Биопрепарат для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической промышленности. Биопрепарат содержит ассоциацию штаммов бактерий Arthrobacter sp. МИА-89, Arthrobacter sp. МИА-74, Arthrobacter sp. ОС-1, взятых при соотношении соответственно 2:2:1, и стабилизирующий агент полиглюкин, при следующем соотношении компонентов, мас.%: ассоциация бактерий 40-60, полиглюкин 2-4, вода - до 100%. Изобретение позволяет повысить скорость утилизации нефти и нефтепродуктов при высоком ее содержании. 4 табл.

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается биопрепарата, включающего ассоциацию штаммов микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, и который может быть использован, например, для очистки загрязненных поверхностей.

Известна смесь специально селекционированных штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ В-3078 (36а-1), Rhodococcus luteus ВКПМ В-3077(25) и Micrococcus flavus ВКПМ В-3079 (53) (ав.св. СССР №1493666, C 02 F 3/34, 1989), используемый для деструкции нефти и нефтепродуктов.

Использование указанных культур микроорганизмов возможно только в аэротенках. Выращивание смеси культур возможно при больших материальных и энергозатратах.

Известен штамм бактерий Arthrobacter sp. ОС-1, выделенный из образца загрязненных нефтью вод, полученных с месторождения Ван-Еган. Штамм депонирован в ВКПМ института ВНИИГенетики под номером Ас-1556 (пат. РФ 2128221).

Известен штамм бактерий Arthrobacter sp. МИА-74, выделенный при воздействии космических излучений на штамм Arthrobacter sp. ОС-1. Штамм депонирован в ВКПМ института ВНИИГенетики под номером Ас-1575 (пат. РФ 2142996).

Известен штамм бактерий Arthrobacter sp. МИА-89, выделенный при воздействии космических излучений на штамм Arthrobacter sp. ОС-1. Штамм депонирован в ВКПМ института ВНИИГенетики под номером Ас-1576 (пат. РФ 2142997).

Указанные выше штаммы предназначены для разложения нефти и нефтепродуктов. Общим недостатком перечисленных выше штаммов является их сухая (лиофилизованная) форма, следствием чего низкая выживаемость микроорганизмов, высокие затраты на производство, необходимость предварительной подготовки (активизации) биопрепарата.

Наиболее близким аналогом является биопрепарат для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов, содержащий ассоциацию микроорганизмов и стабилизирующий агент (пат РФ №2180276). В качестве ассоциации штаммов используют бактериальные культуры-нефтеразрушители Rhodococcus ruber ИЭГМ 327, Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708. В качестве стабилизирующего агента используют биосуфроктант Rhodococcus.

Недостатком известного биопрепарата является недостаточная скорость утилизации нефти и неспособность осуществлять утилизацию нефти и нефтепродуктов при высоком содержании их к объему загрязненного объекта.

Целью данного изобретения является получение биопрепарата, содержащего ассоциацию штаммов, характеризующуюся высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов, которые являются единственными источниками углерода и энергии, и технологичность получения биопрепарата.

Поставленная цель достигается тем, что предлагается использовать биопрепарат, содержащей ассоциацию штаммов бактерий Arthrobacter sp. МИА-89, бактерий Arthrobacter sp. МИА-74, бактерий Arthrobacter sp. ОС-1, взятых при соотношении соответственно 2:2:1, и стабилизирующий агент - полиглюкин, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Ассоциация бактерий	40-60
Полиглюкин	2-4
Вода	до 100%

Биопрепарат имеет форму концентрата суспензии.

Идентификация каждого штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определении бактерий Bergey / Bergey Smanual of Systematic Bacteriology vol. 1.1984р./.

Выращивание проводили в колбах вместимостью 750 мл на качалках при скорости вращения 220 об/мин, объем питательной среды 100 мл.

