Комбинации антител, обладающих селективностью по отношению к рецептору лиганда, индуцирующему апоптоз, ассоциированный с фактором некроза опухоли, и других терапевтических средств

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложены способ селективной индукции апоптоза в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, способ ингибирования пролиферации клеток-мишеней, экспрессирующих DR5, способ лечения индивидуума, страдающего воспалительным или аутоиммунным заболеванием. Каждый из способов характеризуется использованием терапевтического количества антитела в растворимой форме, специфического к TRAIL-рецептору DR5 с последующим воздействием на клетки терапевтического количества одного или более терапевтических средств. При этом антитело при концентрациях менее 1 мкг/мл обладает апоптоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, как in vivo, так и in vitro. Раскрыта композиция для селективной индукции апоптоза в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, на основе указанного антитела и терапевтического количества одного или более терапевтических средств. Использование изобретения позволяет замедлить рост опухоли и сократить количество случаев ее регрессии, что может найти применение в терапии опухоли. 4 н. и 76 з.п. ф-лы, 27 ил., 6 табл.

 

Приоритетная справка

В настоящей заявке заявлен приоритет в соответствии с предварительной заявкой США 60/391478, поданной 24 июня 2002 г., и предварительной заявкой США 60/346402, поданной 1 ноября 200 г., и испрашивается приоритет в соответствии с заявкой РСТ/US01/14151, поданной в мае 2001 г. и находящейся в настоящее время на рассмотрении. В РСТ/US01/14151 заявлен приоритет предварительной заявки США 60/201344, поданной 2 мая 2000 г. Заявки, которые являются приоритетными по отношению к настоящему изобретению, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Настоящее изобретение было создано при поддержке Федерального правительства, выделенные в соответствии с грантом NCI P50 СА 89019-01, выданном Национальным институтом рака, и в соответствии с грантом NIH R03-AR44982, выданном Национальным институтом по лечению артрита, заболеваний скелетных мышц и кожных болезней. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу, способному специфически связываться с одним типом рецептора для лиганда (далее обозначаемого "TRAIL"), индуцирующего апоптоз, ассоциированный с фактором некроза опухоли (далее обозначаемым TNF), а более конкретно к моноклональному антителу, индуцирующему апоптоз клеток in vivo и in vitro, экспрессирующих указанный один тип рецептора, и к терапии, основанной на использовании этого антитела.

Предпосылки создания изобретения

TRAIL является членом семейства белков TNF, которое также включает TNF-α и Fas-лиганд (1). Эти белки являются сильными индукторами апоптоза. В настоящее время идентифицированы пять рецепторов для TRAIL, два из которых, DR4 (TRAIL-R1) и DR5 (TRAIL-R2) (2-7), способны передавать сигналы апоптоза, тогда как три других рецептора, DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) и остеопротегерин (OPG), не являются медиаторами передачи сигнала апоптоза (8-12). Все пять рецепторов для TRAIL имеют значительную гомологию в своих внеклеточных лиганд-связывающих доменах. Аналогично рецептору Fas и рецептору TNF I (далее называемому "TNFRI") внутриклеточные сегменты DR4 и DR5 содержат домен гибели и передают сигнал апоптоза по пути, в котором участвует Fas-ассоциированный белок, содержащий домен гибели (далее обозначаемый "FADD"), и каспаза 8 (6, 7). Помимо передачи сигнала апоптоза, рецепторы DR4 и DR5 могут также активировать каскад реакций с участием NF-κb (6, 7).

Было продемонстрировано, что биологические функции TRAIL включают его способность селективно индуцировать апоптоз трансформированных опухолевых клеток, при этом нормальные клетки являются относительно резистентными к TRAIL-опосредованному апоптозу (13-15). Такая селективность дает основание предполагать, что в отличие от лиганда Fas введение TRAIL ассоциируется с очень низкими уровнями токсичности, как было продемонстрировано при системном введении TRAIL животному-модели, и не приводит к значительному индуцированию токсичности (13). Таким образом, было предположено, что TRAIL является сильным индуктором апоптоза и может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения рака и других заболеваний, ассоциированных с аномальной пролиферацией клеток. Также было предположено, что TRAIL является сильным индуктором апоптоза и может быть использован для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Было продемонстрировано, что TRAIL-опосредованный апоптоз приводит к гибели Т-клеток, индуцируемой активацией, а поэтому действует по альтернативному механизму, отличающемуся от механизма действия лиганда Fas (16, 17). TRAIL-опосредованный апоптоз может также индуцировать апоптоз Т-клеток и других воспалительных клеток (18) и играет определенную роль в цитолитической активности NK-клеток (19-21) и в иммуномодулирующей функции дендритных клеток (22, 23). Таким образом, TRAIL-опосредованный апоптоз может также обеспечивать иммунную предпочтительность и осуществление иммунологического надзора.

Система TRAIL-рецепторов является сложной и включает, по крайней мере, два рецептора гибели, DR4 и DR5, и, по крайней мере, два неапоптотических рецептора, DcR1 и DcR2. Все эти рецепторы не только имеют высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей, но также обладают аналогичной аффинностью связывания с TRAIL (2-12). Способность рецепторов DcR1 и DcR2 конкурировать за связывание с TRAIL без индуцирования апоптоза дает основание предполагать, что они могут действовать как рецепторы-ловушки, которые блокируют или модулируют активность лиганда TRAIL. Кроме того, сообщалось, что нетрансформированные клетки экспрессируют более высокие уровни рецепторов-ловушек, чем трансформированные клетки. Таким образом, предполагается, что дифференциальная модуляция экспрессии рецепторов гибели и рецепторов-ловушек может представлять собой ключевой регуляторный механизм, который определяет чувствительность клеток к TRAIL-опосредуемому апоптозу, но при отсутствии рецептор-специфических антител (2). Хотя были проведены интенсивные исследования экспрессии и функции DR4 и DR5, однако прогресса в этой области пока не наблюдается из-за отсутствия рецептор-специфических моноклональных антител. Пока не было представлено каких-либо данных относительно экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Сообщалось, что для стимуляции перекрестного связывания была генерирована панель антител против рецепторов TRAIL, способных индуцировать апоптоз клеток меланомы in vitro, но только после иммобилизации этих антител, а в некоторых случаях требовалось культивирование этих клеток с актиномицином D (24). Было генерировано несколько антител против DR5 (24). Однако эти ранее генерированные моноклональные антитела против DR5 обладали низкой апопотоз-индуцирующей активностью in vitro даже в условиях перекрестного связывания. О какой-либо in vivo-активности не сообщалось. Эти антитела не были использованы для оценки экспрессии TRAIL-рецепторов на клеточной поверхности (24). Таким образом, необходимо получить моноклональное антитело, которое является селективным по отношению к каждому специфическому TRAIL-рецептору и которое не только способно связываться с рецептором клеточной поверхности, но также способно сильно индуцировать как in vivo, так и in vitro апоптоз аномальных клеток различных типов, включая опухолевые клетки, не требуя при этом перекрестного связывания или иммобилизации. Такое антитело должно служить не только потенциальным терапевтическим агентом, но также и диагностическим инструментом для функционального анализа рецептора TRAIL. Существует крайняя необходимость в продуцировании антитела, специфичного против каждого из рецепторов DR4 и DR5, индуцирующих гибель клеток.

При развитии или прогрессировании многих заболеваний часто случается, что клетки не элиминируются. При многих аутоиммунных заболеваниях и воспалительных состояниях выжившие активированные клетки атакуют нормальные ткани или клетки. Кроме того, прогрессирование онкогенеза и развитие пролиферативного паннуса ревматоидного артрита характеризуется неконтролируемой пролиферацией клеток. Таким образом, недостаточный апоптоз приводит к развитию заболевания, а использование апоптоз-индуцирующего лиганда или моноклонального антитела-агониста для усиления апоптоза рассматривается как возможная терапевтическая стратегия для элиминации таких нежелательных клеток.

Так, например, ревматоидный артрит (далее обозначаемый "РА") является распространенным аутоиммунным заболеванием человека. Современное представление о патофизиологии РА заключается в том, что аутоиммунные Т-клетки и В-клетки инициируют воспалительный ответ в суставах, который приводит к гиперпролиферации синовиоцитов. Гиперпролиферация синовиальных клеток приводит к сверхпродуцированию металлопротеиназ (далее обозначаемых "ММР"), что вызывает эрозивную деструкцию хряща и кости, которая характерна для РА (25). Таким образом, регуляция гиперпролиферации воспалительных синовиальных клеток является ключевой стадией лечения РА. Молекулярные механизмы, приводящие к гиперпролиферации синовиальных клеток, пока неизвестны. Хотя гиперпролиферативные синовиальные клетки не являются злокачественными и не трансформируются, однако многие исследования дают основание предполагать, что они имеют некоторые общие признаки с трансформированными клетками (46). Эти клетки, так называемые "трансформированные на вид синовиоциты", характеризуются плотным шероховатым эндоплазматическим ретикулумом, множеством ядер неправильной формы и изменениями в нормальной веретенообразной форме цитоскелета. Было высказано предположение, что включение онкогенов и вирусных генов может быть главной причиной появления синовиальных РА-клеток, имеющих вид трансформированных клеток (46).

По крайней мере, два аспекта РА позволяют предположить, что нарушение регуляции апоптоза может вносить свой вклад в патологический процесс и что терапевтическая стимуляция апоптоза может оказаться эффективным лечением; то есть неспособность активированных Т-клеток к элиминации позволяет предположить, что в данном случае имеет место индуцированная недостаточной активацией гибель этих Т-клеток, которая представляет собой процесс с участием Fas-опосредованного апоптоза и TRAIL-опосредованного апоптоза, а гиперпролиферативная природа синовиальных РА-клеток является стимулирующим фактором на более поздних стадиях патофизиологии РА. Действительно, было показано, что введение антитела против Fas в воспаленный сустав ингибирует развитие хронического артрита у tax-трансгенных мышей, которые служат моделью человеческого РА (26). Кроме того, локализованная трансдукция гена лиганда fas аденовирусным вектором является эффективной для предупреждения коллаген-индуцированного артрита (27). В обоих случаях наблюдается ингибирование пролиферации воспалительных синовиальных клеток путем усиления Fas-индуцированного апоптоза. Хотя лиганд Fas является сильным индуктором апоптоза в синовиальных клетках РА, применение опосредованного лигандом Fas апоптоза в качестве терапевтического средства для лечения человека ограничено его летальной токсичностью для печени. Таким образом, в отличие от апоптоза, индуцированного лигандом Fas, апоптоз, индуцированный TRAIL-рецептором, представляет собой более безопасное и более эффективное терапевтическое средство для лечения РА.

Индуцированный TRAIL-рецептором апоптоз также представляет собой более безопасное и более эффективное терапевтическое средство для лечения рака, чем апоптоз, индуцированный лигандом Fas. Известно, что TRAIL-опосредованный апоптоз специфически индуцирует апоптоз трансформированных опухолевых клеток и не оказывает негативного влияния на нормальные клетки. Было показано, что системное введение тримеризованного растворимого TRAIL не вызывает токсикоза у экспериментальных животных и даже может индуцировать регрессию имплантированных опухолей (13, 28). Возможность его применения в качестве дополнительной терапии при традиционном лечении появилась благодаря недавнему обнаружению того факта, что экспрессия DR5 и чувствительность TRAIL-опосредованного апоптоза клеток рака молочной железы усиливается при облучении, что дает основание предположить, что при противораковой терапии в комбинации с облучением эффективность TRAIL должна увеличиваться (29).

Кроме того, ген, кодирующий TRAIL-рецептор DR5, был картирован на хромосоме 8р21-22, то есть в локусе с высокой частотой мутации в некоторых раковых клетках (30). Сообщалось, что, по крайней мере, у двух видов опухолевых клеток, мелкоклеточного рака легких (31) и рака головы и шеи (32), обнаруживались мутации в гене домена гибели DR5. Таким образом, исследования рака в целях определения влияния, которое оказывает изменение эпитопа рецептора на развитие и прогрессирование рака, привели к необходимости продуцировать антитело против DR5. Кроме того, функциональность мутаций TRAIL-рецептора должна подтвердить эффективность такого клинического диагностического инструмента при его использовании в сочетании с другими биомаркерами для обнаружения рака на ранней стадии, а также в качестве прогностического фактора агрессивности опухоли.

Краткое описание изобретения

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к антителу, которое распознает TRAIL-рецептор DR5 и которое индуцирует апоптоз в DR5-экспрессирующей клетке in vivo или in vitro. Кроме того, описано антитело, которое распознает DR5, но не распознает DR4, DcR1 или DcR2. Особенно подробно описано моноклональное анти-DR5 антитело, продуцированное гибридомой.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к антителу, которое распознает TRAIL-рецептор DR4 и которое индуцирует апоптоз в DR4-экспрессирующей клетке in vivo или in vitro. Кроме того, описано антитело, которое распознает DR4, но не распознает DR5, DcR1 или DcR2. Особенно подробно описано моноклональное анти-DR4 антитело, продуцированное гибридомой.

Способ настоящего изобретения позволяет индуцировать апопотоз клеток-мишеней или ингибировать пролиферацию клеток-мишеней посредством контактирования клетки с терапевтическим количеством антитела, способного связываться с DR5 или DR4. В некоторых вариантах этого способа может быть индуцирован апоптоз либо может быть ингибирована пролиферация клеток посредством контактирования этих клеток-мишеней с антителами против других рецепторов, ответственных за гибель клеток.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая содержит терапевтическое количество моноклонального антитела, обладающего активностью против DR5, фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, контейнер, включающий указанное антитело и указанный носитель. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению антитела, распознающего DR5, или антитела, распознающего DR4, в целях получения терапевтического средства для селективного апоптоза аномальных или разрегулированных клеток.

Антитело настоящего изобретения взаимодействует с рецептором лиганда, индуцирующего апопотоз, ассоциированный с фактором некроза опухоли, то есть с таким рецептором, как DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG, что приводит к индуцированию апоптоза клетки, экспрессирующей указанный рецептор. Описано антитело настоящего изобретения, способное селективно связываться с эпитопом агонистического или антагонистического рецептора лиганда фактора некроза опухоли.

Настоящее изобретение относится к лечению ассоциированного с апоптозом заболевания, рака, воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания способом, предусматривающим контактирование ткани-мишени, пораженной данным заболеванием, с терапевтическим количеством антитела настоящего изобретения, вводимого отдельно или в комбинации с другими апопотоз-индуцирующими антителами и/или с другими терапевтическими агентам или терапиями.

Кроме того, описан гибридный белок, который включает аминокислотную последовательность антигенного рецептора TRAIL, имеющую, по крайней мере, десять оснований, присоединенных к белку иммуноглобулина или к его фрагменту, способному вырабатывать иммунный ответ у индивидуума.

Настоящее изобретение относится к способу генотерапии, в котором клетку-мишень трансфецируют нуклеиновокислотной последовательностью рецептора TRAIL, присутствующей в экспрессирующем векторе, так, чтобы указанный рецептор TRAIL экспрессировался на указанной клетке-мишени. Затем указанную клетку-мишень обрабатывают антителом, которое селективно связывается с указанным рецептором TRAIL.

Описаны аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую и легкую иммуноглобулиновые цепи антитела, обладающего селективностью по отношению к DR5. Также подробно описаны последовательности антитела, которое селективно связывается с DR4. Кроме того, подробно описаны векторы, включающие последовательность нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, и клетки-хозяева, трансформированные вектором настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против DR5 (например, TRA-8) и к гуманизированному антителу против DR4 (например, 2Е12), а также к трансфецированной клетке, продуцирующей гуманизированное антитело против DR5, и к трансфецированной клетке, продуцирующей гуманизированное антитело против DR4.

Описан способ продуцирования гуманизированного антитела против DR5 или антитела против DR4, предусматривающий трансформацию хозяина последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина и тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, и последующее инкубирование трансформированного хозяина в течение заранее определенного периода времени.

Также описан способ индуцирования апоптоза клеток-мишеней или индуцирования пролиферации клеток, который включает контактирование клетки-мишени с фармацевтически эффективным количеством гуманизированного антитела против DR5, гуманизированного антитела против DR4 или комбинации антитела против DR5 и антитела против другого рецептора гибели (например, антитела против DR4) в присутствии или в отсутствие других терапевтических агентов и в комбинации с другой терапией.

Также рассматривается коммерчески доступный набор для индуцирования апоптоза, который включает гуманизированное селективное антитело TRA-8 против DR5 или гуманизированное селективное антитело против DR4 (например, гуманизированное антитело 2Е12) и который упакован в соответствующий контейнер, содержащий, но необязательно, инструкции по его использованию.

Краткое описание графического материала

Фиг.1. Характеризация TRA-8. (а). Специфическое связывание TRA-8: Вестерн-блот-анализ (верхняя панель): рекомбинантные гибридные белки семейства TNFR, зондированные антителом TRA-8 или антителом против IgG человека. Дорожка 1: гибридный белок DR5/hIgG1 (иммуноген); дорожка 2: DR4/hIgG1 (TRAIL-R1); дорожка 3: DR5/hIgG1; дорожка 4: TRAIL-R3 (DcR-1)/hIgG1; дорожка 5: TRAIL-R4 (DcR-2)/hIgG1; дорожка 6: СD95/hIgG1; дорожка 7: растворимый TNFRI. ELISA-анализ (нижняя панель): номера лунок совпадают с номерами лунок для Вестерн-блот-анализа, за исключением лунки 8, которая относится к мышиному гибридному белку DR5/hIgG1. (b). Активность связывания растворимого TRAIL и TRA-8 с DR5 и DR4: ELISA-планшеты покрывали DR5/hIgG1 (левая панель) или DR4/hIgG1 (средняя панель), а затем инкубировали с TRAIL или TRA-8. (с). Проточный цитометрический анализ экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Клетки Cos-7 трансфецировали экспрессирующим вектором pcDNA3, содержащим полноразмерную кДНК DR5 (заштрихованная гистограмма) или кДНК DR4 (незаштрихованная гистограмма, сплошная линия), либо пустым вектором (незаштрихованная гистограмма, пунктирная линия). Через сорок восемь часов после трансфекции клетки окрашивали TRA-8, а затем PE-конъюгированным антителом против мышиного IgG1. (d). Иммуногистохимическая реактивность in situ для DR5: Через 48 часов после трансфекции предметные стекла с клетками Cos-7, трансфецированными DR5-экспрессирующим или контрольным вектором, окрашенным TRA-8. (е). Цитолитическая активность TRA-8: клетки Jurkat инкубировали с указанными концентрациями TRA-8. После культивирования в течение ночи определяли жизнеспособность клеток с помощью эксклюзионных анализов ATPLite, МТТ и PI. Результаты анализов ATPLite и МТТ выражали в процентах от контроля (среда), а результат анализа PI выражали в процентах по сравнению с PI-негативными клетками. (f). Вестерн-блот-анализ на активацию каспазы: клетки Jurkat инкубировали с 500 нг/мл TRA-8 в течение указанного интервала времени. Клеточные лизаты разделяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ с ДСН, подвергали блот-анализу и зондировали антителами против каспазы. Стрелки указывают на расщепленные субъединицы каждой каспазы. (g). Анализ на ингибирование каспазы: клетки Jurkat инкубировали с 50 нг/мл TRA-8 в течение ночи в присутствии различных концентраций указанных ингибиторов каспазы. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite.

Фиг.2. Экспрессия DR5 на клеточной поверхности и восприимчивость к DR5-опосредованному апоптозу. Нормальные Т- и В-клетки, только что выделенные из периферической крови, Т-клетки (а и а'), клетки глиомы (b и b'), раковые клетки предстательной железы (с) и В-клетки (d) инкубировали с антителом TRA-8 или с контрольным антителом против мышиного изотипа IgG1, а затем с PE-конъюгированным козьим антителом против мышиного IgG1. Незаштрихованные гистограммы представляют изотип контрольного антитела, а сплошные гистограммы представляют TRA-8-окрашивание. Апоптоз определяли с помощью анализа ATPLite после инкубирования в течение ночи с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с TRA-8 (заштрихованные кружки), как показано в а, b' и d.

Фиг.3а'. Т-клеточную линию U937 инкубировали с TRA-8 или с контрольным мышиным антителом изотипа IgG1. Апоптоз определяли с помощью анализа ATPLite после инкубирования в течение ночи с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с TRA-8 (заштрихованные кружки).

Фиг.3. Клеточные линии глиомы (b) и рака предстательной железы (с) инкубировали с TRA-8 или с контрольным мышиным антителом изотипа IgG1. Апоптоз определяли с помощью анализа ATPLite после инкубирования в течение ночи с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с TRA-8 (заштрихованные кружки).

Фиг.4 представляет собой серию графиков, иллюстрирующих жизнеспособность человеческих клеток Jurkat после обработки указанными концентрациями (А) антитела типов TRA-1, -8 и -10, и (В) TRAIL в присутствии фиксированной концентрации антител настоящего изобретения типов, указанных на фиг.4А.

Фиг.5. Экспрессия DR5 в нормальных и раковых тканях: гомогенаты нормальных и раковых тканей зондировали антителом TRA-8 и оценивали на развитие хемилюминесценции. (а). Вестерн-блот-анализ белка DR5 в нормальных тканях: дорожка 1: печень, дорожка 2: головной мозг, дорожка 3: легкие, дорожка 4: почки, дорожка 5: селезенка, дорожка 6: яички, дорожка 7: яичник, дорожка 8: сердце, дорожка 9: поджелудочная железа. (b). Вестерн-блот-анализ белка DR5 в раковых тканях. Зондировали блот раковой ткани, содержащий раковые клетки яичника (дорожка 1), легкого (дорожка 2), печени (дорожка 3), прямой кишки (дорожка 4), шейки матки (дорожка 5), кожи (дорожка 6), яичек (дорожка 7), щитовидной железы (дорожка 8), матки (дорожка 10), желудка (дорожка 11), носоглотки (дорожка 12) и поджелудочной железы (дорожка 13). Проводили иммуногистохимический анализ in situ нормальных тканей (с) и раковых тканей (d) человека. Замороженные срезы подвергали иммуноокрашиванию TRA-8.

Фиг.6. Опухолецидная активность TRA-8. Мышей SCID подкожно инокулировали клетками 1321N1. Мышам внутривенно вводили одну дозу 100 мкг TRA-8 на второй день после инокуляции опухоли (а) или три дозы 100 мкг TRA-8, начиная с 7-го дня после инокуляции опухоли (b). Рост опухоли определяли по ее массе и гистологически оценивали по окрашиванию Н&E. Фотографии указывают на рост жизнеспособных опухолевых клеток у контрольных мышей, но не у TRA-8-обработанных мышей (с, верхняя панель) и на Н&E-окрашивание опухоли (с, нижняя панель). Мышам SCID внутривенно инъецировали 10⁶ клеток Jurkat и этих мышей обрабатывали одной дозой TRA-8 на второй день после инъекции. Через 7 дней клетки селезенки собирали, окрашивали антителом против человеческого CD3 и анализировали с помощью проточной цитометрии (d) или иммуногистохимии (е).

На фиг.7 проиллюстрирована экспрессия DR5 на поверхности синовиальных клеток при РА (А) и ОА (В). 1×10⁶ первичных культивированных синовиальных клеток окрашивали аффинноочищенным TRA-8, а затем PE-конъюгированным козьим антителом против мышиных IgG1. 10000 жизнеспособных клеток анализировали с использованием программы FACSvantage.

Фиг.8 представляет собой серию графиков, иллюстрирующих жизнеспособность клеток и выражающих зависимость концентрации TRAIL и TRA-8, индуцирующей апоптоз репрезентативных штаммов синовиальных клеток РА (А) и ОА (В), от различных концентраций рекомбинантного растворимого TRAIL (незаштрихованные кружки) или аффинноочищенного TRA-8 (заштрихованные кружки). Жизнеспособность клеток выражали в процентах им/мин обработанных клеток по отношению к им/мин необработанных клеток.

Фиг.9 представляет собой серию графиков, иллюстрирующих зависимость DR5-опосредованного апоптоза синовиальных РА-клеток от каспазы. Синовиальные клетки РА (RA512) инкубировали с 50 нг/мл растворимого лиганда Fas (незаштрихованные квадраты), с анти-Fas антителом (СН-11) (заштрихованные квадраты), с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с анти-DR5 антителом (TRA-8) (заштрихованные кружки) в присутствии различных концентраций ингибиторов каспазы. После культивирования в течение ночи жизнеспособность клеток определяли с помощью ATPLite.

Фиг.10А иллюстрирует анализ электрофоретического сдвига в геле, указывающий на активацию NF-κb. Клетки RA1016 инкубировали с 20 нг/мл TNF-α, с 50 нг/мл растворимого TRAIL или с 50 нг/мл TRA-8 в течение указанных промежутков времени, а затем подвергали электрофорезу. Фиг.10В и С представляют собой графики, иллюстрирующие продуцирование ММР-1 и ММР-3. 1×10⁶/мл указанных синовиальных РА-клеток инкубировали с указанными концентрациями TNF-α (незаштрихованные кружки), TRAIL (незаштрихованные треугольники) или TRA-8 (заштрихованные кружки). После культивирования в течение ночи собирали супернатанты культуры. Уровни ММР в супернатантах культуры определяли с помощью ELISA.

Фиг.11. TRA-8 не индуцирует гепатоцеллюлярную токсичность. (а). Нормальные ткани печени не экспрессируют DR5. Парафиновые срезы двух нормальных тканей печени, одной ткани гепатоцеллюлярной карциномы и центрифугированный препарат клеток НерG2 получали для Н&E-окрашивания и соответствующие замороженные срезы окрашивали TRA-8. (b). Проточный цитометрический анализ экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Гепатоциты, выделенные из двух нормальных тканей печени и из ткани гепатоцеллюлярной карциномы, и клетки НерG2 окрашивали TRA-8, анти-Fas антителом (DХ2) или изотипическим контрольным антителом. Заштрихованные гистограммы указывают на TRA-8- или DХ2-окрашивание, а незаштрихованные гистограммы относятся к соответствующим изотипическим контролям.

Фиг.12. TRAIL, но не TRA-8 индуцирует гепатоцеллюлярную токсичность. Свежие нормальные гепатоциты человека выдерживали в среде для культивирования гепатоцитов. (а). Апоптоз гепатоцитов индуцировали с использованием 1 мкг/мл растворимого TRAIL и перекрестно-связывающего агента или TRA-8 в указанное время. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite. Результаты представлены как процент жизнеспособных клеток по отношению к контролю (среда). Затененные столбцы относятся к TRAIL, а черные столбцы относятся к TRA-8. (b). Конденсированные ядра гепатоцитов окрашивали Hoechst 33352 и анализировали с помощью проточной цитометрии. (с). Влияние циклогексимида на апоптоз гепатоцитов. Гепатоциты культивировали в контрольной среде или в среде с 1 мкг/мл TRAIL или TRA-8 в присутствии (заштрихованные столбцы) или в отсутствие (незаштрихованные столбцы) 1 мкг/мл циклогексимида в течение 8 часов. Жизнеспособность клеток определяли с помощью ATPLite. Результаты представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение для культур, полученных с тремя повторениями в двух экспериментах. (d). Сравнение чувствительности нормальных гепатоцитов к DR5- и Fas-опосредованному апоптозу. Свежевыделенные гепатоциты инкубировали с указанными концентрациями растворимого TRAIL, TRA-8, растворимого FasL или анти-Fas mAb СН11 в течение 6 часов. Жизнеспособность клеток определяли с помощью ATPLite. Результаты представлены как процент жизнеспособных клеток по отношению к контролю (среда). Для нормальных гепатоцитов представлены средние значения ± среднеквадратичное отклонение для четырех нормальных индивидуумов. Результаты для клеток гепатоцеллюлярной карциномы, взятых от одного пациента, и для клеток НерG2 представлены как средние значения для культур, полученных с тремя повторениями.

Фиг.13. TRAIL индуцирует гепатит. Мышей В6 внутривенно инокулировали 10⁹ б.о.е. аденовирусного вектора, кодирующего полноразмерный TRAIL человека под контролем транскрипционного элемента "Tet-on". Экспрессию TRAIL индуцировали указанной дозой тетрациклина. (а). Нозерн-блот-анализ экспрессии человеческого TRAIL в печени. Через 24 часа после инокуляции вектора и индуцирования тетрациклином полноразмерную РНК выделяли из печени и зондировали с использованием кДНА человеческого TRAIL или β-актина. (b). Сывороточные уровни AST. Через 24 часа после трансдукции TRAIL определяли сывороточные уровни AST. (с). TRAIL-опосредованная гибель гепатоцитов, инфицированных аденовирусным вектором: мышей В6 внутривенно инокулировали тетрациклин-индуцибельным аденовирусным вектором. Через 48 часов после инокуляции гепатоциты от инокулированных и неинокулированных контрольных мышей выделяли и инкубировали с указанными концентрациями TRAIL в течение 8 часов (левая панель). Жизнеспособность гепатоцитов определяли с помощью анализа ATPLite. Затем, через 48 часов, мышам, инокулированным вышеупомянутым аденовирусным вектором, внутривенно инъецировали 10 мкг растворимого человеческого TRAIL. Через 24 часа после инъекции TRAIL определяли сывороточные уровни AST (правая панель). (d и е). Гистологический анализ на повреждение печени, индуцированное TRAIL. Через 24 часа (d) или на 7-й день (е) после введения TRAIL печень вырезали. Парафиновые срезы окрашивали Н&E и фотографировали при 100× (верхняя панель) и 400× (нижняя панель).

Фиг.14 представляет серию графиков, на которых показано, что активированные Т-клетки и В-клетки, выделенные из человеческих МКПК, экспрессируют повышенные уровни DR5, как было определено с помощью проточной цитометрии для покоящихся (незаштрихованные) и активированных (заштрихованные) клеток.

Фиг.15 представляет графики, иллюстрирующие жизнеспособность в зависимости от концентрации TRA-8 для очищенных Т-клеток и В-клеток, представленных на фиг.14, которые были стимулированы анти-CD3 или анти-μ антителом в течение 48 часов, при этом активированные и бластные клетки были собраны при различной плотности Фиколл-Пак. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite.

Фиг.16 представляет собой гистограмму и графики проточной цитометрии, иллюстрирующие экспрессию CD3 в популяции лимфоцитов, отобранных в клеточном сортере с дискриминационным окном, для мышей NOD/SCID с дефицитом NK-клеток, которым были инъецированы МКПК и TRA-8 или IgG (контроль).

Фиг.17 иллюстрирует CD3- и TUNEL-окрашенные клеточные микрографики для ткани мышиной селезенки, как подробно описано в примере 13.

Фиг.18 представляет график цитотоксичности для клеток хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) и для нормальных В-клеток человека в присутствии TRA-8, BISVIII и их комбинации.

Фиг.19(а). Специфическое связывание 2Е12 с DR4. ELISA-планшеты покрывали растворимой формой гибридного белка "рецептор человеческого TRAIL - Fc человеческого IgG1", как указано, и инкубировали с указанной концентрацией mAb 2Е12, а затем с HRP-конъюгированным антителом против мышиных IgG1. Реакцию проявляли субстратным буфером ТМВ и величины OD измеряли при 450/650 нМ.

Фиг.19(b). 2Е12 связывается с клеточной поверхностью DR4. Клетки Cos-7 трансфецировали вектором, содержащим полноразмерную кДНК для DR4 (заштрихованная гистограмма) или контрольным вектором (незаштрихованная гистограмма). Трансфецированные клетки окрашивали 10 мкг/мл 2Е12 и HRP-конъюгированным антителом против мышиных IgG1. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии.

Фиг.19(с). Апоптоз-индуцирующая активность 2Е12. Клетки человеческой лимфомы Ramos B инкубировали в течение ночи с указанными концентрациями 2Е12 в присутствии 2 мкг/мл антитела против мышиных IgG1. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite. (d). Активация каспазы, индуцированная 2Е12. Клетки Ramos обрабатывали 2Е12 и антителом против мышиных IgG в течение указанных промежутков времени. Активацию каспазы и расщепление PARP определяли с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием специфических антител против каспазы или PARP.

Фиг.20. Действие 2Е12 и адриамицина у бестимусных "голых" мышей, несущих ксенотрансплантаты рака молочной железы. Клетки 2LMP (3×10⁷) подкожно инъецировали бестимусным "голым" мышам на день 0. Двум группам мышей внутрибрюшинно инъецировали 200 мкг 2Е12 в дни 7, 10, 14, 17, 21 и 24. Двум группам мышей вводили i.v. адриамицин (6 мг/кг) в дни 8, 12 и 16. Одной группе мышей антитело не вводили. Данные выражали как среднее изменение размера опухоли по отношению к размеру опухоли на день 7 (n=8 мышей/группу).

Фиг.21. Действие TRA-8, 2Е12 и адриамицина у бестимусных "голых" мышей, несущих ксенотрансплантаты рака молочной железы. Клетки 2LMP (3×10⁷) s.c. инъецировали бестимусным "голым" мышам на день 0. Двум группам мышей i.p. инъецировали 200 мкг TRA-8 и 2Е12 в дни 7, 10, 14, 17, 21 и 24. Двум группам мышей вводили i.v. адриамицин (6 мг/кг) в дни 8, 12 и 16. Одной группе мышей антитело не вводили. Данные выражали как среднее изменение размера опухоли по отношению к размеру опухоли на день 7 (n=8 мышей/группу).

Подробное описание изобретения

Неспособность клеток к элиминации обусловлена нарушениями в апоптоз-индуцирующей системе, которая ассоциируется с некоторыми дефектами, включая, например, нарушение экспрессии или функции лиганда, рецептора или внутриклеточных регуляторных или эффекторных молекул. Настоящее изобретение относится к способу коррекции дефицитной апоптоз-индуцирующей системы, а также выявления конкретных дефектов, присущих данной дефицитной апоптоз-индуцирующей системе.

Настоящее изобретение относится к новому классу моноклональных антител, которые обладают селективной in vivo и in vitro апоптоз-индуцирующей активностью против специфических TRAIL-рецепторов, включая DR5, DR4, DcR1 и DcR2. Так, например, антитела настоящего изобретения специфически связываются с одним из TRAIL-рецепторов. Термин "селективное связывание" или "специфическое распознавание" означает, что данное антитело связывается только с одним TRAIL-рецептором и обнаруживает незначительное связывание или вообще не связывается с другими типами TRAIL-рецепторов в традиционном Вестерн-блот-анализе. Анти-DR5 антитело настоящего изобретения селективно связывается с DR5, а уровень его связывания с DR4, DcR1 или DcR2 не превышает фоновый уровень примерно более чем в 1,5 раза. Аналогичным образом анти-DR4 антитело настоящего изобретения селективно связывается с DR4, а уровень его связывания с DR5, DcR1 или DcR2 не превышает фоновый уровень примерно более чем в 1,5 раза. Антитело настоящего изобретения может быть использовано в качестве реагента для исследования передачи сигнала апоптоза, а также в качестве терапевтически эффективного средства против клеток, экспрессирующих TRAIL-рецепторы, включая, например, раковые клетки широкого класса, клетки, обнаруживающие нарушение регуляции системы апоптоза, активированные лимфоциты или другие активированные иммунные клетки (например, лимфоидные клетки и миелоидные клетки), вирус-инфицированные клетки и аномально пролиферирующиеся синовиальные клетки (например, синовиальные клетки ревматодного артрита, включая воспалительные синовиальные клетки, активированные лимфоидные и миелоидные клетки в синовильной жидкости, макрофаг-подобные синовиоциты и фибробласт-подобные синовиоциты), ассоциированные с аутоиммунными заболеваниями. Антитела настоящего изобретения специфически связываются с TRAIL-рецепторами конкретного типа независимо от степени гомологии между ними. Антитела настоящего изобретения направлены на апоптоз только тех клеток, которые экспрессируют нужный TRAIL-рецептор или, альтернативно, блокируют TRAIL-апоптоз клеток, экспрессирующих нужный рецептор.

Моноклональное антитело против DR5 или моноклональное антитело против DR4 настоящего изобретения служит сильным индуктором апоптоза клеток, экспрессирующих DR5 или DR4, соответственно, in vitro, и сильным индуктором апоптоза in vivo. Гуманизированные фрагментарные CDR-последовательности, привитые к каркасам гуманизированных антител, и гибридный белок анти-DR5 или анти-DR4 антител настоящего изобретения обладают аналогичными апоптотическими свойствами.

До настоящего времени не было получено моноклонального антитела, которое связывается с DR5 клеточной поверхности и которое, даже при низких концентрациях, индуцирует апоптоз клеток, экспрессирующих DR5 как in vitro, так и in vivo в отсутствие перекрестно-связывающего агента. Настоящее изобретение относится к анти-DR5 антителу, действующему как терапевтический агент при лечении различных заболеваний. Было показано, что хотя растворимый TRAIL эффективно индуцирует апоптоз опухолевых клеток in vivo, однако его цитолитическая активность является очень низкой, а поэтому часто оказывается необходимым вводить большие и повторные дозы (13). Настоящее изобретение относится к очищенному антителу, которое связывается с TRAIL-рецептором DR5, где указанное антитело, в его растворимой форме в низких концентрациях, обладает in vivo и in vitro апопотоз-индуцирующей активностью, направленной на клетки-мишени, экспрессирующие DR5. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное очищенное антитело связывается с TRAIL-рецептором DR5 в отсутствие перекрестно-связывающего антитела. Предпочтительно, чтобы данное антитело не индуцировало значительного апоптоза нормальных фибробластов. Предпочтительно, чтобы апопотоз-индуцирующая активность характеризовалась менее чем 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или любым промежуточным процентом жизнеспособности клеток-мишеней при концентрациях антител, составляющих примерно менее чем 0,1, 1, 5, 10 или 20 мкг/мл или любой промежуточной концентрации. Очищенное антитело специфически связывается с TRAIL-рецептором DR5 и не связывается с TRAIL-рецепторами DR4, DcR1 или DcR2 в традиционном Вестерн-блот-анализе. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным антителом является моноклональное антитело, а предпочтительно антитело, имеющее такую же специфичность к эпитопу, как и антитело TRA-8, продуцированное гибридомой "мышь-мышь", депонированной в АТСС под регистрационным номером РТА-1428.

Антитело TRA-8, которое является одним из серии анти-DR5 антител настоящего изобретения, является фармацевтически эффективным у животных, несущих трансген человеческого DR5, и может быть также использовано для создания модели в целях изучения роли DR5 и TRAIL.

В различных вариантах своего осуществления настоящее изобретение относится к антителам, индуцирующим апоптоз в присутствии или в отсутствие перекрестного связывания. Так, например, в предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело против DR5 (например, TRA-8) индуцирует апоптоз в отсутствие перекрестного связывания. Термин "перекрестное связывание" включает, например, перекрестное связывание со "вторым" антителом. В других вариантах своего осуществления настоящее изобретение относится к антителам, индуцирующим апоптоз в присутствии перекрестно-связывающих линкеров, включая, например, предпочтительный вариант антитела против DR4 (2Е12).

Таким образом, настоящее изобретение относится к очищенному антителу, которое специфически связывается с TRAIL-рецептором DR4, где указанное антитело в его растворимой форме обладает in vivo и in vitro апоптоз-идуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR4. В одном из вариантов изобретения указанным антителом является моноклональное антитело, имеющее такую же специфичность к эпитопу, как и гибридома 2Е12, депонированная в АТСС 24 октября 2001 г. под регистрационным номером РТА-3798 и имеющая название "гибридомный клон 2Е12 против человеческого DR4", присвоенное Фондом исследования UAB. Антитело 2Е12, одно из серии антител DR4 настоящего изобретения, обладает фармацевтической активностью, направленной на снижение размеров опухоли по сравнению с размерами опухоли у животных группы необработанного контроля или по сравнению с размерами опухоли до обработки in vivo у животных с раковыми клетками, экспрессирующими DR4.

