Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на ее основе

Изобретение относится к косметической промышленности и может быть использовано в качестве профилактического и лечебно-косметического средства по уходу за кожей. Применяют природный цеолит в порошкообразном состоянии в качестве косметической биологически активной добавки, обеспечивающей неспецифическую активацию эпидермальных макрофагов и восстановление содержания связанной воды в коллагене кожи и полисахаридах межклеточного матрикса. В качестве природного цеолита косметическая биологически активная добавка содержит клиноптиллолит, шабазит, гейландит, филлипсит, компоненты берут в определенном количественном содержании, а косметический литофитокомплекс включает порошкообразный природный цеолит, в качестве которого он содержит клиноптиллолит, шабазит, гейландит и филлипсит, солевые добавки, источник бета-глюкана, представляющий собой порошок овса молочно-восковой спелости, бентонит или каолин, или тальк, компоненты берут в определенном количественном содержании. Композиция обеспечивает неспецифическую активацию макрофагального звена иммунной системы кожи, усиливает дренажную функцию лимфатических сосудов кожи, укрепляет стенки кровеносных и лимфатических капилляров кожи, а также ее внешний вид. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Изобретение относится к косметической промышленности и медицине, а именно к средствам, обеспечивающим улучшение внешнего вида кожи и ее механических свойств, и может быть использовано в качестве профилактического и лечебно-косметического средства по уходу за кожей.

С возрастом кожа становится особенно чувствительна к факторам, вызывающим разрушение липидной прослойки рогового слоя. При этом наблюдается замедленное восстановление липидного барьера кожи после повреждения. В эпидермисе происходит снижение скорости синтеза главных липидов рогового слоя - церамидов, поэтому их количество в роговом слое уменьшается. Ослабление липидного барьера приводит к усилению испарения воды через роговой слой. Одновременно наступает постепенное обезвоживание дермы из-за постепенного разрушения веществ, сберегающих влагу (мукополисахаридов, коллагена), а также вследствие снижения интенсивности кровотока в сосудах дермы. Все это приводит к уменьшению количества воды, поступающей в кожу. Обезвоживание - основная проблема стареющей кожи.

Для увлажнения кожи используются церамиды, обогащенные незаменимыми жирными кислотами и витамином Е, гиалуроновая кислота, которая образует на поверхности кожи нечто вроде водной мантии, а также вещества, усиливающие синтез липидов в эпидермисе, - фитоэстрогены, альфа-гидроксикислоты (Альманах. Косметика и медицина //Косметика для 30-40 лет. - 2002).

Однако указанные средства имеют достаточно высокую стоимость и не могут быть использованы для длительного применения в качестве увлажняющих косметических средств. Кроме того, они не оказывают существенного влияния на неспецифическую активацию эпидермальных макрофагов.

Кроме того, кожа человека находится в трудных условиях. Пыль и грязь, вредные химикалии и УФ-излучение, мороз и зной - все это ежедневно действует на кожу, оставляя свои следы в виде мелких повреждений. Эти повреждения кожа должна залечивать. Роль бригады "скорой помощи", которая первой бросается ремонтировать поврежденный эпидермис, выполняют кожные макрофаги - клетки Лангерганса. Обычно они справляются со своей работой достаточно успешно. Однако многие из тех факторов, которые негативно воздействуют на кожу, одновременно угнетают и клетки Лангерганса. Для того чтобы восстановить их работоспособность, необходима дополнительная их стимуляция.

Известно использование природных полисахаридов для стимуляции макрофагов (Czop JK, Kay J. "Isolation and characterisation of β-glucan receptores on human mononuclear phagocytes". J Exp Med 1991; 173:1511-1520). He все полисахариды способны стимулировать макрофаги. Этими свойствами обладают полисахариды клеточной стенки дрожжей (1,3-бета-глюканы), полисахариды Aloe vera (ацеманнан), а также эхинакозиды, выделенные из растения эхинацеи пурпурной. Эти полисахариды обладают ранозаживляющими, регенерирующими и противовоспалительными свойствами, восстанавливают естественные защитные силы кожи, повышают ее сопротивляемость стрессовым факторам. Ряд продуктов, вырабатываемых активированными макрофагами, стимулируют выработку коллагена клетками дермы и тем самым способствуют разглаживанию мелких морщин. Иммуностимулирующая косметика, содержащая очищенный экстракт клеточной стенки дрожжей, сок эхинацеи пурпурной или гель Aloe vera, способна реально улучшить состояние кожи и продлить ее молодость.