Хранятся штаммы на агаризованных питательных средах при температуре 4-6°С в течение месяца. Более длительное хранение штамма осуществляется в герметично запаянных ампулах в лиофильно-высушенном состоянии. Составы среды для хранения штамма:

Мясопептонный агар (г/л):

Мясная вода	100,0
Агар	20,0
NaCl	5,0
Пептон	10,0
Глюкоза	7,0
Вода водопроводная	до 1 литра

Культурально-морфологические признаки Arthrobacter sp. МИА-89. Культура представляет собой подвижные, грамвариабельные, короткие палочковидные, мелкие клетки, расположенные хаотично. Культура полиморфна. Клетки подвижные, спор не образуют. Размер клеток в пределах 0,5-0,7-1,5 мкм.

Штамм МИА-89 растет на многих натуральных и синтетических средах. На МПА через 2 суток роста при температуре 30°С культура образует колонии неправильной формы, сероватого цвета, не очень крупные, плоские, маслянистой консистенции. Как правило, при выращивании на плотных средах на 2-3 сутки обнаруживается сплошной рост по штриху в виде образований сероватого цвета.

Культура не лизогенна, после хранения на плотных питательных средах в течение 2-3 недель негативных пятен не обнаружено (при Т=30-35°С).

На мясопептонном бульоне при 30°С через 3 суток наблюдается помутнение среды, беловатый осадок, заметно образование тонкого пристеночного кольца, небольшое количество агломератов клеток в толще среды в виде хлопьев, слабая пленка на поверхности среды. Оптимум роста (28-30)°С, рН 6,8-7,2.

Размножение и хранение культуры осуществляли путем пересева ее на мясопептонном агаре следующего состава, г/л:

Мясная вода	100,0
Агар	20,0
NaCl	5,0
Пептон	10,0
Глюкоза	7,0
Вода	до 1 л

Условия культивирования Arthrobacter sp. МИА-89, на ферментационной среде: температура - (28-30)°С, рН 6,8-7,2, продолжительность культивирования 22 часа. Состав ферментационной среды (вес.%):

Кормовые дрожжи (БВК)	2
Кукурузный экстракт	1
Вода водопроводная	до 100

Физико-биохимические признаки штамма МИА-89:

Факультативный анаэроб, растет в диапазоне температур от 18° до 30°С. Крахмал гидролизует слабо, молоко не пептонизирует, желатину не разжижает, казеин не гидролизует, некислотоустойчивый, каталазоположительный. Хорошо растет на МПБ, разбавленной средой Раймонда в отношении 1:1, с NaCl в концентрации 0,5%.

Отношение к источнику углерода.

Штамм МИА-89 ассимилирует углеводы с образованием кислот. Слабо усваивает сахарозу, мальтозу, рамнозу. Данный штамм проявляет хорошую способность к росту на углеводородных субстратах: парафине (С₁₀-С₁₃), гексадекане и сырой нефти. На жидкой среде Раймонда способен усваивать нефть и парафины в концентрации до 20%.

Отношение к источникам азота.

Штамм МИА-89 хорошо растет на средах с аммонийным и нитратным азотом, когда нефть выступает в качестве единственного источника углерода. На производственной питательной среде продуктивность культуры по биомассе составляет 2-3×10⁴ кл/мл, активность на песке с нефтью - на 7-е сутки биодеградация нефти отмечается в разведении 10¹-10⁸. Культура Arthrobacter sp. МИА-89 наиболее активно потребляет тяжелые фракции нефти (С₂₄-С₃₃).

Культура Arthrobacter sp. МИА-74 характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками.

Культура представляет собой подвижные, грамвариабельные короткие палочковидные мелкие клетки и клетки округлой формы, расположенные парами или по несколько в цепочке, а также и по одиночке, расположенные под углом друг к другу, а также отдельные кокковидные клетки. Клетки подвижные, спор не образуют. Размер клеток в пределах 0,7-0,8-2,5 мкм.

Штамм МИА-74 растет на многих натуральных и синтетических средах. На МПА через 2 суток роста при 30°С культура образует круглые колонии, не очень крупные, чуть выпуклые, с матовой поверхностью и ровными краями, слегка кожистой консистенции, с розовым пигментом. Как правило, при выращивании на плотных средах на 2-3 сутки обнаруживается сплошной рост по штриху в виде образований розового цвета.