Антитела против DR5 являются эффективными в растворимой форме при низких дозах, где термин "низкие дозы" означает дозы или концентрации, составляющие примерно менее чем 0,01-1 мкг/мл in vitro и примерно менее чем 1-10 мкг/кг in vivo. Предпочтительным отличительным признаком антител настоящего изобретения является то, что они селективно индуцируют апоптоз клеток, экспрессирующих рецептор DR5, но при этом не индуцируют апоптоз нормальных, неактивированных, нетрансформированных гепатоцитов, фиброцитов, синовиоцитов и т.п. Антитело настоящего изобретения, направленное против TRAIL-рецептора, получают в соответствии с настоящим изобретением от экспериментального животного, но оно может быть получено любыми методами продуцирования или синтеза антител, известными специалистам. Благодаря "гуманизации" антитела настоящего изобретения, при которой сохраняется активность связывания с рецептором и в то же время вырабатывается ослабленный и терапевтически толерантный иммунный ответ в организме человека, такое гуманизированное антитело против TRAIL-рецептора настоящего изобретения используется в качестве терапевтического агониста или антагониста для данного TRAIL-рецептора. Антитело настоящего изобретения может действовать как терапевтический агент in vivo, поскольку в данном случае нет необходимости в обязательном присутствии "второго" перекрестно-связывающего антитела против TRAIL-рецептора.

Настоящее изобретение не ограничивается лишь одним антителом против TRAIL-рецептора, обладающим агонистическим или антагонистическим апоптотическим действием. Наоборот, два или более антител против TRAIL-рецептора контактируют с клеточной культурой in vitro или с тканью организма индивидуума in vivo и обеспечивают усиленное терапевтического действие. Термин "усиленное терапевтическое действие" означает любой дополнительный синергический или потенцирующий эффект. Так, например, клеточная линия глиомы U87 и гемопоэтические клеточные линии U937 и Molt-4 чувствительны к синергическому действию агонистических анти-DR4 и анти-DR5 антител, тогда как их обработка только агонистическим анти-DR5 антителом дает лишь ограниченный эффект в индуцировании апоптоза.

Кроме того, антагонистические антитела против TRAIL-рецептора настоящего изобретения особенно эффективны в том случае, когда это антитело специфически связывается с одним из рецепторов-ловушек DcR1, DcR2 или OPG. Селективное блокирование рецептора-ловушки антителом настоящего изобретения эффективно в клетках таких типов, которые экспрессируют рецепторы-ловушки со сдвигом равновесия TRAIL-связывания в сторону тех TRAIL-рецепторов, которые способны передавать сигнал апоптоза клеток. Таким образом, в другой комбинированной терапии настоящего изобретения антитело, связывающееся с рецептором-ловушкой, сенсибилизирует экспрессирующую клетку в отношении агонистического связывания с TRAIL-рецептором, передающим сигнал апоптоза.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу выявления агонистических и антагонистических эпитопов данного TRAIL-рецептора. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением с использованием панели моноклональных антител, каждое из которых имеет отличающуюся вариабельную или CDR-область, может быть выявлен полиморфизм между индивидуумами, ассоциированный с данным TRAIL-рецептором. Охарактеризованная панель моноклональных антител позволяет определить агонистические и антиагонистические эпитопы и полиморфизм. Таким образом, панель моноклональных антител настоящего изобретения может быть использована для получения лекарственного средства и/или для выявления индивидуума с предрасположенностью к заболеванию.

В другом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к гибридным белкам, включающим антигенный фрагмент TRAIL-рецептора, связанный с белком иммуноглобулина, его полипептидом или фрагментом. "Фрагмент TRAIL-рецептора" означает фрагмент, содержащий достаточное число оснований для вырабатывания иммуногенного ответа к нативному TRAIL-рецептору, экспрессируемому на поверхности клеток индивидуума. Фрагмент гибридного TRAIL-рецептора включает, по крайней мере, десять аминокислот. "Гибридный белок иммуноглобулина или его фрагмента" означает нативный или синтетический сегмент белка или полипептида, имеющий определенное число аминокислотных оснований, достаточное для активации каскада реакций иммуногенного ответа у индивидуума. Иммуноген настоящего изобретения, включающий гибрид фрагмента TRAIL-рецептора, связанного с иммуноглобулиновым фрагментом, может быть использован в качестве in vivo-терапевтического средства для вырабатывания антитела против TRAIL-рецептора in situ у индивидуума.

В еще одном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к генной терапии. Настоящее изобретение также относится к способу селективного индуцирования апоптоза в клетках-мишенях, включающему стадии трансфекции указанных клеток-мишеней вектором, содержащим экспрессируемую последовательность нуклеиновой кислоты для TRAIL-рецептора; экспрессии на указанных клетках TRAIL-рецептора, кодируемого указанной последовательностью нуклеиновой кислоты для TRAIL-рецептора; и контактирования указанных клеток с апоптоз-индуцирующим антителом, селективным в отношении связывания с указанным TRAIL-рецептором. В генотерапии, как аспекте настоящего изобретения, клетки-мишени трансфецируют вектором, несущим экспрессируемую последовательность, соответствующую TRAIL-рецептору, при этом используется стандартный вектор, который выбирают, исходя из чувствительности клеток-мишеней к данному вектору. В качестве векторов для генотерапии обычно используют аденовирус, pAdCMV5. После экспрессии трансфецированного TRAIL-рецептора клетками-мишенями или тканями эти клетки или ткани обрабатывают антителом настоящего изобретения, специфичным к связыванию с указанным трансфецированным TRAIL-рецептором. Следует отметить, что антитело против TRAIL-рецептора является либо агонистом, либо антагонистом в зависимости от нужного терапевтического результата.

Антитела настоящего изобретения могут также действовать в сочетании с сенсибилизатором. Используемый здесь термин "сенсибилизатор" означает любой стимулятор, который индуцирует апоптоз, включая ультрафиолетовый свет, органические молекулы, включая конкретный класс бисиндолмалеимидов, тяжелые металлы и молекулы свободных радикалов.

Что касается терапии рака, то антитело TRA-8 способно индуцировать апоптоз большинства TRAIL-чувствительных опухолевых клеток каспазо-зависимым способом в отсутствие "второго" перекрестно-связывающего антитела. TRA-8 или 2Е12, взятые отдельно или в комбинации с другими антителами, обладают сильной опухолецидной активностью in vivo. Способность TRA-8 или 2Е12 индуцировать апоптоз большинства TRAIL-чувствительных клеток подтверждает то, что для стимуляции апоптоза достаточно либо одного DR5, либо одного DR4. Большинство подробно описанных здесь опухолевых клеток экспрессируют DR5 на своей поверхности, и их чувствительность к TRA-8-индуцированной клеточной гибели коррелирует с их чувствительностью к TRAIL, что указывает на то, что DR5 является главным рецептором гибели для TRAIL-опосредованного апоптоза у большинства опухолевых клеток. Аналогичные результаты были получены с использованием антител, специфичных для DR4 (например, 2Е12). Таким образом, дифференциальная экспрессия DR5 или DR4 нормальными и раковыми клетками является важным фактором для селективности TRAIL-опосредованного апоптоза. TRA-8 "обходит" рецепторы-ловушки, индуцирующие TRAIL-опосредованный апоптоз. Лишь незначительное количество TRAIL-резистентных опухолевых клеток являются чувствительными к TRA-8, однако это свидетельствует о том, что указанные рецепторы-ловушки, очевидно, не играют главной роли в резистентности опухолевых клеток к TRAIL-опосредованному апоптозу.

Хотя предварительные исследования показали, что системное введение животным растворимой формы TRAIL индуцирует регрессию опухоли, не оказывая при этом токсического действия^{3, 4, 22}, однако мембрано-ассоциированная форма человеческого TRAIL вызывает поражение печени у мышей, как будет показано в настоящем описании. Однако токсичность TRAIL для печени является гораздо менее сильной, чем токсичность Fas-лиганда, на что указывали меньшая чувствительность нормальных гепатоцитов к TRAIL-индуцированному поражению печени по сравнению с поражением, индуцируемым лигандом Fas, и отсутствие летального воздействия TRAIL in vivo. Таким образом, титрование TRAIL может быть использовано в противораковой терапии.

В настоящем описании детально показано отсутствие значительных уровней экспрессии белка DR5 нормальными гепатоцитами, и такое отсутствие ассоциируется с резистентностью гепатоцитов к TRA-8-индуцированному апоптозу. Перекрестного связывания DR5 с моноклональным антителом недостаточно для образования гомополимерных форм рецептора гибели, способного стимулировать апоптоз. Эксперименты на обезьянах-игрунках не обнаружили токсического воздействия антитела TRA-8 на печень при его введении. Таким образом, в качестве терапевтического агента моноклональное анти-DR5 антитело-агонист, вероятно, является более селективным и более безопасным, чем растворимый TRAIL. Аналогичным образом, DR4 экспрессируется трансформированными или активированными клетками и не экспрессируется в обнаружимых количествах, или оно экспрессируется лишь в очень небольших количествах нормальными клетками, например фибробластами. DR4 настоящего изобретения индуцирует апоптоз некоторых клеток-мишеней, но при этом не индуцирует заметной клеточной гибели в клетках, не являющихся мишенями, таких как фибробласты и т.п. Используемый здесь термин "отсутствие эффекта или отсутствие обнаружимого или значимого эффекта" означает и включает полное отсутствие эффекта или эффект, уровень которого меньше фонового или контрольного уровней или равен указанным уровням и не превышает фоновый или контрольный уровни более чем в 1,5 раза.

Настоящее изобретение может быть с успехом использовано в скринирующем анализе или в способе визуализации для детекции небольших скоплений DR4- или DR5-клеток, которые еще могут иметь нормальную клеточную морфологию. Так, например, окрашивание in situ клеточных срезов раковых опухолей человека, включая рак легких, предстательной железы и печени, меченными антителами настоящего изобретения позволяет легко идентифицировать раковые клетки. Антитела настоящего изобретения могут быть также использованы для скрининга других патологических манифестаций, включая, например, различные воспалительные и аутоиммунные заболевания, подобные ревматоидному артриту. Такой скрининг может быть даже использован до начала проявления других клинических симптомов и может быть использован в целях выявления индивидуумов с риском развития у них данного заболевания для того, чтобы можно было начать профилактическое лечение до проявления других признаков или симптомов. В частности, наблюдалось, что раковые клетки экспрессируют очень высокие уровни DR5 по сравнению с нормальными клетками того же типа. Таким образом, настоящее изобретение может быть использовано в качестве чувствительного метода скрининга для обнаружения злокачественных опухолей на ранней стадии их развития в тканях, включая, по крайней мере, ткани легких, предстательной железы, толстой кишки, крови, шейки матки, молочной железы и печени. Терапевтический способ, подробно описанный в настоящей заявке, направлен на ингибирование пролиферации аномальных клеток, ассоциированной с такими заболеваниями, как, например, злокачественные раковые опухоли, лимфолейкоз и т.п.

Подробно описанное здесь изобретение, в частности, относится к моноклональному антителу против человеческого DR5, обозначенному TRA-8 и депонированному в АТСС под регистрационным номером РТА-1428. Следует отметить, что подробно описанные здесь способы и результаты, относящиеся к агонистическому моноклональному антителу против человеческого DR5, TRA-8, в целом, могут иметь отношение и применение к анти-DR5 антителам-антагонистам, а также к антителам, вырабатываемым против DR4, DcR1 и DcR2 и действующим как агонисты, так и антагонисты. Таким образом, настоящее изобретение относится к апопотоз-индуцирующему антителу, специфичному к человеческому DR4. В одном из вариантов осуществления изобретения указанное антитело имеет такую же специфичность к эпитопу, как и гибридома 2Е12, депонированная в Американской коллекции типовых культур (Rockville, Md), 24 октября 2001 г. под регистрационным номером, присвоенным Фондом исследования UAB. Этот депонированный материал описан как "гибридомный клон 2Е12 против человеческого DR4", где указанный клон обозначен 2Е12, а противопоставляемым документом является РСТ/US01/14151. Уровни экспрессии рецептора апоптоза, такого как Fas, необязательно должны коррелировать с чувствительностью клеток к апоптозу. Предполагается, что в случае TRAIL-опосредованного апоптоза экспрессия рецепторов-ловушек для TRAIL влияет на чувствительность этих клеток. Кроме того, было высказано предположение, что DR5 должен быть ассоциирован с DR4 для эффективной передачи сигнала апоптоза по пути, в котором участвует FADD и каспаза 8. Присутствие моноклонального анти-DR5 антитела-агониста позволяет оценить регуляцию передачи сигнала DR5 и его относительную роль в TRAIL-опосредованном апоптозе. Сравнение чувствительности этих клеток к TRA-8-опосредованному апоптозу с их чувствительностью к TRAIL-опосредованному апоптозу позволяет выявить роль DR5 в TRAIL-опосредованном апоптозе и механизмы, которые могут влиять на чувствительность клеток. Аналогичными преимуществами обладает и антитело против DR4.

Указанным преимуществом обладают в основном гуманизированные антитела против DR5 и DR4 настоящего изобретения. Молекулярный клон антитела против DR5, например, получают известными методами, подробно описанными в нижеследующих примерах. Для конструирования последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих молекулу моноклонального антитела или его антигенсвязывающую область, используется описанная здесь техника рекомбинантных ДНК (33).

Настоящее изобретение позволяет конструировать гуманизированные антитела против TRAIL-рецептора, которые, по всей вероятности, не индуцируют ответ путем вырабатывания человеческого антимышиного антитела (называемого далее "НАМА") (34), но которые при этом обладают эффективной эффекторной функцией антитела. Полностью человеческие антитела могут быть также получены путем иммунизации мышей, способных вырабатывать полностью человеческое антитело (например, мышей, генетически модифицированных так, чтобы они продуцировали человеческие антитела), с последующим скринингом клонов, которые связываются с DR5 или DR4, индуцируют апоптоз и конкурируют за связывание с эпитопом TRA-8 или 2Е12. Описание способов продуцирования полностью человеческих антител см., например, в работе Lonberg and Huszar (1995), Human antibodies from transgenic mice, Int. Rev. Immunol. 13:65-93, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Термины "человеческое" и "гуманизированное", используемые в настоящем описании по отношению к антителам, относятся к любому антителу, которое, как предполагается, продуцирует слабый терапевтически допустимый иммуногенный ответ у человека.

Настоящее изобретение относится к анти-DR5 антителу, к гуманизированному анти-DR5 антителу, к тяжелой и легкой цепям иммуноглобулинов TRA-8 и к тяжелой и легкой цепям гуманизированных иммуноглобулинов. Настоящее изобретение также относится а анти-DR4 антителу, к гуманизированному анти-DR4 антителу, к иммуноглобулиновой тяжелой и легкой цепям анти-DR4 антитела и к тяжелой и легкой цепям гуманизированных иммуноглобулинов; к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела и их тяжелые и легкие цепи; к векторам, содержащим эти нуклеиновые кислоты; и к клеткам, содержащим указанные векторы. Некоторые усеченные варианты этих белков или генов осуществляют регуляторные или ферментные функции белка или гена с полноразмерной последовательностью. Так, например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие указанные белки, могут быть модифицированы путем замен, добавлений, делеций или мультимерной экспрессии, которая обеспечивает функциональную эквивалентность белков или генов. Вследствие вырожденности кодирующих последовательностей нуклеиновой кислоты для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы и другие последовательности, которые кодируют аминокислотные последовательности, в основном аналогичные аминокислотным последовательностям природных белков. Такими последовательностями являются, но не ограничиваются ими, последовательности нуклеиновой кислоты, включая всю последовательность нуклеиновой кислоты или ее части, кодирующие вышеуказанные полипептиды, которые являются модифицированными вследствие замены различных кодонов, кодирующих функционально эквивалентный аминокислотный остаток в данной последовательности, в результате чего продуцируется молчащая мутация. Следует отметить, что нуклеотидная последовательность иммуноглобулина настоящего изобретения допускает изменение гомологии последовательности вплоть до 25%, как было вычислено стандартными методами ("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.), при условии, что такой вариант образует функциональное антитело, которое распознает TRAIL-рецептор DR5. Так, например, один или несколько аминокислотных остатков в полипептидной последовательности могут быть заменены другой аминокислотой с аналогичной полярностью, которая действует как функциональный эквивалент, что приводит к молчащей альтерации. Аминокислоты для замены в данной последовательности могут быть выбраны из других членов класса, к которому принадлежит данная аминокислота (то есть для консервативной замены). Так, например, неполярными (гидрофобными) аминокислотами являются аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярными нейтральными аминокислотами являются глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженными (основными) аминокислотами являются аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженными (кислотными) аминокислотами являются аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. В объем настоящего изобретения также входят белки или их фрагменты или производные, которые дифференциально модифицируются во время или после трансляции, например, путем гликозилирования, протеолитического расщепления, связывания с молекулой антитела или с другими клеточными лигандами и т.п. Кроме того, рекомбинантный вектор, содержащий последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела настоящего изобретения, могут быть сконструированы так, чтобы это приводило к модификации процессинга или экспрессии вектора. В последовательности нуклеиновой кислоты или в аминокислотной последовательности могут быть сделаны и другие модификации, которые не снижают или существенно не снижают апоптической активности данного антитела. Такие модификации могут быть сделаны в CDR или в области, не являющейся CDR, с использованием стандартной техники. Описание мутагенеза методом "прогулки" по CDR можно найти, например, в работе Yang et al. (1995), J. Mol. Biol. 254:392-403, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание.

Кроме того, для облегчения последующей in vitro-модификации последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ингибитор, может быть мутирована in vitro или in vivo для создания и/или разрушения последовательностей трансляции, инициации и/или терминации, или для создания модификаций в кодирующих областях и/или образования новых сайтов рестриктирующих эндонуклеаз, или для разрушения уже имеющихся сайтов. Для этого могут быть использованы любые методы мутагенеза, известные специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, сайт-направленный мутагенез in vitro, J. Biol. Chem. 253:6551, использование линкеров Tab (Pharmacia) и т.п.

Данные рентгеновского кристаллографического анализа показали, что укладка цепи иммуноглобулина обычно образует длинную цилиндрическую структуру, включающую два слоя антипараллельных β-складчатых листов, каждый из которых состоит из трех или четырех β-цепей. В вариабельной области три петли от каждого из V-доменов кластера Н- и L-цепей вместе образуют антигенсвязывающий центр. Каждая из этих петель завершается гипервариабельной областью (CDR - определяющей комплементарность областью). CDR имеют наиболее высокую степень вариабельности в аминокислотной последовательности антитела. Участки вариабельной области, которые не являются частью CDR, называются "каркасными участками" ("FR"-участки) и обычно играют определенную роль в сохранении структуры CDR. В целях сохранения связывающей области для эпитопного участка TRAIL-рецептора предпочтительно, чтобы все CDR данного антитела были привиты к антителу-акцептору. Следует отметить, что в настоящем изобретении часть от общего количества CDR переносят донору. Следует также отметить, что такой перенос в основном позволяет осуществлять замену одного остатка на другой, одной аминокислоты или аминокислотной области на другую. Однако иногда, а особенно при переносе определенной области, один или несколько остатков могут быть добавлены, делетированы или заменены другим остатком, если это необходимо, и такие делеции и инсерции, а также соответствующие замены и инверсии являются очевидными для каждого специалиста.

Антитело настоящего изобретения получают, например, путем встраивания каждой CDR-области субъединицы L-цепи и Н-цепи моноклонального антитела против TRAIL-рецептора в соответствующую CDR-область человеческого антитела, что приводит к "гуманизации" мышиного моноклонального антитела, эффективно действующего против TRAIL-рецептора.

В настоящем изобретении также генерируют и используют фрагменты антитела, которые содержат молекулу определенного идиотипа, с применением известной техники. Такими фрагментами являются, например: (АВ')₂-фрагмент антитела против TRAIL-рецептора, который может быть продуцирован путем гидролиза молекулы антитела пепсином; АВ'-фрагменты антитела против TRAIL-рецептора, генерированные путем восстановления дисульфидных мостиков (АВ')₂-фрагмента антитела против TRAIL-рецептора; и фрагмент антитела, который генерируют путем обработки указанной молекулы антитела папаином и восстановителем.

Антитела настоящего изобретения могут быть получены различными методами, известными специалистам. Так, например, моноклональное антитело TRA-8 против DR5 может быть получено путем культивирования гибридомы, которая в свою очередь может быть получена путем иммунизации мыши человеческим DR5 с последующим слиянием клеток селезенки или клеток лимфоузлов, взятых у мыши, с клетками мышиной миеломы.

Получение моноклонального антитела включает, например, следующие стадии:

а) очистки биологической макромолекулы для ее использования в качестве антигена;

b) получения антитело-продуцирующих клеток после первой иммунизации животного путем инъекции ему антигена с последующим взятием крови у этого животного и анализом на титр антитела, проводимом для того, чтобы определить, когда нужно удалять селезенку;

с) получения миеломных клеток;

d) слияния антитело-продуцирующих клеток с миеломными клетками;

е) отбора гибридомы, продуцирующей нужное антитело;

f) получения клона одиночных клеток (клонирования);

g) необязательно, культивирования гибридомных клеток или выращивания животных, которым были трансплантированы такие гибридомные клетки, для крупномасштабного продуцирования моноклонального антитела; и

h) тестирования полученного таким образом моноклонального антитела на биологическую активность и специфичность либо проведения анализа на свойства агента-маркера.

Процедура получения моноклонального антитела более подробно описана ниже в соответствии с каждой из вышеуказанных стадий. Этот способ получения антитела настоящего изобретения приводится лишь для иллюстрации способов получения антитела и не является ограничивающим. При этом могут быть использованы и другие известные процедуры или описанный ниже модифицированный способ, где, например, вместо клеток селезенки и миеломы используются антитело-продуцирующие клетки.

(а) Получение антигена

Рекомбинантный белок (называемый далее "рекомбинантным человеческим DR5" или "рекомбинантным человеческим DR4"), который является эффективным в качестве антигена, получают путем трансфекции клеток QBI-293А экспрессирующим вектором pAdDR5-IgG для гибридного белка, содержащего внеклеточный домен человеческого DR5 или DR4 и Fc-область человеческого антитела IgG1 (далее обозначаемого "IgG") (см. РТА-1428), в целях его экспрессии с использованием набора ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canada) с последующим сбором и частичной очисткой продукта экспрессии. Плазмиду pAdDR5-IgG конструируют путем инсерции ДНК, кодирующей гибридный белок, содержащий человеческий DR5 или DR4 и человеческий IgG, в плазмиду pAdСМV5, которая является экспрессионным вектором для клеток животных. В настоящем изобретении могут быть использованы и другие материалы, такие как ДНК, кодирующая DR5 или DR4, вектор и клетка-хозяин.

Гибридный белок "DR5 или DR4 и IgG человека", продуцированный в супернатанте культуры клеток QBI-293А, трансфецированных вектором pAdDR5-IgG, может быть частично очищен аффинной хроматографией на комплексе "белок А-сефароза", аффинной хроматографией на комплексе "белок G-сефароза" или ионообменной хроматографией на колонке с Resource Q (торговый знак: Pharmacia).

Альтернативно, очищенный DR5 или DR4, полученный из мембран человеческой клеточной линии, используется в качестве антигена. Кроме того, поскольку первичные структуры DR4 и DR5 являются известными (см., РТА-1428), то пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, может быть химически синтезирован известным методом, таким как метод Сэнгера, и использован в качестве антигена.

(b) Получение антитело-продуцирующих клеток

Мышь иммунизируют иммуногеном, продуцированным в стадии (а) и смешанным с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда или квасцы. Другими подходящими экспериментальными животными являются, например, крысы, морские свинки, кролики, собаки, куры, лошади, свиньи, коровы и овцы.

Подходящими способами введения иммуногена для иммунизации экспериментального животного являются подкожная, внутрибрюшинная, внутривенная, чрескожная и внутримышечная инъекции, при этом предпочтительной является подкожная и внутрибрюшинная инъекции.

Иммунизация может быть проведена путем введения разовой дозы или нескольких многократных доз через соответствующие интервалы времени (предпочтительно 1-5 недель). Затем проводят мониторинг иммунизированных животных на титр антитела в их сыворотке и животное с достаточно высоким титром антител отбирают в качестве источника антитело-продуцирующих клеток. Отбор животного с высоким титром антител делает последующий процесс более эффективным. Клетки для последующего слияния обычно собирают от животного через 3-5 дней после последней иммунизации.

Методы анализа на титр антител представляют собой хорошо известную технику, такую как радиоиммуноанализ (далее обозначаемый "RIA"), твердофазный иммуноферментный анализ (далее обозначаемый "ELISA"), флуоресцентный анализ с использованием антитела и анализ на пассивную гемагглютинацию, при этом предпочтительными являются RIA и ELISA благодаря их детектирующей чувствительности, быстроте, точности и возможности автоматизации.

Определение титра антител может быть осуществлено, например, с помощью ELISA следующим образом. Сначала очищенный или частично очищенный DR5 или DR4 адсорбируют на твердофазной поверхности, такой как 96-луночный ELISA-планшет, а затем остальную поверхность, с которой DR5 или DR4 не связываются, блокируют белком, не являющимся родственным данному антигену, таким как альбумин бычьей сыворотки (BSA). После промывки для осуществления связывания антитела против DR5 или DR4 в образцах с антигеном поверхность лунок подвергают контакту с серийно разведенными образцами мышиной сыворотки. Для связывания с мышиным антителом добавляют меченное ферментом антимышиное антитело в качестве "второго" антитела. После промывки добавляют субстрат для фермента и титр антитела оценивают путем определения изменения оптической плотности по развитию окраски, вызываемому изменением субстрата или т.п.

(с) Получение миеломных клеток

В качестве источника миеломных клеток служат клетки, полученные от клеточных линий мышей, включая, например, резистентную к 8-азагуанину мышь, происходящую от миеломных штаммов BALB/c, Р3Х63Аg8U.1 (P3-U1) (35), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1) (36), Sp2/0-Ag14 (SP-2) (37), Р3Х63Аg8.653 (653) (38) и Р3Х63Аg8 (X63) (39). Выбранную клеточную линию серийно переносят в соответствующую среду, такую как 8-азагуаниновая среда. 8-азагуаниновая среда включает среду Дульбекко, модифицированную по способу Искова (обозначаемую далее "IMDM") или модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (обозначаемую далее "DMEM"). В среду RPMI-1640 были добавлены глутамин, 2-меркаптоэтанол, гентамицин, фетальная телячья сыворотка (далее обозначаемая "FCS") и 8-азагуанин. А затем, за 3-4 дня до слияния, для обеспечения в день слияния плотности, по крайней мере, 2×10⁷ клеток эти клетки переносят в нормальную среду, такую как среда ASF104 (Ajinomoto, К.К.), содержащая 10% FCS.

(d) Слияние клеток

Для продуцирования антитела в качестве клеток-предшественников используют лимфоциты или клетки плазмы, полученные из любой подходящей части организма животного. Такими источниками лимфоцитов или клеток плазмы являются, например, селезенка, лимфатические узлы, периферическая кровь или любая их подходящая комбинация, при этом чаще всего используют клетки селезенки.

После последней бустер-инъекции для получения антитело-продуцирующих клеток у мыши, имеющей предварительно определенный титр антител, удаляют ткань, в которой присутствуют антитело-продуцирующие клетки. В современной предпочтительной технике слияния клеток селезенки с клетками миеломы, полученными, как описано в стадии (с), используют полиэтиленгликоль.

Указанная техника слияния предусматривает промывку клеток селезенки и миеломы бессывороточной средой (такой как RPMI-1640) или забуференным фосфатом физиологическим раствором (обозначаемым далее "PBS") и их смешивание, так, чтобы отношение клеток селезенки к клеткам миеломы составляло приблизительно между 5:1 и 10:1, после чего клетки центрифугируют. Затем супернатант отбрасывают и осажденные клетки в достаточной степени разрыхляют, после чего, перемешивая, по каплям добавляют 1 мл бессывороточной среды, содержащей 50% (мас./об.) полиэтиленгликоля (Mw 1000-4000). Затем медленно добавляют 10 мл бессывороточной среды, после чего смесь центрифугируют. Супернатант снова отбрасывают, а осажденные клетки суспендируют в соответствующем количестве среды НАТ, содержащей раствор гипоксантина, аминоптерина и тимидина (обозначаемый далее "НАТ") и мышиный интерлейкин-2 (обозначаемый далее "IL-2"). Затем суспензию распределяют по лункам планшетов для культивирования (называемых далее просто "планшетами") и инкубируют в присутствии 5% об./об. СО₂ при 37°С примерно в течение 2 недель, с добавлением, если необходимо, среды НАТ.

(е) Отбор гибридом

Если используемый штамм миеломы является резистентным к 8-азагуанину, то есть если он является дефицитным по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе (HGPRT), то любые неслитые миеломные клетки и любые гибриды миелома-миелома неспособны выживать в среде НАТ. С другой стороны, гибриды антитело-образующих клеток, образуемых друг с другом, а также гибридомы, образованные антитело-продуцирующими клетками и миеломными клетками, могут выживать в этой среде, причем первые имеют лишь ограниченное время жизни. В соответствии с этим продолжительное инкубирование в среде НАТ приводит к отбору лишь нужных гибридом.

Затем полученные гибридомы выращивают до образования колоний, которые затем переносят в среду НАТ, не содержащую аминоптерина (среду НТ). Затем берут аликвоты супернатанта культуры для определения титра антитела против Fas, например, с помощью ELISA. Если в качестве ELISA-антигена используют вышеуказанный рекомбинантный гибридный белок, то необходимо также удалить клоны, продуцирующие антитело, которое специфически связывается с Fc-областью IgG1 человека. Присутствие или отсутствие такого клона может быть проверено, например, с помощью ELISA с использованием Fas-IgG1 или IgG1 в качестве антигена.

(f) Клонирование

Затем гибридомы, которые продуцируют специфические антитела, как было показано с использованием метода, аналогичного описанному в стадии (b) методу определения титра антитела, переносят на другой планшет для клонирования. Подходящими методами клонирования являются метод лимитирующих разведений, в котором гибридомы разводят так, чтобы на одну лунку планшета приходилась одна клетка, а затем культивируют; метод с использованием мягкого агара, в котором колонии выделяют после культивирования в среде с мягким агаром; метод с использованием микроманипулятора для выделения одиночной клетки для культивирования; и "сортировка клона", в котором одиночные клетки разделяют на клеточном сортере.

Процедуру клонирования, осуществляемую, например, методом лимитирующих разведений, повторяют 2-4 раза для каждой лунки, обнаруживающей определенный титр антител; и клоны, имеющие стабильные титры антител, отбирают в качестве гибридом, продуцирующих моноклональное антитело против DR5. Гибридомы, продуцирующие антитело против мышиного DR5, отбирают аналогичным способом для получения клеточной линии, продуцирующей моноклональное антитело против DR5.

Гибридома "мышь-мышь" TRA-8, на основе которой получают антитела настоящего изобретения, была депонирована 1 марта 2000 г. в Американской коллекции типовых культур под регистрационным номером РТА-1428. Гибридома 2Е12 была депонирована 24 октября 2001 г. в Американской коллекции типовых культур под регистрационным номером АТСС № РТА-3798, как описано выше. В соответствии с этим получение антитела с использованием гибридомы "мышь-мышь" TRA-8 или любой другой полученной гибридомы может быть достигнуто в соответствии с процедурой, описанной ниже в стадии (g), без осуществления стадий (а)-(f).

(g) Культивирование гибридомы для получения моноклонального антитела

Затем гибридому, полученную путем клонирования, культивировали не в среде НТ, а в нормальной среде. Крупномасштабное культивирование осуществляют в культуральных роллер-флаконах с использованием либо культуральных флаконов больших размеров, либо спин-культуры. Затем супернатант от крупномасштабной культуры собирают и очищают подходящим методом, таким как гель-фильтрация, хорошо известным специалистам, в целях получения моноклонального антитела против DR5 или DR4, которое было взято за основу для получения антител настоящего изобретения. Гибридома может быть также выращена внутрибрюшинно в сингенной мыши, такой как мышь BALB/c или "голая" (то есть бестимусная) мышь, для получения асцитной жидкости, содержащей моноклональное антитело против DR5 или DR4 в больших количествах. Для очистки собранных антител обычно используются имеющиеся в продаже готовые наборы для очистки моноклональных антител (например, MAbTrap GII Kit; Pharmacia).

Моноклональные антитела, полученные как описано выше, обладают высокой специфичностью по отношению к человеческому DR5 или DR4 соответственно.

(h) Анализ моноклонального антитела

Подходящими методами идентификации изотипа и подкласса моноклонального антитела являются метод Ухтерлони, ELISA и РИА. Для идентификации предпочтительно использовать коммерческий набор, такой как Mouse Typer Kit (торговый знак; BioRad).

Количественная оценка белка может быть осуществлена методом Folin-Lowry или путем вычисления, исходя из оптической плотности при 280 нм (1,4 (OD₂₈₀)=1 мг/мл иммуноглобулина).

Идентификация эпитопа, распознаваемого моноклональным антителом, может быть осуществлена следующим образом. Сначала получают различные неполные структуры молекулы, распознаваемые моноклональным антителом. Эти неполные структуры получают методом, в котором различные отдельные пептиды данной молекулы получают синтетически известными методами олигопептидного синтеза или методом, в котором ДНК, кодирующую нужный полипептидный фрагмент, встраивают в подходящую экспрессирующую плазмиду и экспрессируют в подходящем хозяине, таком как E.coli, с получением пептидов. Обычно для осуществления вышеуказанной цели оба эти метода часто используются в комбинации друг с другом. Так, например, серии полипептидов, имеющих соответственно меньшие длины, и "функционирующих" от С- или N-концов антигенного белка, могут быть получены стандартными методами генной инженерии. Путем установления, какие именно из фрагментов реагируют с антителом, может быть получено приблизительное представление о локализации эпитопа.

Этот эпитоп может быть более точно идентифицирован путем синтеза ряда более мелких олигопептидов, соответствующих данному пептиду или мутантам этого пептида, с использованием стандартных методов олигопептидного синтеза для определения способности связывания указанных пептидов с моноклональным антителом против DR5, например, которое было взято за основу для получения антитела настоящего изобретения, и для оценки конкурентного ингибирования связывания данного пептида, по отношению к антигену, с моноклональным антителом. Для получения широкого ряда олигопептидов могут быть использованы коммерчески доступные наборы, такие как SPOTs Kit (Genosys Biotechnologies, Inc.), и серии наборов для синтеза пептида мультипина, основанного на методе синтеза мультипина (Chiron Corp.).

Антитело настоящего изобретения имеет различные функциональные свойства (а)-(f), описанные ниже, каждое из которых может быть подтверждено, например, методом, описанным ниже.

(а) Специфическое связывание TRA-8 с клетками, экспрессирующими DR5 человека

Отличительным признаком антитела настоящего изобретения является способность связываться с DR5 клеточной поверхности. Это было продемонстрировано в анализе клеток, экспрессирующих DR5, методом проточной цитометрии. Во-первых, специфическое связывание антитела с DR5 клеточной поверхности было подтверждено на клетках Cos-7, трансфецированных полноразмерной кДНК, кодирующей DR5 человека. В частности, TRA-8 распознает лишь клетки Cos-7, трансфецированные рецептором DR5, но не пустым контрольным вектором или вектором, кодирующим DR4. Во-вторых, были протестированы три различных источника: гемопоэтические клетки, клетки глиомы и злокачественные опухолевые клетки рака предстательной железы человека. Большинство из указанных трансформированных опухолевых клеток экспрессировали значительные уровни DR5 клеточной поверхности, хотя эти уровни экспрессии значительно варьировались. В-третьих, были оценены две панели первичных синовиальных клеток фибробластов человека, взятых у пациентов с РА и ОА. Все синовиальные клетки РА экспрессировали значительно более высокие уровни DR5, чем клетки ОА.

(b) Индуцирование апоптоза злокачественных опухолевых клеток человека in vitro в отсутствие перекрестного связывания

Способность антител, продуцированных в соответствии с настоящим изобретением, распознавать TRAIL-рецептор и непосредственно индуцировать апоптоз злокачественных клеток опухолей человека определяли с помощью анализа на жизнеспособность клеток (ATPLite) в процессе in vitro-культивирования клеток с различными концентрациями антитела, а в частности TRA-8. Большинство опухолевых клеток чувствительны к TRA-8-индуцированному апоптозу. Для некоторых клеток TRA-8 обнаруживает сильную апоптоз-индуцирующую активность, так, например, TRA-8 обладает способностью индуцировать апоптоз человеческих клеток Jurkat на пг/мл-уровнях. Важно отметить, что TRA-8-индуцированный апоптоз не требует перекрестного связывания, а у большинства клеток TRA-8 обнаруживает более сильную апопотоз-индуцирующую активность, чем рекомбинантный растворимый TRAIL в присутствии энхансера.

(с) Опухолецидная активность TRA-8 in vivo

Опухолецидную активность TRA-8 оценивали для двух SCID-моделей с опухолевыми клетками человека. Сначала мышей SCID внутривенно инокулировали клетками человеческого лейкоза Jurkat и обрабатывали одной дозой (100 мкг) TRA-8. Результаты показали, что при обработке TRA-8 большинство имплантированных клеток Jurkat были элиминированы из периферической крови и селезенки, как было определено с помощью проточного цитометрического анализа и иммуногистохимического окрашивания in situ клеток Jurkat. Затем мышам SCID подкожно инокулировали клетки астроцитомы человека, 1321N1, и мышей, несущих опухоль, обрабатывали одной дозой TRA-8. Рост имплантированных клеток 1321N1 значительно ингибировался у TRA-8-обработанных мышей, как было определено по размеру опухоли и в гистологическом анализе.

(d) Идентификация синовиальных РА-клеток с использованием TRA-8

Первичные синовиальные клетки, выделенные у 8 пациентов с РА и у 4 пациентов с ОА, тестировали на экспрессию DR5 на клеточной поверхности. TRA-8 давал положительный результат для всех штаммов РА-клеток и отрицательный результат для всех штаммов ОА-клеток. Таким образом, РА отличался от ОА по экспрессии на DR5 клеточной поверхности, как было определено с помощью TRA-8.

(е) Индуцирование апоптоза в синовиальных клетках фибробластов РА с помощью TRA-8

Способность TRA-8 индуцировать апоптоз синовиальных РА-клеток определяли с помощью анализа на жизнеспособность клеток в процессе in vitro-культивирования в присутствии различных концентраций TRA-8. Все РА-клетки обнаруживали от высоких до промежуточных уровней чувствительности к 100 нг/мл TRA-8. В противоположность этому все ОА-клетки были в основном резистентными к TRA-8-индуцированному апоптозу. Важно отметить, что TRA-8 обнаруживало лучшую апоптоз-индуцирующую активность по отношению к синовиальным РА-клеткам, чем растворимый TRAIL с энхансером. Более того, по сравнению с анти-Fas антителом (CH-11) антитело TRA-8 обнаруживало лучшую селективность по отношению к синовиальным РА-клеткам.

(f) TRA-8 не индуцирует продуцирование ММР в синовиальных клетках РА

Поскольку антитело TRA-8 способно индуцировать активацию NF-κb в синовиальных РА-клетках, как и TNF-α, то было оценено влияние TRA-8 на продуцирование ММР1 и ММР3 в синовиальных клетках. Хотя TNF-α индуцирует дозозависимое увеличение ММР, а антитело TRA-8 не способно индуцировать какое-либо продуцирование ММР, однако при определенных концентрациях TRA-8 способствует небольшому снижению продуцирования ММР в синовиальных РА-клетках.