Известно использование бета-глюканов в качестве средства для активации эпидермальных макрофагов (Патент РФ №2239410, МПК А61К 7/00, опубл. 10.11.2004 г.). Бета-глюкан может быть получен из измельченных или лепестковых зерен овса, которые экстрагируют водой и одновременно оказывают ультразвуковое воздействие с плотностью акустической энергии в среде 0,03-0,6 Вт/см³, далее отделяют легкоусвояемые глюканы.

Однако указанные средства не оказывают существенного влияния на восстановление содержания связанной воды в коллагене кожи и полисахаридах межклеточного матрикса.

Наиболее близким аналогом (прототипом) косметической биологически активной добавки, воздействующей на иммунофагоцитарную систему кожи, является сажа - углерод в порошкообразной форме (Джон Генри Кларк. Словарь практической MATERIA MEDICA. Гомеопатическая медицина, М., 2000, т.1, стр.284-289). Углерод широко используется в гомеопатии как средство кожное, лимфатическое и венозное. Использование углеродного порошка в гомеопатии выявило его избирательное действие на ткани кожи, в том числе непосредственно на кожную поверхность, а также на кровеносные и лимфатические капилляры. Данный лечебный препарат обладает глубоким терапевтическим действием и применяется для устранения злокачественных опухолей, раковых язв и застарелых рубцов кожи. Фармакодинамические свойства углерода показывают, что он способен проникать через микроциркуляторное русло и лимфатическую систему в разнообразные структуры кожи. Наряду с противоопухолевым действием углерода были выявлены и его противовоспалительные свойства (особенно при рожистых лимфангиитах), что указывает на непосредственную стимуляцию иммунофагоцитарной системы и ответственных за нее дендритических клеток, фибробластов и гистиоцитов.

Однако существенным недостатком данного средства является неспособность дисперсного или корпускулярного углерода (порошкового или гранулированного) восстанавливать содержание связанной воды в коллагене кожи и полисахаридах межклеточного матрикса. Кроме того, возможны аллергические проявления организма на указанное средство при глубоком проникновении в кожный покров.

Наиболее близким аналогом (прототипом) минерального косметического комплекса является средство для тела и лица, включающее хлорид натрия, бикарбонат натрия и цеолит при соотношении, мас.%: хлорид натрия 35-55; бикарбонат натрия 5-15; цеолит 30-60 (Патент РФ №2133604, МПК А61К 7/48, опубл. 27.07.1999 г.). В качестве цеолита используют натриевую форму клиноптиллолита. Цеолит содержит 0,01-1,0 мас.% ионов меди или цинка, или серебра от массы цеолита. Цеолит используют с размером частиц 10-100 мкм.

Однако указанное средство используется только для очистки лица и тела от вредных для кожи ионов (аммония, тяжелых металлов, включая радиоактивные изотопы).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является выявление свойств косметической биологически активной добавки, обеспечивающих одновременно неспецифическую активацию эпидермальных макрофагов и восстановление содержания связанной воды в коллагене кожи и полисахаридах межклеточного матрикса без проявления аллергических реакций, а также создание на основе ее косметического литофитокомплекса, обеспечивающего указанные выше лечебно-косметические свойства.

Указанный технический результат достигается применением природного цеолита в порошкообразном состоянии в качестве косметической биологически активной добавки, обеспечивающей неспецифическую активацию эпидермальных макрофагов и восстановление содержания связанной воды в коллагене кожи и полисахаридах межклеточного матрикса. В качестве природного цеолита косметическая биологически активная добавка содержит клиноптиллолит, шабазит, гейландит и филлипсит при следующем соотношении компонентов (мас.%):

Клиноптиллолит	0,01-99,9
Шабазит	0,01-99,9
Гейландит	0,01-99,9
Филлипсит	0,01-99,9

Уникальное сочетание в цеолитовом сырье сорбционных, каталитических, ионообменных, ситовых и других свойств обеспечивает широкий спектр его медицинского и косметического применения. Однако в современном уровне техники не обнаружены данные по использованию природных цеолитов в качестве косметической биологически активной добавки, обеспечивающей неспецифическую активацию эпидермальных макрофагов и восстановление содержания связанной воды в коллагене кожи и полисахаридах межклеточного матрикса.

