Среда для культивирования ряски малой, lemna minor l.

Изобретение относится к методу эффективного выращивания ряски малой, Lemna minor L. в стационарных условиях для биотестирования воды. Среда для культивирования Lemna minor L. содержит калий азотнокислый, кальций азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, борную кислоту, при этом в нее дополнительно вводят мелассу при следующем соотношении компонентов, мас.%: калий азотнокислый, KNO₃ - 0,0175-0,014; калий фосфорнокислый однозамещенный, KH₂PO₄ - 0,0045-0,0036; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный, К₂HPO₄·3Н₂O - 0,0045-0,0036; кальций азотнокислый четырехводный, Са(NO₃)₂·4Н₂O - 0,0148-0,0118; магний сернокислый семиводный, MgSO₄·7H₂O - 0,005-0,004; кислота борная, Н₃ВО₃ - 12,0-9,6·10^-6; меласса - 0,002-0,004; дистиллированная вода - остальное. Указанная среда позволяет повысить эффективность культивирования необходимого тест-объекта - ряски малой, которая в дальнейшем используется для тестирования водных проб на присутствие токсичных веществ, в первую очередь ионов тяжелых металлов. 3 табл.

 

Изобретение относится к методу биотестирования воды на степень ее загрязнения тяжелыми металлами, пестицидами и другими токсичными веществами с использованием растений ряски малой, Lemna minor L. как чувствительного тест-объекта.

Для культивирования тест-организма ряски малой известны следующие среды (таблица 1).

Среда Е, стандартно рекомендуемая для выращивания различных видов рясок (в том числе Lemna minor) и содержащая нитраты калия и кальция, дигидрофосфат калия, сульфат магния, борную кислоту и соли марганца, железа, меди, цинка и молибдена. Общая концентрация солей - 0.416 мас.%; количественное соотношение азота, фосфора и калия составляет 4.00:1.32:9.56 соответственно (McLaughlin J., Rogers L. The use of biological assays to evaluate botanicals // Drug Inf. J. 1998. V.32. P.513-524).

Модифицированная среда Штейнберга, содержащая нитратный азот, фосфаты калия, кальций, магний, а также комплекс микроэлементов - неорганических солей тяжелых металлов и борную кислоту. Общая концентрация солей - 0.085 мас.%; количественное соотношение азота, фосфора и калия составляет 4.00:1.05:9.90 соответственно (протокол DIN AK "Bioteste", Vorlage für einen ISO/CEN Entwurf zum Lemnatest, ISO/WD 20079 (Stand: 04.05.2001): Water quality - Duckweed growth inhibition; Determination of the toxic effect of water constituents and waste water to duckweed, Lemna minor) - прототип.

Недостатком этих сред для культивирования ряски малой в целях биотестирования является следующее.

1. В числе микроэлементов содержатся соли тех тяжелых металлов, на которые тестируются водные пробы. Для предотвращения их токсичного действия на растения ряски малой в указанные среды вводится комплексон III - этилендиаминтетраацетат натрия, ЭДТА, который связывает не только ионы тяжелых металлов, но также кальция и магния. Это негативно влияет на рост и развитие ряски малой и может искажать результаты тестов при использовании подобной среды для разбавления образцов согласно стандартной методике (Einhelling F., Leather G., Hobbs L. Use of Lemna minor L. as bioassay on allelopathy // J. Chem. Ecol. 1985. V.11. P.65-92). При культивировании ряски малой в упомянутых средах наблюдали низкий уровень размножения растений (средний суточный коэффициент роста =1.08) и пожелтение (хлороз) листецов.

2. Относительно высокая концентрация фосфата в среде Е, 0.068 мас.%, также может способствовать связыванию ионов тяжелых металлов при их концентрации в тестируемых пробах порядка 0.01-0.001%, на что в принципе рассчитан тест с ряской малой. Таким образом, чувствительность, ожидаемая для данного метода биотестирования, может значительно снижаться при использовании такой среды.