(g) TRA-8 индуцирует активацию многих каспаз

Поскольку каспазы играют решающую роль в индуцировании апоптоза, то была оценена способность TRA-8 индуцировать активацию каспазы в человеческих клетках Jurkat. При инкубировании клеток Jurkat с низкой дозой (50 нг/мл) TRA-8 активация каспазы 8, каспазы 9 и каспазы 3 наблюдалась, по меньшей мере, через 15 минут после начала инкубирования, как было продемонстрировано в Вестерн-блот-анализе и в анализе на расщепление каспазы. По таким параметрам, как время, количество и сила активации каспазы, антитела настоящего изобретения, включая репрезентативное антитело TRA-8, обнаруживают гораздо большую активность, чем любые другие апоптоз-индуцирующие антитела, такие как антитело против человеческого Fas (СН-11).

Антитело 2Е12 в его растворимой форме специфически связывается с DR4, обладает in vivo и in vitro апоптоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR4 (включая, например, раковые клетки, синовиальные клетки ревматоидного артрита, активированные иммунные клетки, например, активированные лимфоциты и инфицированные вирусом клетки), и обладает опухолецидной активностью in vivo (предпочтительно в отсутствие токсичности к неопухолевым клеткам). Предпочтительно, чтобы антитело против DR4 настоящего изобретения обладало апопотоз-индуцирующей активностью, характеризующейся менее чем 60%, 50%, 40%, 30%, 20% или 10% жизнеспособностью клеток-мишеней при концентрациях антител, составляющих менее чем 30 мкг/мл, 3 мкг/мл, 0,3 мкг/мл или 0,03 мкг/мл, и опухолецидной активностью, характеризующейся менее чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% снижением размера опухоли. Таким образом, антитело aAn настоящего изобретения представляет собой молекулу, обладающую способностью селективно индуцировать апоптоз в патогенных клетках, как показано в пунктах (а) и (g). В соответствии с этим оно может быть использовано в качестве профилактического и терапевтического средства для лечения заболеваний, ассоциированных с выживанием нежелательных клеток или с нежелательной пролиферацией клеток, таких как клетки, которым свойственна разрегуляция системы апоптоза, включая систему "Fas/лиганд Fas".

Способность антител настоящего изобретения индуцировать апоптоз была подтверждена культивированием клеток, таких как клеточная линия человеческого лейкоза Jurkat (Американская коллекция типовых культур № TIB-152) и клеточная линия астроцитомы 1321N1, в среде, в которую был добавлен тестируемый образец, и определением уровня выживаемости этих клеток, например, с помощью анализа ATPLite.

Антитело настоящего изобретения, а в частности антитела против DR5 и DR4, обладающие почти такой же иммуногенностью для человека, как и человеческие антитела, используется в качестве средства для профилактики или лечения заболеваний, ассоциированных с нежелательным выживанием клеток или с нежелательной пролиферацией клеток, включая клетки, которым свойственна разрегуляция системы апоптоза при аутоиммунных заболеваниях, например, таких как системная красная волчанка, болезнь Хасимото, ревматоидный артрит, реакция "трансплантат против хозяина", синдром Сьегрена, пернициозная анемия, болезнь Адиссона, склеродермия, синдром Гудпасчера, болезнь Крона, аутоиммунная гемолитическая анемия, бесплодие, тяжелая псевдопаралитическая миастения, рассеянный склероз, базедова болезнь, тромбоцитопеническая пурпура, инсулинзависимый сахарный диабет, аллергия, астма, атопическая болезнь, артериосклероз, миокардит, кардиомиопатия, гломерулярный нефрит, гипопластическая анемия, отторжение трансплантированного органа и множественные злокачественные опухоли легких, предстательной железы, печени, яичника, толстой кишки, шейки матки, лимфатических узлов и молочной железы. Антитела настоящего изобретения могут быть нацелены на активированные иммунные клетки или использованы для селективного индуцирования апоптоза этих клеток, включая активированные лимфоциты, лимфоидные клетки, миелоидные клетки и ревматоидные синовиальные клетки (включая воспалительные синовиациты, макрофаг-подобные синовиоциты и фибробласт-подобные синовиоциты), и вирус-инфицированные клетки (включая, например, клетки, инфицированные ВИЧ), при условии, что эти клетки-мишени экспрессируют или могут быть сконструированы так, чтобы они экспрессировали специфические TRAIL-рецепторы (то есть DR4 или DR5).

Такое профилактическое или терапевтическое средство может быть введено в различных формах. Подходящими способами введения является пероральное введение таких лекарственных форм, как таблетки, капсулы, гранулы, порошки и сиропы; или парентеральное введение, например, путем инъекции и в виде суппозиториев.

Антитело или терапевтическое средство настоящего изобретения может быть введено перорально, ректально, интрацистернально, интравентрикулярно, интракраниально, интратекально, внутрисуставно, внутривагинально, парентерально (внутривенно, внутримышечно или подкожно), местно (в виде порошков, мазей или капель), внутрибрюшинно, чрескожно, путем ингаляции или в виде буккального или назального спрея. Требуемое точное количество антитела или терапевтического агента может варьироваться для различных индивидуумов в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, от тяжести заболевания, подвергаемого лечению, от локализации и размера опухоли, от конкретно используемых соединений, от способа введения и т.п. Подходящее количество может быть определено самим специалистом путем лишь рутинного экспериментирования. Обычно разовая доза антитела варьируется в пределах 0,1-10000 микрограммов, а предпочтительно между 0,1 и 100 микрограммами. Типичные концентрации антитела в носителе составляют в пределах от 0,2 до 2000 нанограммов на миллилитр. Для инъекции в сустав объемы антитела и носителя могут варьироваться в зависимости от данного сустава и приблизительно составляют 0,5-10 мл, а предпочтительно 1-5 мл, для инъекции в коленный сустав человека и приблизительно 0,1-5 мл, а предпочтительно 1-2 мл, для инъекции в голеностопный сустав человека.

В зависимости от выбранного способа введения антитело или терапевтический агент может присутствовать в фармацевтических композициях, изготовленных в виде твердых, полутвердых или жидких лекарственных форм, таких как, например, таблетки, суппозитории, драже, капсулы, порошки, жидкости или суспензии, предпочтительно в виде разовой лекарственной формы, подходящей для однократного введения точной дозы. Такие композиции включают эффективное количество выбранного субстрата в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, и, кроме того, они могут включать другие лекарственные средства, фармацевтические агенты, носители или разбавители. Термин "фармацевтически приемлемый" относится к материалу, который по своим биологическим или каким-либо иным свойствам не является нежелательным и может быть введен вместе с выбранным субстратом, но который при этом не оказывает нежелательного биологического действия или не взаимодействует каким-либо иным нежелательным образом с любым из других компонентов фармацевтической композиции, в которой он содержится.

Композиции, подходящие для парентерального введения, могут включать физиологически приемлемые стерильные водные или безводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии и стерильные порошки для получения стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Примерами подходящих водных и безводных носителей, разбавителей, растворителей или связующего материала являются вода, этанол, полиолы (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, глицерин и т.п.), их подходящие смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Присущая им текучесть может быть сохранена, например, путем использования вещества для покрытий, такого как лецитин, путем поддерживания нужного размера частиц в случае дисперсий и путем использования поверхностно-активных веществ.

Указанные композиции могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Для предупреждения воздействия микроорганизмов могут быть использованы различные антибактериальные и противогрибковые агенты, например парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота и т.п. Желательно также включать изотонические агенты, например сахара, хлорид натрия и т.п. Пролонгированная абсорбция фармацевтической формы для инъекций может быть достигнута путем использования веществ, замедляющих абсорбцию, например моностеарат алюминия и желатин.

Твердыми лекарственными формами для перорального введения являются капсулы, таблетки, драже, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение смешано, по крайней мере, с одним инертным стандартным наполнителем (или носителем), таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат, или (а) с наполнителями или сухими разбавителями, такими как, например, крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, (b) со связующими веществами, таким как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь, (с) с увлажнителями, такими как, например, глицерин, (d) с дезинтеграторами, такими как, например, агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые комплексные силикаты и карбонат натрия, (е) с замедлителями растворения, такими как, например, парафин, (f) с ускорителями абсорбции, такими как, например, четвертичные аммониевые соединения, (g) со смачивающими агентами, такими как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина, (h) с адсорбентами, такими как, например, каолин и бентонит, и (i) с замасливателями, такими как, например, тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия или их смеси. В случае использования капсул, таблеток и драже указанные лекарственные формы могут также содержать забуферивающие агенты.

Твердые композиции аналогичного типа могут быть также использованы как наполнители в мягких и твердых желатиновых капсулах с применением таких наполнителей, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.

Твердые лекарственные формы, такие как таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы, могут иметь покрытия и оболочки, такие как энтеросолюбильные покрытия и другие покрытия, хорошо известные специалистам. Они могут содержать агент, придающий непрозрачность, а также могут представлять собой такую композицию, которая обеспечивает пролонгированное высвобождение активного соединения или соединений в определенной части желудочно-кишечного тракта. Примерами используемых заливочных композиций являются полимерные вещества и воски. Активные соединения могут также присутствовать в микроинкапсулированной форме, если это необходимо, вместе с одним или несколькими из вышеупомянутых наполнителей.

Жидкими лекарственными формами для перорального введения являются фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Помимо активных соединений, жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые специалистами, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как, например, этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, а в частности, масло из семян хлопчатника, арахисовое масло, масло из проросших семян кукурузы, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот сорбитана, или смеси этих веществ и т.п.

Помимо указанных инертных разбавителей, данная композиция может также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подслащивающие агенты, отдушки и ароматизаторы.

Суспензии, помимо активных соединений, могут содержать суспендирующие агенты, такие как, например, этоксилированные изостеариловые спирты, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита и сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакантовая камедь или смеси указанных веществ и т.п.

Композициями для ректального введения предпочтительно являются суппозитории, которые могут быть получены путем смешивания соединений настоящего изобретения с подходящими нераздражающими наполнителями или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или воск для суппозиториев, которые являются твердыми при нормальных температурах, но жидкими при температуре тела, а поэтому они расплавляются в прямой кишке или влагалище и высвобождают активный компонент.

Лекарственными формами для местного применения соединений настоящего изобретения являются мази, порошки, спреи и ингаляторы. Активный компонент смешивают в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут потребоваться для этих целей. В объем настоящего изобретения также входят офтальмические композиции, мази, порошки и растворы.

Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры, амиды и пролекарства" означает соли карбоновых кислот, соли присоединения аминокислот, сложные эфиры, амиды и пролекарства соединений настоящего изобретения, которые, исходя из тщательной оценки специалистов-медиков, являются подходящими для использования при контактировании с тканями пациентов, не вызывают чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п. и соответствуют приемлемому отношению "польза/риск", а также являются эффективными для целевого применения, причем указанный термин также означает цвиттерионные формы соединений настоящего изобретения, если они существуют. Термин "соли" означает относительно нетоксичные соли присоединения неорганических и органических кислот соединений настоящего изобретения. Эти соли могут быть получены in situ во время конечного выделения и очистки соединений или посредством взаимодействия отдельного очищенного соединения в его свободной форме с подходящей органической или неорганической кислотой и выделения полученной таким образом соли. Типичными солями являются гидробромид, гидрохлорид, сульфат, бисульфат, нитрат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, пальмитат, стеарат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат, мезилат, глюкогептонат, лактобионат, метансульфонат и лаурилсульфонат и т.п. Такими солями могут быть катионы на основе щелочных и щелочноземельных металлов, таких как натрий, литий, калий, кальций, магний и т.п., а также катионы нетоксичного аммония, четвертичного аммония и амина, включая, но не ограничиваясь ими, аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, этиламин и т.п. (см., например, работу S.M. Barge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 1977, 66:1-19, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Термин "пролекарство" означает соединения, которые in vivo быстро превращаются в исходные соединения вышеуказанной формулы, например, посредством гидролиза в кровотоке. Подробное обсуждение приводится в работе T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series и в работе Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Клеткой-мишенью является клетка животного, включая, например, человека, примата, не являющегося человеком, кошек, собак, крысу, мышь, морскую свинку, кролика, козу, овцу, корову, лошадь, курицу, свинью, обезьяну-игрунку и хорька.

Кроме того, антитело или терапевтическое средство настоящего изобретения могут присутствовать в несольватированной, а также в сольватированной форме с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как вода, этанол и т.п. В основном для осуществления настоящего изобретения сольватированные формы рассматриваются как эквиваленты несольватированных форм.

Молекулы антител очищают известными методами, включая, например, аминоабсорбционную или аминоаффинную хроматографию и хроматографическую технику, такую как жидкостная хроматография высокого давления или их комбинации.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическому продукту, используемому для доставки позвоночному животному биологически активного антитела против TRAIL-рецептора или гуманизированного антитела против TRAIL-рецептора. Такой фармацевтический продукт содержит фармацевтически эффективное количество антитела против TRAIL-рецептора или его фрагмента, фармацевтически приемлемый носитель и контейнер, включающий носитель и антитело в стерильной форме.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтически эффективное количество антитела настоящего изобретения ингибирует пролиферацию клеток или индуцирует апоптоз клеток посредством контактирования с одной или несколькими клетками-мишенями. Фармацевтически эффективное количество антитела, распознающего DR5 иди DR4, или гуманизированного антитела, распознающего DR5 или DR4, представляет собой вводимое индивидууму количество, которое является достаточным для достижения нужного эффекта. Используемые здесь термины "фармацевтически эффективное количество" и "терапевтическое количество" являются синонимами. Желательными эффектами введения фармацевтически эффективного количества DR5- или DR4-распознающих антител являются гибель одной или нескольких клеток-мишеней, ингибирование роста одной или нескольких клеток-мишеней, стимуляция DR5 или DR4 соответственно, связывание с DR5 или DR4 соответственно и увеличение уровней или активности NF-κb в клетке-мишени. Клетка-мишень представляет собой клетку, которая экспрессирует DR5 или DR4, и такими клетками являются, например, клетки с аномальным ростом и опухолевые клетки, такие как папилломы и бородавки; рак молочной железы, рак толстой кишки, гепатомы, лейкоз, рак легких, меланома, миелома, остеосаркома, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, рак матки, опухоли головного мозга, такие как астроцитомы, активированные иммунные клетки (например, активированные лимфоциты, лимфоидные и миелоидные клетки), воспалительные клетки, синовиальные клетки ревматоидного артрита и инфицированные вирусом клетки. In vivo такой клеткой-мишенью является клетка индивидуума, страдающего патологическим состоянием, включая состояние, при котором пролиферация клеток является аномальной или разрегулированной, например доброкачественные или злокачественные раковые опухоли и ревматоидный артрит.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения клетка-мишень также контактирует с терапевтическим средством. Таким образом, антитела и композиции настоящего изобретения могут быть введены отдельно или в комбинации с одним или несколькими терапевтическими средствами. Такими терапевтическими средствами являются, но не ограничиваются ими, другие члены семейства TNF, химиотерапевтические агенты, антитела, противовирусные средства, стероидные и нестероидные противовоспалительные средства, стандартные иммунотерапевтические средства, цитокины, хемокины и/или факторы роста. Комбинации могут быть введены либо как одно целое (например, в виде смеси), отдельно, но одновременно (например, посредством отдельных внутривенных инъекций в разные участки тела одному и тому же индивидууму) или последовательно (например, сначала одно из данных соединений или средств, а затем второе). Таким образом, используемые термины "комбинация" или "комбинированный" относятся к совместному, одновременному или последовательному введению двух или более средств.

В одном из вариантов осуществления изобретения комбинированная терапия включает введение членов семейства TNF. Молекулами TNF, молекулами, родственными TNF, или TNF-подобными молекулами, которые могут быть введены вместе с антителом настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, растворимые формы TNF-α, лимфотоксин-α (L-T-α, также известный как TNF-β), LT-β (обнаруженный в комплексном гетеротримере LT-α2-β), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-γ (WO 96/14328), TRAIL, AIM-II (WO 97/34911), APRIL (J. Exp. Med. 188:1185-90), эндокин-α (WO 98/07880), TR6 (WO 98/30694), OPG и фактор роста нервных клеток (NGF) и растворимые формы Fas, CD30, CD27, CD40 и 4-IBB, TR2 (WO 96/34095), DR3 (WO 97/33904), DR4 (WO 98/32856), TR5 (WO 98/30693), TRANK, TR9 (WO 98/56892), TRIO (WO 98154202), 312С2 (WO 98/06842) и TR12, и растворимые формы CD154, CD70 и CD153.

В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с природными, синтетическими или генетически сконструированными лигандами CD40 (CD40L), включая, например, растворимую форму CD40L (например, AVREND), биологически активные фрагменты, варианты или производные CD40L, антитела против CD40L (например, антитела-агонисты или антитела-антагонисты) и/или антитела против CD40 (например, агонисты или антагонисты).

В еще одном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью или более агентами, такими как такролим (Fujisawa), талидомид (например, Celgene), анти-Тас (Fv)-PE40 (например, Protein Design Labs), инолимомаб (Biotest), MAK-195F (Knoll), ASM-981 (Novartis), рецептор интерлейкина-1 (например, Immunex), рецептор интерлейкина-4 (например, Immunex), ICM3 (ICOS), BMS-188667 (Bristol Myers Squibb), анти-TNF Ab (например, терапевтические антитела), CG-1088 (Celgene), моноклональное антитело против В7 (например, Innogetics), MEDI-507 (BioTransplant) и ABX-CBL (Abgenix).

В соответствии с настоящим изобретением антитело настоящего изобретения может быть введено с Fas-лигандом (Fas-L) или антителом против Fas, которое связывается с Fas и передает биологический сигнал, приводящий к апоптозу. Предпочтительно, чтобы антителами против Fas, используемыми в этом способе, были моноклональные антитела.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела настоящего изобретения вводят в комбинации с противоретровирусными средствами, нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы, ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы и/или с ингибиторами протеазы. Нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы, которые могут быть введены в комбинации с антителами настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, RETROVIR® (зидовудин/AZT) (Gaxo-Wellcome, Research Triangle Park, NC), VIDEX® (диданозин/ddI) (Bristol-Myers Squibb, New York), HIVID® (зальцитабин/ddC) (Roche, Nutley, New Jersey), ZERIT® (ставудин) (Bristol-Myers Squibb). Ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы, которые могут быть введены в комбинации с антителом настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, VIRAMUNE® (невирапин) (Boehringer Ingelheim/Roxanne, Columbus, Ohio), RESCRIPTOR® (делавирдин) (Pharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan) и SUSTIVA® (эфавиренц) (Bristol-Myers Squibb).

Ингибиторами протеазы, которые могут быть введены в комбинации с антителами настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, CRIXIVAN® (сульфат индинавира) (Merck & Company, Whitehouse Station, NJ), NORVIR® (ритонавир) (Abbott Laboratories, Chicago, IL), INVIRASE® (саквинавир) (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) и VIRACEPT® (нельфинавир) (Agouron Pharmaceuticals, SanDiego, CA). В конкретном варианте осуществления изобретения агенты против ретровирусов, нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы и/или ингибиторы протеазы могут быть использованы в любой комбинации с композициями настоящего изобретения для лечения СПИДа и/или предупреждения или лечения ВИЧ-инфекции.

В других вариантах осуществления изобретения антитело настоящего изобретения может быть использовано в комбинации с агентами против инфекции, вызываемой условно-патогенными микроорганизмами. Агентами против инфекции, вызываемой условно-патогенными микроорганизмами, которые могут быть введены в комбинациями настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, триметоприм-пентамидин, сульфаметоксазол, DAPSONE® (Jacobus Pharmaceuticals, Princeton, NJ), ATOVAQUONE® (GlaxoSMithKline, Research Triangle Park, NC), ISONIAZID® (CIBA Pharmaceuticals, Summit, NJ), RIFADIN® (рифампин) (Hoechst-Marrion-Roussel, Kansas City, MO), PYRAZINAMIDE® (Ledelrle, Pearl River, NY), BIAXIN® (кларитромицин) (Abbott Laboratories, Chicago, IL), ETHAMBUTOL® (Ledelrle, Pearl River, NY) RIFABUTIN® (Pharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, MI), AZITHROMYCIN® (Pfizer Inc., NewYork, NY), GANCICLOVIR® (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ), FOSCARNET® (Astra, Westborough, MA), CIDOFOVIR® (Gilead Sciences, Foster City, CA), KETOCONAZOLE® (Janssen, Titusville, NJ), FLUCONAZOLE® (Pfizer Inc., NewYork, NY), ITRACONAZOLE® (Janssen, Titusville, NJ), ACYCLOVIR® (Glaxo-Wellcome, Research Triangle Park, NC), FAMCICOLCIR® (SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Pittsburgh, PA), пириметамин, лейковорин, NEUPOGEN® (филграстим/GM-CSF) (Amgen, Thousand Oaks, CA) и LEUKINE® (сарграмостим/GM-CSF) (Immunex, Seattle, WA).

В конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения используется в любой комбинации с триметоприм-сульфаметоксазолом и/или с атоваклоном, дапсоном, пентамидином для профилактического лечения и/или предупреждения пневмонии, вызываемой условно-патогенной бактерией Pneumocystis carinii.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения используется в любой комбинации с изониазидом, RIFADIN® (Merrell Dow Pharmaceuticals, Cincinnati, Ohio), пиразинамидом и/или этамбутолом для профилактического лечения и/или предупреждения комплексной инфекции, вызываемой условно-патогенной бактерией Mycobacterium avium. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения используется в любой комбинации с рифабутином, кларитромицином и/или азитромицином для профилактического лечения и/или предупреждения комплексной инфекции, вызываемой условно-патогенной бактерией Mycobacterium tuberculosis. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения используется в любой комбинации с ганцикловиром, фоскарнетом и/или цидофовиром для профилактического лечения и/или предупреждения цитомегаловирусной условно-патогенной инфекции. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения используется в любой комбинации с флуконазолом, траконазолом и/или кетоконазолом для профилактического лечения и/или предупреждения условно-патогенной грибковой инфекции. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения используется в любой комбинации с ацикловиром и/или фамцикловиром для профилактического лечения и/или предупреждения условно-патогенной инфекции, вызываемой вирусом простого герпеса типа I и/или типа II. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения используется в любой комбинации с пириметамином и/или лейковорином для профилактического лечения и/или предупреждения инфекции, вызываемой условно-патогенной бактерией Toxoplasmagondii. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения используется в любой комбинации с лейковорином и/или NEUPOGEN® (Amgen, Thousand Oaks, CA) для профилактического лечения и/или предупреждения инфекции, вызываемой условно-патогенной бактерией.

В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с противовирусным агентом. Противовирусными агентами, которые могут быть введены, являются, но не ограничиваются ими, ацикловир, рибавирин, амантадин и ремантидин.

В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с антибактериальным агентом. Антибактериальными агентами, которые могут быть введены вместе с композициями настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, амоксициллин, аминогликозиды, бета-лактам (гликопептид), бета-лактамазы, клиндамицин, хлорамфеникол, цефалоспорины, ципрофлоксацин, эритромицин, флурохинолоны, макролиды, метронидазол, пенициллины, хинолоны, ритампин, стрептомицин, сульфонамид, тетрациклины, триметоприм, триметоприм-сульфамтоксазол и ванкомицин.

Стандартными неспецифическими иммуносупрессорными агентами, которые могут быть введены в комбинации с антителом настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, стероиды, циклоспорин, аналоги циклоспорина, циклофосфамид, метилпреднизон, преднизон, азатиоприн, FK-506 (Fujisawa Pharmaceuticals, Deefield, IL), 15-дезоксиспергуалин и другие иммуносупрессорные агенты, которые действуют путем подавления функции отвечающих иммунных клеток (включая, например, Т-клетки), либо непосредственно (например, путем воздействия на иммунные клетки), либо опосредованно (путем воздействия на другие опосредующие клетки).

В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с иммунодепрессантами. Препаратами иммунодепрессантов, которые могут быть введены с антителом настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, ORTHOCLONE® (OKT3) (Ortho Biotech, Raritan, NJ), SANDIMMUNE® ORAL (циклоспорин) (Sandoz Pharmaceuticals, Hanover, NJ), PROGRAF® (такролим) (Fujisawa Pharmaceuticals, Deerfield, IL), CELLCEPT® (микофенолят) (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ), азатиоприн, глюкортикостероиды и RAPAMUNE® (сиролим) (Wyeth, Collegeville, PA). В конкретном варианте осуществления изобретения иммунодепрессанты в комбинации с антителом настоящего изобретения могут быть использованы для предупреждения отторжения трансплантатов органов или костного мозга.

В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят отдельно или в комбинации с одним или несколькими иммуноглобулиновыми препаратами для внутривенного введения. Иммуноглобулиновыми препаратами для внутривенного введения, которые могут быть введены с антителом настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, GAMMARE® (Centeon, Kankakee, IL), IVEEGAM® (Immuno-US Inc., Rochester, MI), SANDOGLOBULFN® (Sandoz Pharmaceuticals, Hanover, NJ), GAMMAGARD® (Baxter Healthcare, Glendale, CA) и GAMIMUNE® (Bayer Biological, West Haven, CT). В конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с иммуноглобулиновыми препаратами для внутривенного введения при терапии путем трансплантации (например, трансплантации костного мозга).

В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят отдельно или в комбинации с противовоспалительным средством. Противовоспалительными средствами, которые могут быть введены вместе с композициями настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, глюкокортикостероиды и нестероидные противовоспалительные средства, производные аминоарилкарбоновой кислоты, производные арилуксусной кислоты, производные арилмасляной кислоты, арилкарбоновые кислоты, производные арилпропионовой кислоты, пиразолы, пиразолоны, производные салициловой кислоты, тиазинкарбоксамиды, е-ацетамидокапроновая кислота, S-аденозилметионин, 3-амино-4-гидроксимасляная кислота, амиксетрин, бендазак, бензидамин, буколом, дифенпирамид, дитазол, эморфазон, гвайзулен, набуметон, нинесулид, орготеин, оксацепрол, паранилин, перизоксал, пифоксим, проквазон, проксазол и тенидап.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации со стероидной терапией. Стероидами, которые могут быть введены в комбинации, являются метилпреднизолон (например, метилпреднизолон IV). В конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с преднизоном. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с преднизоном и с иммуносупрессорным агентом. Иммуносупрессорными агентами, которые могут быть введены с преднизоном, являются агенты, описанные в настоящей заявке, но не ограничивающиеся ими, а именно азатиоприн, циклофосфамид и циклофосфамид IV. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с метилпреднизолоном. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с метилпреднизолоном и с иммуносупрессорным агентом. Иммуносупрессорными агентами, которые могут быть введены с метилпреднизолоном, являются агенты, описанные в настоящей заявке, но не ограничивающиеся ими, а именно азатиоприн, циклофосфамид и циклофосфамид IV.

В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с противомалярийным средством. Противомалярийными средствами, которые могут быть введены с композициями настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, гидроксихлорохин, хлорохин и/или акрихин.

В еще одном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с НСПВС. Антитело настоящего изобретения вводят, но необязательно, в комбинации с одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, десятью или более лекарственными средствами, такими как: NRD-101 (Hoechst Marion Roussel, Kansas City, MO), диклофенак (Dimethaid, Ontario, CN), оксапрозин-калий (Monsanto), меказермин (Chiron, Emeryville, CA), T-614 (Toyama), пеметрексед-динатрий (Eli Lilly, Indianapolis, IN), атрелейтон (Abbott, Chicago, IL), вальдекоксиб (Monsanto), эльтенак (Byk Gulden, Melville, NY), кампат, AGM-1470 (Takeda, Lincolnshire, IL), CDP-571 (Celltech, Rochester, NY), CM-101 (CarboMed, Nashville, TN), ML-3000 (Merck), CB-2431 (KS Biomedix, Surrey, UK), CBF, BS2 (KS Biomedix, Surrey, UK), IL-Ira для генотерапии (Valentis, Burlingame, CA), JTE-522 (Japan Tobacco, Tokyo, Japan), паклитаксел (Angiotech, Vancouver, BC), DW-166НC (Dong Wha, Seoul, Korea), мезилат дарбуфелона (Pfizer Inc., New York, NY), растворимый рецептор TNF 1 (синерген; Amgen, Thousand Oaks, CA), IPR 6001 (Institute for Pharmaceuticals Research), трокад (Hoffman-La Roche, Nutley, NJ), EF5 (Scotia Pharmaceuticals), BIIL-284 (Boehringer Ingelheim, Ridgefield, CT), BIIF-1149 (Boehringer Ingelheim, Ridgefield, CT), LEUKOVAX® (Inflammatics, Malvern, PA), MK-663 (Merck, Whitehouse Station, NJ), ST-1482 (Sigma-Tau, Gaithersburg, MD) и пропионат бутиксокорта (Pfizer Inc., New York, NY).

В еще одном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с одним или несколькими DMARD. Так, например, может быть использовано одно, два, три, четыре, пять или более таких лекарственных средств, как: метотрексат, лефлуномид, эдатрексат, эпироприм, иометрексол, пиритрексим, триметрексат, бродимоприм, МХ-68, N-[4-[3-(2,4-диамино-6,7-дигидро-5Н-циклопента[d]пиримидин-5-ил)пропил]бензоил]-L-глутаминовая кислота, N-[[5-[2-(2-амино-1,4,5,6,7,8-гексагидро-4-оксипиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)этил]-2-тиенил]карбонил]-L-глутаминовая кислота, (R)N-[[5-[2-(2-амино-1,4,5,6,7,8-гексагидро-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)этил]-2-тиенил]карбонил]-L-глутаминовая кислота, N-((2,4-диамино-3,4,5,6,7,8-гексагидропиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)этил)-2-тиенилкарбонил-L-глутаминовая кислота, (S)-2-[[[4-карбокси-4-[[4-[[(2,4-диамино-6-птеридинил)метил]амино]бензоил]амино]бутил]амино]карбонил]бензойная кислота, N-[4-[3-(2,4-диамино-1Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-ил)пропил]бензоил]-L-глутаминовая кислота, 2,4-диамино-6-(N-(4-(фенилсульфонил)бензил)метиламино)хиназолин, 2,4-диамино-5-[4-[3-(4-аминофенил-4-сульфонилфениламино)пропокси]-3,5-диметоксибензил]пиримидин, N-[4-[4-(2,4-диамино-5-пиримидинил)бутил]бензоил]-L-глутаминовая кислота, N-[4-[3-(2,4-диамино-5-пиримидинил)пропил]бензоил]-L-глутаминовая кислота, N-[4-[2-(2,4-диамино-6-птеридинил)этил]бензоил]-4-метилен-DL-глутаминовая кислота и гидрохлорид диамида N-(1-метилэтил)-N'-[3'-(2,4,5-трихлорфенокси)пропокси]имидодикарбонимидиновой кислоты (PS15), сульфасалазин, ауротиомалат натрия, ауранофин, циклоспорин, пеницилламин, азатиоприн, противомалярийное лекарственное средство (например, описанное в этом документе), циклофосфамид, хлорамбуцил, золото, Enbrel (этанекрепт) (Wyeth-Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA), анти-TNF антитело и преднизолон. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с противомалярийным лекарственным средством, метотрексатом, анти-TNF антителом, Enbrel и/или с сульфасалазином.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с метотрексатом. В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с анти-TNF антителом. В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с метотрексатом и анти-TNF антителом или анти-Fas антителом. В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с сульфасалазином.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с метотрексатом, анти-TNF антителом, анти-Fas антителом и сульфасалазином. В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с Enbrel. В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с Enbrel и метотрексатом. В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с Enbrel, метотрексатом, сульфасалазином, лефлуномидом, этрорикоксибом, мизопростолом/диклофенак-натрием, вальдекоксибом, тиракоксибом, рофекоксибом, целекоксибом, галантамином, мезилатом дарбуфелона, ацеклофенаком, ML-3000, анакинрой, гуалуронат-натрием, нимесулидом, микофенолятом мофетила, диацереином, сивелесист-натрием, дефлазакортом, гидрохлоридом налмефена, самарием-153, лексидронампентанатрием, пентостатином, Т-614, гидрохлоридом амиприлозы, роцепафантом, ампироксикамом, фамезилатом преднизолона, мелоксикамом, диклофенак-натрием, ломоксикамом, салазосульфапиридином, этодолаком, малеатом флупиртина, эбзеленом, гидратом такролима, набуметоном, клопреднолом, циннаматом пироксикама, проквазоном, римексолоном, фенретинидом, имидазолгидроксибензоатом, дроксикамом, фентиазаком, альфакальцидолом, диацетатом галопредона, гидрохлоридом гусперима, инозином, пранобексом, актаритом, индометацинфарнезилом, мизорибином, толфенаминовой кислотой, дифлунизалом, пироксикамом, оксапрозином, гиалуронат-натрием, буцилламином, циклоспорином, флоктафенином, теноксикамом, пальмитатом дексаметазона, амфенак-натрием, ацеметацином, ауранофином, лобензаритдинатрием или с любыми их комбинациями.

В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с Enbrel, метотрексатом и сульфасалазином. В других вариантах осуществления изобретения одно или несколько противомалярийных средств объединяют с одной из вышеуказанных комбинаций. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с противомалярийным средством (например, гидроксихлорохином), Enbrel, метотрексатом и сульфасалазином. В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с противомалярийным средством (например, гидроксихлорохином), сульфасалазином, анти-TNF антителом и метотрексатом.

В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с химиотерапевтическим агентом. Химиотерапевтическими агентами, которые могут быть введены вместе с композициями настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, производные антибиотиков (например, доксорубицин, блеомицин, даунорубицин и дактиномицин); антиэстрогены (например, тамоксифен); антиметаболиты (например, фторурацил, 5-FU, метатрексат, флоксуридин, интерферон альфа-2В, глутаминовая кислота, пликамицин, меркаптопурин и 6-тиогуанин); цитотоксические агенты (например, кармустин, BCNU, ломустин CCNU, арабинозид цитозина, циклофосфамид, эстрамустин, гидроксимочевина, прокарбазин, митомицин, бисульфан, цисплатин и сульфат винкристина); гормоны (например, медроксипрогестерон, эстрамустин-фосфат натрия, этинилэстрадиол, эстрадиол, ацетат мегестрола, метилтестостерон, дифосфат диэтилстилбестрола, хлортрианизен и тестолактон); производные азотных аналогов горчичного газа (например, мефален, хлорамбуцил, мехлоретамин (азотные аналоги горчичного газа) и тиотепа); стероиды и их комбинации (например, бетаметазон-натрийфосфат) и другие (например, дикарбазин, аспарагиназа, митотант, сульфат винкристина, сульфат винбластина и этопозид). Другими химиотерапевтическими средствами являются, например, СРТ-11, дефлуномид, циклогексимид и митомицин.

В конкретном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с СНОР (циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизоном) или в любой комбинации с компонентами СНОР. В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с ритуксимабом. В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с ритуксимабом и СНОР либо с ритуксимабом и любой комбинацией компонентов СНОР.

В дополнительном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с цитокинами. Цитокинами, которые могут быть введены вместе с композициями настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, GM-CSF, G-CSF, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, анти-CD40 антитело, CD40L, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, TNF-альфа и TNF-бета.

В другом варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с гемопоэтическими факторами роста. Гемопоэтическими факторами роста, которые могут быть введены вместе с композициями настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, LEUKINE® (сарграмостим) и NEUPOGEN® (филграст).

В дополнительных вариантах осуществления изобретения антитело настоящего изобретения вводят в комбинации с одним или несколькими курсами терапевтической или профилактической терапии, такой как, например, лучевая терапия.

Используемый здесь термин "терапевтическое средство" представляет собой соединение или композицию, эффективную для облегчения патологического состояния. Иллюстративным примером терапевтического средства является противораковое соединение, члены семейств TNF, противовоспалительные средства, противовирусные средства, противоретровирусные средства, средства против условно-патогенной инфекции, антибиотики, иммуносупрессорные агенты, иммуноглобулины, противомалярийные средства, болезнь-модифицирующие противоревматические лекарственные средства (DMARD), цитокины, хемокины, факторы роста и "вторые" антитела, стимулирующие апоптоз клеток-мишеней.

Противораковое соединение или химиотерапевтическое средство представляет собой соединение или композицию, эффективную для ингибирования или прекращения роста аномально растущих клеток. Таким образом, такое средство может быть использовано в терапевтических целях для лечения рака, а также других заболеваний, характеризующихся аномальным клеточным ростом. Фармацевтически эффективным количеством противоракового соединения является вводимое индивидууму количество, достаточное для стимуляции ингибирования или прекращения роста аномально растущих клеток. Иллюстративными примерами противораковых соединений являются блеомицин, карбоплатин, хлорамбуцил, цисплатин, колхицин, циклофосфамид, даунорубицин, дактиномицин, диэтилстилбестрол, доксорубицин, этопозид, 5-фторурацил, флоксуридин, мелфалан, метотрексат, митомицин, 6-меркаптопурин, тенипозид, 6-тиогуанин, винкристин и винбластин. Другие примеры противораковых соединений и терапевтических средств можно найти в работах The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J. and Sladek et al., Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1987, Powis et al., eds., Taylor and Francis, New York, N.Y.

При лечении злокачественных опухолей применение антитела настоящего изобретения может быть также объединено с другими терапевтическими методами терапии, такими как химиотерапия и/или лучевая терапия, а терапевтическая эффективность может быть усилена апоптоз-индуцирующими соединениями, такими как бисиндолилмалеимид VIII (BisVIII) или другими сенсибилизирующими агентами, такими как SN-50 или LY294002. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения антитело или антитела настоящего изобретения могут быть объединены с BisVIII или другим сенсибилизирующим агентом и химиотерапевтическим средством (например, адриамицином, этопозидом, топетеканом, таксотером или паклитакселом). В другом варианте осуществления изобретения антитело или антитела настоящего изобретения могут быть объединены с нестероидным противовоспалительным лекарственным средством (например, сульфидом сулиндака или другими ингибиторами СОХ-1 или СОХ-2) и с химиотерапевтическим средством (например, адриамицином, этопозидом, топетеканом, таксотером или паклитакселом). Для лечения других заболеваний, например аутоиммунных и воспалительных заболеваний, могут быть также использованы комбинации различных методов терапии. Так, например, антитело может быть введено в сочетании с другими терапевтическими средствами, таким как противовоспалительные средства, DMARD, химиотерапевтические средства, метотрексат, бисиндолилмалеимид VIII или другие сенсибилизирующие средства и т.п. Для лечения воспалительных или аутоиммунных заболеваний лучевая терапия может быть также объединена с другими терапевтическими средствами. Каждый специалист может выбрать форму лучевой терапии для данного конкретного воспалительного или аутоиммунного заболевания (например, лучевая синовэктомия при лечении артрита).