Предлагаемое средство в виде порошка природного цеолита не только не вызывает аллергических реакций, но само обладает противоаллергическим действием (Патент РФ №2082403, МПК А61К 33/00, опубл. 27.06.1997).

Указанный технический результат достигается также тем, что в косметическом литофитокомплексе, включающем порошкообразный природный цеолит и солевые добавки, согласно изобретению, он дополнительно содержит источник бета-глюкана, представляющий собой порошок овса молочно-восковой спелости, бентонит или каолин, или тальк, в качестве природного цеолита он содержит клиноптиллолит, шабазит, гейландит и филлипсит, а в качестве солевых добавок он содержит каменную соль, или морскую соль, или озерную соль, или соду при следующем соотношении компонентов (мас.%):

Клиноптиллолит	0,01-99,9
Шабазит	0,01-99,9
Гейландит	0,01-99,9
Филлипсит	0,01-99,9
Порошок овса молочно-восковой
спелости (источник бета-глюкана)	0,01-99,9
Каменная соль, или
морская соль, или озерная
соль, или сода	0,01-70,0
Бентонит, или
каолин, или тальк	остальное до 100%

Клиноптиллолит - одна из разновидностей цеолитов - высокоэффективных природных сорбентов, по эффективности сорбции близких к ионообменным смолам. Химический состав клиноптиллолита: (Na, К₂)О·Al₂О₃·10SiO₂·8Н₂О. Суммарная катионная емкость 87 мг-экв/100 г породы, ионообменная емкость - 2.5 мг-экв/г. Отмечена адсорбционная способность к Н₂О (воде), метанолу, СО₂ (углекислому газу), O₂ (кислороду), SO₂ (сернистому газу), H₂S (сероводороду), NH₃ (аммиаку), N₂ (азоту), крупным органическим молекулам.

Шабазит, минерал группы цеолитов, кристаллизуется в тригональной системе, образуя кристаллы ромбоэдрического облика размером до нескольких сантиметров. Встречается также в виде агрегатов кристаллов, плотных скрытокристаллических корок. Цвет белый, буроватый.

Филлипсит относится к минералам группы цеолитов и имеет формулу:

(K₂Ca) [Al₂Si₄O₁₂]_*4,5H₂O. Химический состав: окись калия (К₂О) 4-11%, окись кальция (CaO) 3-8%, окись алюминия (Al₂О₃) 22-24%, двуокись кремния (SiO₂) 44-48%, вода (Н₂О) 15-17%, окись натрия (Na₂О) до 6%.

Гейландит относится к минералам группы цеолитов и имеет следующую формулу - CaNa₂[AlSi3O₈]_2*5Н₂О. Химический состав: окись кальция (CaO) 9,2%, окись алюминия (Al₂О₃) 16,8%, вода (Н₂О) 14,8%.

Бентонит - глина желтовато-зеленоватого цвета, плотная, вязкая, во влажном состоянии с характерным раковистым изломом. Главные породообразующие минералы бентонитовой глины: кальциевый монтмориллонит, кварц и карбонаты.

Каолин, белая глина - это соединение оксидов кремния и алюминия с добавлением воды. Каолин содержит минеральные соли и микроэлементы: кремнезем, цинк, медь, азот и др. Белая глина названа каолином по названию местности в Китае - Каолин, где впервые были обнаружены крупные залежи белой глины. Наиболее широко белую глину используют в составе масок и скрабов. Белая глина - нежнейший абразив (эксфолиант), что позволяет использовать его в качестве мягкого нетравматичного скраба даже для самой чувствительной кожи.

Тальк - распространенный минерал подкласса слоистых силикатов, Mg₃[Si₄O₁₀](OH)₂. Магний замещается Fe, Ni, Al, Cr. Разновидности: миннесотаит (содержание Fe 50-80 ат.%), виллемсеит - существенно никелистый Т., стеатит (жировик) - плотный массивный Т. Кристаллическая структура талька - наложение «пакетов» толщиной около 9 ангстрем, состоящих из двух кремнекислородных слоев с ионами Mg и ОН между ними. Заряды атомов в «пакетах» скомпенсированы, «пакеты» удерживаются совместно лишь слабыми ван-дер-ваальсовыми связями. Цвет белый и зеленый разных оттенков.