Культура не лизогенна, после хранения на плотных питательных средах в течение 2-3 недель негативных пятен не обнаружено (при Т=30-35°С).

На мясопептонном бульоне при 30°С через 3 суток наблюдается помутнение среды, беловатый осадок, заметно образование тонкого пристеночного кольца, небольшое количество агломератов клеток в толще среды в виде хлопьев, слабая пленка на поверхности среды. Оптимум роста (28-30)°С, рН 6,8-7,2.

На минеральной среде Раймонда с нефтью в качестве единственного источника углерода наблюдается легкая опалесцирующая муть в толще среды. Визуально нефть значительно деградирована.

Размножение культуры осуществляли путем пересева на мясопептонном агаре, состав которой указан выше (Среда №1).

Условия культивирования Arthrobacter sp. МИА-74 на ферментационной среде при следующих условиях: температура (28-30)°С, рН 6,8-7,2, время культивирования 22 часа. Состав ферментационной среды (вес.%):

Кормовые дрожжи (БВК)	2
Кукурузный экстракт	1
Вода водопроводная	до 100

Физико-биохимические признаки штамма МИА-74:

Факультативный анаэроб растет в диапазоне температур от 18° до 30°С. Крахмал гидролизует слабо, молоко не пептонизирует, желатину не разжижает, казеин не гидролизует, некислотоустойчивый, каталазоположительный. Хорошо растет на МПБ, разбавленной средой Раймонда в отношении 1:1, с NaCl в концентрации 0,5%.

Отношение к источнику углерода.

Штамм МИА-74 ассимилирует углеводы с образованием кислот. Слабо усваивает сахарозу, мальтозу, рамнозу. Данный штамм проявляет хорошую способность к росту на углеводородных субстратах: парафине (C₁₀-C₁₃), гексадекане и сырой нефти. На жидкой среде Раймонда способен усваивать нефть в концентрации до 20%.

Отношение к источникам азота.

Штамм МИА-74 хорошо растет на средах с аммонийным и нитратным азотом, когда нефть выступает в качестве единственного источника углерода. На производственной питательной среде продуктивность культуры по биомассе составляет 2-3×10⁹ кл/мл, активность на песке с нефтью - на 7 сутки биодеградация нефти отмечается в разведении 10¹-10⁸.

Культура Arthrobacter sp. МИА-74 наиболее активно потребляет легкие нефтяные фракции(С₁₀-С₁₃), ароматические соединения, тяжелые фракции нефти (С₂₄-С₃₃).

Культура Arthrobacter sp. ОС-1 представляет собой подвижные, грамвариабельные короткие палочковидные мелкие клетки и клетки округлой формы, расположенные парами, а также и по одиночке, реже соединенные в цепочки по 3 и более клеток. Культура полиморфна. Встречаются ветвящиеся цепочки и палочки, расположенные под углом друг к другу, а также отдельные более мелкие кокковидные клетки. Образует цисты. Клетки подвижные, образуют капсулу, спор не образуют. Размер клеток в пределах 0,7-0,8-2,5 мкм.

Штамм ОС-1 растет на многих натуральных и синтетических средах. На МПА через 2 суток роста при 30°С культура образует плоские колонии, круглые с матовым слегка приподнятым центром полупрозрачным ровным опалесцирующим на свету краем. На МПА, содержащем вместо глюкозы 0,5% нефти, образует сильно выпуклые, круглые, блестящие, беловато-кремового цвета колонии. Как правило, при выращивании на плотных средах на 2-3 сутки обнаруживается сплошной рост по штриху в виде выпуклых слизистых образований беловато-кремового цвета с маслянистым блеском.

Культура не лизогенна, после хранения на плотных питательных средах в течение 2-3 недель негативных пятен не обнаружено (при Т=30-35°С).

