Полинуклеотид, модулирующий пролиферацию раковых клеток (варианты), полипептид, моноклональное антитело, вектор экспрессии, клетка-хозяин, лекарственное средство для лечения пролиферативного заболевания, фармацевтическая композиция, применение полипептида для получения лекарственного средства

Авторы патента:

ФЕРРАНДИ Эрик (FR)

КАМАРА И ФЕРРЕР Хосе-Антонио (FR)

МАРТИНЕ Жан (FR)

ТЮРЬО Кристоф (FR)

C12N15/63 - введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии

C12N15/12 - гены, кодирующие животные белки

C07K14/435 - из животных; из человека

A61P35 - Противоопухолевые средства

A61K38/17 - из животных; из человека

Владельцы патента RU 2307666:

САНТР НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ СЬЕНТИФИК (СНРС) (FR)
СОСЬЕТЕ ДЕ КОНСЕЙ ДЕ РЕШЕРШ Э Д АППЛИКАСЬОН СЬЕНТИФИК (С.К.Р.А.С.) (FR)

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены полинуклеотиды, кодирующие полипептид, модулирующий пролиферацию раковых клеток, моноклональное антитело, а также вектор экспрессии, клетка-хозяин, фармацевтическая композиция и лекарственное средство, направленные на модуляцию пролиферации раковых клеток. Изобретение может быть использовано для определения степени злокачественности ненормальной клеточной пролиферации, а также для эффективного лечения раковых заболеваний. 11 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил.

Настоящее изобретение относится к новому белку, модулирующему пролиферацию раковых клеток. Используя белки, кодируемые полинуклеотидами с последовательностями SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9, раскрытыми далее, можно также определять степень злокачественности пролиферации ненормальных клеток.

Раковые заболевания являются большой проблемой здоровья во всем мире. Хотя в последние годы был достигнут значительный прогресс в диагностике и лечении раковых заболеваний, в настоящее время не существует ни вакцин, ни других универсальных способов профилактики или лечения рака. Борьба с заболеваниемвключает комбинацию, насколько возможно, более раннего диагноза и активного лечения, включающего различные составляющие, такие как хирургия, лучевая терапия, химиотерапия и также гормонотерапия. Схему процесса лечения конкретного ракового заболевания часто выбирают на основании параметров прогноза, которые включают анализ специфических маркеров опухоли. Однако использование общепринятых маркеров часто приводит к результату, который трудно интерпретировать, и для множества раковых пациентов продолжает наблюдаться повышенная смертность.

Раковые заболевания молочной и предстательной желез являются наиболее распространенными злокачественными опухолями. В Соединенных Штатах ежегодно диагностируется 400000 новых случаев, и приблизительно 100000 мужчин и женщин ежегодно умирают от этих заболеваний (Harris et al., New Eng. J. Med. (1992), 327, 319, 390 and 473).

Признано, что эти заболевания возникают во время многофакторных процессов, включающих мутации в ограниченном числе генов, вероятно в 10 или менее. Эти мутации приводят к изменениям в росте и модуляции клеточной пролиферации тканей, позволяя клеткам расти независимо от контроля нормальных клеток с образованием метастазов и избеганием контроля со стороны иммунной системы. Классы генов, вовлеченных в рак молочной и предстательной желез, могут быть высокоспецифичны к этим классам опухолей. В частности, мутации в генах, участвующих в гормональных реакциях (рецепторы и лиганды класса эстрогенов, прогестерона или также тестостерона), особенно важны, так как они, вероятно, и заставляют клетки пролиферировать, делая их не восприимчивыми к противоопухолевому действию этих гормонов.

Более того, изменения в генах, кодирующих факторы роста, молекулы трансляции сигнала, а также факторы транскрипции, часто вовлечены и имеют изменения, которые сами по себе участвуют в образовании и развитии опухоли (King, Nature Genetics(1992), 2.125).

Нерешенным до настоящего времени вопросом является природа изменений экспрессии генов, которые появляются в человеческих опухолевых клетках необратимым образом, приводя к дифференциации клеток. Тем не менее эта информация очень важна для определения на молекулярном уровне регуляторных диаграмм генной экспрессии, участвующей в росте клеток и дифференциации клеток рака предстательной и молочной желез у человека. Поэтому существует серьезная необходимость в идентификации генных последовательностей, участвующих в необратимой конечной дифференциации клеток.

Совсем недавно, когда заявитель уже обладал излагаемым далее изобретением, последовательность SEQ ID NO: 4 была раскрыта в базе данных Genbank под регистрационным номером AK000755 и идентификационным номером 7021039, однако без указаний активности белков, которые могут кодироваться этой последовательностью.

Объектом настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, включающий полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. Объектом является также антисмысловой полинуклеотид, включающий последовательность, комплементарную последовательности указанного выделенного полинуклеотида, включающего полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5.

Настоящее изобретение относится также к выделенному полинуклеотиду, включающему, по крайней мере, один фрагмент полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, причем указанный полинуклеотид кодирует полипептид, обладающий, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации. В частности, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или к выделенному полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9.

Кроме того, объектом настоящего изобретения является выделенный полипептид, включающий, по крайней мере, один фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID. NO:5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, причем указанный выделенный полипептид обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации. Предпочтительно, чтобы указанный выделенный полипептид содержал фрагмент, обладающий характеристикой иммунологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации.

В частности, настоящее изобретение относится к белку с последовательностью SEQ ID NO: 8 (раскрыта далее), кодируемой фрагментом полинуклеотида с полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5, заключенной между основаниями в положениях 420 (кодон инициации ATG, кодирующий метионин) и 861 (стоп кодон UAA), т.е. полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 (раскрыто далее).

Настоящее изобретение относится также к вектору экспрессии, включающему выделенный полинуклеотид, включающий, по крайней мере, один фрагмент полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 или последовательности, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, причем полипептид кодируется указанным выделенным полинуклеотидом, обладающим, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации. Аналогично оно относится к клетке-хозяину, трансформированной или трансфицированной указанным вектором экспрессии.

Объектом настоящего изобретения является также моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент последнего, который специфически связывает выделенный полипептид, такой, как раскрыт выше, и особенно моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связывают белок с последовательностью SEQ ID NO: 8.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду в виде лекарственного средства, включающему, по крайней мере, один фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, причем указанный выделенный полипептид обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации. В частности, указанный фрагмент может быть фрагментом, кодируемым полинуклеотидом с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9, другими словами, белком с последовательностью SEQ ID NO: 8. Аналогично, настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду в виде лекарственного средства, включающему, по крайней мере, один фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, причем указанный выделенный полипептид обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации.

Настоящее изобретение относится также к моноклональному антителу в виде лекарственного средства или антигенсвязывающему фрагменту последнего, которое специфически связывает выделенный полипептид, включающий, по крайней мере, один фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, причем указанный выделенный полипептид обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации.

В частности, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу в виде лекарственного средства или антигенсвязывающему фрагменту последнего, которое специфически связывает выделенный полипептид, кодируемый полинуклеотидом с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, белок с последовательностью SEQ ID NO: 8).

Настоящее изобретение относится, кроме того, к фармацевтической композиции, включающей выделенный полипептид, включающий:

- фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, или

- фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4,

причем указанный выделенный полипептид обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации;

причем указанная композиция дополнительно включает один или более фармацевтически приемлемый эксципиент.

В частности, предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая белок, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, белок с последовательностью SEQ ID NO: 8), и один или более фармацевтически приемлемый эксципиент.

В другом варианте фармацевтическая композиция настоящего изобретения включает моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент последнего, которое специфически связывает выделенный полипептид, включающий, по крайней мере, один фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, причем указанный выделенный полипептид обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, причем указанная композиция дополнительно включает один или более фармацевтически приемлемый эксципиент.

В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент последнего, который специфически связывает белок, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, белок с последовательностью SEQ ID NO: 8), и фармацевтически приемлемые эксципиенты.

В соответствии с предпочтительным вариантом указанные фармацевтические композиции включают также активатор иммунной реакции (которым может быть адъювант).

Дополнительным объектом изобретения является применение выделенного полипептида для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания, включающего:

- фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4,

В частности, настоящее изобретение относится к применению выделенного полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, белка с последовательностью SEQ ID NO: 8), с одним или более фармацевтически приемлемым эксципиентом для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания.

Другим объектом настоящего изобретения является применение выделенного полинуклеотида, включающего:

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, или

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, или также

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9,

для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания.

Предпочтительно, чтобы используемый выделенный полинуклеотид состоял из полинуклеотида с полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9.

Указанный используемый выделенный полинуклеотид, предпочтительно, присутствует в вирусном векторе, причем указанный вирусный вектор выбирают, например, из группы, состоящей из аденовируса, объединенных аденовирусов, ретровируса и поксвируса.

В другом варианте, также в соответствии с настоящим изобретением, моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент последнего, которое специфически связывает выделенный полипептид, включающий, по крайней мере, один фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, причем указанный выделенный полипептид обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, можно использовать для получения лекарственного средства для лечения пролиферативного заболевания.

В частности, моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент последнего, который специфически связывает выделенный полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент последнего, который специфически связывает белок с последовательностью SEQ ID NO: 8), можно использовать для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания.

В соответствии с предпочтительными вариантами указанного выше использования пролиферативным заболеванием, подлежащим лечению описанным выше полипептидом или полинуклеотидом, является рак. В соответствии с еще более предпочтительными вариантами рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легких и колоректального рака.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ определения того, является ли опухоль у пациента злокачественной, включающий определение во взятом у пациента образце опухоли концентрации выделенного полипептида, включающий, по крайней мере:

В частности, указанный способ определения может быть сам по себе способом определения во взятом у пациента образце опухоли концентрации выделенного полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, концентрации белка с последовательностью SEQ ID NO: 8).

В соответствии с предпочтительным вариантом указанного выше способа указанный способ включает осуществление контакта образца опухоли с моноклональным антителом, которое специфически распознает упомянутый выше выделенный полипептид (и в частности, выделенный полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, белок с последовательностью SEQ ID NO: 8)).

Настоящее изобретение относится также к способу определения того факта, является ли опухоль у пациента злокачественной, включающему определение во взятом у пациента биологическом образце концентрации:

- полинуклеотида с полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 4, или

- полинуклеотида, нуклеотидная последовательность которого является фрагментом полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 4, причем указанный фрагмент, кодирующий выделенный полипептид, обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации.

В частности, указанный способ включает определение во взятом у пациента биологическом образце концентрации выделенного полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, определение концентрации белка с последовательностью SEQ ID NO: 8).