1,3-бета-глюкан содержится в протеинах овса молочно-восковой спелости. Он усиливает активность иммунокомпетентных клеток (макрофагов), в результате чего те начинают интенсивно синтезировать биологически активные вещества, необходимые другим клеткам и системам организма для полноценной жизни. Среди этих веществ, например, цитокины - регуляторные и сигнальные молекулы, благодаря которым клетки понимают, что они должны делать в конкретный момент, чтобы жизнь организма шла своим чередом; эпидермальный фактор роста, который увеличивает скорость обновления клеток эпидермиса; фактор ангиогенеза, который отвечает за рост новых капилляров. При связывании 1,3-бета-глюкана с рецепторами макрофаги переходят в активное состояние, начинают синтезировать и высвобождать целый ряд веществ: цитокин фактор, фактор 1,3-бета-глюкан эффективен против патогенных микроорганизмов, бактерий, вирусов, грибков. Воздействуя на макрофаги, он усиливает их фагоцитарную активность - способность уничтожать, поедать чужеродные микроорганизмы. Солнцезащитные свойства бета-глюкана ярко выражены. Он предохраняет клетки Лангерганса от повреждений под действием УФ-излучения, а они, в свою очередь, защищают эпидермальные клетки и способствуют восстановлению поврежденных участков кожи, снимают воспаление.

Заявляемое средство обеспечивает создание принципиально нового подхода к воздействию на систему местной тканевой защиты с помощью косметических накожных аппликаций с целью улучшения внешнего вида кожи и восстановление ее влагосодержания.

Ниже приведены примеры составов природного цеолита (цеолитный комплекс) как косметической биологически активной добавки (примеры 1-4) и литофитокомплекса (примеры 5-9) в порошкообразном виде с размером частиц 0,01-10 мкм (мас.%).

Пример 1.

Клиноптиллолит	99,9
Шабазит	0,01
Гейландит	0,01
Филлипсит	0,08

Пример 2.

Клиноптиллолит	0,01
Шабазит	99,9
Гейландит	0,08
Филлипсит	0,01

Пример 3.

Клиноптиллолит	0,08
Шабазит	0,01
Гейландит	99,9
Филлипсит	0,01

Пример 4.

Клиноптиллолит	0,01
Шабазит	0,08
Гейландит	0,01
Филлипсит	99,9

Пример 5.

Клиноптиллолит	99,9
Шабазит	0,01
Гейландит	0,01
Филлипсит	0,01
Порошок овса молочно-восковой
спелости (источник бета-глюкана)	0,01
Каменная соль, или
морская соль, или озерная
соль, или сода	0,01
Бентонит, или
каолин, или тальк	остальное до 100%.

Пример 6.

Клиноптиллолит	0,01
Шабазит	0,01
Гейландит	0,01
Филлипсит	0,01
Порошок овса молочно-восковой
спелости (источник бета-глюкана)	99,9
Каменная соль, или морская соль,
или озерная соль, или сода	0,01
Бентонит, или
каолин, или тальк	остальное до 100%.

Пример 7.

Клиноптиллолит	0,01
Шабазит	0,01
Гейландит	0,01
Филлипсит	0,01
Порошок овса молочно-восковой спелости
(источник бета-глюкана)	20,0
Каменная соль, или морская соль,
или озерная соль, или сода	70,0
Бентонит, или
каолин, или тальк	остальное до 100%.

Пример 8.

Клиноптиллолит	25,0
Шабазит	0,01
Гейландит	25,0
Филлипсит	0,01
Порошок овса молочно-восковой спелости
(источник бета-глюкана)	30,0
Каменная соль, или
морская соль, или озерная
соль, или сода	10,0
Бентонит, или
каолин, или тальк	остальное до 100%.

Пример 9.

Клиноптиллолит	20,0
Шабазит	0,01
Гейландит	10,0
Филлипсит	0,01
Порошок овса молочно-восковой
спелости (источник бета-глюкана)	30,0
Каменная соль, или
морская соль, или озерная
соль, или сода	30,0
Бентонит, или
каолин, или тальк	остальное до 100%.

Составы, приготовленные в соответствии с примерами 1-9, перемалывались и смешивались в шаровой мельнице до размера частиц не более 10 мкм.