На мясопептонном бульоне при 30°С через 3 суток наблюдается помутнение среды, беловатый осадок, заметно образование тонкого пристеночного кольца, небольшое количество агломератов клеток в толще среды в виде хлопьев, слабая пленка на поверхности среды. Оптимум роста (28-30)°С, рН 6,8-7,2.

На минеральной среде Раймонда с нефтью в качестве единственного источника углерода наблюдается легкая опалесцирующая муть в толще среды.

Размножение и хранение культуры осуществляли путем пересева на мясопептонном агаре, состав которой указан выше (Среда №1).

Условия культивирования Arthrobacter sp. ОС-1 на ферментационной среде: температура (28-30)°С, рН 6,8-7,2, продолжительность культивирования 22 часа. Состав ферментационной среды (вес.%):

Кормовые дрожжи (БВК)	2
Кукурузный экстракт	1
Вода водопроводная	до 100

Физико-биохимические признаки штамма ОС-1:

Факультативный анаэроб растет в диапазоне температур от 18° до 30°С. Крахмал гилролизует слабо, молоко не пептонизирует, желатину не разжижает, казеин не гидролизует, некислотоустойчивый, каталазоположительный. Хорошо растет на МПБ, разбавленной средой Раймонда в отношении 1:1, с NaCl в концентрации 0,5%.

Отношение к источнику углерода.

Штамм ОС-1 ассимилирует углеводы с образованием кислот. Слабо усваивает сахарозу, мальтозу, рамнозу. Данный штамм проявляет хорошую способность к росту на углеводородных субстратах: парафине (С₁₀-C₁₃), гексадекане и сырой нефти, нефтепродуктах (мазут, дизельное топливо). На жидкой среде Раймонда способен усваивать нефть и парафины в концентрации до 20%.

Отношение к источникам азота.

Штамм ОС-1 хорошо растет на средах с аммонийным и нитратным азотом, когда нефть выступает в качестве единственного источника углерода. На производственной питательной среде продуктивность культуры по биомассе составляет 2-3×10⁹ кл/мл, активность на песке с нефтью - на 7-е сутки биодеградация нефти отмечается в разведении 10¹-10⁸.

Культура Arthrobacter sp. ОС-1 наиболее активно потребляет легкие нефтяные фракции (С₁₀-С₁₃) и средние нефтяные фракции (С₁₄-С₂₀).

Пример 1. Получение биопрепарата

Для получения ассоциации используют штаммы бактерий Arthrobacter sp. МИА-89, бактерий Arthrobacter sp. МИА-74, бактерий Arthrobacter sp. ОС-1, взятые при соотношении соответственно 2:2:1 в количестве 40-60 мас.%. По окончании процесса ферментации каждого штамма полученную постферментационную жидкость подвергают процессу концентрирования. Смешение отдельно наработанных концентратов культур осуществляли непосредственно перед внесением с соответствующим контролем плотности бактериальной суспензии (титр - количество клеток в мл суспензии).

В концентрат бактериальной суспензии, полученной в результате смешения бактерий, вводят полиглюкин в объеме 2-4 мас.%.

№№состава	Штаммы, соотношение	Кол-во ассоциаций, мас%	Полиглюкин, %
МИА-89	МИА-74	ОС-1
1	2	2	1	60	4
2	2	2	1	50	3
3	2	2	1	40	2

Полученный биопрепарат хранят при температуре не выше 10°С. Непосредственно перед использованием препарат разбавляют водой в различных соотношениях.

Основные преимущества предложенного биопрепарата: повышенная степень взаимодействия с углеводородами нефти, в результате которой бактерии-нефтедеструкторы вступают в непосредственный контакт с загрязнителем: обеспечение биодоступности нефтепродуктов в результате их десорбции с почвенных частиц; высокая биодеградабельность. Препарат характеризуется высокой жизнеспособностью входящих в его состав бактерий, удобен в хранении и транспортировке, прост в подготовке к использованию.

Пример 2.