В соответствии с предпочтительным вариантом этого последнего способа указанный способ включает:

(a) получение молекул кДНК из молекул РНК образца опухоли, и

(b) специфическую амплификацию молекул кДНК, которые способны кодировать, по крайней мере, одну часть полипептида.

В настоящем изобретении предложен также способ контроля за развитием или регрессом заболевания у пациента с раковым заболеванием, включающий:

(a) определение, повторяющееся через выбранные промежутки времени, во взятом у пациента биологическом образце концентрации выделенного полипептида, включающего, по крайней мере:

причем указанный выделенный полипептид обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, и

(b) сравнение, с течением времени, концентраций, определенных в (a).

В частности, указанный способ контроля за развитием или регрессом заболевания у пациента с раковым заболеванием должен включать на стадии (a) определение, повторяемое через выбранные промежутки времени, во взятом у пациента биологическом образце концентрации выделенного полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, концентрации белка с последовательностью SEQ ID NO: 8).

Стадия (a) вышеуказанного способа, предпочтительно, должна включать осуществление контакта части биологического образца с моноклональным антителом, которое специфически распознает указанный полипептид (в частности, белок с последовательностью SEQ ID NO: 8). В соответствии с предпочтительным вариантом указанного выше способа биологический образец, взятый у пациента, является, кроме того, частью опухоли.

В соответствии с еще одним вариантом изобретения другой способ контроля за развитием или регрессией ракового заболевания у пациента включает следующие стадии:

(a) определение, повторяемое через выбранные промежутки времени, во взятом у пациента биологическом образце концентрации РНК, кодирующей выделенный полипептид, включающий, по крайней мере:

(b) сравнение, с течением времени, концентраций, определенных в (a).

В частности, указанный способ контроля за развитием или регрессом ракового заболевания у пациента включает на стадии (a) определение, повторяемое через выбранные промежутки времени, во взятом у пациента биологическом образце концентрации РНК, кодирующей выделенный полипептид, кодируемой полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, концентрации РНК, кодирующей белок с последовательностью SEQ ID NO: 8).

В соответствии с предпочтительным вариантом описанного выше способа контроля стадия (a) предпочтительно включает:

(i) получение молекул кДНК из молекул РНК биологического образца, и

(ii) специфическую амплификацию молекул кДНК, которые способны кодировать, по крайней мере, часть указанного выделенного полипептида.

Все описанные выше способы определения и/или контроля являются средствами, которые позволяют врачу после анализа результатов поставить диагноз относительно тяжести и/или развития или регресса опухоли у обследуемого пациента.

Кроме того, предметом настоящего изобретения является набор для диагностики пролиферативных заболеваний, включающий:

(1) моноклональное антитело, которое специфически связывается с выделенным полипептидом, включающим, по крайней мере, один фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 4 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 4,

(2) второе моноклональное антитело или фрагмент последнего, которое связывается с моноклональным антителом, как определено в (1), или с выделенным полипептидом, как определено в (1),

причем второе моноклональное антитело конъюгировано с фрагментом-меткой. В частности, указанный набор для диагностики пролиферативных заболеваний может быть выбран таким, что фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5, является выделенным полипептидом, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, белком с последовательностью SEQ ID NO: 8).

Предпочтительно, чтобы фрагмент-метка вышеуказанного диагностического набора был выбран из группы, включающей радиоизотопы, флуоресцентные группы, люминесцентные группы, ферменты, биотин и окрашивающие частицы.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения выделенного полипептида, включающего, по крайней мере, один фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, причем указанный выделенный полипептид обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, причем указанный способ получения включает следующие последовательные стадии:

(a) культивирование в условиях, подходящих для достижения экспрессии указанного полипептида, клеток-хозяев, трансформированных или трансфицированных вектором экспрессии, включающим выделенный полинуклеотид, включающий, по крайней мере, один фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, причем указанный выделенный полипептид обладает, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, и

(b) выделение полипептида из культур клеток-хозяев.

В частности, целью указанного способа является получение выделенного полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, получение белка с последовательностью SEQ ID NO: 8).

В настоящем изобретении предложен также способ идентификации соединений, способных модулировать клеточный рост и/или дифференциацию, который включает следующие последовательные стадии:

(a) контактирование каждого соединения-кандидата в условиях и в течение промежутка времени, которых достаточно для связывания соединения-кандидата с полипептидом, с выделенным полипептидом, включающим, по крайней мере:

(b) определение связывания каждого соединения-кандидата с указанным полипептидом и идентификация из соединений-кандидатов соединений, способных модулировать клеточный рост и/или дифференциацию.

В частности, указанный способ идентификации соединений, способных модулировать клеточный рост и/или дифференциацию, включает на стадии (a) контактирование каждого из соединений-кандидатов в условиях и в течение промежутка времени, достаточных для обеспечения связывания агента-кандидата с полипептидом, с выделенным полипептидом, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, с белком с последовательностью SEQ ID NO: 8).

Альтернативный способ идентификации соединений, способных модулировать клеточный рост и/или дифференциацию, включает следующие последовательные стадии:

(a) контактирование каждого из соединений-кандидатов в условиях и в течение промежутка времени, достаточных для осуществления взаимодействия агента-кандидата и клетки, с клеткой, способной экспрессировать выделенный полипептид, включающий по крайней мере:

(b) определение воздействия каждого из соединений-кандидатов на концентрацию полипептида в клетках и идентификацию из соединений-кандидатов соединений, способных модулировать клеточный рост и/или дифференциацию.

В частности, указанный альтернативный способ включает на стадии (a) контактирование каждого из соединений-кандидатов в условиях и в течение промежутка времени, достаточных для осуществления взаимодействия агента-кандидата и клетки, с клеткой, способной экспрессировать выделенный полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, клеткой, способной экспрессировать белок с последовательностью SEQ ID NO: 8).

В соответствии с предпочтительными вариантами способов идентификации соединений, способных модулировать клеточный рост и/или дифференциацию, описанные выше соединения-кандидаты выбирают из библиотек небольших молекул, полученных в результате осуществления программ комбинаторной химии.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему эндогенный промотор или регулирующий элемент белка, связанного с дифференциацией, причем белок включает последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотиду, включающему меченый ген под контролем эндогенного промотора или регуляторных элементов белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, причем белок включает последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5. Аналогично, настоящее изобретение относится к клетке, трансформированной или трансфицированной этим последним полинуклеотидом.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации соединений, способных модулировать экспрессию белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, который включает следующие последовательные стадии:

(a) контактирование каждого из соединений-кандидатов в условиях и в течение промежутка времени, достаточных для осуществления взаимодействия каждого из соединений-кандидатов с промотором или регуляторным элементом последнего, с клеткой, трансформированной или трансфицированной полинуклеотидом, включающим меченый ген под контролем эндогенного промотора или регуляторных элементов белка, связанного с модулированием клеточной пролиферации, причем белок включает последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5,

(b) определение воздействия каждого из соединений-кандидатов на концентрацию меченого белка, продуцируемого клеткой, и идентификация соединений, способных модулировать экспрессию белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации.

В соответствии с предпочтительным вариантом способа идентификации соединений, способных модулировать экспрессию белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, описанного выше, соединения-кандидаты выбирают из библиотек небольших молекул, полученных в результате осуществления программ комбинаторной химии.

Фармакологические характеристики, обеспечиваемые полинуклеотидам и полипептидам в соответствии с настоящим изобретением, делают последние пригодными для фармацевтического использования. Действительно, выделенные полипептиды, включающие, по крайней мере:

которые обладают, по крайней мере, одной характеристикой иммунологической и/или биологической активности белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, так же, как и полинуклеотиды, кодирующие указанные полипептиды, можно в соответствии с настоящим изобретением назначать раковым пациентам для замедления развития имеющихся у них опухолей или для того, чтобы вызвать регрессию указанных опухолей.

В указанных выше способах белком, связанным с модуляцией клеточной пролиферации или дифференциации, может быть, в частности, выделенный полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 (другими словами, белок с последовательностью SEQ ID NO: 8).

Упомянутые выше различные элементы станут более очевидны специалистам после прочтения более подробного описания различных аспектов настоящего изобретения.

Подробное описание различных аспектов настоящего изобретения

Как было указано выше, настоящее изобретение в основном относится к продуктам и способам, предназначенным для модуляции клеточного роста и для лечения рака. Настоящее изобретение основано, в частности, на идентификации "последовательностей, связанных с модуляцией клеточной пролиферации", которые представляют собой полипептидные и полинуклеотидные последовательности, связанные с модуляцией клеточной пролиферации. мРНК, связанная с дифференциацией, представляет собой мРНК, уровень содержания которой в дифференцированных клетках выше, нежели в соответствующих не дифференцированных клетках (т.е. уровень содержания мРНК, по крайней мере, в два раза выше). Молекула кДНК, связанная с дифференциацией, представляет собой последовательность, соответствующую мРНК, связанной с дифференциацией (и/или комплементарную последовательность).

Такие молекулы кДНК можно получить из препаратов РНК или мРНК, используя стандартные методики, такие как обратная транскрипция. Аналогично, белок или полипептид, связанный с дифференциацией, включает последовательность, кодируемую мРНК, связанной с клеточной дифференциацией.

Описанные выше фармацевтические композиции могут включать один или более из полипептидов, последовательностей нуклеиновых кислот и/или антител. Полипептиды настоящего изобретения включают, по крайней мере, одну часть белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, или вариант последнего. Последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения включают ДНК- или РНК-последовательности, которые кодируют, по крайней мере, часть такого полипептида или которые комплементарны такой кодирующей последовательности.

Антитела представляют собой белки иммунной системы или антигенсвязывающие фрагменты последней, которые способны связывать часть описанных выше полипептидов.

В другом варианте композиция может включать один или более из агентов, которые модулируют экспрессию гена, связанного с модуляцией клеточной пролиферации.

Полинуклеотиды, полипептиды и белки настоящего изобретения

В частности, объектом настоящего изобретения являются полинуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9, а также полипептид или белок с последовательностью SEQ ID NO: 8.

Настоящее изобретение включает также полинуклеотиды, полинуклеотидные последовательности которых, по крайней мере, на 75%, предпочтительно, по крайней мере, на 85%, и также более предпочтительно, по крайней мере, на 90%, даже на 95%, гомологичны последовательностям описанных выше полинуклеотидов, в частности последовательностям SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9. Это также относится в равной степени к другим полинуклеотидам, полипептидам и белкам, составляющим часть настоящего изобретения, в частности к белку с последовательностью SEQ ID NO: 8.