При нанесении увлажненной смеси косметических составов (примеры 1-9) на распаренную и мокрую поверхность кожного покрова человека (с последующим экспонированием в течение 20-30 минут) происходит биохимическое взаимодействие клеток кожи и компонентов указанных составов. При использовании цеолитсодержащей косметической композиции восстанавливается содержание связанной воды в коллагене кожи и полисахаридах межклеточного матрикса, а также активируется система эпидермальных макрофагов, которые воздействуют на клетки Лангерганса, стимулирущие, в свою очередь, Т-хелперы и запускающие тем самым механизмы тканевой иммунной защиты. Основным физиологическим механизмом указанного процесса является наработка иммунными клетками лимфокинов, стимулирующих митотическое деление всех типов клеток, которые присутствуют в коже (кератиноцитов, фибробластов, лимфоцитов).

Пример 10. Данные исследования действия косметической биологически активной добавки и литофитокомплекса на функциональную активность макрофагов перитонеального экссудата

Использована методика определения функциональной активности перитонеальных макрофагов с помощью НСТ-теста, отражающего уровень окислительно-восстановительного метаболизма клеток.

Продукция активных форм кислорода (супероксидный анион радикал, синглетный кислород, перекись водорода и др.) сопровождает активацию фагоцитоза, усиление бактерицидных потенций макрофагов и отражает уровень окислительно-восстановительного метаболизма фагоцитов. Так как процесс восстановления нитросинего тетразолия до диформазана коррелирует с образованием активных форм кислорода, в основу оценки функционального состояния макрофагов положена реакция восстановления бесцветного раствора нитросинего тетразолиевого реактива до темно-синего диформазана.

Перитонеальные клетки вносили в лунки 96-луночного планшета (1×10⁶ клеток/лунку) в среде RPMI с 5% сыворотки крупного рогатого скота (КРС). Культивирование проводили в течение 2 часов в CO₂ инкубаторе при 37°С. Затем клетки отмывали раствором Хенкса и в каждую лунку добавляли 100 мкл нитросинего тетразолия в концентрации 1 мг/мл и 50 мкл 1% суспензии опсонизированных эритроцитов барана (ЭБ). После инкубации в течение 1 часа клетки отмывали раствором Хенкса и фиксировали 10%-ным раствором формалина. Далее монослой макрофагов отмывали дистиллированной водой и высушивали. После этого в каждую лунку добавляли по 60 мкл 2М КОН и 70 мкл диметилсульфоксида. Уровень функциональной активности оценивали по изменению оптической плотности (ОП) раствора, которую измеряли при длине волны 620 нм на приборе Multiscan. Показатели функциональной активности макрофагов выражали в единицах ОП × 100.

Данные экспериментов подвергали статистической обработке с использованием пакета программ "Statgrapfics 5.0". В качестве критерия достоверности был выбран t-критерий Стьюдента.

Таблица 1 Данные по аппликативному нанесению препаратов на кожу крыс для определения функциональной активности макрофагов
№ гр.	Препарат	Показатели (средние в группе) функциональной активности макрофагов (восстановления НСТ) крыс после аппликации препаратов через
3 суток	7суток	21 сутки
1	Интактные	-	28,58±13,96	48,01±5,38
2.	Вода	26,86±11,97	35,26±5,55	55,50±11,42
3.	Цеолитный комплекс (БАД)	31,87±4,42	39,62±2,79	71,87±3,74
4.	Литофитокомплекс	32,50±23,26	43,69±1,36	98,73±7,60

В выше приведенной таблице 1 даны показатели функциональной активности резидентных перитонеальных макрофагов крыс Вистар через 3 суток, 7 суток и 21 сутки после аппликации различных препаратов для косметики.

На основании этих данных можно сделать заключение о способности цеолитного комплекса (биологически активная добавка - БАД) и литофитокомплексов модулировать окислительно-восстановительный метаболизм перитонеальных макрофагов крыс. Возможно, этот эффект связан с подавлением этими препаратами образования свободных радикалов, которое было индуцировано другими факторами (в данном эксперименте длительной обработкой кожи крыс водой).

Пример 11. Определение иммуномодулирующих свойств косметического литофитокомплекса

Описание эксперимента. Эксперименты выполнены на половозрелых самках крыс линии Вистар. В соответствии с задачами животные были распределены на следующие группы. Группа 1 - интактные крысы. Группа 2 - крысы, которым состригли шерсть с 5% от общей поверхности кожи в межлопаточной области. Этот участок ежедневно промывали водопроводной водой, после чего высушивали полотенцем. Группа 3 - крысы, которым состригли шерсть с 5% от общей поверхности кожи в межлопаточной области. На этот участок апплицировали заявленный цеолитный комплекс, имеющий количественное содержание компонентов в соответствии с примером 1. Время экспозиции 20 минут. Группа 4 - крысы, которым состригли шерсть с 5% от общей поверхности кожи в межлопаточной области. На этот участок апплицировали литофитокомплекс, имеющий количественное содержание компонентов в соответствии с примером 8. Время экспозиции 20 минут.