Экспериментальная оценка способности биопрепарата биодеградировать нефть проводилась в лабораторных условиях, в пилотных и полевых экспериментах комплексно по следующим показателям: убыли суммы углеводородов, изменению фракционного состава нефти в процессе биодеструкции, изменению площади остаточной нефти по отношению к общей площади загрязненной поверхности.

Для биообработки водных поверхностей биопрепарат заявляемого состава разводили до конечной концентрации клеток 1×10⁶ кл/мл в пресной воде, добавляли 0,2% нитроаммофоски. Наносили готовый раствор из расчета 10 л/м² поверхности почвы. Через 10-15 дней проводили повторную биообработку загрязненной поверхности. При необходимости, в случае высокого уровня загрязнения, проводили третью биообработку через 10-15 дней после второй. На почвах при пересыхании обрабатываемой поверхности проводили полив и рыхление, если это было возможно. Обработку почвы и воды в пилотных испытаниях осуществляли из садовых леек, в полевых - с помощью поливальной или пожарной машины вместимостью 5-10 м³.

В лабораторных условиях обработку почвы, искусственно загрязненной нефтью, осуществляли в лабораторной посуде объемом 0,25-0,50 л. Лабораторные эксперименты проводили при комнатной температуре.

Пилотные испытания проводили на поверхности водоемов площадью 1-2 м² и более или на аварийно загрязненных почвах, где предварительно определяли уровень загрязнения.

Полевые испытания проводили на природных объектах после аварийных разливов нефти на них. И пилотные и полевые испытания проводили в летне-осенний период.

Пробы для анализов изначально и в динамике отбирали по пятиточечной схеме стандартным пробоотборником.

Массовый анализ исходного уровня загрязнения и дальнейший мониториг процесса очистки почвенных объектов и воды от нефтяных загрязнений проводили гравиметрическим методом. Качественный состав загрязняющего агента проводили методами газожидкостной хроматографии. Количественный состав нефтяных фракций определяли с помощью площади пиков, качественный - по времени удержания. В качестве контроля использовали нативную нефть, не подвергавшуюся биодеградации.

Эффективность биодеградации загрязнения оценивали по убыли углеводородов нефти в процессе проведения биообработок, принимая за 100% исходную концентрацию загрязнения.

Учет численности живых клеток микроорганизмов во всех экспериментах проводили общепринятым методом предельных разведений на элективных средах.

В табл.1, 2, 3 приведены результаты тестирования биодеградирующей способности биопрепарата в лабораторных условиях, полевых и пилотных экспериментах.

В табл.1 приведены результаты сравнительного тестирования деградирующей способности биопрепарата и препарата Деворойл на модели почвы в лабораторных условиях. В качестве модели был использован образец загрязненной почвы республики Башкортостан предприятия по обеспечению нефтепродуктами. Контролем служил загрязненный углеводородами образец почвы с того же участка без внесения каких бы то ни было дополнительных микроорганизмов.

В табл.2 представлены результаты полевых тестов биодеградирующей способности биопрепарата на природном объекте (река Черная), загрязненном углеводородами (УВ) в результате аварийных разливов нефти.

В табл.3 представлены результаты тестирования биопрепарата в сравнении с отечественным препаратом в пилотных экспериментах, которые были поставлены на застарелом нефтяном загрязнении.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью заявляемого биопрепарата может быть достигнута интенсивная деградация при высоком содержании ее в объекте загрязненного субстрата и он может быть использован для удаления нефтяных загрязнений с поверхности почвы и водоемов.

Биопрепарат для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов, содержащий ассоциацию микроорганизмов и стабилизирующий агент, отличающийся тем, что в качестве ассоциации микроорганизмов препарат содержит бактериальные культуры Arthrobacter sp.МИА-89, Arthrobacter sp.МИА-74, Arthrobacter sp.ОС-1, взятые при соотношении соответственно 2:2:1, и в качестве стабилизирующего агента полиглюкин при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Ассоциация бактерий	40-60
Полиглюкин	2-4
Вода	Остальное до 100%