Объектом настоящего изобретения являются выделенные полинуклеотиды или полипептиды. Полинуклеотид или полипептид называют "выделенным", если он извлечен из его исходного окружения. В частности, полинуклеотид или полипептид является выделенным, если он выделен из биологического материала, с которым он сосуществует в природной системе.

В соответствии с настоящим изобретением полинуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды или белки настоящего изобретения и фрагменты или гибридные белки этих полипептидов или белков, можно использовать для создания рекомбинантных молекул ДНК, которые регулируют экспрессию этих полипептидов или белков, или активных частей последних, в соответствующих клетках-хозяевах. В другом варианте полинуклеотидные последовательности, которые гибридизованы с частями полинуклеотидных последовательностей в соответствии с настоящим изобретением, также можно использовать в гибридизационных тестах нуклеиновых кислот, для Саузерн-блоттинга, Норзерн-блоттинга и т.д.

Вследствие вырожденности генетического кода другие ДНК-последовательности, кодирующие по существу аминокислотные последовательности полипептидов или белков настоящего изобретения, можно использовать для клонирования и экспрессии указанных полипептидов или белков. Такие ДНК последовательности включают те, которые способны гибридизоваться с полинуклеотидными последовательностями полинуклеотидов настоящего изобретения в условиях определенной жесткости, которые можно подобрать несколькими способами. Так, например, во время полимеразной цепной реакции (PCR) можно подобрать температуру, при которой праймеры гибридизуются с матриксом, или подобрать концентрации MgCl₂ в реакционном буфере. При использовании фрагментов радиомеченных ДНК, или олигонуклеотидов для зондирования мембран, жесткость условий можно подобрать, изменяя ионную силу промывочных растворов или тщательно контролируя температуру промывки.

Настоящее изобретение включает, в частности, полинуклеотиды с гомологией, по крайней мере, 75% с полинуклеотидами последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9. Степень гомологии, выраженную в %, рассчитывают следующим образом:

100-100×(N'/N),

где N' представляет число нуклеотидов, модифицированных в соответствии с последовательностями SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9, и N представляет число нуклеотидов в последовательностях SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9.

Предпочтительно, чтобы такая гомологичная нуклеотидная последовательность специфически гибридизовалась с последовательностью, комплементарной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9 в жестких условиях. Параметры, определяющие жесткость условий, зависят от температуры, при которой разделяются 50% спаренных цепочек (T_m).

Для последовательностей, включающих более 30 оснований, и в соответствии с Sambrook et al. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989) T_mопределяют по соотношению:

T_m=81,5+0,41×(% G+C)+16,6×log[катионы] -

0,63×(% формамида)-(600/число оснований)

В настоящем изобретении условия жесткости называют "жесткими", если температура гибридизации на 10°C ниже T_m, и используют гибридизационный буферсодержащий раствор 6×SSC (0,9 M хлорида натрия и 0,09 M цитрата натрия). В таких условиях неспецифическая полинуклеотидная последовательность не гибридизуется с полинуклеотидом последовательности, комплементарной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9.

Измененные ДНК-последовательности, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают делеции, добавления или замещения различных нуклеотидных остатков, что приводит к получению последовательности, которая кодирует тот же самый продукт гена или эквивалентную функцию. Продукт гена также может содержать делеции, добавления или замещения аминокислотных остатков в последовательностях белков настоящего изобретения, что приводит к изменениям, называемым молчащими, т.е. приводя к получению полипептидов и белков с эквивалентной функцией.

Такие замещения аминокислот можно осуществить на основании полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера участвующих остатков.

Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, а положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин, аминокислоты с полярными группами, характеризующиеся близкими значениями гидрофобности, включают лейцин, изолейцин, валин; глицин, аланин; аспарагин, глутамин; серин, треонин; фенилаланин, тирозин.

ДНК-последовательности настоящего изобретения можно модифицировать так, чтобы изменить полинуклеотидные последовательности в соответствии с настоящим изобретением, из различных соображений, включающих не лимитирующий способ изменений, который модифицирует процесс и экспрессию генного продукта. Например, мутации можно вводить, используя методики, хорошо известные специалистам, например непосредственный мутагенез, встраивание новых рестрикционных сайтов, изменение гликозилирования, фосфорилирования, и т.д.

В частности, в некоторых экспрессионных системах, таких как дрожжи, клетки-хозяева могут сверхгликозилировать генный продукт. В такой системе предпочтительно изменить полинуклеотидные последовательности так, чтобы удалить сайты гликозилирования. В объеме описания настоящего изобретения фигурируют также модифицированные полинуклеотидные последовательности, связанные с гетерологичными последовательностями для кодирования гибридного белка. Гибридный белок можно модифицировать так, чтобы он содержал сайт расщепления, расположенный между последовательностью белка настоящего изобретения (например, последовательность SEQ ID NO: 8) и последовательностью гетерологичного белка, так чтобы последовательность белка настоящего изобретения можно было отщепить от гетерологичной части.

Полинуклеотиды, связанные с модуляцией клеточной пролиферации

Любой полинуклеотид, который кодирует полипептид, связанный с модуляцией клеточной пролиферации, или часть или вариант последнего, как здесь раскрыто, включен в объем настоящего изобретения. Такие полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными или могут быть молекулами ДНК (геномными, кДНК или синтетическими) или РНК.

Полинуклеотиды, связанные с дифференциацией, можно получить, используя любую доступную специалистам методику. Например, такой полинуклеотид можно амплифицировать, используя полимеразную цепную реакцию (PCR), из кДНК, полученной из клеток или человеческих тканей. Для такого подхода можно сконструировать и заказать, или синтезировать специфические праймеры; причем эти праймеры основаны на последовательности указанного полинуклеотида. Затем амплифицированную часть можно использовать для выделения полного гена из банка человеческих геномных ДНК или из банка кДНК любой клетки или любой ткани независимо от того, являются ли они нормальными, опухолевыми или дифференцированными благодаря хорошо известным специалистам методикам и методикам, кратко упомянутым далее. В другом варианте полный ген можно сконструировать из нескольких PCR фрагментов. кДНК молекулы, кодирующие белок, связанный с дифференциацией, или часть последнего, можно также получить путем скрининга банка кДНК, полученного, например, из мРНК клеток или тканей. Такие библиотеки коммерчески доступны, или их можно получить, используя стандартные методики (см. Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

В другом варианте можно использовать другие методики скрининга, хорошо известные специалистам.

Молекулу кДНК, связанную с дифференциацией, можно секвенировать, используя стандартные ферментные методики, такие как использующие фрагмент Кленова ДНК полимеразы I, секвеназу X (US Biochemical Corp., Cleveland, OH, USA), меченую полимеразу (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA), термостабильную полимеразу T7 (Amersham, Chicago, IT, USA) или комбинацию рекомбинантных полимераз и экзонуклеаз с перечитывающей активностью, таких как система амплификации элонгазы (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA). Можно использовать автоматическую систему секвенирования с помощью приборов, доступных от коммерческих поставщиков, Perkin Elmer и Pharmacia.

Частичная последовательность кДНК может быть использована для идентификации полинуклеотидной последовательности, которая кодирует полный белок, связанный с модуляцией клеточной пролиферации, используя стандартные методики, хорошо известные специалистам. Среди этих методик можно указать методику скрининга кДНК-библиотеки с использованием одного или более из полинуклеотидных зондов, использующих рекомбинантные свойства RecA (ClonCapture cDNA Selection Kit, Clontech Laboratories, USA).

Для использования методик гибридизации в частичную последовательность можно ввести радиометку (например, с помощью ник-трансляции, или пометив концы, используя ³²P или ³³P) с помощью стандартных методик. Затем скринируют библиотеку бактерий или бактериофагов с помощью гибридизации на фильтрах, содержащих колонии денатурированных бактерий (или отпечатки, содержащие бляшки фагов), используя меченый зонд (см. Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Затем позитивные колонии или бляшки отбирают и амплифицируют, а ДНК выделяют для последующих анализов.

Затем можно определить полную последовательность, используя стандартные методики. Перекрывающиеся последовательности затем собирают в одну непрерывную последовательность. Молекулу полной кДНК можно получить путем лигирования представляющих интерес фрагментов, используя стандартные методики.

В другом варианте существует множество основанных на амплификации методик для получения полной кодирующей последовательности из частичной последовательности кДНК. Среди них амплификацию обычно осуществляют, используя PCR. На стадии амплификации можно использовать любые имеющиеся в продаже наборы. Праймеры можно сконструировать, используя, например, хорошо известное специалистам программное обеспечение. Нуклеотидными праймерами предпочтительно являются молекулы, содержащие 20-30 нуклеотидов с содержанием гуанина и цитозина, по крайней мере, 50%, и такие, которые гибридизуются с последовательностью-мишенью при температурах от 50 до 72°C. Амплифицированный участок можно секвенировать, как указано выше, и перекрывающиеся последовательности собирают в непрерывную последовательность.

Что касается альтернативных подходов, то последовательности, прилегающие к частичной последовательности, можно обнаружить путем амплификации с праймером связывающей последовательности и праймером, специфичным для известного участка. Амплифицированные последовательности подвергают затем второму циклу амплификации.

Дополнительные методики включают PCR с захватом (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. (1991), 1, 111-19) и прогрессивную PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. (1991), 19, 3055-60). Для получения полной кДНК-последовательности можно использовать другие методики, использующие амплификацию.

Возможно получить полную кДНК-последовательность, анализируя последовательности, депонированные в опубликованной базе данных "Expressed Sequence Tags" (EST), доступной из GenBank. Исследования, охватывающие EST, можно осуществить, используя компьютерные программы, хорошо известные специалистам (например, NCBI BLAST), и такие EST можно использовать для создания непрерывной полной последовательности.

Раскрытые выше варианты полинуклеотидных последовательностей (в частности, последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9) также включены в объем настоящего изобретения. Варианты полинуклеотидов могут содержать один или более из замещений, делеций или вставок (см. также выше в разделе "Полинуклеотиды, полипептиды и белки настоящего изобретения").