Композиция в целом представляет собой мелкодисперсный порошок с максимальным размером частиц до 30 мкм.

Результаты.

Через 14 и 21 день от начала эксперимента делали замеры толщины кожной складки на месте аппликации по стандартной методике. Обнаружено статистически значимое утолщение кожной складки у крыс, которым апплицировали цеолитсодержащие композиции. В частности, у крыс 3 группы толщина кожной складки колеблется в пределах 2,40 мм, у крыс 4 группы 2,49 мм, в контроле 2,30 мм. По окончании эксперимента на 22 сутки крыс декапитировали и забирали подкрыльцовые лимфатические узлы, из которых выделяли фагоцитирующие клетки, прилипшие к стеклу. Установлено, что из лимфатичесих узлов крыс опытных групп в сравнении с контролем в значительно большем количестве высеиваются жизнеспособные дендритные клетки, а также макрофаги. В цитоплазме некоторых макрофагов определяются кристаллические частицы диаметром 1-5 мкм.

Таким образом, под воздействием цеолитсодержащих композиций происходит неспецифическая активация макрофагального звена иммунной системы кожи.

Положительные эффекты от аппликаций заявляемыми композициями.

1. Неспецифическая активация макрофагального звена иммунной системы кожи.

2. Усиление дренажной функции лимфатических сосудов кожи.

3. Уменьшение интерстициального отека кожи.

4. Укрепление стенки кровеносных и лимфатических капилляров кожи.

5. Улучшение внешнего вида кожи и ее механических свойств.

Пример 12. Исследование влияния цеолитного комплекса (косметическая добавка) и литофитокомплекса на содержание воды в коллагене кожи

Коллаген в нативном состоянии содержит 65% воды и обладает высокой кристалличностью, благодаря чему изменения конформации этого белка можно зарегистрировать непосредственно в составе фибрилл с помощью спектроскопии ²H ЯМР.

Ранее было изучено изменение характера подвижности молекул воды, связанной с полипептидами коллагена крыс разного возраста. При этом удалось показать, что с увеличением возраста животных количество дефектов в коллагене возрастает.

Цель настоящего эксперимента - изучение системных изменений, происходящих в коллагене кожи в ответ на воздействие накожных аппликаций различных минеральных композиций.

Методы исследования. Исследование было проведено на крысах линии Wistar, самцах и самках, весом 180-450 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор". Минеральные композиции наносили на выстриженный в области загривка участок кожи площадью 3×3 см ежедневно в течение 3, 7 и 21 дней. Изучаемые вещества наносили в виде растворов, нерастворимые минералы смешивали с водой до полужидкой консистенции. Экспозиция длилась 3 мин, затем поверхность кожи промывали теплой проточной водой и вытирали полотенцем. Изучали действие следующих препаратов: цеолитный комплекс (примеры 1 и 4) и литофитокомплекс (примеры 8 и 9). Контролем служила водопроводная вода.

Через сутки после последней аппликации животных забивали декапитацией, проводили вскрытие и макроскопическое исследование органов, забирали образцы кожи для съемки спектров ЯМР. Образцы хранили в плотно укупоренных стеклянных флаконах при температуре 0-4°С.

Для регистрации спектров ²H ЯМР использовали импульсный спектрометр MSL - 300 производства фирмы Брукер (Германия). Образцы кожи весом 100-150 мг непосредственно перед съемкой спектра помещали в тяжеловодородную воду с содержанием 99% ²H₂О на 20 минут для изотопного замещения. Весовой контроль образцов подтвердил отсутствие изменения веса и эффекта поглощения избыточной воды.

Затем образец укладывали в зазор держателя, представляющего собой две тефлоновые пластины, помещенные в стандартную пробирку для регистрации спектров ЯМР. Использованная конструкция позволяла добиваться точной ориентации волокон коллагена перпендикулярно ориентации магнитного поля спектрометра.