Терапия с использованием антитела настоящего изобретения может быть также объединена с терапией, где используется другое антитело. Так, например, антитело против DR5 может быть введено индивидууму, нуждающемуся в этом, во время, до или после введения антитела против DR4, TNF, В7, лиганда CD40, CD40, CD20 (например, ритуксимаба), Fas или их комбинации. Такая комбинированная терапия с использованием антител может быть, кроме того, объединена с введением одного или нескольких терапевтических средств (например, химиотерапевтических средств, доксорубицина и/или метотрексата), лучевой терапией или той и другой.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу селективного индуцирования апоптоза или ингибирования пролиферации клеток-мишеней, экспрессирующих DR5, включающему стадии (а) контактирования клеток-мишеней с терапевтическим количеством антитела, которое специфически связывается с TRAIL-рецептором DR5, где указанное антитело в его растворимой форме обладает in vivo и in vitro апопотоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, и (b) контактирования указанных клеток-мишеней с терапевтическим количеством одного или нескольких терапевтических средств. В одном из вариантов осуществления изобретения одну или обе указанные стадии контактирования осуществляют, но необязательно, in vivo. В другом варианте осуществления изобретения одну или обе указанные стадии контактирования осуществляют in vitro. Клетки-мишени могут быть выбраны из клеток, обнаруживающих нарушение регуляции системы апоптоза, нейтрофилов, активированных лимфоцитов или других активированных иммунных клеток (например, лимфоидных и миелоидных клеток), вирус-инфицированных клеток и аномально пролиферирующихся синовиальных клеток (например, синовиальных клеток, ассоциированных с ревматоидным артритом, включая воспалительные синовиальные клетки, активированные лимфоидные и миелоидные клетки в синовиальной жидкости, макрофаг-подобные синовиоциты и фибробласт-подобные синовиоциты) при аутоиммунных заболеваниях. По сравнению с ранее описанным в литературе антителом против DR5 (24), апоптоз-индуцирующая активность репрезентативного антитела TRA-8 настоящего изобретения является очень высокой, и это антитело способно индуцировать апоптоз клеток Jurkat на пг/мл-уровнях in vitro и обнаруживает превосходную опухолецидную in vivo-активность по сравнению с активностью описанного ранее растворимого TRAIL. Внутривенное введение одной дозы TRA-8 является достаточным для ингибирования роста как клеток солидной опухоли, так и гемопоэтических опухолевых клеток, тогда как для индуцирования регрессии опухолей in vivo растворимым TRAIL требуется гораздо более высокая доза (500 мкг ежедневно в течение 10 дней). Антитела против TRAIL-рецептора настоящего изобретения являются, очевидно, безопасными, как и растворимый TRAIL, поскольку рассматриваемое антитело TRA-8 не индуцирует апоптоз нетрансформированных фибробластов. Аналогичные результаты были получены для антител против DR4.

Векторами настоящего изобретения являются последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую или легкую иммуноглобулиновую цепь антитела против DR5 или DR4 и функционально связанная с регуляторным элементом, таким как промотор или энхансер. Термин "функционально связанный" относится к такому расположению нуклеотидных последовательностей, конфигурация которых позволяет осуществлять их обычные функции. Таким образом, регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, способен регулировать транскрипцию, репликацию и/или трансляцию полипептида. Для каждого специалиста очевидно, что один вектор, но необязательно, включает кодирующие последовательности тяжелой и легкой иммуноглобулиновых цепей антитела против DR5 или DR4. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные векторы кодируют "гуманизированные" легкие или тяжелые иммуноглобулиновые цепи.

Нижеследующие примеры иллюстрируют способы и результаты настоящего изобретения. Эти примеры не ставят своей целью рассмотрение всех аспектов настоящего изобретения, а лишь иллюстрируют его репрезентативные методы и результаты. Указанные примеры не исключают возможные эквиваленты и модификации настоящего изобретения, которые являются очевидными для каждого специалиста.

Пример 1. Получение антигена DR5

1.1. Клонирование кДНК DR5

ДНК, кодирующую человеческий белок DR5, клонировали нижеописанным ОФ-ПЦР-методом, где используются:

а) Матрица

Полноразмерную РНК клеток HeLa экстрагировали с использованием реагента TRIzol (GIBCO BRL). В качестве матрицы для ПЦР-реакции была использована кДНК, которую получали с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК (Amersham Pharmacia Biotech) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к данному набору.

b) ПЦР-праймеры

Были синтезированы следующие олигонуклеотидные праймеры для ПЦР:

5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5р1:SEQ ID NO:1)

5'-ccactgggtgatgttggatggg-3' (DR5р2:SEQ ID NO:2)

Если это не оговорено особо, все олигонуклеотиды в этих примерах синтезировали методом с использованием Lifetechnologies. Все олигонуклеотиды после растворения в дистиллированной воде хранили при -20°С.

с) ПЦР-реакция

Состав ПЦР-реакционного раствора:

кДНК-матрица, 5 мкл от всей 33 мкл реакционной смеси;

праймер DR5р1, 10 пмоль;

праймер DR5р2, 10 пмоль;

10×концентрированный ПЦР-буфер (поставляется с набором), 10 мкл;

dNTP (каждый 2,5 мМ), 4 мкл; и

Полимераза Taq (Promega), 5 единиц.

К этому раствору добавляли стерильную дистиллированную воду до полного объема 100 мкл. Если это не оговорено особо, dNTP получали в виде эквимолярной смеси dATP, dCTP, dGTP и dTTP (каждого 2,5 мМ).

ПЦР-реакцию проводили следующим образом. Раствор сначала нагревали при 94°С в течение 2 минут, после чего 40 раз повторяли цикл нагревания до 94°С в течение 30 секунд, 52°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 3 минут. После завершения этой процедуры реакционный раствор нагревали при 72°С в течение 10 минут.

Полученные таким образом амплифицированные ДНК-фрагменты разделяли на 1% агарозном геле, содержащем 0,25 мкг/мл этидийбромида. Полосы, которые, как было обнаружено, содержали нужные ДНК-фрагменты, вырезали острием бритвы и выделяли ДНК с использованием набора Gene Clean (BIO101). ДНК-фрагмент клонировали с использованием набора для клонирования ТА (Invitrogen, СА). Эту процедуру осуществляли следующим образом.

ДНК-фрагмент, выделенный из ПЦР-реакционного раствора вместе с 50 нг вектора рCR2.1, который поставляется с набором для клонирования ТА, смешивали с 1 мкл 10×буфера для лигазной реакции (6 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 6 мМ хлорида магния, 5 мМ хлорида натрия, 7 мМ β-меркаптоэтанола, 0,1 мМ АТР, 2 мМ DTT, 1 мМ спермидина и 0,1 мг/мл альбумина бычьей сыворотки), к которому добавляли 4 единицы ДНК-лигазы Т4 (1 мкл). Полный объем смеси доводили до 10 мкл путем добавления стерильной деионизованной воды и полученный лигазный раствор инкубировали в течение 15 часов при 14°С. По истечении этого времени 2 мкл лигазного реакционного раствора добавляли к 50 мкл компетентного штамма TOP10F' E.coli, который поставлялся с набором для клонирования ТА и был доведен до состояния компетентности в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору и к которому добавляли 2 мкл 0,5 М β-меркаптоэтанола, и полученную смесь выдерживали на льду в течение 30 минут, затем при 42°С в течение 30 секунд, а затем снова выдерживали на льду в течение 5 минут. После этого к культуре добавляли 500 мкл среды, содержащей 2% об./об. триптона, 0,5% мас./об. дрожжевого экстракта, 0,05% мас./об. хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида калия, 1 мМ хлорида магния и 20 мМ глюкозы (называемой далее средой "SOC"), и смесь инкубировали в течение 1 часа при 37°С при встряхивании. По истечении этого времени, культуру высевали на чашку агара с L-бульоном (1% об./об. триптона, 0,5% мас./об. дрожжевого экстракта, 0,5% мас./об. хлорида натрия, 0,1% мас./об. глюкозы и 0,6% мас./об. бакто-агара (Difco)), содержащую 100 мкг/мл. Появившиеся на чашке резистентные к ампициллину колонии отбирали и соскабливали при помощи платиновой трансфер-петли, а затем культивировали в течение ночи при 37°С, в среде с L-бульоном, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, встряхивая при 200 об/мин. После инкубирования клетки собирали путем центрифугирования, в результате чего была получена ДНК-плазмида с использованием щелочного метода. EcoRI-EcoRI-фрагмент DR5cDNA из полученной таким образом плазмиды субклонировали в плазмиду pcDNA3 (Invitrogen, СА). Полноразмерный ген DR5 в pcDNA3 секвенировали и сопоставляли с опубликованной последовательностью. Полученную таким образом плазмиду обозначали pcDNA3-DR5.

1.2 Конструирование экспрессирующего вектора DR5-IgG

Для получения растворимой формы человеческого DR5, не содержащего трансмембранного домена, конструировали экспрессирующий плазмидный вектор. Этот вектор конструировали так, чтобы он кодировал гибридный белок, включающий внеклеточный домен человеческого DR5, присоединенный к ДНК Fc-фрагмента IgG1 человека (41). ДНК, кодирующую человеческий DR5, не содержащий трансмембранный домен, получали с помощью нижеследующей ПЦР-реакции.

а) Матрица

В качестве матрицы для ПЦР-реакции использовали pcDNA3-DR5.

b) ПЦР-праймеры

Были синтезированы следующие олигонуклеотидные праймеры для ПЦР:

5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5р1:SEQ ID NO:1)

5'-ggatccgtggacacattcgatgtc-3' (DR5р3:SEQ ID NO:3)

Если это не оговорено особо, все олигонуклеотиды в этих примерах синтезировали методом с использованием Lifetech-nologies. Все олигонуклеотиды после растворения в дистиллированной воде хранили при -20°С.

с) ПЦР-реакция

Проводили ПЦР-реакцию и амплифицированную ДНК выделяли, как описано в примере 1.1(с).

Полученную таким образом плазмиду обозначали pCR-ΔDR5. BamHI-EcoRI-фрагмент, кодирующий человеческий Fc-фрагмент, который был выделен из pmFas-hIgG1Fc, субклонировали в BamHI- и EcoRI-сайты множественного клонирования pcDNA3. Полученную таким образом плазмиду обозначали pcDNAFc. Затем BamHI-BamHI-фрагмент, кодирующий область растворимого человеческого DR5, который выделяли из pCR-ΔDR5, субклонировали в BamHI-сайт плазмиды pcDNAFc. Полученную таким образом плазмиду обозначали pcDNAΔDR5-Fc. EcoRI-фрагмент, кодирующий область "растворимый человеческий DR5 - Fc человеческого IgG", который выделяли из плазмиды pcDNAΔDR5-Fc, затупляли по концам с использованием ДНК-полимеразы, фрагмента Кленова (GIBCO BRL), а затем субклонировали в челночный вектор pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies Inc., Canada), который затупляли по концам после разрезания ферментом BamHI. Полученную таким образом плазмиду обозначали pAdΔDR5-Fc.

1.3 Экспрессия и очистка гибридного белка "человеческий DR5-IgG1"

Клетки QBI-293A (поставляемые в наборе ADENO-Quest) ко-трансфецировали pAdΔDR5-Fc и QBI-вирусной ДНК (поставляемой в наборе ADENO-Quest) с использованием набора ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canada) в соответствии с инструкциями. Рекомбинантные вирусные бляшки культивировали и скринировали на экспрессию гибридного белка DR5-IgG с помощью ELISA-анализа супернатанта. Позитивные бляшки амплифицировали в клетках QBI-293A и хранили при -80°С в качестве исходного вирусного штамма. Пятьдесят чашек (150 мм) с клетками QBI-293A трансфецировали рекомбинантным вирусом pAdΔDR5-Fc при 10 m.o.i (множественность заражения). Культуральные среды собирали после трансфекции в течение 48 часов.

Трансфецированные клетки, имеющие ген DR5-IgG, культивировали до плотности 1×10⁶ клеток/мл путем инкубирования в 500 мл среды DMEM (GIBCO), содержащей 10% об./об. FCS при 37°С в атмосфере 5% об./об. CO₂ в течение 2 дней. Затем культуру центрифугировали (1000 об/мин, 5 минут) и супернатант собирали. Выделение DR5-IgG из супернатанта осуществляли с помощью аффинной хроматографии на комплексе белок А-сефароза CL-4В (Pharmacia) при следующих условиях:

Колонка: колонка с белком А-сефарозой CL-4В (размер колонки 2 мл; Pharmacia);

Элюирующий буфер: 0,1 М глицин (рН 2,4), 0,15 М NaCl;

Нейтрализующий буфер: 1 М Трис-HCl (pH 8,5).

После нанесения всего супернатанта на колонку ее три раза промывали 20 мл PBS, а затем добавляли 1 мл элюирующего буфера 10 раз. После этого измеряли оптическую плотность каждой проэлюированной фракции (1 мл). Фракции 2-5 (с OD₂₈₀≥0,1) собирали и после добавления 100 мкл нейтрализующего буфера элюаты отдельно помещали в трубку для диализа и диализовали против 1 литра PBS (рН 7,5) при 4°С. Буфер для диализа меняли два раза.

Затем элюаты анализировали на экспрессию продукта гена DR5-IgG посредством ELISA. Сначала 100 мкл каждой фракции отдельно помещали в лунки 96-луночного микропланшета (Costar) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. По истечении этого времени раствор в лунках удаляли и планшет 3 раза промывали 100 мкл/лунку PBS, содержащим 0,1% об./об. Твина 20 (далее обозначаемым "PBS-Твин"). После промывки добавляли PBS, содержащий 2% (мас./об.) альбумина бычьей сыворотки (обозначаемого далее "BSA"), в количестве 100 мкл/лунку, затем планшет инкубировали при 37°С в течение 1 часа. По истечении этого времени лунки промывали еще 3 раза 100 мкл/лунку PBS-Твина, а затем в каждую лунку добавляли 100 мкл/лунку раствора моноклонального антитела против человеческого IgG1, 1000-кратно разведенного PBS-Твином, и планшет снова инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Затем лунки 3 раза промывали 100 мкл/лунку PBS-Твина. После этого добавляли систему "3,3',5,5'-тетраметилбензидин (далее обозначаемый "ТВМ") - жидкий субстрат" (Sigma) в количестве 100 мкл/лунку и планшет оставляли на 5 минут при комнатной температуре, а затем реакцию гасили добавлением 100 мкл/лунку 0,2 н. Н₂SO₄. Для оценки концентрации связанного антитела оптическую плотность каждой лунки считывали при 450 нм с использованием в качестве контрольного считывания оптической плотности при 650 нм. Оптическую плотность измеряли на микропланшет-ридере (Molecular Devices). Продуцирование DR5-IgG1 подтверждали с помощью указанного ELISA-метода. Молекулярную массу экспрессированного гибридного белка DR5-IgG1 определяли с помощью Вестерн-блот-анализа, в котором использовали mAb против человеческого IgG1 (Sigma) для детекции антитела на геле. Молекулярная масса экспрессированного гибридного белка DR5-IgG1 составляла приблизительно 50 кДа. При этом была достигнута чистота более чем 90%, как было оценено с помощью анализа путем электрофореза в ДСН-ПААГ и детекции белка путем окрашивания кумасси синим.

Пример 2. Генерирование моноклональных антител против человеческого DR5

2.1 Иммунизация

6-8-недельных самок мышей Balb/с (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) иммунизировали аффинно очищенным гибридным белком "человеческий DR5/hIgG1". Для первоначальной иммунизации в подушечку лапы гибридный белок (50 мкг) эмульгировали в полном адъюванте Фрейнда (Difco, Detroit, MI). Мышам через день вводили четыре бустер-инъекции 50 мкг гибридного белка, не содержащего адъюванта. Через три дня после последней инъекции лимфоциты из локальных лимфоузлов подвергали слиянию с клетками миеломы NS-1 и гибридомы культивировали в среде F104, в которую была добавлена 10% фетальная телячья сыворотка. Позитивные гибридомы отбирали с помощью ELISA, при котором планшеты покрывали либо 1 мкг/мл DR5/hIgG1, либо тем же количеством Fas/hIgG1 в качестве контроля. Изотип гибридом определяли с помощью ELISA с использованием панели козьих антител, специфичных к мышиному изотипу Ig (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Моноклональные антитела очищали аффинной хроматографией с использованием иммобилизованного антитела против мышиного IgG1 или белка G (Sigma).

2.2 Слияние клеток

На третий день после бустер-инъекции у мыши удаляли локальные лимфоузлы и помещали в 10 мл бессывороточной среды RPMI 1640 (GIBCO BRL), содержащей 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 300 мкг/мл L-глутаминовой кислоты, а затем лимфоузлы измельчали путем их пропускания через сито (Cell Strainer; Falcon) с использованием шпателя. Полученную клеточную суспензию центрифугировали для осаждения клеток локальных лимфоузлов, которые затем дважды промывали бессывороточной средой RPMI. Затем промытые клетки ресуспендировали в бессывороточной среде RPMI и подсчитывали.

Одновременно клетки миеломы NS1 (Американская коллекция типовых культур TIB-18) культивировали до клеточной плотности, не превышающей 1×10⁸ клеток/мл, в среде ASF104 (Ajinomoto, K.K.), содержащей 10% об./об. FCS (Gibco BRL) ("среда ASF с сывороткой") при 37°С в атмосфере 5% об./об. СО₂, а затем аналогичным образом измельчали, промывали, ресуспендировали и подсчитывали.

Определенное количество клеточной суспензии NS1, которое, как было вычислено, составляло 3×10⁷ клеток, смешивали с определенным количеством суспензии клеток селезенки, которое, как было вычислено, составляло 3×10⁸ клеток. Полученную смесь центрифугировали, а супернатант отбрасывали. Затем проводили стадии слияния клеток, выдерживая все это время пластиковую пробирку, содержащую осадок, при 37°С в химическом стакане с теплой водой.

Затем один мл 50% (мас./об.) полиэтиленгликоля 1500 (Boehringer Manheim) медленно добавляли в пробирку и осадок все время перемешивали кончиком пипетки. После этого двумя порциями медленно добавляли 1 мл бессывороточной среды RPMI, предварительно нагретой до 37°С, а затем добавляли еще 7 мл бессывороточной RPMI. Полученную смесь центрифугировали, супернатант отбрасывали и добавляли, при мягком перемешивании кончиком пипетки, 10 мл среды НАТ, содержащей 10% об./об. FCS. После добавления еще 20 мл среды HAT, содержащей 10% об./об. FCS, суспензию разливали по 96-луночным микропланшетам для культивирования клеток при концентрации 100 мкл/лунку и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% об./об. СО₂. Через 7 или 8 дней во всех лунках среду с желтоватым оттенком заменяли на 100 мкл/лунку свежеприготовленной среды HAT. Гибридные клетки из этих лунок клонировали путем лимитирующего разведения, как описано ниже.

2.3 Клонирование путем лимитирующего разведения

Тимусы от 4-10 недельных самок мышей BALB/c (от Japan SLC, Inc.) удаляли, измельчали на сите (CeII Strainer; Falcon), как описано выше, и полученные дезинтегрированные клетки дважды промывали средой НТ, содержащей 10% об./об. FCS. Количество тимусных клеток, соответствующее количеству клеток от одной мыши, суспендировали в 30 мл среды HT, содержащей 10% об./об. FCS, и получали суспензию клеток-фидеров. Препарат гибридных клеток, полученный, как описано выше в примере 2.2, 10-100-кратно разводили этой суспензией клеток-фидеров, а затем серийно разводили указанной суспензией клеток-фидеров и получали суспензии, имеющие плотности гибридных клеток, составляющие 5, 1 и 0,5 клеток/мл. Полученные таким образом образцы распределяли по лункам 96-луночных микропланшетов для культивирования клеток при концентрации 100 мкл/лунку и инкубировали в течение 5 дней при 37°С в атмосфере 5% об./об. СО₂.

2.4 Скрининг

Супернатанты культуры от растущих гибридом скринировали посредством ELISA с использованием планшетов, покрытых либо 1 мкг/мл DR5/hIgG1, либо тем же количеством Fas/hIgG1 в качестве контроля (41). Связанные антитела детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) антитела против мышиных иммуноглобулинов (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) и с использованием ТМВ (Sigma, St. Louis, MI) в качестве субстрата. Очищенный DR5-IgG1 в концентрации 1 мкг/мл или то же самое количество Fas/hIgG1 вводили в лунку 96-луночного планшета ELISA/RIA STRIP PLATE (Costar, NY). Планшет выдерживали в течение ночи при 4°С для адсорбции белка на поверхности лунки. По истечении этого времени раствор из лунок удаляли и каждую лунку 3 раза промывали PBS-твином. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл PBS, содержащего 1% (мас./об.) альбумина бычьей сыворотки (А3803; Sigma Chemical Co.), и планшет инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Затем лунки еще 3 раза промывали PBS-твином, после чего в каждую лунку добавляли 50 мкл супернатанта каждой культуры от растущих гибридом. Затем планшет инкубировали при 37°С в течение 1 часа и лунки снова 4 раза промывали PBS-твином. После промывки добавляли 50 мкл меченного пероксидазой хрена козьего антитела против мышиного иммуноглобулина (Southern Biotechnology, Birmingham, AL), 1000-кратно разведенного PBS, и планшет снова инкубировали при 37°С в течение 1 часа, после чего лунки 4 раза промывали PBS-твином. После этого добавляли систему "3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) - жидкий субстрат" (Sigma) в количестве 100 мкл/лунку и планшет оставляли на 5 минут при комнатной температуре, после чего реакцию прекращали добавлением 100 мкл/лунку 0,2 н. Н₂SO₄. Оптическую плотность каждой лунки при 450 нм (контроль 650 нм) измеряли на микропланшет-ридере (Molecular Devices) и гибридные клетки отбирали из образца, который имел оптическую плотность (450-650 нм, величины OD; >0,5), явно превышающую плотность образца, к которому не был добавлен супернатант от гибридных клеток (величины OD; ≈0,03). Затем супернатанты культуры от растущих гибридом также скринировали на функциональность путем измерения апоптоз-индуцирующей активности с использованием клеток Jurkat. 50 мкл среды RPMI, содержащей клетки Jurkat (1000 клеток на лунку) и 5 мкМ бисиндолилмалеимида VIII (Bis VIII, Alexis, San Diego, CA) добавляли в 96-луночные планшеты, в которых присутствовали 50 мкл супернатантов культуры растущих гибридом. Клетки культивировали в инкубаторе с повышенной влажностью в течение ночи при 37°С. Апоптоз определяли по жизнеспособности клеток с использованием набора ATPLite в соответствии с инструкциями производителей (Packard Instruments) и образцы считывали на счетчике TopCounter (Packard Instruments).

2.5 ELISA-связывание TRAIL и TRA-8 с рецепторами

ELISA-планшеты сенсибилизировали 2 мкг/мл гибридного белка DR4-Ig или DR5-Ig в течение ночи. После блокирования 3%-ным BSA добавляли растворимый TRAIL-FLAG или TRA-8 в указанных концентрациях и инкубировали при 37°С в течение одного часа. Связывание TRAIL или TRA-8 детектировали с использованием HRP-конъюгированного антитела против Flag (Alexis) или HRP-конъюгированного антитела против мышиного IgG1 (Southern Biotechnology) соответственно. Реакции проявляли ТМВ-субстратным буфером и измеряли на микропланшет-ридере Benchmark (BioRad). Величины Kd оценивали с помощью односайтовой модели связывания с нелинейной регрессией с использованием программы GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Для осуществления конкурентного ELISA добавляли 100 нг/мл TRAIL-FLAG и инкубировали в присутствии различных концентраций TRA-8. Уровень связывания TRAIL определяли, как описано выше.

2.6 Клонирование

Стадии, описанные выше в примерах 2.3 и 2.4, повторяли 5 раз для клеток, отобранных в стадии 2.4, что позволило отобрать несколько клонов гибридомы, каждая из которых продуцирует одно антитело, связывающееся с DR5-IgG, но не связывающееся с Fas-IgG. В результате этой процедуры отбора получали гибридому "мышь-мышь", обозначенную TRA-8 и продуцирующую антитело, связывающееся с DR5-IgG, но не с Fas-IgG. Эта гибридома TRA-8 была депонирована в Американской коллекции типовых культур 1 марта 2000 года под регистрационным номером РТА-1428.

После тестирования с использованием набора для определения изотипа моноклонального антитела (Pierce) было выявлено, что подклассом антитела TRA-8, продуцируемого гибридомой "мышь-мышь" (обозначаемой далее просто как "TRA-8"), является IgG1-κ.

С использованием гибридного белка "человеческий DR5-IgG1" настоящего изобретения в качестве иммуногена было получено путем предварительного ELISA-скрининга семь клонов гибридом, каждый из которых был в высокой степени положительным в отношении гибридного белка DR5-IgG, но не в отношении Fas-IgG, что указывает на то, что полученные гибридомы продуцируют антитела, распознающие внеклеточную часть DR5, но не Fc-часть IgG1 (данные не приводятся).

2.7 Вестерн-блот-анализ

Фильтры для Вестерн-блот-анализа гомогенатов нормальных и раковых тканей человека были закуплены у Geno Technology (St Louis, MO). Каждую дорожку загружали равным количеством белка, определенного с помощью антитела против β-актина. Блоты зондировали 1 мкг/мл TRA-8 в течение ночи, а затем HRP-конъюгированным козьим антителом против мышиного IgG1 (Southern Biotechnology) при комнатной температуре в течение одного часа и проявляли хемилюминисценцией.

2.8. In situ иммуногистохимия

Человеческие ткани получали из Центра по поставке тканевых материалов (Tissue Procurement Center of UAB). Замороженные срезы фиксировали в 70% этаноле, блокировали 10% лошадиной сывороткой в PBS, а затем инкубировали с 10 мкг/мл аффинноочищенного TRA-8 при комнатной температуре в течение 60 минут. Для визуализации реактивности использовали набор с АВС против мышиного IgG с диаминобензидином (Vector, Burlingame, CA) в качестве колориметрического субстрата.

2.9. Анализ активации каспазы

Клетки Jurkat (1Ч10⁶/мл) инкубировали с 500 нг/мл TRA-8. Аликвоты (30 мкг белка) клеточного лизата разделяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ с ДСН, подвергали блот-анализу на найлоновой мембране и полученные блоты зондировали антителами против каспазы 8, 9 и 3 (BD Pharmingen, San Diego, CA), а затем HRP-конъюгированным "вторым" антителом, после чего продукты расщепления визуализировали посредством хемилюминисценции. Набор ингибиторов каспазы закупали у R&D Systems (Minneapolis, MN). Каждый ингибитор каспазы добавляли в культуру в указанных концентрациях.

Пример 3. Очистка моноклонального антитела TRA-8

Гибридому "мышь-мышь", TRA-8, культивировали до плотности 1×10⁶ клеток/мл путем инкубирования в 500 мл среды ASF, содержащей 10% об./об. FCS, при 37°С в присутствии 5% об./об. СО₂ в течение 5 дней. Затем культуру центрифугировали (1000 об/мин, 5 минут) и супернатант собирали. Выделение TRA-8 из супернатанта осуществляли с помощью аффинной хроматографии на комплексе белок G-сефароза CL-4В (Pharmacia) при следующих условиях:

Колонка: колонка с белком G-сефарозой CL-4В (размер колонки 2 мл; Pharmacia);

Элюирующий буфер: 0,1 М глицин (рН 2,4), 0,15 М NaCl;

Нейтрализующий буфер: 1 М Трис-HCl (pH 8,5).

После нанесения всего супернатанта на колонку ее три раза промывали 20 мл PBS, а затем 1 мл элюирующего буфера добавляли 10 раз. После этого измеряли оптическую плотность каждой проэлюированной фракции (1 мл). Фракции 2-5 (с OD₂₈₀=0,1) собирали отдельно.

После добавления 100 мкл нейтрализующего буфера элюаты отдельно помещали в трубку для диализа и элюаты диализовали против 1 литра PBS (рН 7,5) при 4°С. Буфер для диализа меняли два раза. Этот образец анализировали на активность антитела против DR5 с помощью ELISA и с использованием гибридного белка "человеческий DR5-IgG", полученного методом, описанным выше.

Пример 4. Получение антигена DR4, DR4-IgG-экспрессирующего вектора и моноклонального антитела против DR4

В целях получения антигена DR4, который был использован, как описано в примерах 1.2-3 для продуцирования моноклонального антитела против DR4, повторяли процедуры примеров 1-3 с использованием кДНК-матрицы DR4 и праймеров вместо тех, которые были использованы в примере 1.

Пример 5. Моноклональные антитела против DcR1 и DcR2

Моноклональные антитела против рецепторов-ловушек DcR1 и DcR2 продуцировали для получения соответствующих антигенов путем замены соответствующих кДНК и праймеров, как описано в примере 1. Экспрессирующие векторы для DcR1- или DcR2-гибридов с иммуноглобулином G и очищенные моноклональные антитела получали, как описано в примерах 2 и 3.

Пример 6. Специфичность моноклонального антитела

Поскольку все рецепторы TRAIL и другие белки семейства TNFR имеют значительную гомологию, то специфичность рассматриваемого антитела TRA-8 против DR5 определяли с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием двух различных гибридных белков "человеческий DR5-IgG" и растворимых рекомбинантных форм других родственных белков. Первый гибридный белок DR5-Ig конструировали путем лигирования кДНК, кодирующей остатки 1-180 внеклеточной области DR5, и кДНК, кодирующей константную область человеческого IgG1. Гибридную кДНК клонировали в рекомбинантный аденовирусный вектор (Quantum Biotechnologies Inc., Montreal, Canada). Экспрессированный гибридный белок DR5/hIgG1, который имел относительную молекулярную массу 50 кДа, очищали с использованием аффинной колонки с антителом против человеческого IgG (Sigma, St. Louis, MO). Для проведения Вестерн-блот-анализа на специфичность второй гибридный рекомбинантный белок "человеческий DR5-IgG1" (аминокислоты 52-212), а также гибридные белки TRAIL-R1, R3 и R4 закупали у Alexis. Растворимые формы человеческого Fas и TNFR1 были любезно предоставлены Dr.Carl Edwards of Amgen, Inc., Thousands Oaks, CA, USA. Используемые растворимые рекомбинантные молекулы человеческих DR4, DcR1, DcR2, TNFR1, R4 и Fas представляют собой белки-гибриды с человеческим IgG1. 0,5 мкг каждого белка разделяли с помощью электрофореза в 10% ПААГ с ДСН и подвергали блот-анализу на нитроцеллюлозной мембране. Блоты блокировали 5% сухим молоком в PBS при комнатной температуре в течение одного часа и зондировали 1 мкг/мл очищенного моноклонального антитела против DR5 (клон: TRA-8) или 0,1 мкг/мл HRP-конъюгированного козьего антитела против человеческого IgG в течение ночи при 4°С. Конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) козье антитело против человеческого IgG использовали в качестве "второго" антитела для детекции связанного TRA-8. Блоты проявляли посредством хемилюминесценции.

Клетки Cos-7, трансфецированные вектором pcDNA3 (Clontech, Palo Alto, CA), содержащим полноразмерный DR5 или DR4, или пустым вектором, использовали для анализа методом проточной цитометирии. Полноразмерную кДНК, кодирующую человеческий TRAIL или мышиный Fas-лиганд, клонировали в вектор pTRE ниже от регулируемого тетрациклином промотора (Clontech). Затем XhoI-HindIII-фрагменты pTRE-hTRAIL или pTRE-mFasL клонировали в аденовирусный челночный вектор pAdBN (Quantum Biotechnologies, Inc.). Клетки-хозяева 293 котрансфецировали линеаризованным pAd-pTRE-hTRAIL или pAd-pTRE-mFasL и большим фрагментом ДНК аденовируса. Экспрессию функционального человеческого TRAIL или мышиного Fas-лиганда из рекомбинантных вирусных бляшек скринировали с помощью анализа на высвобождение ⁵¹Cr клетками Jurkat, используемыми в качестве мишеней.

TRA-8 сильно реагировало с гибридным белком DR5-IgG (˜50 кДа), который использовали для иммунизации, как показано на фиг.1а, DR5, #1, и слабо реагировало со вторым гибридным белком DR5-IgG (˜60 кДа), как показано на фиг.1а, DR5, #2. Какого-либо значительного связывания TRA-8 с DR4, DcR1, DcR2, Fas (CD95) или TNFR1 не наблюдалось. Эти результаты показали, что TRA-8 распознает эпитопы, которые являются специфичными для DR5, но не для других членов этого семейства.

TRA-8 не реагировало с другими членами суперсемейства TNF-рецепторов, такими как Fas (CD95) и TNF-рецептор I, а также не обнаруживало перекрестной реакции с мышиным гомологом DR5, на что указывают отношения оптической плотности при 450 нм и 650 нм, где нижняя панель пронумерована 1-7 (фиг.1а, столбец 8 нижней панели). Растворимые TRAIL и TRA-8 показали сравнимое связывание с иммобилизованным DR5 (фиг.1b, левая панель). В противополoжность этому TRAIL связывался с DR4, а TRA-8 не обнаруживал какой-либо связывающей активности с DR4 (фиг.1b, средняя панель). Величины Kd для связывания TRAIL и TRA-8 с DR5 оценивали при 59 нМ и 3 нМ соответственно. Важно отметить, что TRA-8 эффективно конкурирует с TRAIL за связывание с DR5, но не за связывание с DR4, как было показано в конкурентном ELISA (фиг.1b, правая панель). Эти результаты подтверждают специфичность TRA-8 по отношению к человеческому DR5.

TRA-8 способно детектировать экспрессию DR5 на клеточной поверхности, причем анализ, проводимый методом проточной цитометрии, указывал на специфическое связывание с поверхностью клеток Cos-7, трансфецированных полноразмерным человеческим DR5, но не с поверхностью клеток Cos-7, трансфецированных DR4 или пустым вектором (фиг.1с). Аналогичным образом, иммуногистохимия in situ с использованием TRA-8 продемонстрировала реактивность с клетками Cos-7, трансфецированными полноразмерной ДНК DR5, но не с клетками, трансфецированными контрольным вектором (фиг.1d). TRA-8 не индуцирует апоптоз нетрансфецированных клеток Cos-7, а ОТ-ПЦР РНК от клеток Cos-7, проводимая с использованием парных праймеров, кодирующих человеческий DR5, указывала на отсутствие специфичных ПЦР-продуктов. Последующий функциональный анализ с использованием человеческих клеток Jurkat в качестве мишеней показал, что в отсутствие перекрестного связывания TRA-8 сильно индуцирует гибель клеток, как было продемонстрировано в трех различных анализах на жизнеспособность клеток, включая эксклюзионные анализы ATPLite, МТТ и PI (фиг.1е). Более 50% клеток Jurkat погибали под действием нанограммовых уровней TRA-8, как показал анализ ATPLite. Киллерная активность антитела TRA-8 была специфичной по отношению к DR5, поскольку она могла блокироваться гибридным белком DR5-Ig, но не гибридным белком DR4-Ig (данные не приводятся). Расщепление каспаз 8, 9 и 3 может быть детектировано с помощью Вестерн-блот-анализа, по крайней мере, через 30 минут после TRA-8-обработки клеток Jurkat (фиг.1f), а гибель клеток Jurkat полностью ингибировалась общим ингибитором каспаз (Z-VAD) (фиг.1g). Ингибиторы отдельных каспаз, специфичные для каспаз 8, 3, 9 и 10, частично ингибировали гибель клеток, что дополнительно указывало на то, что TRA-8-опосредованная гибель клеток происходит, главным образом, по механизму каспазо-зависимого апоптоза.

Пример 7. Проточный цитометрический анализ на экспрессию DR5 клеточной поверхности: главный рецептор гибели присутствует на многих опухолевых клетках, но не присутствует на нормальных клетках

Способность TRA-8 к связыванию с DR5, экспрессированным на клеточной поверхности, и специфичность этой реакции оценивали с использованием клеток COS-7 (Американская коллекция типовых культур № CRL-1651), трансфецированных экспрессирующим вектором, содержащим полноразмерную кДНК человеческого DR5 или DR4, или пустым вектором, используемом в качестве контроля. Конъюгированное с фикоэритрином (РЕ) антитело против мышиного IgG1 (Pharmingen) использовали в качестве "второго" антитела для детекции связанного TRA-8. Флуоресценцию 1×10⁴ клеток измеряли на проточном цитометре (FACSVantage) при следующих условиях:

Длина волны возбуждения: 488 нм;

Длина волны детекции: 600 нм.

Проточный цитометрический анализ показал, что TRA-8 окрашивало приблизительно 30% клеток COS-7, трансфецированных DR5-вектором, на что указывала заштрихованная гистограмма на фиг.1с. Этот процент соответствует эффективности трансфекции, определенной с помощью анализа на трансфекцию, проводимого с использованием белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра (GFP) (данные не приводятся). TRA-8 не давало значительного окрашивания клеток, трансфецированных либо DR4 (незаштрихованная гистограмма), либо контрольным вектором (пунктирная гистограмма), что указывало на то, что TRA-8 является специфичным для DR5 клеточной поверхности.

Несмотря на широкие исследования экспрессии DR5 в опухолевых клетках на мРНК-уровне (пожалуйста, вставьте ссылку), механизм поверхностной экспрессии DR5 точно неизвестен. Таким образом, наличие моноклонального анти-DR5 антитела позволило авторам настоящего изобретения оценить уровни экспрессии DR5 на клеточной поверхности и выявить корреляцию экспрессии с чувствительностью клеток к TRAIL-опосредованному апоптозу. Нижеследующую панель клеток (1×10⁶) инкубировали с 10 мкг/мл аффинноочищенного TRA-8 при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем окрашивали PE-конъюгированным антителом против мышиного IgG1 (Pharmingen) в течение еще 30 минут. 10000 жизнеспособных клеток анализировали на проточном цитометре FACSVantage при следующих условиях:

Длина волны возбуждения: 488 нм;

Длина волны детекции: 600 нм.

Было протестировано пять гемопоэтических клеточных линий: Jurkat, СЕМ-6, Molt-4, Н-9 и U937. Экспрессия DR5 наблюдалась на поверхности клеток Jurkat, СЕМ-6, Н-9 и U937, но почти не обнаруживалась на клетках Molt-4, как показано на фиг.2а и 2а'. Хотя высокие уровни экспрессии РНК DR5 были описаны ранее (43), однако FACS-анализ показал, что эти клетки не экспрессируют высоких уровней поверхностного DR5. Эти результаты показали, что экспрессия DR5 на клеточной поверхности не коррелирует с транскрипционной экспрессией DR5, что не является неожиданным для данного рецептора. Уровень экспрессии DR5 на клеточной поверхности может быть специфическим в отношении клеточных линий дифференцировки, поскольку большинство клеток гемопоэтического происхождения экспрессировали низкие уровни DR5, тогда как большинство клеток глиомы и предстательной железы экспрессировали высокие уровни DR5.

Моноклональное антитело TRA-8 использовали для определения роли DR5 в индуцировании TRAIL-опосредованного апоптоза путем оценки панели различных типов опухолевых клеток человека на его экспрессию на клеточной поверхности, а также на чувствительность этих клеток к TRAIL- и TRA-8-опосредованному апоптозу. Первичные Т-клетки периферической крови не экспрессировали значительных уровней DR5 на своей клеточной поверхности и были резистентными к TRAIL- и TRA-8-опосредованному апоптозу (фиг.2а, 2а' и 3а'). Хотя все пять протестированных клеточных линий Т-клеточного лейкоза человека экспрессировали детектируемые, но относительно низкие уровни DR5 клеточной поверхности, однако две из них (Jurkat и СЕМ-6) оказались в высокой степени восприимчивыми к TRAIL- и TRA-8-опосредованному апоптозу, что свидетельствовало о том, что для индуцирования апопотоза этих клеток достаточно одного DR5. Клетки Molt-4 и U937 были частично восприимчивыми к TRAIL-опосредованному апоптозу, но относительно резистентными к TRA-8-опосредованному апоптозу, что позволяет предположить, что другие TRAIL-рецепторы могут участвовать в передаче сигнала апоптоза. Клетки Н-9 являются резистентными к TRAIL- и TRA-8-опосредованному апоптозу, что позволяет сделать вывод о блокировании, опосредуемом внутриклеточным антиапоптотическим механизмом.