Таблица 1
Компоненты	Концентрация, мас.%
Модифицированная среда Штейнберга	Среда Е
Калий азотнокислый	0.0350	0.1515
Калий фосфорнокислый однозамещенный	0.0090	0.0680
Калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный	0.0013	-
Кальций азотнокислый четырехводный	0.0295	0.1180
Магний сернокислый семиводный	0.0100	0.0492
Кислота борная	12·10-6	0.0286
Цинк сернокислый семиводный	18·10-6	0.00022
Железо треххлористое шестиводное	76·10-6	0.0054
Марганец двухлористый четырехводный	18·10-6	0.00362

Продолжение таблицы 1
Компоненты	Концентрация, мас.%
Модифицированная среда Штейнберга	Среда Е
Натрий молибденовокислый двухводный	4.4·10-6	0.00012
Медь сернокислая пятиводная	-	0.00022
ЭДТА	0.00015	0.00112

Техническим решением задачи является повышение эффективности культивирования ряски малой в стационарных условиях для последующего использования ее культуры в биотестировании.

Поставленная задача достигается тем, что в среду для культивирования растений ряски малой, Lemna minor L., содержащую калий азотнокислый, кальций азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый и борную кислоту, дополнительно вводят мелассу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

калий азотнокислый, KNO₃ - 0.0175-0.0140;

калий фосфорнокислый однозамещенный, КН₂РО₄ - 0.0045-0.0036;

калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный, К₂НРО₄·3Н₂О - 0.0045-0.0036;

кальций азотнокислый четырехводный, Са(NO₃)₂·4Н₂О - 0.0148-0.0118;

магний сернокислый семиводный, MgSO₄·7Н₂О - 0.005-0.004;

кислота борная, H₃BO₃ - 12.0-9.6·10^-6;

меласса - 0.002-0.004;

дистиллированная вода - остальное.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что использование мелассы обеспечивает хороший рост растений ряски, отсутствие их хлороза при длительном культивировании; в то же время такая среда вполне пригодна для проведения корректного и высокочувствительного биотестирования воды на наличие тяжелых металлов. Кроме того, при содержании 1:1 однозамещенного / двузамещенного фосфорнокислого калия значение рН среды имеет значение, близкое к 6, что соответствует норме для ряски малой и в то же время не способствует переходу токсичных металлов в нерастворимые соединения.

По данным патентной и научной литературы не обнаружено аналогичного решения, которое бы обеспечило достижение поставленной задачи, что позволяет говорить об изобретательском уровне предложения.

Среду готовят следующим образом.

1. Исходно приготовляют концентрированные растворы питательных солей, борной кислоты и мелассы в дистиллированной воде; концентрации указаны в таблице 2.

2. Раствор борной кислоты титруют 4%-м (мас.) раствором гидроксида калия до рН 7 с индикаторным красителем бромтимоловым синим.

3. Аликвоты концентрированных растворов, указанные в таблице 2, разводят дистиллированной водой до общего объема 2 л.

Общая концентрация солей - 0.0475 мас.%; количественное соотношение азота, фосфора и калия составляет 3:1:8 соответственно.

Таблица 2
Компоненты	Конечная концентрация компонентов. мас.%	Концентрация в исходных растворах, мас.%	Объемы аликвот, разводимых до 2 л готовой среды, мл
Калий азотнокислый	0.0175	3.5	10
Калий фосфорнокислый однозамещенный	0.0045	0.9	10
Калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный	0.0045	0.9	10
Кальций азотнокислый четырехводный	0.0148	2.95	10

Продолжение таблицы 2
Компоненты	Конечная концентрация компонентов, мас.%	Концентрация в исходных растворах, мас.%	Объемы аликвот, разводимых до 2 л готовой среды, мл
Магний сернокислый семиводный	0.0050	1	10
Кислота борная	12·10-6	0.12	0.2
Меласса	0.002	1	4

При таком способе приготовления среды представляется целесообразным приводить примеры на совокупность граничных значений концентраций солей и борной кислоты, при различном разбавлении аликвот их концентрированных растворов. В таблице 3 даются эти значения для пяти примеров, рассмотренных ниже.