Зимографический анализ кожи. Образцы кожи для зимографии немедленно после изъятия замораживали при 20°С, затем кожу в замороженном состоянии измельчали бритвенным лезвием, помещали в экстрагирующий раствор следующего состава: 50 мМ Трис-HCl рН 7,6,150 мМ NaCl мМ CaCl₂, 1 микроМ ZnCl₂, 0,01% BRIJ 35, 2 мМ АРМА (аминофенилацетата ртути). Соотношение веса ткани к объему буферного раствора 1:3.

Экстракцию металлопротеиназ проводили при + 4 градусах в течение 18 часов, затем тракты центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин.

В супернатантах определяли содержание белка по биурету и выявляли в них профиль желатиназ, разделяя белки в полиакриламидном геле, содержащем желатин.

Результаты и обсуждение. ЯМР спектры коллагена отражают "качество" укладки коллагена в фибриллах, показывая количество и степень упорядоченности воды в структуре этого белка.

В таблице 2 зарегистрировано снижение содержания воды в коже при увеличении возраста животных.

Таблица 2 Величины дублетных расщеплений (Δv, кГц) спектров 2H ЯМР коллагена кожи крыс разного возраста
Возраст (недели)	Кожа	Аппликации цеолитным комплексом на кожу крыс, возраст 36 недель	Аппликации литофитокомплексом на кожу крыс, возраст 36 недель
7	0,96	0,99	0,97
15	1,04
36	1,29

При нанесении различных аппликаций на 5% общей поверхности кожи крыс уже через 3 дня от начала воздействия происходят информационные изменения и в коллагене кожи, и в сухожилии, что говорит о системности реакций соединительной ткани. На восьмой день от начала аппликаций эти изменения становятся еще более выраженными. Все апплицируемые композиции вызывают заметные изменения в ЯМР спектрах коллагена кожи как на месте аппликации, в коже, так и в межклеточном матриксе.

При продолжении аппликативных воздействий до 21 дня картина снова изменяется: в коллагене кожи в ответ на применение аппликаций природного цеолита и литофитокомплекса происходит накопление связанной воды, что соответствует образованию новых фибрилл коллагена. Из таблицы 2 видно, что литофитокомплекс при 3-недельном применении вызывает в коже наработку молодого коллагена (Δv=0,97кГц), а цеолитный комплекс (косметическая биологически активная добавка) при 3-недельном применении вызывает в коже наработку молодого коллагена (Δv=0,99 кГц), что было подтверждено проведенными дополнительно морфологическими исследованиями. Зимографический анализ показал, что в коже происходят сходные изменения профиля матриксных металлопротеиназ на восьмой день от начала эксперимента при всех изученных нами аппликативных воздействиях. Исчезает про- ММР-9, присутствующая в коже интактных крыс, и выявляются только высокомолекулярные желатиназы, возможно, эсктрагированные из клеточной мембраны моноцитов и нейтрофилов. По-видимому, отсутствие ММР-9 косвенно подтверждает, что при кратковременных аппликациях изученных композиций в коже не происходит патологических изменений.

1. Применение природного цеолита в порошкообразном состоянии в качестве косметической биологической активной добавки, обеспечивающей неспецифическую активацию эпидермальных макрофагов и восстановление содержания связанной воды в коллагене кожи и полисахаридах межклеточного матрикса.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что в качестве природного цеолита косметическая биологическая добавка содержит клиноптиллолит, шабазит, гейландит и филлипсит при следующем соотношении компонентов, мас.%:

клиноптиллолит	0,01-99,9
шабазит	0,01-99,9
гейландит	0,01 - 99,9
филлипсит	0,01-99,93

3. Косметический литофитокомплекс, включающий порошкообразный природный цеолит и солевые добавки, отличающийся тем, что он дополнительно содержит источник бета-глюкана, представляющий собой порошок овса молочно-восковой спелости, бентонит или каолин, или тальк, в качестве природного цеолита он содержит клиноптиллолит, шабазит, гейландит и филлипсит, а в качестве солевых добавок он содержит каменную соль, или морскую соль, или озерную соль или соду при следующем соотношении компонентов, мас.%:

клиноптиллолит	0,01-99,9
шабазит	0,01-99,9
гейландит	0,01-99,9
филлипсит	0,01-99,9
порошок овса молочно-восковой
спелости (источник бета-глюкана)
каменная соль, или морская соль, или
озерная соль, или сода	0,01-70,0
бентонит, или каолин, или тальк	остальное до 100%