Часть последовательности, комплементарной кодирующей последовательности (т.е. антисмысловой полинуклеотид), также можно использовать в качестве зонда или в качестве модулятора генной экспрессии. кДНК-конструкции, которые можно транскрибировать в антисмысловую РНК, можно ввести в клетки или ткани для облегчения продуцирования антисмысловой РНК. Антисмысловой полинуклеотид можно использовать, как здесь раскрыто, для ингибирования экспрессии гена, связанного с модуляцией клеточной пролиферации. Антисмысловую методику можно использовать для регуляции генной экспрессии в результате образования тройной спирали, что уменьшает способность двойной спирали раскрываться достаточно для связывания полимераз, факторов транскрипции или регуляторных молекул (см. Gee et al. in Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches (1994), Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). В другом варианте антисмысловую молекулу можно использовать для гибридизации с регуляторным участком гена (например, с промотором или сайтом инициации транскрипции) и блокирования транскрипции гена или блокирования трансляции в результате ингибирования связывания рибосом с транскриптом.

Затем полинуклеотиды можно модифицировать, повышая их стабильность in vivo. Возможные модификации включают (но этим не ограничиваются): добавление последовательностей к 5' и/или 3' концам; использование фосфоротиоата или 2' O-метил, а не фосфодиэстеразных связей в скелете; и/или встраивание оснований, таких как инозин, квеозин и вибутозин, аналогично ацетиладенину, метилтиоаденину и другим модифицированным формам аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина.

Другие изменения полинуклеотидов настоящего изобретения уже были описаны ранее в разделе "Полинуклеотиды, полипептиды и белки настоящего изобретения".

Последовательности нуклеотидов, как раскрыто в настоящем изобретении, можно соединить с другими нуклеотидными последовательностями, используя общепринятые методики рекомбинантных ДНК. Например, полинуклеотид можно клонировать в большой набор векторов экспрессии, включая плазмиды, фагемиды, производные лямбда фага и космиды. Представляющие особый интерес векторы включают векторы экспрессии, векторы репликации и векторы секвенирования. Обычно вектор содержит функциональный источник репликации в, по крайней мере, одном организме, подходящие сайты рестрикции эндонуклеазами и один или более из селективных маркеров. Присутствие других элементов зависит от конкретного их использования, необходимого специалисту, который будет выбирать характеристики вектора экспрессии в зависимости от этих требований и имеющегося оборудования.

Полинуклеотиды можно получить в таком виде, чтобы они проникали в клетку и экспрессировали соответствующий полипептид. Такие формы особенно полезны при лечении, как будет раскрыто далее.

Специалистам известно, что существует ряд способов для экспрессии полинуклеотида в клетке-мишени и что можно использовать любую из таких методик. Например, полинуклеотид можно встроить в вирусный вектор, такой как аденовирус или ретровирус (но также можно использовать и другие). Методики для встраивания ДНК в такие векторы хорошо известны специалистам. Ретровирусный вектор может переносить или встраивать ген для селекционного маркера и/или всей мишени, как ген, кодирующий лиганд специфического рецептора мишеневой клетки, для того, чтобы сделать вектор мишенеспецифическим.

Другие формы для полинуклеотидов включают коллоидные дисперсионные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нано-капсулы, микросферы, шарики и системы, основанные на использовании липидов, включая эмульсии типа масло-в-воде, мицеллы, смеси мицелл и липосом. Предпочтительными коллоидными системами, которые используют для доставки продукта in vitro и in vivo, являются липосомы (т.е. искусственные мембранные пузырьки).

Полипептиды, связанные с модуляцией клеточной пролиферации

В объеме описания полипептиды настоящего изобретения включают, по крайней мере, одну часть белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, или вариант последнего, причем указанная часть является иммунологически или биологически активной. Такие полипептиды могут быть любой длины, включая полный белок, олигопептид (т.е. состоящий из относительно ограниченного числа аминокислот, например 8-10 остатков, соединенных пептидными связями), или пептид промежуточного размера. Полипептид может также включать дополнительные последовательности.

В контексте настоящего изобретения полипептид является иммунологически активным, если он распознается поверхностными рецепторами B и/или T клеток. Иммунологическую активность можно тестировать, используя стандартные методики, такие как приведены в обзоре Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993). Такие методики включают скрининг полипептидов, полученных из природного полипептида, для определения их способности реагировать с антиген-специфической антисывороткой и/или T клеточными линиями или клонами, которые можно получить стандартными способами. Иммунологически активная часть белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, реагирует с такими антисыворотками и/или T клетками, причем ее реакционная способность лишь немного меньше, чем реакционная способность полного полипептида (например, в ELISA тесте и/или в тесте на реакционную способность T клеток). Такие скрининги обычно осуществляют, используя способы, хорошо известные специалистам, такие как описаны Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Эпитопы B и T клеток также можно предсказать, используя компьютерные методики.

В другом варианте иммуногенные участки можно идентифицировать, используя компьютерный анализ, например программу Tsites® (cf. Rothbard and Taylor, EMBO J. (1988), 7, 93-100; Deavin et al., Mol. Immunol. (1996), 33, 145-155), которая исследует пептидные единицы, обладающие способностью вызывать реакцию. Пептидные единицы, которые пригодны для связывания с главными комплексами гистосовместимости класса I или II (MHC) у мыши или человека, можно идентифицировать с помощью BIMAS метода (Parker et al., J. Immunol. (1994), 152:163, 1994). Для подтверждения иммуногенности пептид можно тестировать, используя HLA A2 трансгенных мышей и/или с помощью in vitro теста стимуляции с использованием дендритных клеток, фибробластов или периферических клеток крови.

Аналогично, полипептид является "биологически активным", если он обладает одной или более из структурных, регуляторных и/или биохимических функций природного белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации. Наличие биологической активности можно определить хорошо известными специалистам способами.

Например, сравнительные исследования последовательностей могут указать конкретную биологическую активность белка. Тесты, приводящие к оценке указанной активности, можно затем использовать на основе тестов, которые уже известны специалистам. Некоторые части и другие варианты таких белков также демонстрируют это свойство по данным in vitro или in vivo тестов.

Как было указано выше, полипептиды настоящего изобретения могут включать один или более из частей варианта эндогенного белка, причем эта часть является иммунологически и/или биологически активной (т.е. часть обладает одной или более из антигенных, иммуногенных и/или биологических характеристик полного белка). Предпочтительно, чтобы такая часть была бы, по крайней мере, столь же активной, как и полный белок при тестировании, которое позволяет определить такие свойства. Полипептидный "вариант" является полипептидом, который отличается от природного белка замещениями, вставками, делециями и/или модификациями в аминокислотах. Некоторые варианты содержат консервативные замещения. "Консервативным замещением" является замещение, при котором одну аминокислоту заменяют другой аминокислотой, обладающей такими же свойствами, как те, которые определены специалистом, который не ожидает каких-либо изменений во вторичной структуре, так же как и в гидропатической природе полипептида. Аминокислотные замещения обычно осуществляют на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; а полярные незаряженные аминокислоты, обладающие сходными величинами гидрофобности, включают лейцин, изолейцин и валин; глицин и аланин; аспарагин и глутамин; серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Другие группы аминокислот, которые могут представлять консервативные изменения, являются, в частности, следующими: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; и (5) Phe, Tyr, Trp, His. Вариант может также, или в качестве альтернативы, содержать неконсервативные изменения.

Варианты, составляющие часть настоящего изобретения, включают также полипептиды, в которых первичная структура природного белка модифицирована в результате образования ковалентных или нековалентных конъюгатов с другими полипептидами или химическими структурами, такими как липидные группы или гликозил, или фосфатацетильные группы.

Настоящее изобретение включает также полипептиды, содержащие или не содержащие звенья гликозилирования. Полипептиды, экспрессированные в дрожжевых системах экспрессии или в клетках млекопитающих, могут быть в плане молекулярных весов и схемы гликозилирования аналогичны или могут слегка отличаться от природных молекул, в зависимости от используемой системы экспрессии.

Экспрессия ДНК в бактериях, таких как E. coli, приводит к образованию негликозилированных молекул. Сайты N-гликозилирования эукариотических белков характеризуются триплетом аминокислот Asn-A1-Z, где A1 представляет любую аминокислоту кроме Pro, и Z представляет серин или треонин.

В объем настоящего изобретения включены также аллели белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации. Эти аллели являются альтернативными формами природного белка, образовавшимися в результате одной или более мутаций в результате делеции, добавления или замещения аминокислот, что приводит к изменению в РНК. Аллельные белки могут отличаться своими последовательностями, но полная их структура, так же как и функции практически одинаковы. Белок, связанный с модуляцией клеточной пролиферации, варианты и части последнего обычно получают из нуклеиновых кислот, кодирующих нужный полипептид, используя стандартные методики. Для получения эндогенного белка можно использовать выделенную кДНК.

Другие вариации полипептидов и белков настоящего изобретения были, кроме того, описаны выше в разделе "Полипептиды и полинуклеотиды настоящего изобретения".

Для получения варианта полипептида можно использовать стандартные методики мутагенеза, такие как направленный мутагенез, используя направленный олигонуклеотид.

Вообще для экспрессии рекомбинантных полипептидов настоящего изобретения можно использовать любые известные специалистам векторы экспрессии. Экспрессию можно осуществить в любых подходящих клетках-хозяевах, которые были трансформированы или трансфицированы экспрессионным вектором, содержащим ДНК-последовательность, которая кодирует рекомбинантный полипептид. Подходящие клетки-хозяева включают клетки прокариот, высших эукариот или дрожжевые клетки. Предпочтительно в качестве клеток-хозяев использовать клетки E. coli, дрожжевые клетки или клетки млекопитающих, такие как COS, CHO, MCF7 (человеческие опухолевые клетки, выделенные из карциномы молочной железы) или DU 145 (человеческие опухолевые клетки, выделенные из рака предстательной железы).

После осуществления экспрессии надосадочную жидкость систем хозяин/вектор, которые секретировали рекомбинантный белок или полипептид в культуральную среду, можно на первой стадии сконцентрировать, используя стандартные методики, такие как осаждение спиртом или фильтрация с использованием имеющихся в продаже фильтров. После стадии концентрирования полученный продукт можно нанести на подходящую очищающую матрицу, такую как аффинная матрица, или на ионообменную смолу. Для контроля за степенью очистки полипептида можно использовать одну или более из стадий обработки с помощью ВЭЖХ.

Некоторые части и другие варианты также можно создать синтетическим способом, используя хорошо известные специалистам методики. Например, части и другие варианты, содержащие менее 500 аминокислот, предпочтительно менее чем 100 аминокислот и более предпочтительно менее чем 50 аминокислот, можно синтезировать химическим способом. Полипептиды можно синтезировать, используя методику синтеза на твердой фазе, которая имеется в продаже, и такую методику, как синтез на мерифильдной смоле, когда аминокислоты последовательно добавляют к аминокислотной цепочке в процессе синтеза (см. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2146). Доступно также множество других методик синтеза с использованием твердой фазы (например, способ Roberge et al., Science (1995), 269, 202-204). Оборудование для автоматизированного синтеза полипептидов можно купить у поставщиков, таких как Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, USA), и затем синтез полипептидов осуществить в соответствии с рекомендациями изготовителей.