Панель клеток включала клеточные линии злокачественной глиомы человека, Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, СН235MG, U87 и нормальные астроциты человека, которые были предоставлены Dr. Yancey Gillespie of the Neurosurgery Department of the University of Alabama at Birmingham. Клеточные линии рака предстательной железы человека, Du154, PC3 и LnCap, были предоставлены Dr. William Grizzle of the Pathology Department of the University of Alabama at Birmingham, который получал указанные клеточные линии из Американской коллекции типовых культур. Т-клеточные линии лейкоза человека, В-клеточную линию лимфомы, клетки Jurkat НерG2 (Американская коллекция типовых культур TIB-152) и CCRF-CEM СЕМ-6 (Американская коллекция типовых культур CCL-119); моноцитарные клеточные линии, U937 (Американская коллекция типовых культур CRL-2367) закупали в Американской коллекции типовых культур. Все вышеуказанные клеточные линии культивировали в среде RPMI 1640, в которую была добавлена 10% FCS. Клеточная линия астроцитомы человека, 1321N1, была любезно предоставлена Dr. Richard Jope of Psychiatry Department of the University of Alabama at Birmingham и была культивирована в среде DMEM с добавлением 5% FCS.

Растворимый рекомбинантный человеческий TRAIL, закупленный у Alexis Corporation (San Diego, CA), представляет собой гибридный белок, состоящий из внеклеточного домена человеческого TRAIL (аминокислотные остатки 95-281), присоединенного у N-конца к FLAG-метке, и линкерного пептида из 8 аминокислот. В отличие от ранее описанного His-меченного TRAIL этот препарат из одного TRAIL не индуцирует сильный апоптотический ответ в клетках Jurkat, и для усиления апопотоза требуется присутствие антитела против FLAG в качестве перекрестно-связывающего агента. Антитело против FLAG также закупали у Alexis.

Все 10 протестированных злокачественных клеток глиомы человека экспрессировали детектируемые уровни DR5 на клеточной поверхности. Большинство из них экспрессировали DR5 от промежуточных до высоких уровней, как показано на фиг.2b. Три линии, D54-MG, U373MG и СН235-MG, экспрессировали высокие уровни DR5, тогда как шесть линий, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SМК1 и 1321N1, экспрессировали промежуточные уровни DR5. Только одна клеточная линия, Н-465, экспрессировала низкие уровни DR5. Все три клеточные линии рака предстательной железы экспрессировали высокие уровни DR5, как показано на фиг.2с.

Как и нормальные первичные Т-клетки, первичные В-клетки не экспрессировали значительных уровней DR5 и не подвергались апоптозу после обработки TRAIL или TRA-8 (фиг.2d). Три (SКW6.4, EB-3 и Raji) из четырех протестированных клеточных линий В-лимфомы экспрессировали относительно высокие уровни DR5 и были очень чувствительными к TRAIL- и TRA-8-опосредованному апоптозу. Четвертая клеточная линия, Daudi, экспрессировала очень низкие уровни DR5 и была гораздо менее чувствительна к TRAIL- и TRA-8-опосредованному апоптозу. Хотя первичные астроциты не экспрессировали детектируемых уровней DR5 клеточной поверхности (фиг.2b'), однако все четыре протестированные глиомные клеточные линии экспрессировали высокие уровни DR5. Более высокий уровень экспрессии DR5 на глиомных клетках в отличие от Т- и В-клеток не сопровождался значительно более высокой чувствительностью к TRAIL- и DR5-опосредованному апоптозу, что давало основание предположить, что уровень экспрессии DR5 на клеточной поверхности необязательно должен коррелировать с уровнем апоптоза опухолевых клеток. ОТ-ПЦР, проводимая для определения уровней переноса DR4, DR5 и DcR2, обнаруживала перенос этих рецепторов во все протестированные клетки (таблица 1). Однако в основном первичные нормальные клетки экспрессировали относительно низкие уровни DR5 по сравнению с трансформированными опухолевыми клетками.

Таблица 1 ОТ-ПЦР-анализ экспрессии TRAIL-рецептора*
Клетки	DR5	DR4	DcR2
Первичные Т-клетки	<0,001	<0,001	0,015
Jurkat	0,10	<0,001	0,21
CEM-6	0,50	0,59	0,25
Molt-4	0,10	<0,001	0,05
H-9	0,73	0,61	0,07
Превичные В-клетки	<0,001	<0,001	0,024
SKW6.4	0,95	0,66	0,45
EB3	0,40	<0,001	0,35
Raji	0,55	0,11	0,45
Daudi	0,73	0,36	0,63
Нормальные астроциты	0,05	<0,001	0,12
SH683	0,56	0,96	0,14
U87	0,44	0,56	0,21
D54	1,15	0,46	0,12
1321N1	0,25	0,35	0,05
Полноразмерную РНК выделяли из клеток и ОТ-ПЦР осуществляли, как описано в Методах. ПЦР-продукты разделяли на 3% агарозном геле и анализировали с использованием системы Fluor-S MAX MiltiImager System (BioRad). Величины представлены как отношения к значению для β-актина.

Пример 8. Индуцирование апопотоза in vitro в злокачественных клетках

Для того чтобы определить, индуцирует ли TRA-8 апоптоз в трансформированных клетках in vitro, все DR5-положительные опухолевые клетки оценивали на их чувствительность к апопотозу, индуцированному TRA-8 или TRAIL.

Клетки-мишени (1×10³ на лунку) культивировали в 96-луночных планшетах в присутствии указанных концентраций растворимого TRAIL вместе с перекрестно-связывающим агентом (Alexis) или TRA-8 при 37°С в течение ночи. Жизнеспособность клеток определяли с использованием (1) набора ATPLite в соответствии с инструкциями производителей (Packard Instruments, Meriden, CT); (2) набора для оценки пролиферации/жизнеспособности клеток МТТ (Sigma) или (3) PI-окрашивания погибших клеток и клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. После завершения культивирования клетки окрашивали 10 мкг/мл PI и PI-негативные клетки отсортировывали как жизнеспособные клетки. Для анализа конденсированных ядер гепатоцитов клетки окрашивали 10 нг/мл Hoechst 33352 (Molecular Probes) и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Антитело TRA-8 оказалось способным индуцировать апоптоз у большинства злокачественных глиомных клеточных линий человека (9/10), у 2 из 3 раковых клеточных линий предстательной железы и у 2 из 4 DR5-положительных гемопоэтических клеточных линий. Это антитело не индуцировало апоптоз клеточной линии Molt-4, которая экспрессирует на своей поверхности почти недетектируемые уровни DR5. Однако среди указанных клеточных линий уровни чувствительности клеток к TRA-8-опосредованнному апоптозу значительно варьируются.

Вариабильность чувствительности указанных клеток к индуцированному антителом TRA-8 апоптозу дает основание предположить, что, хотя для такой чувствительности требуется минимальный уровень экспрессии DR5 на клеточной поверхности, этот уровень экспрессии DR5 на клеточной поверхности необязательно является главным определяющим фактором чувствительности, и на этот процесс влияют другие факторы. Несмотря на то, что все клетки глиомы в основном экспрессировали значительно более высокие уровни поверхностного DR5, чем гемопоэтические клетки, чувствительность глиомных клеток к TRA-8-индуцированному апоптозу в отличие от гемопоэтических клеток не увеличивалась пропорционально. Чувствительность пяти клеточных линий глиомы D37-MG, D54-MG, U373-MG, СН235-MG и 1321N1 к TRA-8-опосредованному апоптозу является высокой и эквивалентна их чувствительности к TRAIL-опосредованному апоптозу, как показано на фиг.3b. Две глиомные клеточные линии, Н-456 и SМК1, гораздо менее восприимчивы к апоптозу, индуцированному TRA-8. В случае клеток Н-456 экспрессия поверхностного DR5 является низкой; однако у более чувствительных клеточных линий экспрессия DR5 на поверхности SМК1 является аналогичной, что позволяет предположить, что в определении чувствительности к TRAIL-опосредованному апоптозу могут играть определенную роль и другие механизмы. Хотя все три клеточные линии рака предстательной железы экспрессировали высокие уровни DR5, однако клетки Du145 являются наиболее чувствительными к TRA-8-опосредованному апоптозу, клетки РС3 являются частично чувствительными, а клетки LnCAP являются полностью резистентными к апоптозу, как показано на фиг.3с. Было обнаружено, что среди гемопоэтических клеток клетки Jurkat и СЕМ-6 являются очень восприимчивыми к TRA-8-апоптозу, как показано на фиг.2а, хотя обе эти клеточные линии, как было обнаружено, экспрессировали низкие уровни DR5. Несмотря на то что DR5 был детектирован на клетках U937, эти клетки оказались резистентными к TRA-8-опосредованному апоптозу. Аналогичным образом, хотя клетки Н-9 экспрессировали детектируемые уровни DR5, клетки Н-9 были резистентными к TRA-8-опосредованному апоптозу. Эти результаты подтвердили существование регуляторных механизмов, влияющих на DR5-опосредованный апоптоз.

Дополнительные антитела против DR5, связывающиеся с поверхностью клеток, были продуцированы, как описано в процедурах примеров 1-3. Два дополнительных антитела против DR5, обозначенных TRA-1 и TRA-10, исследовали вместе с TRA-8 для определения их относительной способности индуцировать апоптоз и для того, чтобы установить, действуют ли они как агонисты или, наоборот, блокируют TRAIL-опосредованный апоптоз, то есть действуют как антагонисты. Человеческие клетки Jurkat были использованы в качестве мишени для определения агонистической и/или антагонистической активности трех антител против DR5, обозначенных TRA-1, TRA-8 и TRA-10. Как показано на фиг.4, после инкубирования в течение ночи с 2,5 мкг на мл жизнеспособность клеток составляла примерно 90%, 70% и 20% для TRA-10, TRA-1 и TRA-8 соответственно. Антитело TRA-8 индуцировало сильный апоптотический дозозависимый ответ, TRA-1 индуцировало лишь умеренный апоптотический ответ, а TRA-10 индуцировало лишь слабый ответ. Поэтому TRA-8 было классифицировано как антитело-агонист против DR5. На фиг.4 жизнеспособность человеческих клеток Jurkat показана как дозозависимая функция TRAIL-индуцированного апоптоза. В исследовании апоптоза, индуцированного низкими дозами TRAIL, TRA-10 в значительной степени блокировало апоптоз человеческих клеток Jurkat. Таким образом, TRA-10 было классифицировано как антитело-антагонист против DR5.

Чувствительность пяти глиомных клеточных линий, D37-MG, D54-MG, U373-MG, СН235-MG и 1321N1, к TRA-8-индуцированному апоптозу эквивалента их чувствительности к TRAIL-опосредованному апоптозу, как показано на фиг.3b, что указывало на то, что TRAIL-индуцированный апоптоз в этих клетках опосредуется, главным образом, DR5. Кроме того, две глиомные клеточные линии, Hs683 и U251-MG, являются резистентными к TRAIL-индуцированному апоптозу, но частично чувствительными к TRA-8-индуцированному апоптозу, что указывает на то, что в этих клетках функционируют рецепторы-ловушки и что использование антитела TRA-8 позволяет "обходить" этот регуляторный механизм. В клеточных линиях рака предстательной железы, несмотря на их варьирующуюся чувствительность к TRA-8-индуцированному апоптозу, эта чувствительность коррелирует с чувствительностью клеток к апоптозу, индуцированному TRAIL, что снова позволяет предположить, что DR5 играет главную роль в TRAIL-опосредованном апоптозе раковых клеток предстательной железы. Было обнаружено, что из гемопоэтических клеток клетки Jurkat и СЕМ-6 являются очень чувствительными к TRA-8- и TRAIL-опосредованному апоптозу. Уровень апоптоза, индуцированного TRA-8, аналогичен уровню апоптоза, индуцированному TRAIL, как показано на фиг.2а и 3а'. Лишь одна глиомная клеточная линия, U87, и две гемопоэтические клеточные линии, U937 и Molt-4, обнаруживали чувствительность к TRAIL-индуцированному апоптозу, но при этом они были менее чувствительными или вообще резистентными к TRA-8-индуцированному апоптозу. Одна клеточная линия, Н-9, экспрессировала детектируемые уровни DR5, но была резистентной к апоптозу, индуцированному TRA-8 или TRAIL. Хотя для TRA-8-индуцированного апоптоза требуются минимальные уровни экспрессии DR5, уровень экспрессии DR5 необязательно является показателем чувствительности клеток к TRA-8-опосредованному апоптозу, поскольку в некоторых клетках, в модуляции TRAIL-опосредованного апоптоза определенную роль играют рецепторы-ловушки, но не очевидно, что они играют главную роль в большинстве тестируемых ранее клеток, а поэтому, как и ожидалось, использование антитела TRA-8 позволяет "обходить" действие этих рецепторов-ловушек; при этом в трансформированных клетках могут присутствовать функциональные мутации рецептора DR5; и наконец, внутриклеточные регуляторные механизмы могут иметь важное или даже более весомое значение для определения чувствительности клеток к TRAIL- и DR5-опосредованному апоптозу, чем рецепторы-ловушки.

Проведенные ранее исследования показали, что мРНК DR5 имеет широкое распределение в нормальных тканях⁷. Для оценки экспрессии DR5 на белковом уровне панель гомогенатов нормальной ткани человека (Geno Technology, St. Louis, MO) зондировали антителом TRA-8 в Вестерн-блот-анализе. Из девяти нормальных человеческих тканей ткань головного мозга была слабо положительной (фиг.5а, дорожка 2). Реактивность TRA-8 не обнаруживала белок DR5 в печени (дорожка 1), легком (дорожка 3), почках (дорожка 4), селезенке (дорожка 5), яичках (дорожка 6), яичниках (дорожка 7), сердце (дорожка 8) или в поджелудочной железе (дорожка 9). В противоположность этому все тринадцать раковых тканей человека были позитивно окрашены TRA-8 (фиг.5b), включая раковые ткани яичника (дорожка 1), легкого (дорожка 2), печени (дорожка 3), прямой кишки (дорожка 4), шейки матки (дорожка 5), кожи (дорожка 6), яичек (дорожка 7), щитовидной железы (дорожка 8), матки (дорожка 10), желудка (дорожка 11), носоглотки (дорожка 12) и поджелудочной железы (дорожка 13). Кроме того, иммуногистохимический анализ in situ нормальных и раковых тканей с использованием TRA-8 подтвердил, что за исключением нескольких разрозненных положительных клеток в селезенке экспрессия DR5 в нормальных тканях молочной железы, легких и селезенки не детектировалась (фиг.5с). Соответствующие раковые ткани, включая инфильтрирующую дуктальную карциному молочной железы, мелкоклеточный рак легких и лимфому, положительно реагировали с TRA-8 (фиг.5d). Из всех протестированных 22 раковых тканей 5 из 6 тканей рака молочной железы, 2 из 2 тканей рака шейки матки, 4 из 5 тканей рака печени, 5 из 8 лимфом, 2 из 2 тканей рака легких и 2 из 2 тканей рака поджелудочной железы положительно реагировали с TRA-8. Эти результаты совпадают с результатами, полученными в проточном цитометрическом анализе, и указывают на то, что раковые ткани экспрессируют более высокие уровни DR5, чем нормальные ткани.

Пример 9. Опухолецидная активность TRA-8 in vivo

По различным причинам многие агенты, которые давали обещающие результаты в in vitro исследованиях, не обнаруживали эффективности in vivo. Поэтому важно проанализировать эффективность TRA-8 на модели животного in vivo. Для этого антитело TRA-8 против человеческого DR5 вводили мышам, несущим ксенотрансплантаты человека, которые экспрессируют молекулу человеческого DR5. В этих целях использовали 6-8-недельных мышей NOD/SCID (Jackson Laboratory), которым подкожно инъецировали клетки астроцитомы человека 1321N1 (1×10⁷), либо внутривенно инъецировали клетки лейкоза Jurkat человека (1×10⁶). На 2-й день после инокуляции опухолью мышам внутривенно инъецировали TRA-8 (100 мкг). Через пять дней после TRA-8-обработки рост опухолевых клеток 1321N1 определяли по размеру и массе опухоли. Рост клеток Jurkat определяли по массе селезенки и по проценту CD3-положительных человеческих клеток Jurkat в селезенке инокулированных животных. Затем брали биопсию опухолевых тканей и проводили гистологический анализ.

Ранняя обработка одной внутривенной дозой 100 мкг TRA-8 через один день после инокуляции опухолью приводила к полному ингибированию клеток 1321N1 в образовавшейся солидной опухоли (фиг.6а). Поздняя обработка тремя дозами 100 мкг TRA-8 через одну неделю после инокуляции опухолью приводила к 4-кратному или более уменьшению массы опухоли (фиг.6b). Образование опухоли не наблюдалось у животных, рано обработанных TRA-8 (фиг.6с, верхняя панель). Гистологический анализ выявил резкую дегенерацию опухолевой ткани у животных, обработанных TRA-8 (фиг.6с, нижняя панель). Аналогичным образом, TRA-8-обработка ингибировала заселение селезенки клетками Jurkat, на что указывал дефицит CD3-положительных клеток Jurkat в селезенке (фиг.6d, 6е). Гистологический анализ имплантированной опухоли выявил несколько разрозненных опухолевых клеток мягкой ткани TRA-8-обработанных животных, тогда как у контрольных животных обнаруживалось образование солидной опухоли, как показано на фиг.6с. В модельных клетках Jurkat число клеток Jurkat в селезенке у TRA-8-обработанных животных составляло менее 2% в отличие от почти 10%-ного их содержания в селезенке контрольных животных, как было продемонстрировано в проточном цитометрическом анализе, проиллюстрированном на фиг.6а, и при in situ CD3-окрашивании, как показано на фиг.6с.

Эти результаты подтверждают недавно полученные данные, указывающие на то, что системное введение перекрестно-связанного рекомбинантного TRAIL приводит к ингибированию роста опухоли in vivo (13). Эти результаты показали, что одна доза TRA-8 является в высокой степени эффективной в элиминации опухолевых клеток in vivo.

Поскольку в мышиной модели использовали античеловеческое антитело, то в оценке токсичности TRA-8-обработки не было необходимости. Однако исследование введения TRAIL in vivo показало, что указанная обработка не ассоциируется с какой-либо значительной токсичностью (13).

Пример 10. Синовиальные РА-клетки являются чувствительными к TRAIL- и TRA-8-индуцированному апоптозу

Большинство предшествующих исследований по TRAIL-опосредованному апоптозу было направлено на злокачественные клетки. В соответствии с настоящим изобретением TRAIL-опосредованный апоптоз имеет также терапевтический эффект при аутоиммунных и воспалительных состояниях, таких как РА.

10.1. Проточный цитометрический анализ экспрессии DR5 на клеточной поверхности синовиальных клеток при РА

Экспрессию DR5 на панели из восьми первичных культивированных синовиальных клеток у пациентов с РА сравнивали с экспрессией DR5 на панели из восьми первичных культивированных синовиальных клеток у пациентов с остеоартритом (обозначаемым далее "ОА"). Восемь клеточных культур первичных человеческих синовиальных РА-клеток: RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 и RA-929, были любезно предоставлены Dr. M. Ohtsuki (Sankyo Co. Ltd., Tokyo, Japan) и культивированы в DMEM, в которую были добавлены 10% FCS, пенициллин, стрептомицин и глутамин. Семь первичных клеточных культур синовиальных клеток ОА выделяли из синовиальных тканей пациентов с ОА стандартным методом с использованием коллагеназы и культивировали в тех же условиях. Число пассажей всех первичных клеток составляло 10. Экспрессию DR5 определяли с помощью FACS-анализа, как описано в примере 5.

Все первичные культуры РА-клеток экспрессировали высокие уровни поверхностного DR5, и у этих синовиальных клеток, выделенных у различных пациентов, как показано на фиг.7а, наблюдалось небольшое различие в уровнях экспрессии. В противоположность этому экспрессия DR5 на поверхности синовиальных клеток, выделенных у пациентов с ОА, была либо очень низкой, либо вообще не детектировалась, как показано на фиг.7b. Было обнаружено, что SV40-трансформированные синовиальные клетки экспрессировали высокие уровни DR5, сравнимые с уровнями, экспрессируемыми РА-клетками. В противоположность этому нетрансформированные клетки фибробластов экспрессировали низкие уровни DR5, сравнимые с уровнями, экспрессируемыми ОА-клетками, как показано на фиг.7b.

10.2. Чувствительность синовиальных РА-клеток к апоптозу, опосредованному TRA-8 или TRAIL

В основном все синовиальные клетки, выделенные у пациентов с РА, были чувствительными к апоптозу, индуцированному TRAIL и антителом против DR5, а все ОА-клетки были резистентными к апоптозу, индуцированному TRAIL и антителом против DR5, как показано на фиг.8а, b. Эти исследования показали, что антитело TRA-8 нацелено преимущественно на измененные клетки, а не на нормальные клетки. Кроме того, картина чувствительности или резистентности к апоптозу, индуцированному TRAIL, коррелирует с картиной чувствительности или резистентности к апоптозу, индуцированному антителом против DR5, что свидетельствует о том, что для запуска TRAIL-апоптоза синовиальные клетки используют, главным образом, DR5.

Как и у злокачественных клеток, у синовиальных РА-клеток чувствительность к апоптозу, индуцированному TRAIL или антителом против DR5, варьируется, хотя они экспрессируют аналогичные уровни DR5. RA-512 и RA-707 являются наиболее чувствительными, поскольку свыше 80% клеток уничтожались концентрациями TRAIL или TRA-8, составляющими менее 20 нг/мл. RA-1014, RA-811, RA-716 и RA-929 являются клетками с промежуточной чувствительностью к TRAIL или TRA-8, при этом почти 100%-ная гибель клеток наблюдалась в присутствии высоких концентраций (>50 мг/мл) TRAIL или TRA-8. Что касается клеток RA-1016 и RA-1021, то, несмотря на то, что большинство из них (свыше 60%) погибали при низкой дозе TRAIL или TRA-8, часть клеток выживала в присутствии высоких концентраций TRAIL или TRA-8, что свидетельствовало о том, что субпопуляция этих клеток была резистентной к TRAIL-опосредованному апоптозу. В противоположность этому все ОА-клетки были гораздо менее чувствительными к TRAIL- и TRA-8-индуцированному апоптозу. При этом даже в присутствии высокой концентрации TRAIL или TRA-8 погибало не более чем 60% клеток ОА52F и ОА69F. Клетки ОА72М были полностью резистентными к TRAIL- или TRA-8-индуцированному апоптозу. SV40-трансформированные синовиальные клетки также были чувствительными к TRAIL- и TRA-8-индуцированному апоптозу (данные не приводятся). В противоположность этому нетрансформированные клетки фибробластов являются, очевидно, резистентными к TRAIL и TRA-8.

Ранее было показано, что для запуска апоптоза DR5 использует путь, в котором участвует FADD/каспаза 8 (44). Для определения каспазо-зависимого DR5-опосредованного апоптоза синовиальных РА-клеток РА-клетки культивировали с TRAIL или антителом против DR5 в присутствии специфических ингибиторов каспазы. Из восьми протестированных ингибиторов каспазы ингибиторы каспазы 6, 8 и 10 обладали способностью ингибировать апоптоз синовиальных РА-клеток, индуцированный TRAIL и DR5, как показано на фиг.9, что указывало на то, что эти три каспазы участвуют в DR5-опосредованном апоптозе.

10.3 TRA-8 или TRAIL индуцируют активацию NF-κb в синовиальных РА-клетках, не приводящую к повышенному высвобождению ММР

Имеется значительное количество данных, подтверждающих идею о том, что существует тесная связь между передачей сигнала апоптоза и передачей сигнала пролиферации (45). Было установлено, что DR5, помимо передачи сигнала апоптоза, способен активировать NF-κb-путь и что активация NF-κb может способствовать передаче антиапоптотического сигнала. Поэтому был проведен анализ на сдвиг в геле. Клетки стимулировали 50 нг/мл рекомбинантного растворимого TRAIL, Fas-лиганда, в присутствии 1 мг/мл энхансера или 50 нг/мл TRA-8 в течение указанного времени. Получали ядерные экстракты и эти экстракты инкубировали с [³²Р]-меченным олиго-ДНК-зондом, подвергнутым двойному окрашиванию. Результаты анализировали с использованием люминофора Cyclone (TopCount NXT, Packard Instrument Company, CT). После инкубирования синовиальных РА-клеток с TNF-α или TRAIL клетки NF-κb активировались в зависимости от времени инкубирования. Антитело TRA-8 способствовало сильной активации NF-κb. В противоположность этому Fas-лиганд оказался неспособным индуцировать активацию NF-κb, как показано на фиг.10а.

Таким образом, хотя TRAIL и антитело TRA-8 индуцируют сильный апоптотический ответ в синовиальных РА-клетках, они также активируют NF-κb, а активация NF-κb, как известно, усиливает провоспалительное действие TNF-α при ревматоидном артрите (РА). Таким образом, возможно, что TRAIL, так же как и TNF-α, может служить в качестве провоспалительного цитокина. Для того чтобы определить, имеет ли TRAIL- и TNF-α-индуцированная активация NF-κb аналогичное биологическое действие, уровень продуцирования ММР определяли с помощью ELISA. Синовиальные клетки культивировали лишь в одной среде либо в среде с 50 нг/мг интерлейкина 1b, 10 нг/мл TNF-α, 50 нг/мг TRAIL или 50 нг/мл TRA-8 в течение ночи. Уровни ММР-1 и ММР-3 в супернатантах культуры определяли с использованием ELISA-наборов.

При инкубировании синовиальных РА-клеток с провоспалительным цитокином, TNF-α или IL-1b уровень продуцирования ММР-1, 3 и 13 увеличивался по сравнению с контролем, где использовалась среда, как показано на фиг.10b, c. В противоположность этому обработка TRAIL или антителом против DR5 не ассоциировалась с повышенным высвобождением указанных ММР.

Пример 11А. Отсутствие гепатоцеллюлярной токсичности

Для 24-часовых анализов на жизнеспособность клеток свежие нормальные гепатоциты человека в 96-луночных планшетах закупали у In Vitro Technology (Baltimore, MD). Гепатоциты культивировали в среде для культивирования гепатоцитов, содержащей 1 мкг/мл растворимого TRAIL или TRA-8. Для проведения 6-часовых анализов на жизнеспособность клеток нормальные гепатоциты или гепатоцеллюлярные раковые клетки выделяли из свежих хирургических образцов, взятых в Центре по поставке тканевого материала (UAB Tissue Procurement Center). Все реагенты для выделения гепатоцитов человека, включая буфер для перфузии гепатоцитов, среду для гидролиза, промывочную среду и среду для связывания, закупали у Gibco. Ткань на предметных стеклах гидролизовали в среде для гидролиза гепатоцитов при 37°С и со встряхиванием (50 об/мин) в течение одного часа. Выделенные гепатоциты собирали путем центрифугирования при низкой скорости (50 g, 3 мин) и 6 раз промывали средой для промывки гепатоцитов. Моноклеточную суспензию гепатоцитов культивировали в среде для связывания, содержащей 10% FCS, в 96-луночных планшетах Matrigel (BD) в течение шести часов. Несвязанные гепатоциты удаляли путем двойной промывки предварительно нагретой средой для связывания. Затем связанные гепатоциты инкубировали с различными концентрациями растворимого TRAIL или FasL в присутствии перекрестносвязывающего агента, TRA-8 или СН11 в течение 6 часов.

TRAIL имеет, по крайней мере, два рецептора (DR4 и DR5), способных индуцировать апоптоз. TRA-8 использовали для того, чтобы определить, достаточно ли одного перекрестного связывания DR5 для индуцирования апоптоза нормальных гепатоцитов. Экспрессию DR5 на белковом уровне оценивали в пяти нормальных тканях печени человека и в пяти раковых тканях печени человека посредством иммуногистохимического анализа in situ с использованием TRA-8. Срезы нормальных тканей печени обнаруживали нормальную архитектуру и морфологию клетки после окрашивания H&E (фиг.11а, левые верхние панели) в отсутствие положительной реакции с антителом TRA-8 против DR5 (фиг.11а, левые нижние панели). В противоположность этому гепатоцеллюлярная ткань карциномы человека положительно реагировала с TRA-8, причем картина этой реакции соответствовала присутствию DR5 на клеточной мембране и в цитоплазме раковых клеток. Клеточная линия человеческой гепатоцеллюларной карциномы человека НерG2 также была DR5-положительной. Эти результаты совпадали с результатами, полученными для пяти нормальных тканей печени, и лишь одна из пяти раковых тканей печени (аденома печени) оказалась DR5-отрицательной. Эти результаты совпадают с данными Вестерн-блот-анализа, представленными на фиг.5а и указывающими на то, что, как и в случае других нормальных тканей, нормальная ткань печени человека не экспрессировала значительных уровней белка DR5. Кроме того, Вестерн-блот-анализ выделенных нормальных гепатоцитов человека, зондированных TRA-8, не выявил детектируемых уровней DR5.

Экспрессия DR5 на поверхности человеческих гепатоцитов, обнаруженная в проточном цитометрическом анализе, показала, что свежеприготовленные нормальные гепатоциты не экспрессировали детектируемых уровней DR5 на клеточной поверхности (фиг.11b, верхние левые панели). DR5 не был детектирован на нормальных гепатоцитах человека, которые были подвергнуты криоконсервации или помещены в кратковременную культуру. В противоположность этому свежевыделенные клетки гепатоцеллюлярной карциномы, как и клетки НерG2, экспрессировали DR5 на своей поверхности. При использовании Fas для сравнения было выявлено, что все нормальные гепатоциты, гепатоцеллюлярные клетки карциномы и клетки НерG2 экспрессировали эквивалентные уровни Fas (фиг.11b, нижние панели). Эти результаты совпадают с результатами, полученными в иммуногистохимическом анализе in situ и в Вестерн-блот-анализе, и указывают на то, что DR5 в высокой степени экспрессируется на поверхности раковых клеток печени, но не на поверхности нормальных гепатоцитов. Присутствие мРНК-уровней для DR4, DR5, DcR1 и DcR2 в человеческих гепатоцитах, как было продемонстрировано с помощью ОТ-ПЦР²³, позволяет предположить, что гепатоциты человека могут экспрессировать очень низкие уровни белка DR5, которые составляют ниже пороговых уровней для детекции TRA-8.

Для того чтобы определить, индуцирует ли TRA-8 гепатоцеллюлярную токсичность, оценивали чувствительность нормальных гепатоцитов человека к апоптозу, индуцированному TRA-8 и растворимым TRAIL вместе с перекрестносвязывающим агентом. При культивировании нормальных гепатоцитов в присутствии высокой концентрации TRAIL наблюдалось зависимое от времени снижение жизнеспособности клеток, как было определено с помощью анализов ATPLite (фиг.12а) и МТТ. TRAIL-опосредованная гибель нормальных гепатоцитов могла наблюдаться уже через четыре часа после добавления TRAIL. После завершения 24-часового культивирования более 80% гепатоцитов погибали под действием TRAIL. В противоположность этому за аналогичный период культивирования TRA-8 не индуцировало значительной гибели нормальных гепатоцитов. Число конденсированных ядер, окрашенных Hoechst и являющихся индикаторами апоптоза, увеличивалось у TRAIL-обработанных гепатоцитов, но не у TRA-8-обработанных гепатоцитов (фиг.12b). Число апоптотических гепатоцитов явно коррелировало со снижением жизнеспособности клеток, как было определено в анализе ATPLite, что дает основание предположить, что TRAIL-индуцированная гибель гепатоцитов опосредована апоптозом. Это было подтверждено способностью Z-VAD ингибировать TRAIL-опосредованную токсичность гепатоцитов. Поскольку циклогексимид является сильным стимулятором апоптоза, то было проведено исследование действия этого соединения на TRAIL- и TRA-8-обработанные гепатоциты. Во время 4-часового культивирования циклогексимид значительно усиливал гибель гепатоцитов, индуцированную TRAIL, при этом более 70% гепатоцитов погибали под действием TRAIL в присутствии циклогексимида (фиг.12с). Однако обработка циклогексимидом не приводила к увеличению TRA-8-опосредованной гибели гепатоцитов. Для сравнения характеристик TRA-8-индуцированного апоптоза гепатоцитов с TRAIL-индуцированным апоптозом нормальные гепатоциты, а также раковые клетки инкубировали с различными концентрациями растворимого TRAIL вместе с перекрестносвязывающим агентом или с TRA-8. Во время 6-часового культивирования TRAIL индуцировал умеренный апопототический ответ у нормальных гепатоцитов. Свыше 20% гепатоцитов погибали в присутствии 500 нг/мл TRAIL (фиг.12d, верхняя левая панель). TRA-8-обработка нормальных гепатоцитов за тот же самый промежуток времени не приводила к какой-либо значительной клеточной гибели. В противоположность нормальным гепатоцитам первичные гепатоцеллюлярные клетки карциномы (фиг.12d, верхняя средняя панель) и клетки НерG2 (фиг.12d, верхняя правая панель) были в высокой степени чувствительны к апоптозу, опосредованному TRAIL или TRA-8. Свыше 80% гепатоцеллюлярных клеток карциномы и почти 100% клеток НерG2 погибали в течение 8-часового периода культивирования. Эти результаты показали, что нормальные гепатоциты являются полностью резистентными к TRA-8-опосредованному апоптозу и гораздо менее чувствительными к TRAIL-опосредованному апоптозу, чем раковые клетки печени. При использовании Fas-лиганда и антитела против Fas (СН-11) какого-либо значительного различия в чувствительности к Fas-опосредованному апоптозу нормальных гепатоцитов, гепатоцеллюлярных клеток карциномы и клеток НерG2 не наблюдалось (фиг.12d, нижние панели).

Сравнительный пример 11В. Индуцирование гепатита in vivo мембрано-ассоциированным TRAIL человека

8-10-недельным самкам мышей В6 внутривенно инъецировали 10⁹ б.о.е. Ad/hTRAIL с равным количеством Ad/Tet-on. Сразу после инокуляции аденовирусными векторами мышам давали питьевую воду с различными концентрациями тетрациклина. Поражение печени определяли по уровням AST в сыворотке с использованием диагностического набора AST (Sigma). Экспрессию TRAIL определяли с помощью Нозерн-блот-анализа.

Для того чтобы определить, индуцирует ли мембрано-ассоциированная форма TRAIL поражение печени in vivo, конструировали рекомбинантный аденовирусный вектор, кодирующий полноразмерный человеческий TRAIL (Ad/hTRAIL), экспрессия которого находится под контролем тетрациклин-индуцибельного промотора. Через 24 часа после внутривенной Ad/hTRAIL-инокуляции мышей В6 наблюдалась дозозависимая индуцированная тетрациклином экспрессия человеческого TRAIL в печени, как было продемонстрировано с помощью Нозерн-блот-анализа (фиг.13а). Уровни экспрессии TRAIL явно коррелировали с поражением печени, на что указывало тетрациклин-зависимое, а также дозозависимое увеличение уровней трансаминаз в сыворотке (фиг.13b). Поскольку инокуляция аденовирусным вектором самим по себе может приводить к увеличению чувствительности гепатоцитов к TRAIL-опосредованному апоптозу, то гепатоциты мышей, инокулированных Ad/TRAIL, выделяли и тестировали на TRAIL-опосредованную клеточную гибель. Какого-либо значительного увеличения клеточной гибели Ad/TRAIL-инфицированных гепатоцитов по сравнению с гепатоцитами контрольных мышей не наблюдалось (фиг.13с, левая панель). Более того, после внутривенной инъекции растворимого человеческого TRAIL у мышей, инокулированных Ad/TRAIL, не неблюдалось увеличения поражения печени. Из этого также следует, что гепатит, индуцированный Ad/TRAIL, опосредован высокими уровнями экспрессии TRAIL в мембранной форме. Гистологический анализ срезов печени выявил, что поражение гепатоцитов заметно уже через 24 часа после инокуляции вектором (фиг.13d) и сохраняется, по крайней мере, в течение 7 дней (фиг.13е). Эти патологические изменения в печени также зависят от тетрациклина и от дозы. На ранней стадии, через 24 часа после обработки, TRAIL-индуцированное поражение печени характеризовалась наличием очагов некроза. Инфильтрация воспалительных клеток не наблюдалась на этой стадии, но имела место геморрагия. На 7-й день после инокуляции наблюдались диффузные поражения печени с заметной дольковой неупорядоченностью, тяжелая дегенерация гепатоцитов с неравномерно комковатой структурой цитоплазмы и большими прозрачными областями, а также с явно выраженными апоптозом и некрозом. Характерным признаком этой стадии был обширный инфильтрат мононуклеарных клеток. Эти результаты показали, что человеческий TRAIL в его мембрано-ассоциированной форме способен индуцировать разрушение печени in vivo. Несмотря на способность человеческого TRAIL вызывать тяжелый гепатит у мышей, он не индуцировал летальный ответ. В противоположность этому у мышей, инокулированных аналогичными тетрациклин-регулируемыми векторами, кодирующими Fas-лиганд, развивался молниеносный гепатит с массивным апоптозом, и некроз гепатоцитов сопровождался тяжелой геморрагией и смертью животных в зависимости от дозы тетрациклина через 72 часа после инокуляции. В подгруппе, получавшей 3 мг/мл или более тетрациклина, смертность достигала 100% через 48 часов после инокуляции. В противоположность этому все мыши, получавшие Ad/hTRAIL, независимо от дозы тетрациклина были еще живы через четыре недели после инокуляции. Из этого следует, что in vivo TRAIL в своей мембрано-ассоциированной форме является менее сильным индуктором гепатоцеллюлярных повреждений, чем Fas-лиганд. Кроме того, это позволяет предположить, что TRAIL может индуцировать поражение печени по механизму, который отличается от механизма, вызывающего токсичность Fas-лиганда.

Пример 12. Активированные человеческие Т- и В-клетки экспрессируют повышенные уровни DR5

Для того чтобы определить, играет ли DR5 какую-либо роль в TRAIL-опосредованном апоптозе активированных Т-клеток и В-клеток, оценивали экспрессию DR5 на поверхности покоящихся и активированных Т- и В-клеток с использованием TRA-8. Нестимулированные человеческие Т-клетки в МКПК не экспрессировали повышенных уровней DR5 (фиг.14). Через 48 часов после стимуляции либо антителом против CD3, либо Con-A экспрессия DR5 на клеточной поверхности заметно увеличивалась. Аналогичным образом нестимулированные В-клетки экспрессировали очень низкие уровни DR5. Стимуляция анти-μ антителом, но не LPS, приводила к увеличению экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Эти результаты показали, что активированные Т- и В-клетки экспрессируют более высокие уровни DR5 на своей поверхности. Клетки окрашивали 20 мкг/мл TRA-8 и PE-конъюгированным антителом против мышиного IgG1.

Пример 13. Активированные Т- и В-клетки становятся чувствительными к TRA-8-опосредованному апоптозу

Для того чтобы определить, являются ли активированные Т- и В-клетки чувствительными к TRA-8-опосредованному апоптозу, Т-клетки и В-клетки из МКПК человека стимулировали in vitro анти-CD3 или анти-μ антителом в течение 48 часов соответственно. Жизнеспособные клетки и пролиферирующие бластные клетки собирали градиентным центрифугированием и инкубировали с различными концентрациями TRA-8. Нестимулированные Т-клетки и В-клетки были не чувствительны к TRA-8-опосредованному апоптозу (фиг.15). Все стимулированные Т-клетки и В-клетки обнаруживали умеренное повышение чувствительности к TRA-8-опосредованному апоптозу, при этом 20% клеток погибали под действием TRA-8 после культивирования в течение ночи. В высокой степени пролиферирующие бластные Т-клетки были еще более чувствительны к TRA-8-опосредованному апоптозу. Более 70% бластных Т-клеток погибали под действием TRA-8. Бластные В-клетки по сравнению с другими клетками также были более чувствительны к TRA-8-опосредованному апоптозу. Эти результаты показали, что активированные Т- и В-клетки были чувствительны к DR5-опосредованному апоптозу.