Таблица 3
	Концентрации ингредиентов в готовой среде, мас.%
Калий азотнокислый	Калий фосфорнокислый однозамещенный	Калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный	Кальций азотнокислый четырехводный	Магний сернокислый семиводный	Кислота борная
Пример 1	0.0175	0.0045	0.0045	0.0148	0.0050	12·10-6
Пример 2	0.0140	0.0036	0.0036	0.0118	0.0040	9.6·10-6
Пример 3	0.0175	0.0045	0.0045	0.0148	0.0050	12·10-6
Пример 4	0.0233	0.0060	0.0060	0.0197	0.0066	16·10-6
Пример 5	0.0175	0.0045	0.0045	0.0148	0.0050	12·10-6

Граничные значения концентрации мелассы (мас.%): 0.001; 0.002; 0.004; 0.01. Все приводимые значения были определены опытным путем через оценку интенсивности роста ряски малой в средах с варьирующим составом. Эффективность заявляемой среды проверяли выращиванием в ней растений ряски малой при постоянной температуре 24-26°С и освещенности порядка 3000 люкс в течение 4-7 суток. После того часть размножившихся растений пересаживали в свежие порции среды; такой перенос повторяли трижды.

Пример 1. Готовят концентрированные растворы указанных выше питательных веществ в дистиллированной воде, в концентрациях, приведенных в таблице 2. Раствор борной кислоты титруют 4%-м (мас.) раствором гидроксида натрия до рН 7 с бромтимоловым синим. Раствор мелассы 1%-й прогревают 15 минут на водяной бане при 100°С для гибели грибных спор и бактериальных клеток, затем охлаждают. Отмеривают аликвоты концентрированных растворов солей и борной кислоты (объемы приведены в таблице 2) и 2 мл 1%-го раствора мелассы, разводят их дистиллированной водой до конечного объема 2.0 литра и перемешивают. Конечная концентрация мелассы в среде составляет 0.001 мас.%, концентрации остальных ингредиентов приведены в таблице 3. На полученной среде средний суточный коэффициент роста (СКР) имел значение 1.30, тогда как в контрольных посевах на водопроводной воде с добавлением 0.001% мелассы среднее значение СКР было 1.12. Однако у некоторого числа растений в среде был отмечен хлороз, таким образом, при данных концентрациях ингредиентов среда неоптимальна для выращивания ряски малой.

Пример 2. Готовят концентрированные растворы указанных выше питательных солей, борной кислоты и мелассы в дистиллированной воде, в концентрациях, приведенных в таблице 2. Раствор борной кислоты титруют 4%-м (мас.) раствором гидроксида натрия до рН 7 с бромтимоловым синим. Раствор мелассы 1%-й прогревают 15 минут на водяной бане при 100°С для гибели грибных спор и бактериальных клеток, затем охлаждают. Отмеривают аликвоты концентрированных растворов солей и борной кислоты (объемы приведены в таблице 2) и 5 мл 1%-го раствора мелассы, разводят их дистиллированной водой до объема 2.5 литра и перемешивают. Конечная концентрация мелассы в среде составляет 0.002 мас.%, концентрации остальных ингредиентов приведены в таблице 3. На полученной среде средний суточный коэффициент роста (СКР) имел значение 1.32, тогда как в контрольных посевах на водопроводной воде с добавлением 0.002% мелассы среднее значение СКР было 1.04. Все растения, как в опыте, так и в контроле, оставались зелеными. Таким образом, при данных концентрациях ингредиентов среда является оптимальной для стационарного культивирования ряски малой.