Выделенные полинуклеотиды или полипептиды

Обычно раскрытые в настоящем изобретении полипептиды и полинуклеотиды являются выделенными. "Выделенный" полипептид или полинуклеотид представляет собой полинуклеотид или полипептид, извлеченный из своего исходного окружения. Например, природный белок является выделенным, если его отделяют от биологического материала, с которым он сосуществует в природной системе. Полинуклеотид рассматривают как выделенный, если, например, он клонирован в вектор, который не является частью естественного окружения.

Сигнальные последовательности

Известны способы предсказания того, содержит ли белок сигнальную последовательность, а также содержит ли он сайт расщепления для этой последовательности. Например, в способе McGeoch (Virus Res. (1985), 3, 271-286) используется информация о короткой N-концевой заряженной последовательности незаряженного участка полного белка (нерасщепленного). В способе Von Heinje (Nucleic Acid Res. (1986), 14, 4683-4690) используют информацию об остатках, которые окружают сайт расщепления. Точность предсказания сайтов расщепления известных секретированных белков млекопитающих для каждого из этих способов составляет 75-80%. Однако эти два способа не всегда предсказывают одни и те же сайты для данного белка.

В данном случае выведенная аминокислотная последовательность секретированного полипептида была проанализирована с помощью компьютерной программы под названием SignalP (Sequence Analysis Software Package from the Genetic Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, USA). Эта компьютерная программа предсказывает клеточную локализацию белка на основании аминокислотной последовательности.

Она также в некоторых случаях распознает тот факт, что отщепление сигнальной последовательности секретированного белка неодинаково, что приводит к образованию нескольких типов молекул. Эти полипептиды и полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, включены в объем настоящего изобретения.

Кроме того, сигнальная последовательность, идентифицированная указанным выше способом, не может предсказать природу сигнальной последовательности. Например, природная сигнальная последовательность может быть расположена выше или ниже предсказанной последовательности. Однако существует вероятность того, что указанная сигнальная последовательность способна направлять секретированный белок в направлении эндоплазматического ретикулума. Эти полипептиды и кодирующие их полинуклеотиды включены в объем настоящего изобретения.

Сайты расщепления иногда меняются от одного вида к другому, и предсказать их невозможно с определенностью.

Аминокислотные последовательности, начиная с метионина, идентифицируют, определяя последовательности, кодируемые полинуклеотидами, в то время как другие рамки считывания могут быть легко транслированы с использованием методик молекулярной биологии, хорошо известных специалистам. Полипептиды, продуцируемые этими альтернативными открытыми считывающими рамками, также включены в объем настоящего изобретения.

Антитела и фрагменты последних

В настоящем изобретении предложены связывающие агенты, такие как антитела, которые специфически связывают белки, связанные с модуляцией клеточной пролиферации. Такой агент называют "специфически связывающимся" с белком, модулирующим клеточную пролиферацию, если он реагирует на детектируемом уровне (например, определяемом с помощью ELISA теста) с белком, связанным с модуляцией клеточной пролиферации, или частью, или вариантом последнего, и не реагирует детектируемым образом с другими белками. Термин "связывание" относится к нековалентной ассоциации 2 отдельных молекул таким образом, что при этом образуется комплекс. Связывающую способность можно оценить, например, определяя константы связывания для образования комплекса. Константа связывания представляет собой величину, получаемую, если величину концентрации комплекса разделить на произведение величин концентраций компонентов. Обычно, 2 продукта называют "связанными", если константа связывания достигает величины 103 л/моль. Константу связывания можно определить, используя хорошо известные специалистам методики.

Любой агент, который удовлетворяет вышеуказанному критерию, может рассматриваться как связующий агент.

Для настоящего изобретения связующим агентом является, предпочтительно, антитело или фрагмент последнего. Антитело можно получить любым доступным специалисту способом (см. Harlow and Lane, Antibodies. A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Вообще антитела можно получить, используя методики культуры клеток, включая выработку моноклональных антител или в результате трансфекции генов антител в клетки-хозяева бактерий или млекопитающих, для того, чтобы получить рекомбинантные антитела.

Среди других методик предпочтительно использовать описанные далее методики. Полипептид, содержащий иммуноген, вводят с помощью инъекций группе млекопитающих (например, мышей, крыс, кроликов, овец или коз). На этой стадии полипептиды настоящего изобретения могут служить иммуногенами без модификации. В другом варианте, в частности для небольших пептидов, усиленную иммунную реакцию можно вызвать, если полипептид соединен с транспортным белком, таким как бычий сывороточный альбумин или гемоцианин слизня. Иммуноген вводят с помощью инъекции животному-хозяину, предпочтительно, в соответствии с определенной заранее схемой, и у животных периодически отбирают кровь. Специфические к полипептиду поликлональные антитела можно затем выделить из таких антисывороток, например, с помощью аффинной хроматографии, используя пептиды, фиксированные на подходящей твердой подложке.

Гибридные белки

Любой гибридный ген может быть получен специалистом для того, чтобы анализировать субклеточную локализацию белка настоящего изобретения, в частности субклеточную локализацию белка с последовательностью SEQ ID NO: 8. В продаже имеются многочисленные плазмидные конструкции, такие как белок глутатион-S-трансфераза (GST), или флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), или также без ограничений полигистидиновый хвост.

Человеческие эукариотические клетки-хозяева (например, HEK-293) субкультивируют в течение 24 часов перед осуществлением трансфекции, что позволяет обеспечить нормальный метаболизм клеток и более высокую эффективность трансфекции. Повышающиеся концентрации (1, 5 и 10 мкг) одного вектора, содержащего меченый белок (GFP, GST или гистидиновый хвост), или вектора, содержащего полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 4, полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 5 или полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 9, гибридизуют с меченым белком, который был получен с использованием реагента Effectene®, в соответствии с рекомендациями производителя (Qiagen).

Затем клетки анализируют с помощью конфокального микроскопа, например, для определения локализации белка. Если, например, предполагают, что белок секретирован, надосадочные жидкости выделяют, лиофилизируют, наносят на акриламидный гель и анализируют с помощью Вестерн-блоттинга, используя антитела, направленные против меченого белка.

Фармацевтические композиции

В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения продукты, такие как полипептиды, антитела и/или нуклеиновые кислоты, можно включить в фармацевтические композиции или в вакцины. Фармацевтические композиции включают один или более из этих продуктов и один или более из фармацевтически приемлемых эксципиентов (транспортных агентов). Некоторые фармацевтические композиции, которые можно необязательно использовать в качестве вакцин, могут содержать один или более из полипептидов и активатор иммунной реакции, такой как адъювант или липосомы (в которые продукт и включают). Фармацевтические композиции и вакцины могут, кроме того, содержать систему введения, такую как биоразлагаемые микрогранулы. Фармацевтические композиции и вакцины, включенные в объем настоящего изобретения, могут также содержать другие продукты, которые могут быть биологически активными или не активными.

Фармацевтическая композиция или вакцина может содержать ДНК, кодирующую один или более из полипептидов, как указано выше, так что этот полипептид вырабатывается in situ. Как было указано выше, ДНК может быть представлена в любой форме для введения, известной специалистам, включая нуклеиновые кислоты, бактериальные или вирусные экспрессионные системы. Подходящие экспрессионные системы нуклеиновых кислот содержат ДНК-последовательности, необходимые для экспрессии в организме пациента.

Системы введения на основе бактерии включают введение бактерии (такой как Bacillus-Calmette-Guerrin), которая экспрессирует иммуногенную часть полипептида на ее поверхности. Предпочтительно, ДНК можно вводить, используя вирусную экспрессионную систему (например, поксвирус, ретровирус или аденовирус), включая использование непатогенных (дефективных) агентов.

Хотя в фармацевтических композициях настоящего изобретения можно использовать любые подходящие транспортные средства, известные специалистам, тип транспортного средства будет меняться в соответствии с выбранным способом введения. Композиции настоящего изобретения можно приготовить в формах, соответствующих каждому способу введения, включая, например, местное, назальное, внутривенное, внутричерепное, внутрибрюшинное, подкожное и внутримышечное введение.

Для парентерального введения, такого как подкожные инъекции, транспортный агент должен, предпочтительно, содержать воду, соль, спирт, жир, парафин или буфер. Для перорального введения можно использовать любые указанные выше транспортные агенты или твердые транспортные агенты, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. В качестве транспортных агентов для фармацевтических композиций настоящего изобретения можно также использовать биоразлагаемые микрогранулы. Для некоторых местных применений предпочтительны такие формы, как кремы и лосьоны.

Такие композиции могут также включать буферы (например, нейтральные или фосфатные забуференные солевые растворы), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, хелатирующие агенты, такие как EDTA или глутатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия) и/или защитные агенты. В другом варианте композиция настоящего изобретения может быть представлена в форме лиофилизата. Продукты можно также инкапсулировать в липосомах, используя стандартные методики.

В соответствии с настоящим изобретением каждый из вариантов адъювантов можно использовать в вакцинах для индукции иммунной реакции. Большинство адъювантов содержит вещество, защищающее антиген от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и стимулятор иммунной реакции, такой как липид A, белки, полученные из Bordetella Pertussis или Mycobacterium tuberculosis. Подходящие адъюванты имеются в продаже, такие как, например, адъювант Фрейнда и полный адъювант (Difco Laboratories, Detroit, MIY, USA; Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ, USA)), биоразлагаемые микрогранулы, монофосфориллипид A, и цитокины, такие как GM-CSF или интерлейкин-2, -7 или -12.

Раскрытые выше композиции можно также вводить в форме композиций с замедленным высвобождением (т.е. в формах, таких как капсулы или губки, которые обеспечивают медленное высвобождение продукта после его введения). Такие композиции можно приготовить, используя хорошо известные специалистам методики, и ввести, например, перорально, ректально или с помощью подкожной имплантации, или путем имплантации в нужную мишень. Формы с замедленным высвобождением могут содержать полипептид, полинуклеотид или антитела, диспергированные в транспортной матрице и/или содержащиеся в резервуаре, защищенном диффузной мембраной. Транспортные агенты для применения в таких формах являются биосовместимыми и должны также быть биоразлагаемыми; предпочтительно, чтобы такая форма обеспечивала относительно постоянный уровень выделения активного ингредиента. Количество активного продукта, содержащееся в форме с замедленным высвобождением, зависит от места имплантации.