Пример 14. TRA-8 способствуют снижению числа активированных Т-клеток у человека/мыши SCID

Для определения in vivo анти-Т-клеточной эффективности TRA-8 мышам NOD/SCID внутривенно инъецировали 1×10⁸ человеческих МКПК. Обычно Т-клетки человека у мышей SCID быстро активируются в ответ на ксеногенную стимуляцию. Мышам SCID с человеческими МКПК внутрибрюшинно инъецировали 100 мкг TRA-8 или контрольный IgG1 ежедневно в течение трех дней, начиная с дня переноса. Через пять дней после переноса мононуклеарные клетки выделяли из селезенки и окрашивали антителом против человеческого CD3, после чего популяцию лимфоцитов отбирали с помощью проточного цитометрического анализа и анализировали на CD3-положительные Т-клетки человека. Приблизительно 30% лимфоцитов селезенки представляли собой Т-клетки человека, как было определено с помощью окрашивания антителом против человеческого CD3 у контрольных мышей. Однако среди лимфоцитов селезенки у TRA-8-обработанных мышей имелось лишь несколько человеческих Т-клеток (менее 3%) (фиг.16). Гистологическое исследование in situ в селезенке контрольных мышей выявило, что Т-клетки человека снова заселялись в селезенку, причем было обнаружено только несколько апоптотических клеток, на что указывало окрашивание TUNEL. В противоположность этому у TRA-8-обработанных мышей повторное заселение жизнеспособными человеческими Т-клетками не наблюдалось, а вместо этого наблюдалось большое количество апоптотических клеток (фиг.17). Эти результаты показали, что TRA-8 обладают анти Т-клеточной активностью in vivo, а поэтому антитела настоящего изобретения могут быть использованы для лечения заболевания, ассоциированного с реакцией "трансплантат против хозяина" (GVH).

Пример 15. Противораковая терапевтическая активность TRA-8

15.1 Экспрессия и функция DR5 в раковых тканях и клеточных линиях человека

i) Экспрессия DR5 в раковых тканях человека, обнаруживаемая при окрашивании in situ антителом TRA-8. Для того чтобы определить, происходит ли дифференциальная экспрессия повышенных уровней DR5 в раковых клетках и тканях, панель раковых тканей человека, включающую свыше 20 раковых тканей молочной железы, 6 раковых тканей яичника, 5 раковых тканей толстой кишки и 5 раковых тканей предстательной железы окрашивали TRA-8 для иммуногистохимического анализа. Большинство этих раковых тканей экспрессировали детектируемый DR5. Уровни экспрессии DR5 в этих раковых тканях варьировались. В основном раковые ткани экспрессировали более высокие уровни DR5, чем ткани, не вовлеченные в патологический процесс. Кроме того, экспрессия DR5, очевидно, не коррелирует с мутацией р53.

ii) Экспрессия и функция DR5 в раковых клеточных линиях человека (Таблица 2). Девять клеточных линий рака молочной железы человека, три клеточные линии рака яичника человека, три клеточные линии рака толстой кишки человека и три клеточные линии рака предстательной железы человека оценивали in vitro на экспрессию DR5 на клеточной поверхности и чувствительность к TRA-8-индуцированному апоптозу. 7 из 9 клеточных линий рака молочной железы человека, 3 из 3 клеточных линий рака яичника, 3 из 3 клеточных линий рака толстой кишки и 3 из 3 клеточных линий рака предстательной железы экспрессировали различные уровни DR5 на клеточной поверхности. Из 9 клеточных линий рака молочной железы три оказались очень чувствительными, три имели промежуточную чувствительность, а три были резистентными к TRA-8-опосредованному апоптозу. Все три клеточные линии рака яичника имели очень высокую чувствительность. Одна из трех клеточных линий рака толстой кишки имела очень высокую чувствительность, а две другие имели промежуточную чувствительность. Две из трех клеточных линий рака предстательной железы имели промежуточную чувствительность, а одна оказалась резистентной.

Таблица 2 Экспрессия и функция DR5 в раковых клетках человека
Клеточная линия	Источник	Экспрессия1	Чувствительность2
2LMP	молочная железа	+	++++
LCC6	молочная железа	+++	++++
MB468	молочная железа	+++	+++
MB231	молочная железа	++	+++
ZR-75-1	молочная железа	+++	++
SKBR3	молочная железа	+	++
MB453	молочная железа	++	+
BT474	молочная железа	+	-
DY36T2	молочная железа	-	-
Caov-3	яичник	+	++++
OVCAR-3	яичник	++	++++
Skov-3	яичник	+	+++
WiDR	толстая кишка	+++	++++
HST29	толстая кишка	++	+++
T84	толстая кишка	+	++
PC3	предстательная железа	+++	++
LnCap	предстательная железа	+++	+
Du-145	предстательная железа	+++	+
Примечания: 1определяли методом проточной цитометрии, клетки окрашивали 20 мкг/мл TRA-8 и сравнивали с контрольным антителом. 2определяли с помощью анализа ATPLite. ++++: погибало свыше 80% клеток; +++: погибало 60-80% клеток; ++: погибало 40-60% клеток; +: погибало 20-40% клеток; - клетки не погибали.

iii) Общая цитотоксичность TRA-8 и адриамицина. В некоторых клеточных линиях рака молочной железы оценивали действие адриамицина на TRA-8-индуцированный апоптоз. Высокие дозы адриамицина давали аддитивный эффект. Однако в некоторых TRA-8-резистентных линиях низкие дозы адриамицина синергически усиливали TRA-8-индуцированный апоптоз.

iv) In vitro и in vivo активность связывания TRA-8 с раковыми клетками человека. Использование меченного радиоизотопом TRA-8. Активность связывания TRA-8 с клеточной линией рака молочной железы оценивали in vitro и in vivo у мышей SCID с имплантированной опухолью. In vitro активность связывания с раковыми клетками оценивали как величину Kd=3 нм, которая, по предварительным оценкам авторов изобретения с помощью ELISA, является постоянной и, по крайней мере, в 50 раз превышает величину для растворимого TRAIL. In vivo, TRA-8 локализовалось в имплантированных опухолевых тканях.

15.2. Терапия хронического лимфолейкоза у мышей NOD/SCID с использованием TRA-8

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) представляет собой наиболее распространенную форму В-клеточных злокачественных опухолей. Большинство злокачественных В-клеток при ХЛЛ имеют зрелый фенотип и являются резистентными к большинству стимуляторов апоптоза. Была оценена экспрессия и функция DR5 в В-клетках у пяти пациентов с ХЛЛ. Все пациенты имели большое число периферических В-клеток, на что указывало более 95% CD19⁺-В-клеток среди МКПК. По сравнению с нормальными первичными В-клетками В-клетки у всех пациентов с ХЛЛ имели более высокие уровни DR5 на клеточной поверхности и были более чувствительными к TRA-8-индуцированному апоптозу in vitro. Интересно отметить, что В-клетки ХЛЛ также были чувствительными к цитотоксичности, индуцированной бисиндолмалеимидом VIII (BisVIII). После комбинированной обработки TRA-8 и BisVIII почти 50% В-клеток ХЛЛ погибали, тогда как нормальные В-клетки оказались нечувствительными (фиг.18). Через пять дней после переноса В-клеток ХЛЛ мышам NOD/SCID наблюдалось повторное заселение примерно 25%-30% CD19⁺-В-клеток в селезенку мышей-реципиентов. Однако обработка тремя дозами 100 мкг TRA-8 приводила к полной элиминации В-клеток ХЛЛ в селезенке у четырех из пяти мышей-реципиентов SCID. Таким образом, TRA-8, взятое отдельно или в сочетании с другими веществами, является активным в качестве терапевтического средства для лечения хронического лимфолейкоза.

Пример 16. Клонирование кДНК

(1) Определение N-концевых аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей TRA-8

Для получения кДНК тяжелой и легкой цепей TRA-8 N-концевые аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей TRA-8 и гены клонированных TRA-8 определяли известными методами.

Десять мкг раствора, содержащего антитело TRA-8 против человеческого DR5, подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с ДСН ("ДСН-ПААГ") при концентрации геля 12% (мас./об.) и постоянном напряжении 100 В в течение 120 минут. После электрофореза гель погружали на 5 минут в буфер для переноса, содержащий 25 мМ Трис-HCl (pH 9,5), 20% метанол, 0,02% об./об. ДСН. По истечении этого времени белок, содержащийся в геле, переносили на 14 часов на поливинилидендифторидную мембрану ("PVDF-мембрана"; размер пор 0,45 мкм; Millipore, Japan), предварительно смоченную в буфере для переноса, с использованием устройства для блоттинга (KS-8451; Marysol) при постоянном напряжении 10 В и при 4°С.

По истечении этого времени PVDF-мембрану промывали буфером для промывки, 25 мМ NaC1, 10 мМ боратно-натриевый буфер (pH 8,0), а затем окрашивали в окрашивающем растворе (50% об./об. метанола, 20% об./об. уксусной кислоты и 0,05% мас./об. кумасси бриллиантового голубого) в течение 5 минут для обнаружения полос белка. Затем PVDF-мембрану обесцвечивали путем добавления 90% об./об. водного раствора метанола, и полосу, соответствующую тяжелой цепи, то есть полосу с более низкой подвижностью, и полосу, соответствующую легкой цепи, то есть полосу с более высокой подвижностью, предварительно локализованные на PVDF-мембране, вырезали и промывали деионизованной водой.

N-концевые аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей определяли автоматическим методом Эдмана (см. Edman, P., et al., (1967), Eur. J. Biochem., 1, 80) с использованием газофазового секвенатора белка (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K. K.).

Было определено, что N-концевая аминокислотная последовательность полосы, соответствующей тяжелой цепи, представляет собой:

Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu (SEQ ID NO:4 в списке последовательностей);

а N-концевая аминокислотная последовательность полосы, соответствующей легкой цепи, представляет собой:

Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Ser (SEQ ID NO:5 в списке последовательностей).

Сравнение этих аминокислотных последовательностей с данными аминокислотных последовательностей антител, полученных, как описано Kabat et al. (См. Kabat E.A., et al., (1991), в "Sequnces of Proteins of Immunological Interest Vol.II,", U.S. Department of Health and Human Services), выявило, что тяжелая цепь (γ1-цепь) и легкая цепь (k-цепь) TRA-8 принадлежат к подтипам 3d и 1 соответственно.

(2) Клонирование кДНК

На основании вышеуказанных результатов были синтезированы олигонуклеотидные праймеры, которые, как ожидалось, должны гибридизироваться с частями 5'-нетранслируемых областей и с теми же самыми концами 3'-транслируемых областей генов, принадлежащих к этим мышиным подтипам. Затем кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи TRA-8, клонировали с использованием нижеследующей комбинации обратной транскрипции и ПЦР (ОТ-ПЦР):

а) Матрица

Полноразмерную РНК гибридомы TRA-8 (АТСС № РТА-1428) экстрагировали с использованием реагента TRIzol (GIBCO BRL). В качестве матрицы для ПЦР-реакции использовали кДНК, которую получали с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК (Amersham Pharmacia Biotech) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к данному набору.

b) ПЦР-праймеры

Были синтезированы следующие олигонуклеотидные праймеры для ПЦР:

5'-cagcactgaa cacggacccc-3' (H5NCS1: SEQ ID NO:6 списка последовательностей);

5'-aaaggtaatt tattgagaag-3' (H5NCS2: SEQ ID NO:7 списка последовательностей);

5'-cctcaccatg aacttcgggc-3' (H5SS1: SEQ ID NO:8 списка последовательностей);

5'-ctgttgtatg cacatgagac-3' (H5SS2: SEQ ID NO:9 списка последовательностей);

5'-gaagtgatgc tggtggagtc-3' (H5CS1: SEQ ID NO:10 списка последовательностей);

5'-agtgtgaagt gatgctggtg-3' (H5CS2: SEQ ID NO:11 списка последовательностей);

5'-tttaccagga gagtgggaga g-3' (H3CR: SEQ ID NO:12 списка последовательностей);

5'-tgcagagaca gtgaccagag-3' (H3VR: SEQ ID NO:13 списка последовательностей);

5'-tgttcaggac cagcatgggc-3' (L5NCS1: SEQ ID NO:14 списка последовательностей);

5'-aagacatttt ggattctaac-3' (L5NCS2: SEQ ID NO:15 списка последовательностей);

5'-tatcatgaag tctttgtatg-3' (L5SS1: SEQ ID NO:16 списка последовательностей);

5'-gatggagaca cattctcagg-3' (L5SS2: SEQ ID NO:17 списка последовательностей);

5'-gacattgtga tgacccagtc-3' (L5CS: SEQ ID NO:18 списка последовательностей);

5'-ttaacactca ttcctgttga-3' (L3CR: SEQ ID NO:19 списка последовательностей) и

5'-gactgggtca tcacaatgtc-3' (LCSR: SEQ ID NO:20 списка последовательностей).

Если это не оговорено особо, то все олигонуклеотиды в этих примерах синтезировали методом с использованием Pharmacia Biotech. Все олигонуклеотиды после растворения в дистиллированной воде хранили при -20°С.

с) ПЦР-реакция

Состав ПЦР-реакционного раствора:

кДНК-матрица, 5 мкл от всей 33 мкл реакционной смеси;

праймер DR5р1, 10 пмоль;

праймер DR5р2, 10 пмоль;

10×концентрированный ПЦР-буфер (поставляется с набором), 10 мкл;

dNTP (каждый 2,5 мМ), 4 мкл; и

полимераза Taq (Promega), 5 единиц.

К этому раствору добавляли стерильную дистиллированную воду до полного объема 100 мкл. Если это не оговорено особо, dNTP получали в виде эквимолярной смеси dATP, dCTP, dGTP и dTTP (каждого 2,5 мМ).

ПЦР-реакцию проводили следующим образом. Раствор сначала нагревали при 94°С в течение 2 минут, после чего 40 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 30 секунд, при 52°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 3 минут. После завершения этой процедуры реакционный раствор нагревали при 72°С в течение 10 минут.

Полученные таким образом амплифицированные ДНК-фрагменты разделяли на 1% агарозном геле, содержащем 0,25 мкг/мл этидийбромида. Полосы, которые, как было установлено, содержали нужные ДНК-фрагменты, вырезали острием бритвы и выделяли ДНК с использованием набора Gene Clean (BIO101). ДНК-фрагмент клонировали с использованием вектора pGEM-Т Easy (Promega). Эту процедуру осуществляли следующим образом.

ДНК-фрагмент, выделенный из ПЦР-реакционного раствора вместе с 50 нг вектора pGEM-Т Easy (поставляется с набором), смешивали в 1 мкл 10×буфера для лигазной реакции (6 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 6 мМ хлорида магния, 5 мМ хлорида натрия, 7 мМ β-меркаптоэтанола, 0,1 мМ АТР, 2 мМ DTT, 1 мМ спермидина и 0,1 мг/мл альбумина бычьей сыворотки), к которому добавляли 4 единицы ДНК-лигазы Т4 (1 мкл). Полный объем смеси доводили до 10 мкл путем добавления стерильной деионизованной воды и полученный лигазный раствор инкубировали в течение 15 часов при 14°С. По истечении этого времени 2 мкл лигазного реакционного раствора добавляли к 50 мкл компетентного штамма JM109 E.coli (поставляемого с набором и доведенного до состояния компетентности в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору), после чего к этому раствору добавляли 2 мкл 0,5 М β-меркаптоэтанола и полученную смесь выдерживали на льду в течение 30 минут, затем при 42°С в течение 30 секунд, а затем снова на льду в течение 5 минут. После этого к культуре добавляли 500 мкл среды, содержащей 2% об./об. триптона, 0,5% мас./об. дрожжевого экстракта, 0,05% мас./об. хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида калия, 1 мМ хлорида магния и 20 мМ глюкозы, (называемой далее средой "SOC") и смесь инкубировали в течение 1 часа при 37°С со встряхиванием. По истечении этого времени культуру высевали на чашку с L-агаровым бульоном (1% об./об. триптона, 0,5% мас./об. дрожжевого экстракта, 0,5% мас./об. хлорида натрия, 0,1% мас./об. глюкозы и 0,6% мас./об. бакто-агара (Difco)), содержащим 100 мкг/мл. Появившиеся на чашке резистентные к ампициллину колонии отбирали и соскабливали при помощи платиновой трансфер-петли, а затем культивировали в течение ночи при 37°С в среде с L-бульоном, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, встряхивая при 200 об/мин. После инкубирования клетки собирали центрифугированием, в результате чего получали ДНК-плазмиду щелочным методом. Плазмиду, полученную для тяжелой цепи TRA-8, обозначали рН62, а плазмиду, полученную для легкой цепи TRA-8, обозначали рL28. Штаммы-трансформанты E.coli, содержащие эти плазмиды и обозначенные JM109/рН62 E.coli и JM109/рL28 E.coli, были депонированы 20 апреля 2001 г. в Международном депозитарии патентуемых микроорганизмов, Национальный институт промышленных наук и передовых технологий, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов, и имеют регистрационные номера FERM BP-7560 и FERM BP-7561 соответственно. Нуклеотидные последовательности этих ДНК, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь TRA-8, определяли дидезокси-методом (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) с использованием ДНК-анализатора 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).

Нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепей TRA-8 представлены как SEQ ID NO:21 и 22 соответственно в списке последовательностей. Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей TRA-8 представлены как SEQ ID NO:23 и 24 в списке последовательностей соответственно. N-концевые аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей TRA-8, определенные выше, точно соответствуют указанным последовательностям. Кроме того, при сравнении аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей с базой данных для аминокислотных последовательностей антител было установлено, что для тяжелой цепи нуклеотиды 58-414 в SEQ ID NO:21 соответствуют вариабельной области, а нуклеотиды 415-1392 в SEQ ID NO:21 соответствуют константной области. Для легкой цепи нуклеотиды 64-387 в SEQ ID NO:22 соответствуют вариабельной области, а нуклеотиды 388-702 в SEQ ID NO:22 соответствуют константной области. Локализация и последовательности CDR также были выявлены путем сравнения их гомологии с последовательностями в базе данных. Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи TRA-8 представлены в SEQ ID NO:25, 26 и 27 соответственно. Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи TRA-8 представлены в SEQ ID NO:28, 29 и 30 соответственно.

Пример 17. Конструирование гуманизированного варианта антитела TRA-8

(1) Молекулярное моделирование вариабельной области TRA-8

Молекулярное моделирование вариабельной области TRA-8 проводили методом, в основном известным как гомологичное моделирование (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Первичные последовательности вариабельных областей человеческого иммуноглобулина, которые были зарегистрированы в Банке данных белков (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)) и для которых была осуществлена рентгеновская кристаллография трехмерной структуры, сравнивали с каркасными областями TRA-8, определенными выше. В результате были отобраны 1NCD и 1HIL, которые имели наиболее высокую степень гомологии с каркасными участками для легкой и тяжелой цепей TRA-8 соответственно. Трехмерные структуры каркасных участков генерировали путем комбинирования координат 1NCD и 1HIL, которые соответствовали легкой и тяжелой цепям TRA-8, в результате чего получали "каркасную модель". С использованием классификации, описанной Chothia и др., CDR антитела TRA-8 были классифицированы следующим образом: CDRL₁, CDRL₂, CDRH₁ и CDRH₂ принадлежат к каноническим классам 2,1,1,3 соответственно, а CDRL₃ не принадлежит к какому-либо конкретному каноническому классу. CDR-петли CDRL₁, CDRL₂, CDRH₁ и CDRH₂ были приписаны конформациям, присущим их соответствующим каноническим классам, и интегрированы в каркасную модель. CDRL₃ был приписан конформации кластера 8А в соответствии с классификацией Thornton et al., (см., J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)), а CDRH₃ отнесен к классу k(8)C в соответствии с правилом Н3 (FEBS Letter 455, 188-197 (1999)). Затем репрезентативные конформации для CDRL₃ и CDRH₃ интегрировали в каркасную модель.

И, наконец, для исключения нежелательного контакта между атомами проводили вычисления энергии для того, чтобы получить вероятную энергетическую молекулярную модель вариабельной области TRA-8. Вышеуказанную процедуру осуществляли с использованием коммерчески доступной системы молекулярного моделирования, АВМ (Oxford Molecular Limited, Inc.). Для получения молекулярной модели точность данной структуры может быть затем оценена с использованием программного обеспечения PROCHECK (J. Appl. Cryst., (1993), 26, 283-291).

(2) Конструирование аминокислотных последовательностей для гуманизированного TRA-8

Конструирование гуманизированных антител TRA-8 осуществляли методом, в основном известным как CDR-прививка (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 10029-10033 (1989)). Антитело-акцептор выбирали, исходя из гомологии аминокислот в каркасной области. Последовательности каркасной области в TRA-8 сравнивали со всеми человеческими каркасными последовательностями в базе данных аминокислотных последовательностей антител Kabat (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)). В результате, в качестве акцептора выбирали антитело mAb58'CL из-за наиболее высокой гомологии, то есть 80%, его каркасной области. Аминокислотные остатки в каркасной области mAb58'CL сопоставляли с каркасной областью TRA-8 и идентифицировали положения с различными аминокислотами. Локализацию этих остатков анализировали с использованием трехмерной модели TRA-8, сконструированной, как описано выше, а донорные остатки, которые должны быть привиты к акцептору, выбирали в соответствии с критерием Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 10029-10033 (1989)). Гуманизированные последовательности TRA-8 конструировали, как описано в нижеследующем примере, путем переноса нескольких донорных остатков в антитело-акцептор mAb58'CL.

Пример 18. Конструирование экспрессирующего вектора для тяжелой цепи гуманизированного антитела

(1) Конструирование плазмиды, несущей ДНК вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного TRA-8

Для определения активности гуманизированного TRA-8 плазмиду, несущую тяжелую цепь гуманизированного TRA-8, конструировали описанным ниже способом. Однако следует отметить, что способ "гуманизации" TRA-8 не ограничивается этими примерами.

Как показано в SEQ ID NO:31 списка последовательностей, гуманизацию аминокислотных последовательностей тяжелой цепи мышиного антитела TRA-8 против человеческого DR5 осуществляли путем замены 13-й аминокислоты (лизина), 19-й аминокислоты (лизина), 40-й аминокислоты (треонина), 42-й аминокислоты (глутаминовой кислоты), 44-й аминокислоты (аргинина), 84-й аминокислоты (серина), 88-й аминокислоты (серина), 93-й аминокислоты (метионина), 114-й аминокислоты (треонина) и 115-й аминокислоты (лейцина) глутамином, аргинином, аланином, глицином, глицином, аспарагином, аланином, валином, лейцином и валином соответственно.

Плазмиду, несущую ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного TRA-8 (SEQ ID NO:31 в списке последовательностей), конструировали нижеописанным способом.

Для конструирования нижеследующих ДНК-последовательностей, каждая из которых содержала вышеописанные замены, использовали ПЦР.

Были синтезированы следующие 12 олигонуклеотидов:

Нижеследующие 2 ПЦР-праймера были синтезированы, как описано выше:

5'-ttggataagc ttggcttgac-3' (Р1; SEQ ID NO:44) и

5'-gaccgatggg cccttggtgg a-3' (Р2; SEQ ID NO:45).

Синтез ДНК, кодирующей полипептидную цепь, содержащую секреторную сигнальную последовательность, вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного TRA-8 и 8 аминокислотных остатков у N-конца области IgG-CH1, осуществляли с использованием комбинированной ПЦР соответственно.

ДНК-фрагмент получали нижеописанным способом.

Состав ПЦР-реакционного раствора:

олигонуклеотид А, 10 пмоль;

олигонуклеотид В, 10 пмоль;

олигонуклеотид С, 10 пмоль;

олигонуклеотид D, 10 пмоль;

олигонуклеотид Е, 10 пмоль;

олигонуклеотид F, 10 пмоль;

олигонуклеотид G, 10 пмоль;

олигонуклеотид H, 10 пмоль;

олигонуклеотид I, 10 пмоль;

олигонуклеотид J, 10 пмоль;

олигонуклеотид К, 10 пмоль;

олигонуклеотид L, 10 пмоль;

олигонуклеотидный праймер Р1, 2 мкМ;

олигонуклеотидный праймер Р2, 2 мкМ;

10×буфер Pyrobest II, 10 мкл;

dNTP-смесь, 8 мкл;

ДНК-полимераза Pyrobest, 0,5 мкл; и

бидистиллированная вода до конечного объема 50 мкл.

ПЦР-реакцию проводили следующим образом. Сначала раствор нагревали при 94°С в течение 5 минут, а затем проводили 7 циклов нагревания до 98°С в течение 10 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты. После завершения этой процедуры реакционный раствор нагревали при 72°С в течение 15 минут.

К 200 мкл каждого из ПЦР-продуктов добавляли равный объем фенола-хлороформа (50% об./об. фенола, насыщенного водой, 48% об./об. хлороформа, 2% об./об. изоамилового спирта) и смесь интенсивно перемешивали в течение 1 минуты. По истечении этого времени смесь центрифугировали при 10000×g и водный слой выделяли и смешивали с равным объемом смеси хлороформизоамилового спирта (96% об./об. хлороформа и 4% об./об. изоамилового спирта), которую снова интенсивно центрифугировали при 10000×g, и водный слой выделяли. Серия стадий, описанных в этом разделе, далее будет называться "экстракция фенолом".

Затем выделенный водный слой осаждали этанолом. Используемый в этом описании термин "осаждение этанолом" означает добавление при смешивании одной десятой объема 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 2,5 объема 100% этанола к обрабатываемому раствору с последующим замораживанием этой смеси с использованием сухого льда. Затем полученную смесь центрифугировали при 10000×g и выделяли ДНК в виде осадка.

После экстракции фенолом и осаждения этанолом полученный ДНК-осадок сушили в вакууме, растворяли в минимальном количестве бидистиллированной воды и разделяли с помощью электрофореза на 3% агарозном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл водного раствора бромида этидия для обнаружения ДНК при УФ-излучении. ДНК-полосы, соответствующие ДНК гуманизированного TRA-8, вырезали лезвием бритвы и элюировали из геля с использованием набора Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA). После экстракции фенолом проэлюированную ДНК концентрировали путем центрифугирования при 7500×g, осаждали этанолом и, наконец, растворяли в 5 мкл дистиллированной воды.

Каждую из экстрагированных ДНК клонировали с использованием вектора pGEM-Т Easy (Promega) следующим образом:

ДНК-фрагмент, полученный в ПЦР-реакции, 5 мкл;

10×Taq-полимеразный буфер, 1 мкл;

dNTP-смесь, 1 мкл;

полимераза Taq (5 ед./мл), 1 мкл; и

бидистиллированная вода до конечного объема 10 мкл.

После проведения реакции каждого вышеуказанного раствора при 70°С в течение 30 минут каждый ДНК-раствор и вектор pGEM-Т Easy лигировали с использованием набора для лигирования ДНК, Версия 2.0 (Takara Syuzo Co, Ltd.) в соответствии с инструкциями производителей.

После 4-часового инкубирования при 15°С, 2 мкл инкубированного реакционного раствора смешивали со 100 мкл компетентного штамма JM109 E.coli при плотности клеток 1-2×10⁹ клеток/мл (Takara Syuzo Co, Ltd.) и смесь выдерживали на льду в течение 30 минут, затем при 42°С в течение 30 секунд, а затем снова выдерживали на льду в течение 1 минуты. После этого к смеси добавляли 500 мкл среды SOC (2% об./об. триптона, 0,5% мас./об. дрожжевого экстракта, 0,05% мас./об. хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида калия, 1 мМ хлорида магния и 20 мМ глюкозы) и смесь инкубировали еще один час при встряхивании. Затем выделяли штаммы-трансформанты и из этих штаммов получали плазмидную ДНК, как описано в "Molecular Cloning A Laboratory Manual". Нуклеотидные последовательности этих ДНК, кодирующих тяжелую цепь гуманизированного TRA-8, подтверждали дидезокси-методом (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) с использованием ДНК-анализатора 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).

Полученные плазмиды обозначали рНВ14 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую тяжелую цепь гуманизированного TRA-8). Штамм-трансформант E.coli, содержащий эти плазмиды и обозначенный JM109/рНВ14 E.coli, был депонирован 20 апреля 2001 г. в Международном депозитарии патентуемых микроорганизмов, Национальный институт промышленных наук и передовых технологий, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов, и имеет регистрационный номер FERM BP-7556.

(2) Конструирование экспрессирующих плазмид, несущих ДНК вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного TRA-8

Рекомбинантные экспрессирующие векторы для клеток животных конструировали путем встраивания ДНК, кодирующей тяжелую цепь гуманизированного TRA-8 (клонированную как описано выше) следующим образом.

Один мкг плазмиды рSRННН3 (Европейская патентная заявка ЕР 0909816 А1), несущей геномную ДНК человеческой вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного моноклонального антитела НFE7A против Fas и константной области человеческого IgG1, экспрессирующий вектор для клеток млекопитающих, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и ApaI и выделяли с помощью электрофореза на 3% агарозом геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл водного раствора бромида этидия для обнаружения ДНК при УФ-излучении. Полосы векторной ДНК, содержащей геномную ДНК константной области человеческого IgG1 без вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного НFE7A, вырезали лезвием бритвы и элюировали из геля с использованием набора Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA). После экстракции фенолом проэлюированную ДНК концентрировали путем центрифугирования при 7500×g, а затем осаждали этанолом и, наконец, растворяли в 5 мкл дистиллированной воды, после чего дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную гидролизованную дефосфорилированную плазмиду (100 нг) лигировали с 1 мкг ДНК-фрагмента рНВ14, содержащего ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного TRA-8, которая также была гидролизована ферментами HindIII и ApaI, с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем лигированную смесь использовали для трансформации клеток JM109 E.coli, которые после этого засевали в чашки с LB-агаром, содержащие 50 мкг/мл ампициллина.

Полученные таким способом трансформанты культивировали в 2 мл жидкой LB-среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина при 37°С в течение ночи, после чего плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН.

Экстрагированную плазмидную ДНК гидролизовали HindIII и ApaI и подвергали электрофорезу на 3% (мас./об.) агарозном геле для подтверждения присутствия или отсутствия нужной вставки ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного TRA-8. Инсерция и ориентация нужного ДНК-фрагмента в данном векторе были подтверждены секвенированием ДНК с использованием анализатора генных последовательностей (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Полученные экспрессирующие плазмиды, несущие кДНК, кодирующую тяжелую цепь гуманизированного TRA-8, обозначали рНВ14-1.

Пример 19. Конструирование экспрессирующего вектора для легкой цепи гуманизированного антитела

(1) Конструирование векторов для легких цепей гуманизированных вариантов антитела TRA-8

Как показано в SEQ ID NO:46 списка последовательностей, в гуманизированной аминокислотной последовательности легкой цепи мышиного антитела TRA-8 против человеческого DR5, 8-я аминокислота (гистидин), 9-я аминокислота (лизин), 10-я аминокислота (фенилаланин), 11-я аминокислота (метионин), 13-я аминокислота (треонин), 20-я аминокислота (серин), 42-я аминокислота (глутамин), 43-я аминокислота (серин), 60-я аминокислота (аспарагиновая кислота), 63-я аминокислота (треонин), 77-я аминокислота (аспарагин), 78-я аминокислота (валин), 80-я аминокислота (серин), 83-я аминокислота (лейцин), 85-я аминокислота (аспарагиновая кислота), 87-я аминокислота (фенилаланин), 99-я аминокислота (глицин), 103-я аминокислота (лейцин) и 108-я аминокислота (аланин) у N-конца аминокислотной последовательности легкой цепи TRA-8 заменены пролином, серином, серином, лейцином, аланином, треонином, лизином, аланином, серином, серином, серином, лейцином, пролином, фенилаланином, треонином, тирозином, глутамином, валином и треонином соответственно. Полученная последовательность была обозначена LМ2.

Экспрессирующие плазмиды, несущие указанный тип аминокислотных последовательностей гуманизированной легкой цепи антитела TRA-8 против человеческого DR5, конструировали, как описано ниже.

1) Синтез праймеров для получения вариабельных и константных областей легкой цепи гуманизированного TRA-8

ДНК, кодирующую полипептидную цепь LМ2 (SEQ ID NO:46 в списке последовательностей), каждая из которых представляет собой гибрид вариабельной области легкой цепи гуманизированного анти-DR5 антитела TRA-8 и константной области легкой цепи человеческого Ig (κ-цепь), синтезировали соответствующим образом с использованием комбинации ПЦР.

Помимо 7AL1P (SEQ ID NO:47) и 7ALCN (SEQ ID NO:48), были синтезированы нижеследующие олигонуклеотидные праймеры для ПЦР:

2) Конструирование плазмиды рCR3.1/М2-1 (клонирующей легкую цепь гуманизированного TRA-8)

LМ2-ДНК-фрагмент, определенный в SEQ ID NO:55 в списке последовательностей и кодирующий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO:46 в том же списке последовательностей, получали путем проведения 2-стадийной ПЦР, встраивали в плазмидный вектор и клонировали в E.coli.

а) Первая стадия ПЦР

LМ2-F1-ДНК-фрагмент, кодирующий секреторную сигнальную последовательность и часть FRL₁-области, с добавленным сайтом расщепления рестриктирующим ферментом HindIII у 5'-конца, получали при следующих условиях. Матричные плазмиды рHSGHM17 и pSRPDHH получали в соответствии с описанием в Европейской патентной заявке ЕР 0909816 А1.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды рHSGHM17 (Европейская патентная заявка ЕР 0909816 А1), 25 нг;

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер НКSRP11, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ2-F2-ДНК-фрагмент, кодирующий часть FRL₁, CDRL₁, FRL₂ и CDRL₂, получали при нижеследующих условиях.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pL28, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер НКСDF11, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер НКCDR12, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ2-F3-ДНК-фрагмент, кодирующий CDRL₂, FRL₃ и часть CDRL₃, получали при нижеследующих условиях.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pHSRPDHH (Европейская патентная заявка ЕР 0909816 А1), 25 нг;

олигонуклеотидный праймер НКСDF22, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер НКCDR22, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ2-F4-ДНК-фрагмент, кодирующий CDRL₃, FRL₄ и константную область, с добавленным у 3'-конца сайтом расщепления рестриктирующим ферментом EcoRI, получали при нижеследующих условиях.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pSRPDHH, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер НКСF12, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

Амплифицированные ДНК-фрагменты, полученные после ПЦР, выделяли с помощью электрофореза в 5% полиакриламидном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл этидийбромида для детекции продуцированной ДНК при УФ-излучении. Детектированные таким образом соответствующие ДНК-полосы вырезали лезвием бритвы.

b) Вторая стадия ПЦР

LМ2-ДНК, в которой были лигированы вышеописанные LМ2-F1-ДНК, LМ2-F2-ДНК, LМ2-F3-ДНК и LМ2-F4-ДНК-фрагменты, получали при следующих условиях.

Состав реакционного раствора:

фрагмент геля с LМ2-F1-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ2-F2-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ2-F3-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ2-F4-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5,0 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5,0 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

Полученный таким образом LМ2-ДНК-фрагмент встраивали в плазмиду рCR3.1DNA с использованием набора для клонирования эукариотического ТА (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей и вводили в компетентный штамм TOP10F' E.coli, имеющийся в наборе. Нуклеотидные последовательности этих ДНК, кодирующих легкую цепь гуманизированного TRA-8, были подтверждены дидезокси-методом (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) с использованием ДНК-анализатора 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).

Полученные плазмиды обозначали рCR3.1/М2-1 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи гуманизированного TRA-8 и константную область легкой цепи человеческого Ig).

Полученную плазмиду рCR3.1/М2-1, содержащую LМ2-ДНК-фрагмент, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды рНSG399 гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную таким образом дефосфорилированную рНSG399-ДНК и LМ2-ДНК-фрагмент, который был также гидролизован рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агаровую среду, содержащую 0,1 мМ IPTG, 0,1% Х-Gal и 50 мкг/мл хлорамфеникола (конечные концентрации). Полученные белые трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 50 мкг/мл хлорамфеникола, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН. Экстрагированную плазмидную ДНК гидролизовали ферментами HindIII и EcoRI, а затем клон, несущий LM2-ДНК-фрагмент, отбирали с помощью электрофореза на 1% агарозном геле.

В соответствии с вышеописанной процедурой получали плазмиду pHSG/М2-1-4, несущую гибридный фрагмент вариабельной области "гуманизированной" легкой цепи LМ2-TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ. Штамм-трансформант E.coli, содержащий эти плазмиды и обозначенный E.coli DH5α/pHSG/М2-1-4, был депонирован 20 апреля 2001 г., в Международном депозитарии патентуемых микроорганизмов, Национальный институт промышленных наук и передовых технологий, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов, и имеет регистрационный номер FERM BP-7563.

3) Конструирование плазмиды pSR/М2-1 (экспрессирующей плазмиды для гуманизированной легкой цепи LМ2-TRA-8

Полученную плазмиду pHSG/М2-1-4, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи гуманизированного LМ2-TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК-плазмиды pSRPDHH (Европейская патентная заявка ЕР 0909816 А1) гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную дефосфорилированную ДНК плазмиды pSRPDHH и HindIII-EcoRI-ДНК-фрагмент, полученный из pHSG/М2-1-4, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агар. Полученные трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и из полученной культуры экстрагировали плазмидную ДНК щелочным методом с использованием ДСН. Инсерция и ориентация нужного ДНК-фрагмента в векторе pSRPDHH были подтверждены секвенированием ДНК с использованием анализатора генных последовательностей (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Полученную экспрессирующую плазмиду, несущую кДНК, кодирующую легкую цепь гуманизированного TRA-8, обозначали pSR/М2-1.

Пример 20. Продуцирование гуманизированного антитела

Трансфекцию клеток COS-7 (то есть клеточной линии, происходящей от почек обезьяны) экспрессирующими плазмидами для тяжелой цепи гуманизированного TRA-8 и легкой цепи гуманизированного TRA-8, полученными, как описано выше, осуществляли методами с использованием трансфецирующего реагента FUGENE6 (Boehringer Mannhiem Biochemica) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к данному набору.

Клетки COS-7 (Американская коллекция типовых культур № CRL-1651) культивировали до полуконфлюентности (3×10⁶ клеток на чашку) в культуральной чашке (площадь культуры: 57 см³; Sumitomo Bakelite), содержащей модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (обозначаемую далее "DMEM"; Gibco BRL), в которую была добавлена 10% фетальная телячья сыворотка (обозначаемая далее "FCS"; Moregate).

Одновременно 10 мкг/чашку (всего 5 чашек) ДНК тяжелой цепи гуманизированного DR5 в экспрессирующей плазмиде (рНА15-1) и 10 мкг/чашку ДНК легкой цепи гуманизированного DR5 в экспрессирующей плазмиде, полученных щелочным методом с использованием ДСН и центрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия, смешивали, осаждали этанолом, а затем суспендировали в 5 мкл/чашку dH₂O.

После смешивания 15 мкл/чашку трансфецирующего реагента FUGENE6 со 180 мкл/чашку DMEM без FCS этот раствор FUGENE (185 мкл/чашку) смешивали с 5 мкл/чашку ДНК-раствора, содержащего 10 мкг/чашку ДНК тяжелой цепи гуманизированного DR5 в экспрессирующей плазмиде и 10 мкг/чашку ДНК легкой цепи гуманизированного DR5 в экспрессирующей плазмиде. После инкубирования в течение 15 минут при комнатной температуре полученную плазмидную суспензию (200 мкл) добавляли в предварительно приготовленные планшеты с COS-7. После инкубирования в 5% CO₂ при 37°С в течение 24 часов культуральную среду заменяли средой DMEM без FCS. После инкубирования в 5% CO₂ при 37°С в течение 72 часов супернатант культуры выделяли для очистки продуктов экспрессии в надосадочных жидкостях. Методом, описанным выше, клетки COS-7 трансфецировали каждой из нижеследующих плазмидных комбинаций:

(А) без плазмидной ДНК;

(В) котрансфекция рHВ14-1 и pSR/M2-1.

