 мг/мышь через 3 часа | 5 | 1 | 3 | 0 | 0 | 4/5 |
| Таблица 4 Эффективность лечения бактериолитическим комплексом легочной формы сибирской язвы | ||||||
| Группа животных | Количество животных в группе | Гибель животных на ... сутки | Кол. погибших/кол. зараженных | |||
| 4 | 5 | 6 | 7 | |||
| I - Контроль заражающей дозы | 5 | 4 | 1 | 5/5 | ||
| II - Интраназальное введение бактериолитического комплекса 1 мг/мышь через 3 часа | 5 | 4 | 0 | 0 | 0 | 4/5 |
| III - Интраназальное введение бактериолитического комплекса 1 мг/мышь через 24 часа | 5 | 4 | 0 | 0 | 0 | 4/5 |
| IV - Подкожное введение бактериолитического комплекса в лапу 1 мг/мышь через 3 и 24 часа | 5 | 1 | 1 | 0 | 0 | 2/5 |
| V - Интраназальное введение бактериолитического комплекса 1 мг/мышь без культуры | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0/5 |
| Таблица 5 Эффективность лечения сибирской язвы при внутрибрюшинном заражении мышей | ||||||
| Группа животных | Количество животных в группе | Гибель животных на ... сутки | Количество павших/кол. зараженных | |||
| 2 | 3 | 4 | 6 | |||
| I - Контроль заражающей дозы | 10 | 2 | 2 | 4 | 2 | 10/10 |
| II - Внутрибрюшинное введение бактериолитического комплекса в дозе 1 мг/мышь | 10 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1/10 |
| III - Подкожное введение бактериолитического комплекса в дозе 1 мг/мышь | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0/10 |
| Таблица 6 Определение антибиотикоустойчивости сибиреязвенных вакцинных штаммов методом дисков | |||||||
| Штаммы | Зона задержки роста культуры (мм) при использовании дисков с антибиотиками | ||||||
| Amp | Rif | Ery | Ole | Km | Cm | Tc | |
| СТИ-1 | 4 | 2 | 3 | 4 | 6 | 4 | 7 |
| СТИ-ПРТС | 0 | 0 | 3 | 4 | 6 | 4 | 0 |
| Таблица 7 Эффективность лечения животных, зараженных антибиотикоустойчивым штаммом Bacillus anthracis СТИ-ПРТС | |||||||
| Группы животных, Штаммы | Гибель животных из взятых в опыт при заражении дозами | ||||||
| 107 спор | 106 спор | 105 спор | |||||
| 1. СТИ-1 - контроль (без лечения) | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||||
| 2. СТИ-1 - лечение доксициклином (7 дней) | 3/3 | 1/3 | 0/3 | ||||
| 3. СТИ-1 - лечение бактериолитическим комплексом однократно через 3 часа | 3/3 | 0/3 | 0/3 | ||||
| 4. СТИ ПРТС - контроль (без лечения) | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||||
| 5. СТИ ПРТС - лечение доксициклином(7 дней) | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||||
| 6. СТИ ПРТС - лечение бактериолитическим комплексом однократно через 3 часа | 3/3 | 0/3 | 0/3 |
| Таблица 8 Эффективность лечения сибирской язвы при подкожном заражении хомяков вирулентным штаммом 4-7 | |||||
| Группа животных | Количество животных в опыте | Гибель животных на ... сутки | Количество павших/кол. зараженных | ||
| 2 | 3 | 4 | |||
| I - контроль (без лечения) | 5 | 2 | 3 | - | 5/5 |
| 2 - лечение бактериолитическим комплексом однократно через 3 часа в ту же лапу | 5 | - | - | - | 0/5 |
| 3 - лечение бактериолитическим комплексом через 3 и 24 часа в ту же лапу | 5 | - | - | - | 0/5 |
| 4 - лечение бактериолитическим комплексом однократно через 3 и 24 часа в другую лапу | 5 | 1 | - | 1 | 2/5 |
1. Средство, обладающее бактерицидным действием в отношении вегетативных и споровых клеток Bacillus anthracis, отличающееся тем, что оно содержит бактериолитический комплекс, продуцируемый штаммом бактерий Lysobacter sp. XL1, включающий следующие компоненты, мас.%:
| Бактериолитические ферменты: | |
| мурамидаза, мурамоилаланинамидаза, | |
| эндопептидаза, бактериолитический | |
| фермент, имеющий молекулярную массу около 22 кДа | 2-5 |
| Протеаза | 1-2 |
| Балластные компоненты | 2-4 |
| Полисахарид | Остальное |
2. Способ ингибирования жизнеспособности вегетативных и споровых клеток Bacillus anthracis, включающий введение действующего вещества, отличающийся тем, что в качестве действующего вещества используют средство по п.1.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве действующего вещества используют средство по п.1 в виде раствора в фосфатном буфере, при этом раствор готовят непосредственно перед применением.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что средство по п.1 вводят подкожно в ту часть тела, где находится очаг заражения.
5. Способ по п.2, отличающийся тем, что средство по п.1 вводят через 3 и 24 ч после заражения Bacillus anthracis.
6. Способ профилактики сибирской язвы, вызываемой Bacillus anthracis, включающий введение действующего вещества, отличающийся тем, что в качестве вещества используют средство по п.1, при этом используют подкожную инъекцию средства при однократном введении не позднее чем через 3 ч после заражения или наложение на предполагаемое место проникновения возбудителя пропитанной действующим средством повязки (салфетки), а также обработку возможного очага инфекции аэрозолем, содержащим средство по п.1.