Противораковая терапия

В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения описанные продукты можно использовать для противораковой терапии. В частности, полинуклеотиды и полипептиды, связанные с модуляцией клеточной пролиферации, можно использовать для ингибирования роста и индуцирования модуляции клеточной пролиферации в специфических опухолях молочной и предстательной железы.

Такие полипептиды или полинуклеотиды можно также использовать для лечения многочисленных форм рака, включая меланомы, множественные формы глиобластом, рака легких, также как и колоректальные раковые заболевания. В рамках таких способов лечения можно также использовать агенты, которые активируют экспрессию таких полипептидов или полинуклеотидов.

В соответствии с этими аспектами настоящего изобретения продукты (которыми могут быть полипептиды или нуклеиновые кислоты) предпочтительно включать в фармацевтические композиции, как указано выше.

Пациентами, которых можно лечить, являются все теплокровные животные и, предпочтительно, люди. У подходящего для лечения по способу настоящего изобретения пациента раковое заболевание может быть диагностировано, а может и не быть диагностировано. Другими словами, раскрытые выше фармацевтические композиции можно поэтому использовать для ингибирования развития ракового заболевания на различных его стадиях (для профилактики ракового заболевания или для лечения пациента с раковым заболеванием).

Фармацевтические композиции настоящего изобретения вводят способом, который соответствует каждому конкретному подлежащему лечению раковому заболеванию.

Схему, длительность и частоту введения определяют на основании состояния пациента, типа и тяжести заболевания и способа введения. Схема и частота введения могут меняться от пациента к пациенту. Обычно фармацевтические композиции и вакцины можно вводить с помощью инъекций (например, используя внутрикожные, внутримышечные, внутривенные и подкожные инъекции), интраназально (например, ингаляционно) или перорально. За период в 52 недели предпочтительно вводить от 1 до 10 доз. Для каждого конкретного пациента может быть подобрана соответствующая альтернативная схема.

Обычно соответствующая доза и схема введения предусматривает достаточное количество продукта для обеспечения терапевтического и/или профилактического благоприятного воздействия. За такой реакцией может следовать установление улучшенного клинического результата (например, более частые ремиссии, полное или частичное выздоровление, или более длительное отсутствие заболевания) у проходящих лечение пациентов по сравнению с пациентами, которых не лечат или лечат более низкими дозами.

В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения полипептид можно вводить в дозах в интервале от 100 мкг до 5 мг. Молекулы ДНК, кодирующие такие полипептиды, обычно можно вводить в количествах, достаточных для выработки сопоставимых уровней полипептидов. Соответствующие дозы обычно определяют, используя экспериментальные модели и/или клинические тесты. Обычно предпочтительно использование минимальных доз, которых достаточно для обеспечения эффективного лечения. Обычно пациентов наблюдают в аспекте эффективности лечения, используя подходящие тесты для лечения или профилактики состояний, которые знакомы специалистам.

Способы выявления и контроля за раковыми заболеваниями

Полипептиды, полинуклеотиды и антитела, раскрытые в настоящем изобретении, можно использовать в многочисленных способах выявления ракового заболевания у пациента. Наличие в клетках-хозяевах полипептидов и/или полинуклеотидов, связанных с модуляцией клеточной пролиферации, таких как те, что раскрыты в настоящем изобретении, является показателем дифференциации и прекращения клеточного роста. Так, последовательности, связанные с модуляцией клеточной пролиферации, можно использовать в качестве маркеров различий между нормальными клетками и злокачественными клетками (и позволить расшифровывающему результаты врачу диагностировать, например, раки предстательной и молочной желез, легких и ободочной кишки). Последовательности, связанные с модуляцией клеточной пролиферации, можно также использовать в качестве маркеров для контроля за ходом лечения.

Способы, включающие использование антител, могут позволить исследователю детектировать присутствие или отсутствие полипептидов, раскрытых в настоящем изобретении, в любом имеющемся биологическом образце. Подходящие биологические образцы включают биоптаты опухолевых тканей или здоровых тканей, гомогенаты или экстракты из таких тканей, взятых у пациента. Существует большое число типов тестов, известных специалистам, для использования антител для детектирования полипептидных маркеров в образце (см., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Например, можно осуществить тест в соответствии с методикой Вестерн-блоттинга, когда препарат белка подвергают обработке на электрофоретическом геле, переносят на подходящую мембрану и подвергают взаимодействию с антителом. Затем присутствие антител на мембране можно определить, используя подходящий детектирующий реагент, как раскрыто далее.

В соответствии с другими аспектами изобретения можно осуществить тесты, включающие использование антител, иммобилизованных на твердой подложке, связанных с полипептидом. Связанный полипептид можно детектировать, используя второе антитело или другие реагенты, содержащие меченый фрагмент. В другом варианте можно использовать конкурирующий тест, в котором полипептид метят меченым фрагментом, чтобы обеспечить связывание с антителом, иммобилизованным после инкубирования антитела с образцом. Способность компонентов образца ингибировать связывание маркированного полипептида с антителом является показателем реакционной способности образца с иммобилизованным антителом и, таким образом, показателем концентрации полипептида в образце.

Твердой подложкой может быть любой известный специалистам материал, на который можно прикрепить антитело. Например, твердой подложкой могут быть тестовые лунки в микротитровальном планшете или фильтры, изготовленные из нитроцеллюлозы или любого другого подходящего материала. В другом варианте подложкой могут служить гранулы, стекло, пластиковые материалы или латексы, такие как полистирол или поливинилхлорид. Подложкой могут также служить магнитные частицы.

Антитела можно иммобилизовать на твердой подложке, используя различные методики, известные специалистам и подробно описанные в научной литературе. В контексте настоящего изобретения термин "иммобилизация" относится как к нековалентной ассоциации, такой как адсорбция, так и к ковалентным связям (которые могут непосредственно связывать антиген и функциональные группы на подложке или связи, возникающие в результате использования связывающего агента). Предпочтительна иммобилизация за счет адсорбции на лунках микротитровальных планшетов или на мембранах. В этом случае адсорбцию можно осуществить, помещая антитело в соответствующий буфер, в присутствии твердой подложки на соответствующий промежуток времени. Время контактирования меняется в зависимости от температуры, но обычно составляет от 1 часа до 1 дня. Обычно для иммобилизации нужного количества полипептида бывает достаточно поместить в лунки пластикового (например, полистирольного или поливинилхлоридного) планшета антитела в количестве от 1 пг до 10 нг, предпочтительно от 100 до 200 нг.

Ковалентную связь антитела с твердой подложкой можно также осуществить, осуществляя взаимодействие подложки с бифункциональным реагентом, который реагирует с подложкой и с функциональной группой антитела, такой как гидроксил или аминогруппа. Например, антитело можно ковалентно связать с подложками, покрытыми соответствующим полимером, используя бензохинон, или путем конденсации альдегидных групп на подложке с амином и активированным водородом на партнере, в соответствии со стандартными методиками.

В некоторых случаях для детектирования полипептида в образце используют "сэндвич-тест" с двумя антителами. Этот тест можно осуществить, помещая антитело, иммобилизованное на твердой подложке, вместе с лунками микротитровального планшета в присутствии биологического образца, так что полипептид в образце может связывать иммобилизованное антитело. Нефиксированные продукты удаляют из комплекса полипептид-антитело и добавляют второе антитело (содержащее меченый фрагмент), способное связывать различные сайты полипептида. Затем, используя соответствующую методику, специфическую для меченого фрагмента, определяют количество второго антитела, которое остается связанным с твердой подложкой.

Более конкретно, если антитело иммобилизовано на твердой подложке, как описано выше, связывающие белок сайты обычно блокированы. Можно использовать любой известный специалистам в этой области блокирующий агент, такой как бычий сывороточный альбумин или Tween 20^ТМ (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA). Затем иммобилизованное антитело инкубируют с образцом, и полипептид может связаться с антителом. Образец перед инкубированием можно разбавить в соответствующем разбавителе, таком как фосфатно-буферный раствор (PBS).

Обычно подходящим временем контактирования (т.е. временем инкубирования) является промежуток времени, достаточный для обеспечения детектирования наличия полипептида в образце, взятом у индивидуума. Предпочтительно, чтобы определенное таким образом время контактирования было бы достаточным для достижения уровня связывания, по крайней мере, 95% от того времени, при котором достигается равновесие между связанными пептидами и несвязанными пептидами. Специалистам должно быть очевидно, что промежуток времени, необходимый для достижения равновесия, должен определяться измерением уровня связывания за этот промежуток времени. При комнатной температуре времени инкубирования 30 минут обычно бывает достаточно. Затем несвязанные продукты можно удалить, промывая твердую подложку соответствующим буфером, таким как фосфатно-буферный раствор, содержащий 0,1% Tween 20^ТМ. Затем к твердой подложке можно добавить второе антитело, содержащее меченый фрагмент.

Меченые фрагменты предпочтительно включают ферменты (такие как пероксидаза), кофакторные субстраты, красящие ингибиторы, люминесцентные группы, флуоресцентные группы и биотин. Конъюгирование антитела с меченым фрагментом можно осуществить, используя стандартные методики, известные специалистам.

Затем второе антитело инкубируют с иммобилизованным комплексом антитело-полипептид в течение промежутка времени, которого достаточно для обеспечения детектирования связанного полипептида.

Подходящее время можно обычно определить, измеряя уровень связывания за промежуток времени. Затем второе несвязанное антитело удаляют и детектируют второе связанное антитело, используя меченый фрагмент. Способ, который используют для детектирования меченого фрагмента, зависит от природы меченого фрагмента. Для радиоактивных групп обычно подходят способы, использующие сцинтилляцию или авторадиографический подсчет. Для детектирования красящих агентов, флуоресцентных или люминесцентных групп можно использовать спектроскопические методы. Биотин можно определять, используя авидин, соединенный с меченым фрагментом (вместе с радиоактивной или флуоресцентной группой или ферментом). Ферментные меченые фрагменты обычно можно детектировать, добавляя субстрат (обычно в течение подходящего промежутка времени), с последующим спектральным (или другим) анализом продуктов реакции.

Для диагностики наличия или отсутствия ракового заболевания детектируемый сигнал, обусловленный меченым фрагментом, связанным с твердым носителем, обычно сравнивают с сигналом, соответствующим известным значениям, полученным для неопухолевой ткани. Предпочтительно, чтобы предельное значение было средней величиной сигналов, полученных, когда иммобилизованное антитело инкубируют с образцами от пациентов без раковых заболеваний. Обычно образец, дающий сигнал, который в три раза выше или в три раза ниже стандартного отклонения от заранее определенного предельного значения, рассматривают как индикативный.