Пример 3. Готовят концентрированные растворы указанных выше питательных веществ в дистиллированной воде, в концентрациях, приведенных в таблице 2. Раствор борной кислоты титруют 4%-м (мас.) раствором гидроксида натрия до рН 7 с бромтимоловым синим. Раствор мелассы 1%-й прогревают 15 минут на водяной бане при 100°С для гибели грибных спор и бактериальных клеток, затем охлаждают. Отмеривают аликвоты концентрированных растворов солей и борной кислоты (объемы приведены в таблице 2) и 6 мл 1%-го раствора мелассы, разводят их дистиллированной водой до объема 2.0 литра и перемешивают. Конечная концентрация мелассы в среде составляет 0.003 мас.%, концентрации остальных ингредиентов приведены в таблице 3. На полученной среде средний суточный коэффициент роста (СКР) имел значение 1.37, тогда как в контрольных посевах на водопроводной воде с добавлением 0.003% мелассы среднее значение СКР было 1.04. Растения в среде оставались зелеными. Таким образом, при данных концентрациях ингредиентов среда является оптимальной для стационарного культивирования ряски малой в течение по крайней мере 7 суток.

Пример 4. Готовят концентрированные растворы указанных выше питательных солей, борной кислоты и мелассы в дистиллированной воде, в концентрациях, приведенных в таблице 2. Раствор борной кислоты титруют 4%-м (мас.) раствором гидроксида натрия до рН 7 с бромтимоловым синим. Раствор мелассы 1%-й прогревают 15 минут на водяной бане при 100°С для гибели грибных спор и бактериальных клеток, затем охлаждают. Отмеривают аликвоты концентрированных растворов солей и борной кислоты (объемы приведены в таблице 2) и 6 мл 1%-го раствора мелассы, разводят их дистиллированной водой до объема 1.5 литра и перемешивают. Конечная концентрация мелассы в среде составляет 0.004 мас.%, концентрации остальных ингредиентов приведены в таблице 3. На полученной среде средний суточный коэффициент роста (СКР) имел значение 1.14, тогда как в контрольных посевах на водопроводной воде с добавлением 0.004% мелассы среднее значение СКР было 1.08. Наблюдали также слабый хлороз растений в среде. Таким образом, при данных концентрациях ингредиентов среда неоптимальна для выращивания ряски малой.

Пример 5. Готовят концентрированные растворы указанных выше питательных веществ в дистиллированной воде, в концентрациях, приведенных в таблице 2. Раствор борной кислоты титруют 4%-м (мас.) раствором гидроксида натрия до рН 7 с бромтимоловым синим. Раствор мелассы 1%-й прогревают 15 минут на водяной бане при 100°С для гибели грибных спор и бактериальных клеток, затем охлаждают. Отмеривают аликвоты концентрированных растворов солей и борной кислоты (объемы приведены в таблице 2) и 20 мл 1%-го раствора мелассы, разводят их дистиллированной водой до объема 2.0 литра и перемешивают. Конечная концентрация мелассы в среде составляет 0.01 мас.%, концентрации остальных ингредиентов приведены в таблице 3. На полученной среде средний суточный коэффициент роста (СКР) имел значение 1.36, тогда как в контрольных посевах на водопроводной воде с добавлением 0.01% мелассы среднее значение СКР было 1.16. Все растения как в опыте, так и в контроле, оставались зелеными. Таким образом, полученная среда пригодна для стационарного культивирования ряски малой в течение по крайней мере 7 суток. Однако при относительно высоких концентрациях мелассы в нестерильных условиях существует угроза интенсивного размножения бактерий и грибов в среде с культурой ряски.

Среда для культивирования растений ряски малой, Lemna minor L., содержащая калий азотнокислый, кальций азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, борную кислоту, при этом в нее дополнительно вводят мелассу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

калий азотнокислый, KNO3	0,0175-0,014
калий фосфорнокислый однозамещенный, КН2PO4	0,0045-0,0036
калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный,
К2HPO4·3H2O	0,0045-0,0036
кальций азотнокислый четырехводный, Са(NO3)2·4Н2O	0,0148-0,0118
магний сернокислый семиводный, MgSO4·7H2O	0,005-0,004
кислота борная, Н3ВО3	12,0-9,6·10-6
меласса	0,002-0,004
дистиллированная вода	остальное