Затем культуру центрифугировали (1000 об/мин, 5 минут) и супернатант собирали. Супернатант снова центрифугировали (9800 об/мин, 15 минут) и фильтровали через 0,45 мкм фильтр (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, cat.# 25CS045 AS). Выделение IgG из фильтратов осуществляли посредством аффинной хроматографии с использованием белка G-POROS (Applied Biosystems) при следующих условиях:

ВЭЖХ: BioCAD 700E (Applied Biosystems);

Колонка: сенсорная кассета с белком G-ID (размер колонки: 2,1 мм ID × 30 мм LD, объем слоя: 0,1 мл; cat.№ 2-1002-00, Applied Biosystems);

Элюирующий буфер: 0,1 М глицин-HCl (рН 2,5);

Нейтрализующий буфер: 1 М Трис-HCl (pH 8,5);

Детекция: 280 нм;

Скорость потока: 1 мл/мин;

Размер фракции: 0,5 мл/0,5 мин;

Пробирка для фракционирования: полипропиленовая 1,5 мл микропробирка.

Температура: 4°С.

После нанесения всех фильтратов на колонку для промывки колонки использовали 30 мл PBS (Sigma, cat.№ 1000-3). После нанесения элюирующего буфера начинали сбор фракций. Каждая микропробирка для фракционирования содержала 55 мкл 1 М NaCl, 110 мкл нейтрализующего буфера и 74 мкл 2 мг/мл альбумина бычьей сыворотки (Sigma, cat.№ А-7030) в PBS. Фракции 8-10 собирали и диализовали против 1 литра PBS (рН 7,5) при 4°С в течение 1 дня с использованием анализатора Slide Analyzer (Pierce, cat.# 66450). Буфер для диализа меняли дважды.

Подтверждение экспрессии гуманизированных антител и количественный анализ полученных продуктов экспрессии в надосадочных жидкостях культуры осуществляли с помощью ELISA с использованием антитела против IgG человека.

В каждую лунку 96-луночного планшета (MaxiSorp, Nunc) добавляли 100 мкл козьего Fc-специфического поликлонального антитела против человеческого IgG (Kappel), растворенного в конечной концентрации 0,5 мкг/мл в буфере для адсорбции (0,05 М гидрогенкарбонат натрия, 0,02% азида натрия, рН 9,6), и планшет инкубировали при 37°С в течение 2 часов для стимуляции адсорбции антитела. Затем планшет пять раз промывали 350 мкл PBS(-), содержащим 0,05% Твина 20 (BioRad) (далее называемого "PBS-T"). После промывки к лункам добавляли супернатант культуры, разведенный в DMEM, содержащей 10% FCS, и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. После повторной промывки PBS-T в каждую лунку добавляли 100 мкл меченного щелочной фосфатазой Fc-специфического козьего поликлонального антитела против человеческого IgG (Jackson Immuno Research Lab), 10000-кратно разведенного PBS-T, и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. После повторной промывки PBS-T добавляли субстратный раствор п-нитрофенилфосфата, имеющийся в наборе, содержащем субстрат щелочной фосфатазы (BioRad) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору. После инкубирования при 37°С в течение 0,5-1 часа измеряли оптическую плотность при 450 нм. В экспериментах настоящего изобретения иммуноглобулин G подкласса 1 плазмы человека (IgG1) (Biopure AG), разведенный в DMEM, содержащей 10% FCS до определенных концентраций, использовали как образец с эталонной концентрацией для гуманизированных анти-DR5 антител, содержащихся в надосадочных жидкостях культуры.

В результате этого экспрессию и очищенные продукты в надосадочных жидкостях культур специфически детектировали с использованием антитела против человеческого IgG. Количество антитела против человеческого IgG составляло 8,96 мкг (800 мкл).

Пример 21. Апоптоз-индуцирующая активность гуманизированного антитела

Для оценки апоптоз-индуцирующей активности очищенного гуманизированного антитела TRA-8 использовали клетки Jurkat (АТСС № TIB-152).

Клетки Jurkat, культивированные в среде RPMI 1640 с 10% FCS (Gibco BRL) при 37°С в течение 3 дней в присутствии 5% СО₂, добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Sumitomo Bakelite) в количестве 50 мкл на лунку. Гуманизированное антитело TRA-8, полученное, как описано в примере 20, доводили до концентрации конечного нужного продукта 100 нг/мл в среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS, путем оценки их концентраций в жидкостях методом, описанным в примере 20. Каждый из полученных растворов продуктов экспрессии, доведенных до 100 нг/мл, использовали для приготовления серийных разведений путем 2-кратного разведения средой RPMI 1640, содержащей 10% FCS. Каждое из полученных разведений гуманизированного антитела TRA-8 добавляли в каждую лунку при концентрации 50 мкл на лунку. После проведения реакции при 37°С в течение 12 часов добавляли 50 мкл 25 мкМ PMS (метосульфат феназина; Sigma Chemical Co.), содержащие 1 мг/мл ХТТ (2,3-бис[2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил]-2Н-тетразолий-5-карбоксианирида внутренней соли Sigma Chemical Co.) (конечные концентрации 250 мкг/мл для ХТТ и 5 мкМ для PMS). После инкубирования в течение 3 часов измеряли оптическую плотность каждой лунки при 450 нм для определения жизнеспособности клеток с использованием восстанавливающей способности митохондрий в качестве индикатора.

Жизнеспособность клеток в каждой лунке вычисляли по следующей формуле:

Жизнеспособность (%)=100×(а-b)/(c-b),

где "а" представляет значение для тестируемой лунки, "b" представляет значение для лунки без клеток, и "с" представляет значение для лунки, в которую не было добавлено антитело.

В результате было продемонстрировано, что продукт экспрессии, полученный, как описано в примере 20 (гуманизированное антитело TRA-8), индуцирует апоптоз в Т-клеточной лимфоме, экспрессирующей антиген DR5 человека.

Пример 22. Реактивность TRA-8 с различными молекулами DR5

Для определения реактивности TRA-8 с различными молекулами DR5 реактивность TRA-8 оценивали с использованием активированных лимфоцитов, как описано ниже.

Сначала пробы периферической крови брали у человека (30 мл), у обезьяны-игрунки (3 мл) и у собакоподобной обезьяны (20 мл). К этим пробам крови добавляли 1 мл гепарина (Novoheparin; Novo), а затем пробы медленно наносили на равный объем раствора Фиколл-Пак+ (Ficoll-Paque PLUS, Amersham Pharmacia Biotech., удельный вес для всех обезьян составлял 1,077, за исключением собакоподобной обезьяны, удельный вес образцов которой составлял 1,072) и центрифугировали при 1700 об/мин в течение 30 минут с получением фракции мононуклеарных клеток периферической крови. Эту фракцию мононуклеарных клеток дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хэнкса, а затем суспендировали в среде RPMI 1640 с 10% об./об. FCS до клеточной плотности 1×10⁶ клеток/мл. К полученной суспензии добавляли фитогемаглютинин-Р (РНА-Р, Sigma Chemicals, Co.) до конечной концентрации 5 мкг/мл и образец инкубировали при 37°С в течение 24 часов в присутствии 5% об./об. СО₂. По истечении этого времени клетки выделяли путем центрифугирования, промывали и ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% об./об. FCS. После этого для активации выделенных клеток к суспензии добавляли интерлейкин-2 (Amersham Pharmacia Biotech.) до конечной концентрации 10 единиц/мл и эту суспензию инкубировали при 37°С в течение 72 часов в присутствии 5% об./об. СО₂.

Определенное количество активированного препарата, которое, как было вычислено, содержало 1×10⁶ активированных лимфоцитов, помещали в тест-пробирку и суспендировали либо в 50 мкл 0,5, 1, 5, 10 мкг/мл TRA-8 в PBS, либо в 50 мкл одного PBS. Полученную суспензию выдерживали на льду в течение 1 часа, после чего клетки 3 раза промывали аликвотами 500 мкл PBS, а затем суспендировали в 50 мкл 20 мкг/мл FITC-меченного антитела против мышиных IgG (Bioresource) в PBS. С использованием клеток, суспендированных в 500 мкл PBS, используемого в качестве контроля, измеряли интенсивность флуоресценции на проточном цитометре (FACSCalibur; Becton Dickinson).

Распределение численности клеток определяли по интенсивности флуоресценции и подсчитывали соотношения числа окрашенных клеток к полному числу клеток. Затем с использованием концентрации TRA-8 вычисляли каждую величину Kd и отношения числа окрашенных клеток к общему числу клеток. Способности клеток реагировать с активированными лимфоцитами человека, обезьяны-игрунки и собакоподобной обезьяны были почти одинаковыми. В соответствии с этим было установлено, что антитело TRA-8 способно связываться с DR5 приматов разных видов, включая человека, против клеток которого было первоначально продуцировано TRA-8.

Пример 23. Исследование возрастающей дозы TRA-8 у обезьян-игрунок

Предварительное исследование относительной токсичности возрастающих доз TRA-8 осуществляли с использованием 1 самца и 1 самки игрунки. Для этого внутривенно вводили три серии разовых доз и это введение проводили с 7-дневным интервалом. Эти дозы TRA-8 составляли 50, 250 и 1250 мкг/массу тела. Через 48 часов после каждой обработки из бедренной вены брали кровь и получали плазму. Активности аспартат-аминотрансферазы и аланин-аминотрансферазы в плазме измеряли с использованием анализатора (FUJI DRI-CHEM: Fuji Film Medical Co., Ltd.). Все пробы крови брали без анестезии. В результате после каждой обработки биохимический анализ плазмы не выявил каких-либо поражений печени.

Пример 24. In vitro и in vivo фармакологические исследования действия TRA-8 против раковых клеток

Для того чтобы определить, обладает ли TRA-8 терапевтической противораковой активностью, оценивали in vitro киллерную активность TRA-8 с использованием различных раковых клеточных линий, как описано ниже.

Различные раковые клетки (2-8×10³ клеток/50 мкл), культивированые в среде RPMI 1640 (для Jurkat), в среде DMEM (для НСТ-116), МЕМ-R (для WiDr) или DMEM-F12 (для COL2-Jck) и полученные от Gibco BRL с 10% FCS (Gibco BRL) при 37°С в присутствии 5% СО₂, добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Sumitomo Bakelite). TRA-8 доводили до конечной концентрации нужного продукта 100 нг/мл в среде, содержащей 10% FCS. Раствор TRA-8 (100 нг/мл) использовали для приготовления серийных разведений путем 2-кратного серийного разведения средой, содержащей 10% FCS. Каждое из полученных разведений раствора TRA-8 добавляли в каждую лунку при концентрации 50 мкл на лунку и инкубировали при 37°С. После проведения реакции при 37°С в течение 72 часов добавляли 50 мкл 25 мкМ PMS (метосульфат феназина; Sigma Chemical Co.), содержащие 1 мг/мл ХТТ (конечная концентрация 250 мкг/мл для ХТТ и 5 мкМ для PMS). После инкубирования в течение 3 часов измеряли оптическую плотность каждой лунки при 450 нм, после чего определяли жизнеспособность клеток с использованием восстанавливающей способности митохондрий в качестве индикатора.

Жизнеспособность клеток в каждой лунке вычисляли по следующей формуле:

Жизнеспособность (%)=100×(а-b)/(c-b),

где "а" представляет значение для тестируемой лунки, "b" представляет значение для лунки без клеток, и "с" представляет значение для лунки, в которую не было добавлено антитело.

Результаты представлены ниже в таблице 3.

Таблица 3
Клетки	ED50 (мкг/мл)
Jurkat	0,001-0,01
HCT-116	0,004-0,02
WiDr	0,007-0,03
COL2-Jck	2,28

Антитело TRA-8 сильно индуцировало апоптоз различных раковых клеточных линий в in vitro условиях.

Кроме того, оценивали противоопухолевое действие in vivo TRA-8 у "голых" (бестимусных) мышей с имплантированными клетками WiDr, поскольку TRA-8 не вступает в перекрестную реакцию с мышиным DR5.

Антитело TRA-8 против человеческого DR5 вводили "голым" мышам, несущим человеческие ксенотрансплантаты, которые экспрессируют молекулу человеческого DR5. Для этого использовали 6-недельных "голых" мышей BALb/c (самок, от Clea Japan Inc.), которым имплантировали человеческие клеточные линии рака толстой кишки WiDr (5 мм³). Через день после имплантации опухоли этим мышам с трансплантатом ежедневно внутрисуставно вводили инъекцию TRA-8 (5 мкг/массу тела) до 14 раз. Рост опухоли WiDr ежедневно оценивали по размеру опухолевой массы. Результаты представлены ниже в таблице 4.

Таблица 4
	8 дней	11 дней	15 дней	18 дней	22 дней	25 дней
Контроль (PBS)	196	249	469	584	833	1193
SD	±55	±77	±149	±230	±274	±419
TRA-8	158	97	155	195	365	530
SD	±78	±30	±60	±58	±91	±135

В этой модели все необработанные животные обнаруживали заметный рост опухоли, а опухолевый рост у TRA-8-обработанных животных ингибировался, на что указывал размер опухоли. Этот результат показал, что TRA-8 является эффективным средством для элиминации опухолевых клеток in vivo.

Пример 25. Комбинированное исследование TRA-8

Клеточную линию рака предстательной железы человека РС-3 получали из Американской коллекции тканевых культур (АТСС) и выдерживали в питательной смеси F12-К (21127-022, Gibco BRL), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS, Hyclone), 1% L-глутамина-200 мМ (25030-149, Gibco BRL) и 0,5% раствор пенициллина и стрептомицина (Р-7539, Sigma). Среду RPMI 1640 (MED-008, IWAKI), в которую было добавлено 10% FBS и 0,5% раствор пенициллина и стрептомицина, использовали в описанном ниже эксперименте. Экспоненциально растущие клетки РС-3 собирали путем трипсинизации и дважды промывали свежей средой. Затем, за день до начала эксперимента, клетки подсчитывали, ресуспендировали в свежей среде при плотности 5×10⁴ клеток/мл и распределяли с тремя повторениями по плоскодонным 96-луночным планшетам (3598, Corning-Coster) в полном объеме 100 мкл/лунку. Репрезентативное противораковое лекарственное средство, паклитаксел (169-18611, Wако), растворенное в диметилсульфоксиде (10 мг/мл), разводили в свежей среде, а затем добавляли в 96-луночные планшеты, содержащие клетки при концентрации 50 мкл/лунку. Конечные концентрации диметилсульфоксида составляли менее чем 0,1%. После инкубирования в течение 24 часов при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в лунки добавляли TRA-8, разведенное в свежей среде. После инкубирования в течение еще 24 часов в лунки добавляли 50 мкл минимальной поддерживающей среды (11095-098, Gibco BRL), содержащей 1 мг/мл ХТТ и 25 мМ PMS, и планшеты инкубировали в течение 6 ч. Затем измеряли OD450 на приборе SPECTRA MAX 250 (Molecular Devices) и жизнеспособность клеток определяли следующим образом:

Жизнеспособность клеток (%)=(OD450 для лунок, содержащих клетки, обработанные таксолом и/или TRA-8 (агент(ы)) - OD450 для лунок, не содержащих ни клеток, ни агента)×100/(OD450 для лунок, содержащих клетки, но не содержащих агента - OD450 для лунок, не содержащих ни клеток, ни агента).

Результаты вышеописанного анализа для антитела TRA-8, используемого вместе с репрезентативным противораковым лекарственным средством, паклитакселом, представлены ниже. Паклитаксел снижал жизнеспособность клеток РС-3, но более чем 40% сигналов, указывало на то, что при концентрациях вплоть до 200 нМ еще оставались жизнеспособные раковые клетки. При этом добавление 0,1 нг/мл TRA-8 значительно снижало жизнеспособность раковых клеток, вплоть до 10%, хотя после разового введения TRA-8 при этой концентрации не наблюдалось какого-либо снижения жизнеспособности клеток. Этот результат явно свидетельствовал о том, что TRA-8 обнаруживал противораковую синергическую активность при его объединении с другими противораковыми лекарственными средствами.

Пример 26. Анализ гуманизированных антител TRA-8 другого типа

(1) Конструирование гуманизированных антител

Конструирование гуманизированной версии TRA-8 осуществляли методом, в основном известным как CDR-прививка. В качестве антитела-акцептора использовали антитело mAb58'CL, описанное в сравнительном примере 2, и к этому акцептору присоединяли CDR-области антитела TRA-8. В каркасной области к акцептору присоединяли некоторые аминокислоты из TRA-8 или из человеческих "консенсусных" последовательностей в соответствии с критерием Queen et al. (Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 86, 10029-10033 (1989)) и гуманизированные последовательности TRA-8 конструировали, как описано ниже.

(2) Конструирование плазмиды, несущей ДНК вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного или мышиного TRA-8 других типов

Как показано на SEQ ID NO:56 списка последовательностей, гуманизацию Н1-типа аминокислотных последовательностей тяжелой цепи мышиного антитела TRA-8 против человеческого DR5 осуществляли путем замены 3-й аминокислоты (метионина), 13-й аминокислоты (лизина), 19-й аминокислоты (лизина), 40-й аминокислоты (треонина), 42-й аминокислоты (глутаминовой кислоты), 44-й аминокислоты (аргинина), 84-й аминокислоты (серина), 88-й аминокислоты (серина), 93-й аминокислоты (метионина), 114-й аминокислоты (треонина) и 115-й аминокислоты (лейцина) глутамином, глутамином, аргинином, аланином, глицином, глицином, аспарагином, аланином, валином, лейцином и валином, соответственно.

Как показано на SEQ ID NO:59 списка последовательностей, гуманизацию Н3-типа аминокислотных последовательностей тяжелой цепи мышиного антитела TRA-8 против человеческого DR5 осуществляли путем замены 13-й аминокислоты (лизина), 19-й аминокислоты (лизина), 40-й аминокислоты (треонина), 42-й аминокислоты (глутаминовой кислоты), 44-й аминокислоты (аргинина), 88-й аминокислоты (серина), 93-й аминокислоты (метионина), 114-й аминокислоты (треонина) и 115-й аминокислоты (лейцина) глутамином, аргинином, аланином, глицином, глицином, аланином, валином, лейцином и валином соответственно.

Как показано на SEQ ID NO:60 списка последовательностей, гуманизацию Н4-типа аминокислотных последовательностей тяжелой цепи мышиного антитела TRA-8 против человеческого DR5 осуществляли путем замены 13-й аминокислоты (лизина), 19-й аминокислоты (лизина), 88-й аминокислоты (серина), 93-й аминокислоты (метионина), 114-й аминокислоты (треонина) и 115-й аминокислоты (лейцина) глутамином, аргинином, аланином, валином, лейцином и валином соответственно.

Как показано на SEQ ID NO:61 списка последовательностей, плазмиду, несущую ДНК вариабельной области тяжелой цепи химерного TRA-8, обозначали как "М-тип". Кроме того, гуманизированное TRA-8, описанное в примерах 17 и 18, обозначали "Н2-тип".

Плазмиды, несущие ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного или химерного TRA-8, конструировали нижеописанным способом.

Для конструирования нижеследующих ДНК-последовательностей, каждая из которых содержала вышеописанные замены, использовали ПЦР.

Были синтезированы следующие 24 олигонуклеотида:

Нижеследующие 2 ПЦР-праймера были синтезированы, как описано выше:

5'-ttggataagc ttggcttgac-3' (Р1; SEQ ID NO:44) и

5'-gaccgatggg cccttggtgg a-3' (Р2; SEQ ID NO:45).

Синтез ДНК Н1-типа, кодирующей полипептидную цепь, содержащую секреторную сигнальную последовательность, вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного TRA-8 и 8 аминокислотных остатков у N-конца области IgG-CH1, осуществляли с использованием комбинированной ПЦР соответственно.

ДНК-фрагмент Н1-типа получали нижеописанным способом.

Состав ПЦР-реакционного раствора:

олигонуклеотид А, 10 пмоль;

олигонуклеотид В2, 10 пмоль;

олигонуклеотид С, 10 пмоль;

олигонуклеотид D, 10 пмоль;

олигонуклеотид Е, 10 пмоль;

олигонуклеотид F, 10 пмоль;

олигонуклеотид G, 10 пмоль;

олигонуклеотид H2, 10 пмоль;

олигонуклеотид I, 10 пмоль;

олигонуклеотид J, 10 пмоль;

олигонуклеотид К, 10 пмоль;

олигонуклеотид L, 10 пмоль;

олигонуклеотидный праймер Р1, 2 мкМ;

олигонуклеотидный праймер Р2, 2 мкМ;

10×буфер Pyrobest II, 10 мкл;

dNTP-смесь, 8 мкл;

ДНК-полимераза Pyrobest, 0,5 мкл; и

бидистиллированная вода до конечного объема 50 мкл.

ПЦР-реакцию проводили следующим образом. Сначала раствор нагревали при 94°С в течение 5 минут, а затем проводили 7 циклов нагревания при 98°С в течение 10 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты. После завершения этой процедуры реакционный раствор нагревали при 72°С в течение 15 минут.

После экстракции фенолом и осаждения этанолом полученный ДНК-осадок сушили в вакууме, растворяли в минимальном количестве бидистиллированной воды и разделяли с помощью электрофореза на 3% агарозном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл водного раствора этидийбромида для обнаружения ДНК при УФ-излучении. ДНК-полосы, соответствующие ДНК Н1-типа, вырезали лезвием бритвы и элюировали из геля с использованием набора Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA). После экстракции фенолом проэлюированную ДНК концентрировали путем центрифугирования при 7500×g, затем осаждали этанолом и, наконец, растворяли в 5 мкл дистиллированной воды.

Синтез ДНК Н3-типа, кодирующей полипептидную цепь, содержащую секреторную сигнальную последовательность, вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного TRA-8 и 8 аминокислотных остатков у N-конца области IgG-CH1, осуществляли с использованием комбинированной ПЦР соответственно.

ДНК-фрагмент Н3-типа получали нижеописанным способом.

Состав ПЦР-реакционного раствора:

олигонуклеотид А, 10 пмоль;

олигонуклеотид В, 10 пмоль;

олигонуклеотид С, 10 пмоль;

олигонуклеотид D, 10 пмоль;

олигонуклеотид Е2, 10 пмоль;

олигонуклеотид F, 10 пмоль;

олигонуклеотид G, 10 пмоль;

олигонуклеотид H, 10 пмоль;

олигонуклеотид I, 10 пмоль;

олигонуклеотид J, 10 пмоль;

олигонуклеотид К2, 10 пмоль;

олигонуклеотид L, 10 пмоль;

олигонуклеотидный праймер Р1, 2 мкМ;

олигонуклеотидный праймер Р2, 2 мкМ;

10×буфер Pyrobest II, 10 мкл;

dNTP-смесь, 8 мкл;

ДНК-полимераза Pyrobest, 0,5 мкл; и

бидистиллированная вода до конечного объема 50 мкл.

ПЦР-реакцию проводили следующим образом. Сначала раствор нагревали при 94°С в течение 5 минут, а затем проводили 7 циклов нагревания при 98°С в течение 10 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты. После завершения этой процедуры реакционный раствор нагревали при 72°С в течение 15 минут.

После экстракции фенолом и осаждения этанолом полученный ДНК-осадок сушили в вакууме, растворяли в минимальном количестве бидистиллированной воды и разделяли с помощью электрофореза на 3% агарозном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл водного раствора этидийбромида для обнаружения ДНК при УФ-излучении. ДНК-полосы, соответствующие ДНК Н3-типа, вырезали лезвием бритвы и элюировали из геля с использованием набора Geneclean Spin. После экстракции фенолом проэлюированную ДНК концентрировали путем центрифугирования при 7500×g, осаждали этанолом и, наконец, растворяли в 5 мкл дистиллированной воды.

Синтез ДНК Н4-типа, кодирующей полипептидную цепь, содержащую секреторную сигнальную последовательность, вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного TRA-8 и 8 аминокислотных остатков у N-конца области IgG-CH1, осуществляли с использованием комбинированной ПЦР соответственно.

ДНК-фрагмент Н4-типа получали нижеописанным способом.

Состав ПЦР-реакционного раствора:

олигонуклеотид А, 10 пмоль;

олигонуклеотид В, 10 пмоль;

олигонуклеотид С2, 10 пмоль;

олигонуклеотид D, 10 пмоль;

олигонуклеотид Е2, 10 пмоль;

олигонуклеотид F, 10 пмоль;

олигонуклеотид G, 10 пмоль;

олигонуклеотид H, 10 пмоль;

олигонуклеотид I2, 10 пмоль;

олигонуклеотид J, 10 пмоль;

олигонуклеотид К2, 10 пмоль;

олигонуклеотид L, 10 пмоль;

олигонуклеотидный праймер Р1, 2 мкМ;

олигонуклеотидный праймер Р2, 2 мкМ;

10×буфер Pyrobest II, 10 мкл;

dNTP-смесь, 8 мкл;

ДНК-полимераза Pyrobest, 0,5 мкл; и

бидистиллированная вода до конечного объема 50 мкл.

ПЦР-реакцию проводили следующим образом. Сначала раствор нагревали при 94°С в течение 5 минут, а затем проводили 7 циклов нагревания при 98°С в течение 10 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты. После завершения этой процедуры реакционный раствор нагревали при 72°С в течение 15 минут.

После экстракции фенолом и осаждения этанолом полученный ДНК-осадок сушили в вакууме, растворяли в минимальном количестве бидистиллированной воды и разделяли с помощью электрофореза на 3% агарозном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл водного раствора этидийбромида для обнаружения ДНК при УФ-излучении. ДНК-полосы, соответствующие ДНК Н4-типа, вырезали лезвием бритвы и элюировали из геля с использованием набора Geneclean Spin. После экстракции фенолом проэлюированную ДНК концентрировали путем центрифугирования при 7500×g, осаждали этанолом и, наконец, растворяли в 5 мкл дистиллированной воды.

Синтез ДНК М-типа, кодирующей полипептидную цепь, содержащую секреторную сигнальную последовательность, вариабельную область тяжелой цепи химерного TRA-8 и 8 аминокислотных остатков у N-конца области IgG-CH1, осуществляли с использованием комбинированной ПЦР соответственно.

ДНК-фрагмент М-типа получали нижеописанным способом.

Состав ПЦР-реакционного раствора:

олигонуклеотид А, 10 пмоль;

олигонуклеотид В3, 10 пмоль;

олигонуклеотид С2, 10 пмоль;

олигонуклеотид D, 10 пмоль;

олигонуклеотид Е3, 10 пмоль;

олигонуклеотид F2, 10 пмоль;

олигонуклеотид G, 10 пмоль;

олигонуклеотид H3, 10 пмоль;

олигонуклеотид I2, 10 пмоль;

олигонуклеотид J, 10 пмоль;

олигонуклеотид К3, 10 пмоль;

олигонуклеотид L2, 10 пмоль;

олигонуклеотидный праймер Р1, 2 мкМ;

олигонуклеотидный праймер Р2, 2 мкМ;

10×буфер Pyrobest II, 10 мкл;

dNTP-смесь, 8 мкл;

ДНК-полимераза Pyrobest, 0,5 мкл; и

бидистиллированная вода до конечного объема 50 мкл.

ПЦР-реакцию проводили следующим образом. Сначала раствор нагревали при 94°С в течение 5 минут, а затем проводили 7 циклов нагревания при 98°С в течение 10 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты. После завершения этой процедуры реакционный раствор нагревали при 72°С в течение 15 минут.

После экстракции фенолом и осаждения этанолом полученный ДНК-осадок сушили в вакууме, растворяли в минимальном количестве бидистиллированной воды и разделяли с помощью электрофореза на 3% агарозном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл водного раствора этидийбромида для обнаружения ДНК при УФ-излучении. ДНК-полосы, соответствующие ДНК М-типа, вырезали лезвием бритвы и элюировали из геля с использованием набора Geneclean Spin. После экстракции фенолом проэлюированную ДНК концентрировали путем центрифугирования при 7500×g, осаждали этанолом и, наконец, растворяли в 5 мкл дистиллированной воды.

Каждую полученную экстрагированную ДНК (Н1-типа, Н3-типа, Н4-типа и М-типа) клонировали с использованием вектора pGEM-Т Easy (Promega) следующим образом:

ДНК-фрагмент, полученный в результате ПЦР-реакции (Н1, Н3, Н4 или М), 5 мкл;

10×Taq-полимеразный буфер, 1 мкл;

dNTP-смесь, 1 мкл;

полимераза Taq (5 ед./мл), 1 мкл; и

бидистиллированная вода до конечного объема 10 мкл.

После проведения реакции каждого вышеуказанного раствора при 70°С в течение 30 минут каждый ДНК-раствор и вектор pGEM-Т Easy лигировали с использованием набора для лигирования ДНК, Версия 2.0 (Takara Syuzo Co, Ltd.) в соответствии с инструкциями производителей.

После 4-часового инкубирования при 15°С 2 мкл инкубированного реакционного раствора смешивали со 100 мкл компетентного штамма JM109 E.coli при плотности клеток 1-2×10⁹ клеток/мл (Takara Syuzo Co, Ltd.) и смесь выдерживали на льду в течение 30 минут, затем при 42°С в течение 30 секунд, а затем снова выдерживали на льду в течение 1 минуты. После этого к смеси добавляли 500 мкл среды SOC (2% об./об. триптона, 0,5% мас./об. дрожжевого экстракта, 0,05% мас./об. хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида калия, 1 мМ хлорида магния и 20 мМ глюкозы) и смесь инкубировали еще один час при встряхивании. Затем выделяли штаммы-трансформанты и из этих штаммов получали плазмидную ДНК, как описано в "Molecular Cloning A Laboratory Manual". Нуклеотидную последовательность этой ДНК, кодирующей тяжелую цепь гуманизированного или мышиного TRA-8, определяли дидезокси-методом, соответственно (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467), с использованием ДНК-анализатора 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).

Полученные плазмиды обозначали рНА15 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую тяжелую цепь гуманизированного TRA-8 Н1-типа), рНС10 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую тяжелую цепь гуманизированного TRA-8 Н3-типа), рНD21 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую тяжелую цепь гуманизированного TRA-8 Н4-типа) и рМ11 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую тяжелую цепь химерного TRA-8). Штаммы-трансформанты E.coli, содержащие эти плазмиды и обозначенные E.coli JM109/рНА15, E.coli JM109/рНС10, E.coli JM109/рНD21 и E.coli JM109/рМ11, были депонированы 20 апреля 2001 г. в Международном депозитарии патентуемых микроорганизмов, Национальный институт промышленных наук и передовых технологий, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов, и имеют регистрационный номер FERM BP-7555, FERM BP-7557, FERM BP-7558 и FERM BP-7559 соответственно.

(3) Конструирование экспрессирующих плазмид, несущих ДНК вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного или мышиного TRA-8 нескольких типов

Рекомбинантный экспрессирующий вектор для клеток животных конструировали путем встраивания ДНК, кодирующей тяжелую цепь гуманизированного TRA-8 Н1-типа, Н3-типа и Н4-типа или химерного М-типа (клонированную как описано выше), следующим образом.

Один мкг плазмиды рSRННН3 (Европейская патентная заявка ЕР 0909816 А1), несущей геномную ДНК человеческой вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного моноклонального антитела НFE7A против Fas и константной области человеческого IgG1, то есть экспрессирующего вектора для клеток млекопитающих, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и ApaI и выделяли с помощью электрофореза на 3% агарозном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл водного раствора бромида этидия для обнаружения ДНК при УФ-излучении. Полосы векторной ДНК, содержащие геномную ДНК константной области человеческого IgG1 без вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного НFE7A, вырезали лезвием бритвы и элюировали из геля с использованием набора Geneclean Spin. После экстракции фенолом проэлюированную ДНК концентрировали путем центрифугирования при 7500×g, а затем осаждали этанолом и, наконец, растворяли в 5 мкл дистиллированной воды, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную гидролизованную дефосфорилированную плазмиду (100 нг) лигировали с 1 мкг ДНК-фрагмента рНА15, рНС10, рНD21 или рМ11, содержащего ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного или химерного TRA-8, которое также было гидролизовано ферментами HindIII и ApaI с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем лигированную смесь использовали для трансформации клеток JM109 E.coli, которые после этого высевали в чашки с LB-агаром, содержащие 50 мкг/мл ампициллина.

Полученные таким способом трансформанты культивировали в 2 мл жидкой LB-среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 37°С, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН.

Экстрагированную плазмидную ДНК гидролизовали ферментами HindIII и ApaI и подвергали электрофорезу на 3% (мас./об) агарозном геле для подтверждения присутствия или отсутствия нужной вставки ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного или химерного TRA-8. Инсерция и ориентация нужного ДНК-фрагмента в данном векторе были подтверждены секвенированием ДНК с использованием анализатора генных последовательностей (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Полученные экспрессирующие плазмиды, несущие кДНК, кодирующую тяжелую цепь гуманизированного или химерного TRA-8, обозначали рНА15-1, рНС10-3, рНD21-1 и рМ11-1 соответственно.

(4) Конструирование векторов для гуманизированных легких цепей

(4.1) Конструирование экспрессирующего вектора для легкой цепи гуманизированного антитела (LМ1-типа)

Как показано в SEQ ID NO:72 списка последовательностей, гуманизацию другого типа (LМ1-типа) аминокислотных последовательностей легкой цепи мышиного антитела TRA-8 против человеческого DR5 осуществляли путем замены 3-й аминокислоты (валина), 8-й аминокислоты (гистидина), 9-й аминокислоты (лизина), 10-й аминокислоты (фенилаланина), 11-й аминокислоты (метионина), 13-й аминокислоты (треонина), 20-й аминокислоты (серина), 42-й аминокислоты (глутамина), 43-й аминокислоты (серина), 60-й аминокислоты (аспарагиновой кислоты), 63-й аминокислоты (треонина), 77-й аминокислоты (аспарагина), 78-й аминокислоты (валина), 80-й аминокислоты (серина), 83-й аминокислоты (лейцина), 85-й аминокислоты (аспарагиновой кислоты), 87-й аминокислоты (фенилаланина), 99-й аминокислоты (глицина), 103-й аминокислоты (лейцина) и 108-й аминокислоты (аланина) у N-конца аминокислотной последовательности легкой цепи TRA-8 глутамином, пролином, серином, серином, лейцином, аланином, треонином, лизином, аланином, серином, серином, серином, лейцином, пролином, фенилаланином, треонином, тирозином, глутамином, валином и треонином соответственно. Полученная последовательность была обозначена LМ1.

Экспрессирующие плазмиды, несущие указанный тип аминокислотных последовательностей "гуманизированной" легкой цепи антитела TRA-8 против человеческого DR5 (LМ1-типа, SEQ ID NO:72 в списке последовательностей), конструировали, как описано ниже.

1) Синтез праймеров для получения вариабельных и константных областей легкой цепи гуманизированного TRA-8 (LМ1-типа)

ДНК, кодирующую полипептидную цепь LМ1 (SEQ ID NO:72 в списке последовательностей), каждая из которых представляет собой гибрид вариабельной области легкой цепи гуманизированного анти-DR5 антитела TRA-8 (LМ1-типа) и константной области легкой цепи человеческого Ig (κ-цепь), синтезировали соответствующим образом с использованием комбинации ПЦР.

Помимо 7AL1P (SEQ ID NO:47) и 7ALCN (SEQ ID NO:48), были синтезированы HKCDF11 (SEQ ID NO:50), HKCDR12 (SEQ ID NO:51), HKCDF22 (SEQ ID NO:52), HKCDR22 (SEQ ID NO:53) и HKCF12 (SEQ ID NO:54).

Нижеследующий олигонуклеотидный праймер синтезировали для ПЦР:

5'-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga-3' (HKSPR12; SEQ ID NO:77).

2) Конструирование плазмиды рCR3.1/LМ1-2 (клонирующей легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ1-типа)

LМ1-ДНК-фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO:72 в списке последовательностей, получали путем проведения 2-стадийной ПЦР, встраивали в плазмидный вектор и клонировали в E.coli.

а) Первая стадия ПЦР

LМ1-F1-ДНК-фрагмент, кодирующий секреторную сигнальную последовательность и часть FRL₁-области, с добавленным сайтом расщепления рестриктирующим ферментом HindIII у 5'-конца получали при следующих условиях. Матричные плазмиды рHSGHM17 и pSRPDHH получали в соответствии с описанием в Европейской патентной заявке ЕР 0909816 А1.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды рHSGHM17, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер НКSPR12, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ1-F2-ДНК-фрагмент, кодирующий часть FRL₁, CDRL₁, FRL₂ и CDRL₂, получали при нижеследующих условиях.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pL28, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер НКСDF11, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер НКCDR12, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ1-F3-ДНК-фрагмент, кодирующий CDRL₂, FRL₃ и часть CDRL₃, получали при нижеследующих условиях.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pSRPDHH, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер НКСDF22, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер НКCDR22, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ1-F4-ДНК-фрагмент, кодирующий CDRL₃, FRL₄ и константную область с добавленным сайтом расщепления рестриктирующим ферментом EcoRI у 3'-конца, получали при нижеследующих условиях.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pHSRPDHH, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер НКСF12, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

Амплифицированные ДНК-фрагменты, полученные в результате ПЦР, выделяли с помощью электрофореза в 5% полиакриламидном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл этидийбромида для детекции продуцированной ДНК при УФ-излучении. Детектированные таким образом соответствующие ДНК-полосы вырезали лезвием бритвы.

b) Вторая стадия ПЦР

LМ1-ДНК, в которой были лигированы вышеописанные LМ1-F1-ДНК, LМ1-F2-ДНК, LМ1-F3-ДНК и LМ1-F4-ДНК-фрагменты, получали при следующих условиях.

Состав реакционного раствора:

фрагмент геля с LМ1-F1-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ1-F2-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ1-F3-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ1-F4-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5,0 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5,0 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

Полученный таким образом LМ1-ДНК-фрагмент встраивали в плазмиду рCR3.1DNA с использованием набора для клонирования эукариотического ТА (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей и вводили в компетентный штамм TOP10F' E.coli, имеющийся в наборе. Нуклеотидные последовательности этих ДНК, кодирующих легкую цепь гуманизированного TRA-8 (LМ1-типа), подтверждали дидезокси-методом (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) с использованием ДНК-анализатора 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).

Полученные плазмиды обозначали рCR3.1/LМ1-2 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи гуманизированного TRA-8 (LМ1-типа) и константную область легкой цепи человеческого Ig).

Полученную плазмиду рCR3.1/LМ1-2, содержащую LМ1-ДНК-фрагмент, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды рНSG399 гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную таким образом дефосфорилированную рНSG399-плазмидную ДНК и LМ1-ДНК-фрагмент, который был также гидролизован рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). После этого DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агаровую среду, содержащую 0,1 мМ IPTG, 0,1% Х-Gal и 50 мкг/мл хлорамфеникола (конечные концентрации). Полученные белые трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 50 мкг/мл хлорамфеникола, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН. Экстрагированную плазмидную ДНК гидролизовали ферментами HindIII и EcoRI, а затем клон, содержащий LM1-ДНК-фрагмент, отбирали посредством электрофореза на 1% агарозном геле.