Более подробно данный материал раскрыт в: Sackett et al., Clinical Epidemiology. A basic Science for Clinical Medicine, p. 106-107 (Little Brown and Co., 1985).

Наличие или отсутствие у пациента ракового заболевания можно также определить, оценивая уровни содержания мРНК, кодирующей полипептид настоящего изобретения в биологическом образце (например, полученном при биопсии) относительно заранее определенного предельного значения.

Такую оценку можно осуществить, используя множество методов, известных специалистам, таких как, например, гибридизация in situ и амплификация полимеразной цепной реакцией (PCR). Зонды и праймеры, используемые в таких способах, обычно можно получить из последовательностей, перечисленных в примерах, или из аналогичных последовательностей, идентифицированных у других индивидуумов. Зонды можно использовать в стандартных методиках гибридизации и можно маркировать детектирующим агентом для облегчения детектирования зонда. Такие реагенты включают (но этим не ограничиваются): радионуклеиды, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемых продуктов.

Праймеры обычно можно использовать в способах детектирования, включающих полимеразную цепную реакцию (PCR), такую как RT-PCR (PCR с обратной транскриптазой), в которой PCR используют с обратной транскрипцией. Обычно РНК экстрагируют из ткани образца и транскрибируют в противоположном направлении для получения кДНК-молекул. PCR амплификация с использованием специфических праймеров приводит к получению кДНК-молекул, связанных с модуляцией клеточной пролиферации, которые можно выделить и визуализировать, используя, например, электрофорез в геле. Амплификацию обычно осуществляют в образцах, полученных от пар опухолевых и неопухолевых тканей одного и того же индивидуума или также от пар опухолевых и неопухолевых тканей от различных индивидуумов. Реакцию амплификации можно осуществить на последовательных разведениях кДНК, покрывающих 2 порядка величины. Изменение экспрессии в 2 раза или в большее число раз в разведениях опухолевого образца по сравнению с экспрессией в таких же разведениях неопухолевого образца обычно рассматривают как индикативное.

Некоторые тесты, проводимые для установления диагноза, можно, кроме того, осуществлять непосредственно на опухоли.

Такие тесты включают контактирование опухолевых клеток с антителом или фрагментом последнего, которое связывает белок, связанный с модуляцией клеточной пролиферации. Связанное антитело или фрагмент последнего можно детектировать непосредственно или косвенно за счет меченого фрагмента. Такие антитела можно также использовать для применения в гистологических исследованиях. В другом варианте в таких применениях можно использовать антисмысловой полинуклеотид.

В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения улучшение и/или реакцию на лечение ракового заболевания можно контролировать, осуществляя любой из описанных выше тестов в течение некоторого промежутка времени и оценивая изменение в уровне реакции (т.е. детектируемое количество полипептида или мРНК). Например, тесты можно проводить ежемесячно в течение 1-2 лет. Обычно раковое заболевание у пациента прогрессирует, если у него с течением времени снижается уровень реакции. Напротив, раковое заболевание не прогрессирует, если детектируемый сигнал остается постоянным или возрастает со временем.

В настоящем изобретении предложены также наборы для осуществления всех описанных выше способов диагностики. Такие наборы включают 2 компонента (или больше), необходимые для осуществления таких тестов. Такие компоненты могут быть продуктами, реагентами и/или контейнерами или оборудованием. Например, контейнер в наборе может содержать моноклональное антитело или фрагмент последнего, которое специфически связывает полипептид, связанный с модуляцией клеточной пролиферации. Такие антитела или фрагменты можно получить прикрепленными к материалу подложки, как раскрыто выше. Один или более из дополнительных контейнеров может содержать предназначенные для использования в тесте элементы, такие как реагенты или буферы. Такие наборы могут также содержать реагент для детектирования (например, антитело), содержащий меченый фрагмент, пригодный для непосредственного или косвенного детектирования связанного антитела.

Способы идентификации связывающих или модулирующих агентов

Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы идентификации продуктов, которые связывают и/или которые модулируют экспрессию белков, связанных с модуляцией клеточной пролиферации. Такие агенты обычно можно идентифицировать, осуществляя контактирование полипептида, представленного в настоящем изобретении, с продуктом-кандидатом/агентом-кандидатом в условиях и в течение промежутка времени, которых достаточно для осуществления взаимодействия с полипептидом и/или его эффектором (например, его рецептором). Таким образом, можно осуществить каждый из вариантов теста на связывание, которые хорошо известны специалистам, чтобы протестировать способность продукта-кандидата связываться с полипептидом или его эффектором (например, с его рецептором).

В других тестах агенты можно скринировать, используя клетки, о которых известно, что они обладают повышенной экспрессией гена, связанного с модуляцией клеточной пролиферации. Можно осуществить контактирование таких клеток с агентами-кандидатами, и экспрессию гена, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, оценить по отношению к экспрессии, наблюдаемой в отсутствие агента-кандидата.

В другом варианте продукты-кандидаты можно скринировать в отношении их способности модулировать экспрессию (например, транскрипцию) белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации. Для оценки воздействия агента-кандидата на экспрессию белка, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, промотор или регуляторный элемент последнего можно связать с меченым геном, как указано выше. Такую конструкцию можно трансфицировать в подходящие клетки-хозяева, которые затем подвергают контактированию с агентом-кандидатом.

Указанные клетки-хозяева, предпочтительно, используют для скрининга библиотек небольших молекул, полученных с помощью комбинаторных химических программ. В соответствии с этим предпочтительным вариантом клетки инкубируют вместе с библиотекой, затем подвергают лизису, и надосадочную жидкость анализируют в отношении активности меченого гена в соответствии со стандартными схемами.

Продукты, которые повышают активность меченого гена, являются индукторами транскрипции гена, связанного с модуляцией клеточной пролиферации, и поэтому могут быть использованы в качестве ингибиторов прогрессирования раковых заболеваний.

Если нет других указаний, все используемые здесь технические и научные термины имеют те же значения, которые обычно предполагают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. Аналогично, все указанные здесь публикации, патентные заявки, все патенты и все остальные ссылки приведены здесь для ссылки.

Представленные далее примеры приводятся для иллюстрации вышеуказанных процедур и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ:

Пример 1: Выделение и характеризация кДНК фрагментов SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5

ДНК последовательность SEQ ID NO: 1, присутствующая в опубликованной базе данных, содержащей EST (Genbank, регистрационный номер AA 176076), приведена ниже:

На основании этой последовательности синтезируют пару праймеров 5' Прямой 1 и 3' Обратный 1 соответствующих последовательностей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 (приведенных далее) для получения зонда, который позволяет осуществить клонирование полной кДНК, содержащей полную открытую рамку считывания, кодирующую соответствующий ген.

Последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 имеют следующий вид:

- SEQ ID NO: 2: 5'-CTG ACC TTT CAG TTT TCC ATA GC-3'

- SEQ ID NO: 3: 5'-ATC TAT TTC TGC CAA ACA AGA A-3'

На начальной фазе осуществляют полимеразную цепную реакцию (PCR) для ряда имеющихся в продаже кДНК банков, используя праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. Условия реакции включают 0,5 мкМ Прямой 1 (SEQ ID NO: 2) и Обратный 1 (SEQ ID NO: 3), 200 мкМ дезоксинуклеотидтрифосфатов (или dNTP: dATP, dCTP, dGTP и dTTP), 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl₂ и 0,5 ед меченой ДНК полимеразы в конечном объеме 50 мкл. Параметры термического цикла включают денатурирование при 94°C в течение 30 сек, гибридизацию праймеров при 60°C в течение 1 минуты и удлинение полимеризации при 72°C в течение 30 сек (при окончательном удлинении в 5 минут).

Продукты, полученные в результате PCR, разделяют на 1%-ном агарозном геле и визуализируют, используя окрашивание этидиумбромидом. В результате получают полосу, соответствующую 245 парам оснований в кДНК банках из головного мозга, гипофиза, легких, почек и кишечника человека (Quantum) и соответствующую 290 парам оснований в кДНК банке из молочной и предстательной железы человека. Эти результаты представлены на ФИГ.1.

Полученные таким образом в результате осуществления PCR продукты очищают, используя электроэлюирование, и используют в качестве зондов для клонирования кДНК, содержащей полную открытую рамку считывания, используя рекомендации изготовителей для применения набора для клонирования кДНК ClonCapture (Clontech).

Последовательности нуклеиновых кислот позитивных клонов определяют, используя автоматизированный секвенатор. Так получают последовательности SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, которые представлены ниже:

Пример 2: Клонирование SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 в вектор экспрессии

Последовательности нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 служат источниками для синтеза новых праймеров 5' Прямой 1 и 3' Обратный 1 соответствующих последовательностей SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 (представлены далее). Эти последовательности соответственно содержат HindIII и EcoRI рестрикционные сайты.

Последовательности SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 имеют следующий вид:

- SEQ ID NO: 6: 5'- GCA AGC TTG CGG GGG AGG AGG AGG G -3'

- SEQ ID NO: 7: 5'- CGG AAT TCC CGG GGG GAA TCG CAG -3'

Реакцию PCR осуществляют, используя те же самые условия реакции, которые были приведены в примере 1, с праймерами SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7. Продукты, полученные в результате указанной PCR реакции, можно встроить непосредственно в вектор экспрессии типа, но не исключительным образом, pCDNA3.1 (InVitrogen). После стадии PCR амплификации полученные продукты подвергают гидролизу, используя HindIII и EcoRI, для освобождения концов, содержащих эти последовательности, затем очищают электроэлюированием из агарозного геля.

Затем последовательности SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 встраивают в вектор экспрессии, такой как, например, pCDNA3.1 (InVitrogen). Анализ с помощью расщепления соответствующими рестриктазами различных бактериальных клонов, в которые ввели указанные векторы экспрессии, обеспечивает возможность выделения бактериальных клонов, содержащих новые конструкции "вектор экспрессии/SEQ ID NO: 4" или "вектор экспрессии/SEQ ID NO: 5".

Получение больших количеств этих плазмидных конструкций осуществляют, используя набор для очистки плазмидных ДНК (Qiagen).

Свойства полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5

Экспрессия полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 в человеческих опухолевых тканях

Получение РНК из клеточных культур и опухолевых тканей

Клетки в культуре опухолевых тканей хранят при -80°C перед стадией экстрагирования тотальных РНК. Экстрагирование тотальных РНК основано на методике, описанной в научной литературе (Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem. (1987), 162, 156) с использованием реагента Trizol (Gibco/BRL). Качество экстрагированных таким образом РНК анализируют на 1%-ном агарозном геле в присутствии этидиумбромида.

Обратная транскрипция из РНК

Тотальные РНК транскрибируют в обратном направлении с олиго(dT) праймерами и используя обратную транскриптазу Superscript® в соответствии с руководством изготовителей (Gibco/BRL).

Полимеразная цепная реакция (PCR) продуктов, полученных в результате обратной транскрипции

Анализ экспрессии последовательностей SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) продуктов, полученных в результате обратной транскрипции, используя праймеры 5' Прямой 1 и 3' Обратный 1 соответствующих последовательностей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. Условия реакции включают: 0,5 мкМ Прямой 1 и Обратный 1, 200 мкМ dNTP, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 50 мМ KC1, 1,5 мМ MgCl₂ и 0,5 ед меченой ДНК полимеразы в конечном объеме 50 мкл. Параметры термического цикла включают денатурирование при 94°C в течение 30 сек, гибридизацию праймеров при 60°C в течение 1 минуты и удлинение полимеризации при 72°C в течение 30 сек (при конечном удлинении в течение 5 минут).

Продукты, полученные в результате PCR, выделяют на 1%-ном агарозном геле и визуализируют, используя окрашивание этидиумбромидом.

В некоторых случаях используют гибридизационный анализ на нейлоновой мембране, который осуществляют, используя в качестве зонда последовательность SEQ ID NO: 4, маркированную альфаP32-dCTP, с использованием набора для введения метки случайным образом (Pharmacia). Затем мембрану промывают в мягких условиях (2ЧSSC, 0,1% SDS при 60°C), а затем промывают в жестких условиях (0,1ЧSSC, 0,1% SDS при 65°C). Затем мембрану экспонируют на пленке Kodak XAR.

Анализ экспрессии полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 в образцах рака молочной железы

Анализ экспрессии полинуклеотидов с последовательностямипоследовательности SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 осуществляют для 15 образцов опухолей, полученных в результате хирургического удаления у пациенток с опухолью молочной железы.

Полученные в соответствии с приведенным выше протоколом кДНК стандартизируют, используя маркер G3PDH (глицеральдегид 3-фсфатдегидрогеназа), экспрессированный подходящим образом для контроля за изменениями количества РНК или кДНК в различных образцах. Затем продукты PCR реакций гибридизуют на нейлоновой мембране в соответствии с описанным выше протоколом.

Полученные результаты, представленные на ФИГ.2, демонстрируют, что при таком подходе присутствие полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 можно визуализировать в опухолевых образцах, полученных из рака молочной железы.

Ингибирование клеточной пролиферации полинуклеотидами с последовательностями SEQ ID NO: 4 и ПОСЛЕД.ID.NO.5

Клетки опухоли предстательной железы DU 145 (Код ATCC) культивируют в DMEM среде (среда Игла, модифицированная по Дульбекко), содержащей 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицинсульфата, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой. Эти клетки субкультивируют в течение 24 часов перед осуществлением протокола трансфекции, что обеспечивает нормальный метаболизм клеток и более высокую эффективность трансфекции. Возрастающие концентрации (1, 5 и 10 мкг) только вектора (pCDNA3.l) или вектора, содержащего полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 4 (1, 5 и 10 мкг) или полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 5 (1, 5 и 10 мкг), обеспечивают, используя реагент Effectene® в соответствии с рекомендациями изготовителя (Qiagen).

Клетки выделяют через 48 часов после трансфекции, используя обработку трипсином, затем подсчитывают. В то же время клетки центрифугируют при скорости 5000 об/мин, затем замораживают при -80°C для экстрагирования ARN, как указано выше (см. раздел "Получение РНК из клеточных культур и опухолевых тканей").

Полученные результаты представлены на ФИГ.3 (полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 4) и ФИГ.4 (полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 5). Они демонстрируют, что кДНК, кодирующая полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 4, или кДНК, кодирующая полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 5, экспрессируется пропорционально количеству вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 4 или полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 5 (Часть A). Кроме того, эти результаты демонстрируют, что клеточный рост в значительной степени ингибируется в присутствии возрастающих концентраций вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 4 или полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 5, по сравнению с ростом клеток, транфицированных с 10 мкг только вектора (Часть B). Корреляция между ингибированием роста опухолевых клеток и количеством трансфицированного вектора, содержащего полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 4 или полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 5, составляет 1 или до 0,96 соответственно.

Полипептид, кодируемый из фрагмента последовательности SEQ ID NO: 5

В последовательности SEQ ID NO: 5 наблюдается открытая рамка считывания, в которой присутствует кодон инициации (ATG), кодирующий инициирующий метионин в положении 420 и стоп кодон (UAA) в положении 861. Белок с последовательностью SEQ ID NO: 8, который состоит из 147 аминокислот, соответствует транслированному таким образом полинуклеотиду, и представлен ниже:

Полинуклеотид, которому соответствует белок с последовательностью SEQ ID NO: 8, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, представленную ниже:

Описание чертежей

ФИГ. 1 представляет результаты, полученные при использовании PCR после выделения на 1%-ном агарозном геле и визуализации с использованием окрашивания этидиумбромидом.

ФИГ. 2 представляет результаты, полученные при использовании Саузерн-блоттинга для 15 образцов карцином молочной железы (обозначены S1 до S15).

ФИГ. 3 демонстрирует, в ее части A, экспрессию кДНК, кодирующей полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 4 в клетках DU 145 (опухоль предстательной железы), и в ее части B, ингибирование клеточного роста в присутствии возрастающих концентраций вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 4.

ФИГ. 4 демонстрирует, в части A, экспрессию кДНК, кодирующей полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 5 в клетках DU 145 (опухоль предстательной железы), и в ее части B, ингибирование клеточного роста в присутствии возрастающих концентраций вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид с SEQ ID NO: 5.

1. Выделенный полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, который кодирует полипептид, обладающий по крайней мере одной иммунологической и/или биологической активностью, характерной для белка, связанного с модуляцией клеточного роста и/или дифференциацией.

2. Антисмысловой полинуклеотид, включающий последовательность, комплементарную последовательности полинуклеотида по п.1, где антисмысловой полинуклеотид ингибирует экспрессию гена, связанного с модуляцией клеточной пролиферации.

3. Выделенный полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9, который кодирует полипептид, обладающий по крайней мере одной иммунологической и/или биологической активностью, характерной для белка, связанного с модуляцией клеточного роста и/или дифференциацией.

4. Выделенный полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9, который может использоваться в качестве зонда или модулятора генной экспрессии.

5. Выделенный полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 8, кодируемый фрагментом полинуклеотида по п.3, обладающий по крайней мере одной иммунологической и/или биологической активностью, характерной для белка, связанного с модуляцией клеточного роста и/или дифференциацией.

6. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент последнего, специфически связывающие полипептид, обладающий по крайней мере одной иммунологической и/или биологической активностью, характерной для белка, связанного с модуляцией клеточного роста и/или дифференциацией, полученные с использованием полипептида по п.5.

7. Вектор экспрессии, включающий выделенный полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 и регуляторные элементы.

8. Клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная вектором экспрессии по п.7, и продуцирующая полипептид по п.5.

9. Лекарственное средство для лечения пролиферативного заболевания, включающее выделенный полипептид по п.5.

10. Фармацевтическая композиция для лечения пролиферативного заболевания, включающая выделенный полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 8, и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

11. Применение выделенного полипептида с последовательностью SEQ ID NO: 8 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания.

12. Применение по п.11, отличающееся тем, что пролиферативным заболеванием является раковое заболевание.

Рекомбинантное опухолеспецифичное антитело (варианты) и его применение // 2306320

Рекомбинантный лентивирусный вектор, клетка-хозяин, трансдуцированная лентивирусным вектором, способ ее трансдукции и применение // 2305708

Изобретение относится к области генной инженерии. .

Рекомбинантное антитело против остеопонтина и его применение // 2305111

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано в медицине для лечения аутоиммунных заболеваний, ревматизма, ревматоидного артрита. .

Пептид, стимулирующий противоопухолевый иммунный ответ, фармацевтическая композиция на его основе, способ лечения млекопитающего и способ модуляции иммунного ответа // 2305107

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. .

Молекулы антител, обладающие специфичностью в отношении фактора некроза альфа опухоли человека, и их применение // 2303604

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .

Антиген muc1 со сниженным числом повторяющихся vntr-блоков // 2303069

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .

Способ введения ретровирусных векторов в клетки бластодермы при получении трансгенных кур // 2303068

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способам получения трансгенной птицы. .

Вирусные векторы с зависимой от условий репликацией и их применение // 2301260

Изобретение относится к области генной инженерии. .

Полипептиды, происходящие из триптофанил-трнк-синтетазы, и их применение для регуляции развития кровеносных сосудов // 2297425

Изобретение относится к биотехнологии. .

Антиген muc1 со сниженным числом повторяющихся vntr-блоков // 2303069

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .

Способ генодиагностики устойчивости овец к скрепи // 2303067

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Рекомбинантный плацентарный фактор роста и способ его получения // 2295535

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине. .

Система доставки нуклеиновых кислот // 2294192

Способ локального подавления ангиогенеза в ткани-мишени // 2292395

Изобретение относится к области генной и клеточной инженерии и может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине. .

Полипептид с биологической активностью ингибитора индуцируемой коллагеном адгезии тромбоцитов, его получение и применение // 2292351

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии и может быть использовано в медицине, а также в производстве медицинской техники. .

Рекомбинантный маннан-связывающий лектин человека // 2292217

Изобретение относится к способу приготовления состава, включающего маннан-связывающий лектин, и к лечению состояний, связанных с дефицитом маннан-связывающего пектина, что связано с повышенной предрасположенностью к инфекциям.

Штамм дрожжей pichia pastoris 2-2 - продуцент тромбоцитарного фактора роста человека (pdgf-bb) и способ получения тромбоцитарного фактора роста человека // 2290434

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению препарата на основе тромбоцитарного фактора роста человека (PDGF-BB), и может быть использовано в терапевтических, ветеринарных целях, в диагностике, для получения реагентов, для культивирования тканей.

Рекомбинантный рецептор коллагена на тромбоцитах гликопротеин vi и его применение в фармацевтике // 2287580

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в медицине. .

Ингибитор интерлейкина-1, способ его получения, молекула днк, кодирующая ингибитор интерлейкина-1 и его предшественник // 2286388

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности генной инженерии, и может быть использовано в медико-биологической промышленности. .

Очищенный иммуногенный белок, его фрагменты и производные // 2304585

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в медицине в диагностических и лечебных целях. .