В результате проведения вышеописанной процедуры получали плазмиду pHSG/М1-2-2, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи гуманизированного LМ1-TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ. Штамм-трансформант E.coli, содержащий эти плазмиды и обозначенный E.coli DH5α/pHSG/М1-2-2, был депонирован 20 апреля 2001 г. в Международном депозитарии патентуемых микроорганизмов, Национальный институт промышленных наук и передовых технологий, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов, и имеет регистрационный номер FERM BP-7562.

3) Конструирование плазмиды pSR/LМ1-2 (экспрессирующая плазмида для "гуманизированной" легкой цепи LМ1-TRA-8)

Полученную плазмиду pHSG/М1-2-2, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи гуманизированного LМ1-TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды pSRPDHH (Европейская патентная заявка ЕР 0909816 А1) гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную дефосфорилированную ДНК плазмиды pSRPDHH и HindIII-EcoRI-ДНК-фрагмент, полученный из pHSG/М1-2-2, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агар. Полученные трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН. Инсерция и ориентация нужного ДНК-фрагмента в векторе pSRPDHH были подтверждены секвенированием ДНК с использованием анализатора генных последовательностей.

Полученную экспрессирующую плазмиду, несущую кДНК, кодирующую легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ1-типа, обозначали pSR/LМ1-2.

(4.2) Конструирование экспрессирующего вектора для легкой цепи гуманизированного антитела (LМ3-типа)

Как показано в SEQ ID NO:73 списка последовательностей, гуманизацию другого типа (LМ3-типа) аминокислотных последовательностей легкой цепи мышиного антитела TRA-8 против человеческого DR5 осуществляли путем замены 8-й аминокислоты (гистидина), 9-й аминокислоты (лизина), 10-й аминокислоты (фенилаланина), 11-й аминокислоты (метионина), 13-й аминокислоты (треонина), 20-й аминокислоты (серина), 42-й аминокислоты (глутамина), 43-й аминокислоты (серина), 77-й аминокислоты (аспарагина), 78-й аминокислоты (валина), 80-й аминокислоты (серина), 83-й аминокислоты (лейцина), 85-й аминокислоты (аспарагиновой кислоты), 87-й аминокислоты (фенилаланина), 99-й аминокислоты (глицина), 103-й аминокислоты (лейцина) и 108-й аминокислоты (аланина) у N-конца аминокислотной последовательности легкой цепи TRA-8 пролином, серином, серином, лейцином, аланином, треонином, лизином, аланином, серином, лейцином, пролином, фенилаланином, треонином, тирозином, глутамином, валином и треонином соответственно. Полученная последовательность была обозначена LМ3.

Экспрессирующие плазмиды, несущие указанный тип аминокислотных последовательностей гуманизированной легкой цепи антитела TRA-8 против человеческого DR5 (LМ3-типа, SEQ ID NO:73 в списке последовательностей), конструировали, как описано ниже.

1) Синтез праймеров для получения вариабельных и константных областей легкой цепи гуманизированного TRA-8 LМ3-типа

ДНК, кодирующую полипептидную цепь LМ3 (SEQ ID NO:73 в списке последовательностей), каждая из которых представляет собой гибрид вариабельной области легкой цепи гуманизированного анти-DR5 антитела TRA-8 и константной области легкой цепи человеческого Ig (κ-цепь), синтезировали соответствующим образом с использованием комбинации ПЦР.

Помимо 7AL1P (SEQ ID NO:47) и 7ALCN (SEQ ID NO:48), были синтезированы нижеследующие олигонуклеотидные праймеры для ПЦР:

2) Конструирование плазмиды рCR3.1/LМ3-3-44 (клонирующей легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ3-типа)

LМ3-ДНК-фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO:73 в списке последовательностей, получали путем проведения 2-стадийной ПЦР, встраивали в плазмидный вектор и клонировали в E.coli.

а) Первая стадия ПЦР

LМ3-F31В-ДНК-фрагмент, кодирующий секреторную сигнальную последовательность, с добавленным сайтом расщепления рестриктирующим ферментом HindIII у 5′-конца, FRL₁, CDRL₁, FRL₂ и CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ и часть константной области, получали при следующих условиях.

Состав реакционного раствора:

олигонуклеотидный праймер МОD1F1, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R1, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F22, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R22, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F3, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R3, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F42, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R4, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F5, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R52, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F6, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R6, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F7, 50 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R7, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер LR17, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ3-F31С-ДНК-фрагмент, кодирующий часть константной области, с добавленным сайтом расщепления рестриктирующим ферментом EcoRI у 3'-конца получали при нижеследующих условиях.

Матричную плазмиду pSRPDHH получали, как описано в Европейской патентной заявке ЕР 0909816 А1.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pSRPDHH, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер MOD1F7, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

После ПЦР амплифицированные ДНК-фрагменты выделяли с помощью электрофореза в 5% полиакриламидном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл этидийбромида для детекции продуцированной ДНК при УФ-излучении. Детектированные таким образом соответствующие ДНК-полосы вырезали лезвием бритвы.

b) Вторая стадия ПЦР

LМ3-ДНК, в которой были лигированы вышеописанные LМ3-F31В-ДНК и LМ3-F31С-ДНК-фрагменты, получали при следующих условиях.

Состав реакционного раствора:

фрагмент геля с LМ3-F31В-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ3-F31С-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5,0 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5,0 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

Полученный таким образом LМ3-ДНК-фрагмент встраивали в плазмиду рCR3.1DNA с использованием набора для клонирования эукариотического ТА (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей и вводили в компетентный штамм TOP10F' E.coli, имеющийся в наборе. Нуклеотидные последовательности этих ДНК, кодирующих легкую цепь гуманизированного TRA-8 (LМ1-типа), подтверждали дидезокси-методом (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) с использованием ДНК-анализатора 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).

Полученные плазмиды обозначали рCR3.1/LМ3-3-44 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи гуманизированного TRA-8 LМ3-типа и константную область легкой цепи человеческого Ig).

Полученную плазмиду рCR3.1/LМ3-3-44, содержащую LМ3-ДНК-фрагмент, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды рНSG399 гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную таким образом дефосфорилированную рНSG399-плазмидную ДНК и LМ3-ДНК-фрагмент, который был также гидролизован рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агаровую среду, содержащую 0,1 мМ IPTG, 0,1% Х-Gal и 50 мкг/мл хлорамфеникола (конечные концентрации). Полученные белые трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 50 мкг/мл хлорамфеникола, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН. Экстрагированную плазмидную ДНК гидролизовали ферментами HindIII и EcoRI, а затем клон, несущий LM3-ДНК-фрагмент, отбирали при помощи электрофореза на 1% агарозном геле.

В результате проведения вышеописанной процедуры получали плазмиду pHSG/М3-3-22, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи гуманизированного LМ3-TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ. Штамм-трансформант E.coli, содержащий эти плазмиды и обозначенный E.coli DH5α/pHSG/М3-3-22, был депонирован 20 апреля 2001 г. в Международном депозитарии патентуемых микроорганизмов, Национальный институт промышленных наук и передовых технологий, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов, и имеет регистрационный номер FERM BP-7564.

3) Конструирование плазмиды pSR/LМ3-3-44-10 (экспрессирующая плазмида для гуманизированной легкой цепи LМ3-TRA-8)

Полученную плазмиду pHSG/М3-3-22, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи гуманизированного LМ3-TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды pSRPDHH (Европейская патентная заявка ЕР 0909816 А1) гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную дефосфорилированную ДНК плазмиды pSRPDHH и HindIII-EcoRI-ДНК-фрагмент, полученный из pHSG/М3-3-22, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агар. Полученные трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН. Инсерция и ориентация нужного ДНК-фрагмента в векторе pSRPDHH были подтверждены секвенированием ДНК с использованием анализатора генных последовательностей (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Полученную экспрессирующую плазмиду, несущую кДНК, кодирующую легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ3-типа, обозначали pSR/LМ3-3-44-10.

(4.3) Конструирование экспрессирующего вектора для легкой цепи гуманизированного антитела (LМ4-типа)

Как показано в SEQ ID NO:74 списка последовательностей, гуманизацию другого типа (LМ4-типа) аминокислотных последовательностей легкой цепи мышиного антитела TRA-8 против человеческого DR5 осуществляли путем замены 8-й аминокислоты (гистидина), 9-й аминокислоты (лизина), 10-й аминокислоты (фенилаланина), 11-й аминокислоты (метионина), 13-й аминокислоты (треонина), 20-й аминокислоты (серина), 42-й аминокислоты (глутамина), 43-й аминокислоты (серина), 77-й аминокислоты (аспарагина), 78-й аминокислоты (валина), 80-й аминокислоты (серина), 83-й аминокислоты (лейцина), 85-й аминокислоты (аспарагиновой кислоты), 99-й аминокислоты (глицина), 103-й аминокислоты (лейцина) и 108-й аминокислоты (аланина) у N-конца аминокислотной последовательности легкой цепи TRA-8 пролином, серином, серином, лейцином, аланином, треонином, лизином, аланином, серином, лейцином, пролином, фенилаланином, треонином, глутамином, валином и треонином соответственно. Полученная последовательность была обозначена LМ4.

Экспрессирующие плазмиды, содержащие указанный тип аминокислотных последовательностей "гуманизированной" легкой цепи антитела TRA-8 против человеческого DR5 (LМ4-типа, SEQ ID NO:74 в списке последовательностей), конструировали, как описано ниже.

1) Синтез праймеров для получения вариабельных и константных областей легкой цепи гуманизированного TRA-8 LМ4-типа

ДНК, кодирующую полипептидную цепь LМ4 (SEQ ID NO:74 в списке последовательностей), каждая из которых представляет собой гибрид вариабельной области легкой цепи гуманизированного анти-DR5 антитела TRA-8 и константной области легкой цепи человеческого Ig (κ-цепь), синтезировали соответствующим образом с использованием комбинации ПЦР.

Помимо 7AL1P (SEQ ID NO:47), 7ALCN (SEQ ID NO:48) MOD1F1 (SEQ ID NO:78), MOD1R1 (SEQ ID NO:79), MOD1F22 (SEQ ID NO:80), MOD1R22 (SEQ ID NO:81), MOD1F3 (SEQ ID NO:82), MOD1R3 (SEQ ID NO:83), MOD1F42 (SEQ ID NO:84), MOD1R4 (SEQ ID NO:85), MOD1F5 (SEQ ID NO:86), MOD1R52 (SEQ ID NO:87), MOD1F7 (SEQ ID NO:90), MOD1R7 (SEQ ID NO:91) и LR17 (SEQ ID NO:101), для ПЦР были синтезированы следующие олигонуклеотидные праймеры:

5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F62, SEQ ID NO:92),

5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag-3' (MOD1R62, SEQ ID NO:93)

2) Конструирование плазмиды рCR3.1/LМ4-5-3 (клонирующей легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ4-типа)

LМ4-ДНК-фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO:74 в списке последовательностей, получали путем проведения 2-стадийной ПЦР, встраивали в плазмидный вектор и клонировали в E.coli.

а) Первая стадия ПЦР

LМ4-F41В-ДНК-фрагмент, кодирующий секреторную сигнальную последовательность с сайтом расщепления рестриктирующим ферментом HindIII у 5'-конца, FRL₁, CDRL₁, FRL₂, CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ и часть константной области, получали при следующих условиях.

Состав реакционного раствора:

олигонуклеотидный праймер МОD1F1, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R1, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F22, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R22, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F3, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R3, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F42, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R4, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F5, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R52, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F62, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R62, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F7, 50 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R7, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер LR17, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С 2 минуты, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ4-F41С-ДНК-фрагмент, кодирующий часть константной области, с добавленным сайтом расщепления рестриктирующего фермента EcoRI у 3'-конца получали при нижеследующих условиях.

Матричную плазмиду pSRPDHH получали, как описано в Европейской патентной заявке ЕР 0909816 А1.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pSRPDHH, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер MOD1F7, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

После ПЦР амплифицированные ДНК-фрагменты выделяли с помощью электрофореза в 5% полиакриламидном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл этидийбромида для детекции продуцированной ДНК при УФ-излучении. Детектированные таким образом соответствующие ДНК-полосы вырезали лезвием бритвы.

b) Вторая стадия ПЦР

LМ4-ДНК, в которой были лигированы вышеописанные LМ4-F41В-ДНК и LМ4-F41С-ДНК-фрагменты, получали при следующих условиях.

Состав реакционного раствора:

фрагмент геля с LМ4-F41В-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ4-F41С-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5,0 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5,0 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

Полученный таким образом LМ4-ДНК-фрагмент встраивали в плазмиду рCR3.1DNA с использованием набора для клонирования эукариотического ТА (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей и вводили в компетентный штамм TOP10F' E.coli, имеющийся в наборе. Нуклеотидные последовательности этих ДНК, кодирующих легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ4-типа, подтверждали дидезокси-методом (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) с использованием ДНК-анализатора 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).

Полученные плазмиды обозначали рCR3.1/LМ4-5-3 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи гуманизированного TRA-8 LМ4-типа и константную область легкой цепи человеческого Ig).

Полученную плазмиду рCR3.1/LМ4-5-3, содержащую LМ4-ДНК-фрагмент, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды рНSG399 гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную таким образом дефосфорилированную рНSG399-плазмидную ДНК и LМ4-ДНК-фрагмент, который был также гидролизован рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агаровую среду, содержащую 0,1 мМ IPTG, 0,1% Х-Gal и 50 мкг/мл хлорамфеникола (конечные концентрации). Полученные белые трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 50 мкг/мл хлорамфеникола, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН. Экстрагированную плазмидную ДНК гидролизовали ферментами HindIII и EcoRI, а затем клон, несущий LM4-ДНК-фрагмент, отбирали при помощи электрофореза на 1% агарозном геле.

В результате проведения вышеописанной процедуры получали плазмиду pHSG/М4-5-3-1, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи гуманизированного LМ4-TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ. Штамм-трансформант E.coli, содержащий эти плазмиды и обозначенный E.coli DH5α/pHSG/М4-5-3-1, был депонирован 20 апреля 2001 г. в Международном депозитарии патентуемых микроорганизмов, Национальный институт промышленных наук и передовых технологий, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов, и имеет регистрационный номер FERM BP-7565.

3) Конструирование плазмиды pSR/LМ4-5-3-3 (экспрессирующая плазмида для гуманизированной легкой цепи LМ4-TRA-8)

Полученную плазмиду pHSG/М4-5-3-1, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи гуманизированного LМ4-TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды pSRPDHH (Европейская патентная заявка ЕР 0909816 А1) гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную дефосфорилированную ДНК плазмиды pSRPDHH и HindIII-EcoRI-ДНК-фрагмент, полученный из pHSG/М4-5-3-1, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали этой лигированной ДНК и высевали на LB-агар. Полученные трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН. Инсерция и ориентация нужного ДНК-фрагмента в векторе pSRPDHH были подтверждены секвенированием ДНК с использованием анализатора генных последовательностей (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Полученную экспрессирующую плазмиду, несущую кДНК, кодирующую легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ4-типа, обозначали pSR/LМ3-5-3-3.

(4.4) Конструирование экспрессирующего вектора для легкой цепи гуманизированного антитела (LМ5-типа)

Как показано в SEQ ID NO:75 списка последовательностей, гуманизацию другого типа (LМ5-типа) аминокислотных последовательностей легкой цепи мышиного антитела TRA-8 против человеческого DR5 осуществляли путем замены 8-й аминокислоты (гистидина), 9-й аминокислоты (лизина), 10-й аминокислоты (фенилаланина), 11-й аминокислоты (метионина), 13-й аминокислоты (треонина), 20-й аминокислоты (серина), 42-й аминокислоты (глутамина), 43-й аминокислоты (серина), 77-й аминокислоты (аспарагина), 78-й аминокислоты (валина), 80-й аминокислоты (серина), 83-й аминокислоты (лейцина), 103-й аминокислоты (лейцина) и 108-й аминокислоты (аланина) у N-конца аминокислотной последовательности легкой цепи TRA-8 пролином, серином, серином, лейцином, аланином, треонином, лизином, аланином, серином, лейцином, пролином, фенилаланином, валином и треонином соответственно. Полученная последовательность была обозначена LМ5.

Экспрессирующие плазмиды, несущие указанный тип аминокислотных последовательностей гуманизированной легкой цепи антитела TRA-8 против человеческого DR5 (LМ5-типа, SEQ ID NO:75 в списке последовательностей), конструировали, как описано ниже.

1) Синтез праймеров для получения вариабельных и константных областей легкой цепи гуманизированного TRA-8 LМ5-типа

ДНК, кодирующую полипептидную цепь LМ5 (SEQ ID NO:75 в списке последовательностей), каждая из которых представляет собой гибрид вариабельной области легкой цепи гуманизированного анти-DR5 антитела TRA-8 и константной области легкой цепи человеческого Ig (κ-цепь), синтезировали соответствующим образом с использованием комбинации ПЦР.

Помимо 7AL1P (SEQ ID NO:47), 7ALCN (SEQ ID NO:48) MOD1F1 (SEQ ID NO:78), MOD1R1 (SEQ ID NO:79), MOD1F22 (SEQ ID NO:80), MOD1R22 (SEQ ID NO:81), MOD1F3 (SEQ ID NO:82), MOD1R3 (SEQ ID NO:83), MOD1F42 (SEQ ID NO:84), MOD1R4 (SEQ ID NO:85), MOD1F5 (SEQ ID NO:86), MOD1R52 (SEQ ID NO:87), MOD1F7 (SEQ ID NO:90) и LR17 (SEQ ID NO:101), для ПЦР были синтезированы следующие олигонуклеотидные праймеры:

2) Конструирование плазмиды рCR3.1/LМ5-3-42 (клонирующей легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ5-типа)

LМ5-ДНК-фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO:75 в списке последовательностей, получали путем проведения 2-стадийной ПЦР, встраивали в плазмидный вектор и клонировали в E.coli.

а) Первая стадия ПЦР

LМ5-F51В-ДНК-фрагмент, кодирующий область секреторной сигнальной последовательности с сайтом рестриктирующего фермента HindIII у 5'-конца, FRL₁, CDRL₁, FRL₂, CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ и часть константной области, получали при следующих условиях.

Состав реакционного раствора:

олигонуклеотидный праймер МОD1F1, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R1, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F22, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R22, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F3, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R3, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F42, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R4, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F52, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R52, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F63, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R63, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1F7, 50 пмоль,

олигонуклеотидный праймер МОD1R72, 5 пмоль,

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер LR17, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ5-F51С-ДНК-фрагмент, кодирующий часть константной области, с добавленным сайтом рестриктирующего фермента EcoRI у 3'-конца получали при нижеследующих условиях. Матричную плазмиду pSRPDHH получали, как описано в Европейской патентной заявке ЕР 0909816 А1.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pSRPDHH, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер MOD1F7, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

После ПЦР амплифицированные ДНК-фрагменты выделяли с помощью электрофореза в 5% полиакриламидном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл этидийбромида для детекции продуцированной ДНК при УФ-излучении. Детектированные таким образом соответствующие ДНК-полосы вырезали лезвием бритвы.

b) Вторая стадия ПЦР

LМ5-ДНК, в которой были лигированы вышеописанные LМ5-F51В-ДНК и LМ5-F51С-ДНК-фрагменты, получали при следующих условиях.

Состав реакционного раствора:

фрагмент геля с LМ5-F51В-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ5-F51С-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5,0 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5,0 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

Полученный таким образом LМ5-ДНК-фрагмент встраивали в плазмиду рCR3.1DNA с использованием набора для клонирования эукариотического ТА (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей и вводили в компетентный штамм TOP10F' E.coli, имеющийся в наборе. Нуклеотидные последовательности этих ДНК, кодирующих легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ5-типа, подтверждали дидезокси-методом (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) с использованием ДНК-анализатора.

Полученные плазмиды обозначали рCR3.1/LМ5-3-42 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи гуманизированного TRA-8 LМ5-типа и константную область легкой цепи человеческого Ig).

Полученную плазмиду рCR3.1/LМ5-3-42, содержащую LМ5-ДНК-фрагмент, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды рНSG399 гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную таким образом дефосфорилированную рНSG399-плазмидную ДНК и LМ5-ДНК-фрагмент, который был также гидролизован рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агаровую среду, содержащую 0,1 мМ IPTG, 0,1% Х-Gal и 50 мкг/мл хлорамфеникола (конечные концентрации). Полученные белые трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 50 мкг/мл хлорамфеникола, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН. Экстрагированную плазмидную ДНК гидролизовали ферментами HindIII и EcoRI, а затем клон, несущий LM5-ДНК-фрагмент, отбирали при помощи электрофореза на 1% агарозном геле.

В результате проведения вышеописанной процедуры получали плазмиду pHSG/М5-3-27, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи гуманизированного LМ5-TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ.

3) Конструирование плазмиды pSR/LМ5-3-27-1 (экспрессирующей плазмиды для гуманизированной легкой цепи LМ5-TRA-8)

Полученную плазмиду pHSG/М5-3-27, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи гуманизированного LМ5-TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды pSRPDHH (Европейская патентная заявка ЕР 0909816 А1) гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную дефосфорилированную pSRPDHH-ДНК и HindIII-EcoRI-ДНК-фрагмент, полученный из pHSG/М5-3-27, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агар. Полученные трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры с использованием щелочного ДСН. Инсерция и ориентация нужного ДНК-фрагмента в векторе pSRPDHH были подтверждены секвенированием ДНК с использованием анализатора генных последовательностей (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Полученную экспрессирующую плазмиду, несущую кДНК, кодирующую легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ5-типа, обозначали pSR/LМ5-3-27-1.

(4.5) Конструирование экспрессирующего вектора для легкой цепи гуманизированного антитела (химерного типа)

Последовательность, показанную в SEQ ID NO:76 списка последовательностей, то есть аминокислотную последовательность легкой цепи TRA-8 химерного типа, обозначали LМ6.

Экспрессирующие плазмиды, несущие указанный тип аминокислотных последовательностей гуманизированной легкой цепи антитела TRA-8 против человеческого DR5 (LМ6-типа) (SEQ ID NO:75 в списке последовательностей), конструировали, как описано ниже.

1) Синтез праймеров для получения вариабельных и константных областей легкой цепи гуманизированного TRA-8 LМ6-типа

ДНК, кодирующую полипептидную цепь LМ6 (SEQ ID NO:75 в списке последовательностей), каждая из которых представляет собой гибрид вариабельной области легкой цепи мышиного анти-DR5 антитела TRA-8 (LМ6-типа) и константной области легкой цепи человеческого Ig (к-цепи), синтезировали соответствующим образом с использованием комбинаций ПЦР.

Помимо 7AL1P (SEQ ID NO:47) и 7ALCN (SEQ ID NO:48) были синтезированы следующие олигонуклеотидные праймеры для ПЦР:

2) Конструирование плазмиды рCR3.1/LМ6-1-16 (клонирующей легкую цепь гуманизированного TRA-8 LМ6-типа)

LМ6-ДНК-фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO:75 в списке последовательностей, получали путем проведения 2-стадийной ПЦР, встраивали в плазмидный вектор и клонировали в E.coli.

а) Первая стадия ПЦР

LМ6-F1-ДНК-фрагмент, кодирующий секреторную сигнальную последовательность и часть FRL₁, с добавленным сайтом рестриктирующго фермента HindIII у 5'-конца получали при нижеследующих условиях. Матричные плазмиды pHSGHM17 и pSRPDHH получали, как описано в Европейской патентной заявке ЕР 0909816 А1.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pHSGHM17, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер HKSPR13, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ6-F2-ДНК-фрагмент, кодирующий часть FRL₁, CDRL₁, FRL₂, CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ и часть константной области, получали при нижеследующих условиях.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды рL28, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер MVF11, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер MVR12, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

LМ6-F3-ДНК-фрагмент, кодирующий часть FRL₄ и константную область, с добавленным сайтом рестриктирующего фермента EcoRI у 3'-конца, получали при нижеследующих условиях.

Состав реакционного раствора:

ДНК плазмиды pSRPDHH, 25 нг;

олигонуклеотидный праймер MСF11, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

После ПЦР амплифицированные ДНК-фрагменты выделяли с помощью электрофореза в 5% полиакриламидном геле. После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл этидийбромида и продуцированную ДНК детектировали при УФ-излучении. Детектированные таким образом соответствующие ДНК-полосы вырезали лезвием бритвы.

b) Вторая стадия ПЦР

LМ6-ДНК, в которой были лигированы вышеописанные LМ6-F1-ДНК, LМ6-F2-ДНК и LМ6-F3-ДНК-фрагменты, получали при следующих условиях.

Состав реакционного раствора:

фрагмент геля с LМ6-F1-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ6-F2-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

фрагмент геля с LМ6-F3-ДНК, полученный в первой стадии ПЦР,

олигонуклеотидный праймер 7AL1P, 50 пмоль;

олигонуклеотидный праймер 7ALCN, 50 пмоль;

dNTP-смесь, 5,0 мкл;

10×ПЦР-буфер, 5,0 мкл;

ДНК-полимераза ampliTaq, 2,5 единицы.

Реакционный раствор, имеющий вышеуказанный состав, доводили до конечного объема 50 мкл путем добавления бидистиллированной воды и использовали в ПЦР.

Температурные условия ПЦР: осуществляли нагревание при 94°С в течение 2 минут, после чего 30 раз повторяли цикл нагревания при 94°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а затем нагревали при 72°С в течение 10 минут.

Полученный таким образом LМ6-ДНК-фрагмент встраивали в плазмиду рCR3.1DNA с использованием набора для клонирования эукариотического ТА (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей и вводили в компетентный штамм TOP10F' E.coli, имеющийся в наборе. Нуклеотидные последовательности этих ДНК, кодирующих легкую цепь гуманизированного TRA-8, подтверждали дидезокси-методом с использованием ДНК-анализатора.

Полученные плазмиды обозначали рCR3.1/LМ6-1-16 (плазмида, несущая кДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи мышиного TRA-8 и константную область легкой цепи человеческого Ig).

Полученную плазмиду рCR3.1/LМ6-1-16, содержащую LМ6-ДНК-фрагмент, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды рНSG399 гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную таким образом дефосфорилированную рНSG399-плазмидную ДНК и LМ6-ДНК-фрагмент, который был также гидролизован рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агаровую среду, содержащую 0,1 мМ IPTG, 0,1% Х-Gal и 50 мкг/мл хлорамфеникола (конечные концентрации). Полученные белые трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 50 мкг/мл хлорамфеникола, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры щелочным методом с использованием ДСН. Экстрагированную плазмидную ДНК гидролизовали ферментами HindIII и EcoRI, а затем клон, несущий LM6-ДНК-фрагмент, отбирали при помощи электрофореза на 1% агарозном геле.

В результате проведения вышеописанной процедуры получали плазмиду pHSG/М6-1-4-1, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи мышиного TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ. Штамм-трансформант E.coli, содержащий эти плазмиды и обозначенный E.coli DH5α/pHSG/М6-1-4-1, был депонирован 20 апреля 2001 г. в Международном депозитарии патентуемых микроорганизмов при Национальном институте промышленных наук и передовых технологий, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов, и имеет регистрационный номер FERM BP-7566.

3) Конструирование плазмиды pSR/LМ6-1-4-6 (экспрессирующая плазмида для легкой цепи LМ6-TRA-8 химерного типа)

Полученную плазмиду pHSG/М6-1-4-1, несущую гибридный фрагмент вариабельной области легкой цепи мышиного TRA-8 и константной области цепи человеческого Igκ, гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI.

Один мкг ДНК клонирующей плазмиды pSRPDHH гидролизовали рестриктирующими ферментами HindIII и EcoRI, а затем дефосфорилировали с использованием CIP. Полученную дефосфорилированную ДНК плазмиды pSRPDHH и HindIII-EcoRI-ДНК-фрагмент, полученный из pHSG/М6-1-4-1, лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Версия 2.0 (Takara Syuzo Co., Ltd.). Затем DH5α E.coli трансформировали лигированной ДНК и высевали на LB-агар. Полученные трансформанты культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и плазмидную ДНК экстрагировали из полученной культуры с использованием щелочного ДСН. Инсерция и ориентация нужного ДНК-фрагмента в указанном векторе были подтверждены секвенированием ДНК с использованием анализатора генных последовательностей.

Полученную экспрессирующую плазмиду, несущую кДНК, кодирующую легкую цепь TRA-8 (химерного типа), обозначали pSR/LМ6-1-4-6.

(5) Продуцирование гуманизированного или химерного антитела TRA-8 нескольких типов

Трансфекцию клеток COS-7 осуществляли методами с использованием трансфецирующего реагента FUGENE6 (Boehringer Mannhiem Biochemica) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к данному набору.

Клетки COS-7 (Американская коллекция типовых культур № CRL-1651) культивировали до полуконфлюентности (3×10⁶ клеток на чашку) в культуральной чашке (площадь культуры: 57 см³; Sumitomo Bakelite, K.K.), содержащей модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (обозначаемую далее "DMEM"; Gibco BRL), в которую была добавлена 10% фетальная телячья сыворотка (обозначаемая далее "FCS"; Moregate).

Одновременно 10 мкг/чашку (всего 5 чашек) плазмидной ДНК тяжелой цепи гуманизированного DR5 в экспрессирующей плазмиде (рНА15-1) и 10 мкг/чашку плазмидной ДНК легкой цепи гуманизированного DR5 в экспрессирующей плазмиде, полученных с использованием щелочного ДСН и центрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия, смешивали, а затем осаждали этанолом и суспендировали в 5 мкл/чашку dH₂O.

После смешивания 15 мкл/чашку трансфецирующего реагента FUGENE6 с 180 мкл/чашку DMEM без FCS этот раствор FUGENE6 (185 мкл/чашку) смешивали с 5 мкл/чашку ДНК-раствора, содержащего 10 мкг/чашку плазмидной ДНК тяжелой цепи гуманизированного DR5 и 10 мкг/чашку плазмидной ДНК легкой цепи гуманизированного DR5. После инкубирования в течение 15 минут при комнатной температуре полученную плазмидную суспензию (200 мкл) добавляли в предварительно приготовленные планшеты с COS-7. После инкубирования в 5% CO₂ при 37°С в течение 24 часов культуральную среду заменяли средой DMEM без FCS. После инкубирования в 5% CO₂ при 37°С в течение 72 часов супернатант культуры выделяли и продукты экспрессии очищали в надосадочных жидкостях. Методом, описанным выше, клетки COS-7 трансфецировали каждой из нижеследующих плазмидных комбинаций:

(А) котрансфекция рHА15-1 и pSR/LM1-2 (H1L1),

(В) котрансфекция рHВ14-1 и pSR/M2-1 (H2L2),

(С) котрансфекция рHB14-1 и pSR/LM3-3-44-10 (H2L3),

(D) котрансфекция рHB14-1 и pSR/LM4-5-3-3 (H2L4),

(E) котрансфекция рHС10-3 и pSR/M2-1 (H3L2),

(F) котрансфекция рHC10-3 и pSR/LM3-3-44-10 (H3L3),

(G) котрансфекция рHC10-3 и pSR/LM4-5-3-3 (H3L4),

(H) котрансфекция рHD21-1 и pSR/LM5-3-27-1 (H4L5),

(I) котрансфекция рM11-1 и pSR/LM6-1-4-6 (химера).

Затем культуру центрифугировали (3500 об/мин, 15 минут) и супернатант собирали. Этот супернатант фильтровали через 0,45 мкм фильтр (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, cat.# 25CS045 AS). Выделение IgG из фильтратов осуществляли аффинной хроматографией с белком G-POROS (Applied Biosystems) при следующих условиях:

ВЭЖХ-система: BioCAD 700E (Applied Biosystems);

колонка: сенсорная кассета с белком G-ID (размер колонки: 2,1 мм ID × 30 мм LD, объем слоя 0,1 мл; Applied Biosystems);

элюирующий буфер: 0,1 М глицин-HCl (рН 2,5);

нейтрализующий буфер: 1 М Трис-HCl (pH 8,5);

детекция: 280 нм;

скорость потока: 1 мл/мин;

размер фракции: 0,5 мл/0,5 мин;

пробирка для фракций: полипропиленовая 1,5 мл микропробирка;

температура: 4°С.

После нанесения всех фильтратов на колонку для промывки колонки использовали 50 мл PBS (Sigma, Cat.№ 1000-3). После нанесения элюирующего буфера начинали сбор фракций. Каждая микропробирка для фракционирования содержала 55 мкл 1 М NaCl, 110 мкл нейтрализующего буфера и 74 мкл 2 мг/мл альбумина бычьей сыворотки (Sigma, Cat.# А-7030) в PBS. Фракции 7-8 собирали.

Подтверждение экспрессии гуманизированных антител и количественный анализ полученных продуктов экспрессии в надосадочных жидкостях культуры осуществляли с помощью ELISA с использованием антитела против человеческого IgG.

В каждую лунку 96-луночного планшета (MaxiSorp, Nunc) добавляли 100 мкл козьего Fc-специфического поликлонального антитела против человеческого IgG (Kappel), растворенного в конечной концентрации 0,5 мкг/мл в буфере для адсорбции (0,05 М гидрогенкарбонат натрия, 0,02% азида натрия, рН 9,6) и планшет инкубировали при 37°С в течение 2 часов для стимуляции адсорбции антитела. Затем планшет пять раз промывали 350 мкл PBS-Т. После промывки к лункам добавляли супернатант культуры, разведенный средой DMEM, содержащей 10% FCS, и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. После повторной промывки PBS-T в каждую лунку добавляли 100 мкл меченного щелочной фосфатазой Fc-специфического козьего поликлонального антитела против человеческого IgG (Jackson Immuno Research Lab), 10000-кратно разведенного PBS-T, и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. После повторной промывки PBS-T добавляли субстратный раствор п-нитрофенилфосфата, поставляемого с набором, содержащим субстрат щелочной фосфатазы (BioRad), в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору. После инкубирования при 37°С в течение 0,5-1 часа измеряли оптическую плотность при 450 нм. В экспериментах настоящего изобретения иммуноглобулин G человеческой плазмы подкласса 1 (IgG1) (Biopure AG), разведенный DMEM, содержащей 10% FCS, до определенных концентраций, использовали как образцы с эталонной концентрацией для гуманизированных анти-DR5 антител, содержащихся в надосадочных жидкостях культуры.

В результате этого экспрессию и очищенные продукты в супернатанте культуры специфически детектировали с использованием антитела против человеческого IgG. Конечная концентрация антитела против человеческого IgG составляла 44,03 мкг/мл (Н1L1), 39,8 мкг/мл (Н2L2), 26,7 мкг/мл (Н2L3), 41,0 мкг/мл (Н2L4), 39,3 мкг/мл (Н3L2), 24,7 мкг/мл (Н3L3), 21,5 мкг/мл (Н3L4), 16,7 мкг/мл (Н4L5) и 18,3 мкг/мл (химера) соответственно.

(6) Апоптоз-индуцирующая активность гуманизированного антитела нескольких типов или химерного антитела

Для оценки апоптоз-индуцирующей активности очищенного гуманизированного антитела TRA-8 использовали клетки Jurkat (АТСС № TIB-152).

Клетки Jurkat, культивированные в среде RPMI 1640 с 10% об./об. FCS (Gibco BRL) в течение 3 дней при 37°С в присутствии 5% СО₂, добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Sumitomo Bakelite) в количестве 50 мкл на лунку. Гуманизированное антитело TRA-8, полученное, как описано в примере 26, доводили до концентрации конечного нужного продукта 100 нг/мл в среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS, путем оценки их концентраций в жидкостях методом, описанным в примере 26. Каждый из полученных растворов продуктов экспрессии, доведенных таким образом до 100 мг/мл, использовали для приготовления серийных разведений путем 2-кратного разведения средой RPMI 1640, содержащей 10% FCS. Каждый из растворов разведенного гуманизированного антитела TRA-8 (Н1L1, Н2L2, Н2L3, Н2L4, Н3L3, Н3L4 или Н4L5) добавляли в каждую лунку при концентрации 50 мкл на лунку. После проведения реакции при 37°С в течение 12 часов добавляли 50 мкл 25 мкМ PMS, содержащего добавленный 1 мг/мл ХТТ (конечные концентрации 250 мкг/мл для ХТТ и 5 мкМ для PMS). После инкубирования в течение 3 часов измеряли оптическую плотность каждой лунки при 450 нм, а затем определяли жизнеспособность клеток с использованием восстанавливающей способности митохондрий в качестве индикатора.

Жизнеспособность клеток в каждой лунке вычисляли по следующей формуле:

Жизнеспособность (%)=100×(а-b)/(c-b),

где "а" представляет собой значение для тестируемой лунки, "b" представляет собой значение для лунки без клеток, и "с" представляет собой значение для лунки, в которую не было добавлено антитело.

В результате было продемонстрировано, что протестированные гуманизированные антитела индуцируют апоптоз в Т-клеточной лимфоме, экспрессирующей антиген DR5 человека.

Кроме того, апоптоз-индуцирующую активность гуманизированного TRA-8 по отношению к клеткам РС-3 оценивали путем добавления таксола методом, описанным в примере 25.

Клеточную линию рака предстательной железы человека РС-3 (АТСС № CRL-1435) получали из Американской коллекции тканевых культур (АТСС) и выдерживали в питательной смеси F12-К (21127-022, Gibco BRL), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS, Hyclone), 1% L-глутамина-200 мМ (25030-149, Gibco BRL) и 0,5% раствор пенициллина и стрептомицина (Р-7539, Sigma). Среду RPMI 1640 (MED-008, IWAKI), в которую были добавлены 10% FBS и 0,5% раствор пенициллина и стрептомицина, использовали в описанном ниже эксперименте. Экспоненциально растущие клетки РС-3 собирали путем трипсинизации и дважды промывали свежей средой. Затем, за день до начала эксперимента, клетки подсчитывали, ресуспендировали в свежей среде при плотности 5×10⁴ клеток/мл и распределяли с тремя повторениями по плоскодонным 96-луночным планшетам (3598, Corning-Coster) в полном объеме 100 мкл/лунку. Репрезентативное противораковое лекарственное средство, паклитаксел (169-18611, Wако), растворенное в диметилсульфоксиде (10 мг/мл), разводили в свежей среде, а затем добавляли в 96-луночные планшеты, содержащие клетки при концентрации 50 мкл/лунку. Конечная концентрация диметилсульфоксида составляла менее 0,1%. После инкубирования в течение 24 часов при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в лунки добавляли гуманизированное антитело TRA-8 (Н1L1, Н2L2, Н2L3, Н2L4, Н3L2, Н3L3, Н3L4 или Н4L5), разведенное в свежей среде. После инкубирования в течение еще 24 часов в лунки добавляли 50 мкл минимальной поддерживающей среды (11095-098, Gibco BRL), содержащей 1 мг/мл ХТТ и 25 мМ PMS, и планшеты инкубировали в течение 6 ч. Затем измеряли OD450 на счетчике ARVO HTS 1420 Multilabel Counter (Wallac Berthold) и жизнеспособность клеток определяли следующим образом:

Жизнеспособность клеток (%) = (OD450 для лунок, содержащих клетки, обработанные таксолом и/или гуманизированным TRA-8 (агент(ы)) - OD450 для лунок, не содержащих ни клеток, ни агента) × 100/(OD450 для лунок, содержащих клетки, но не содержащих агента - OD450 для лунок, не содержащих ни клеток, ни агента).

В результате было продемонстрировано, что протестированные гуманизированные антитела индуцируют апоптоз клеток рака предстательной железы, экспрессирующих антиген DR5 человека.

Пример 27. Продуцирование антитела против DR4

Гибридный белок, содержащий внеклеточный домен человеческого DR4 (а.к. 1-236) и Fc-фрагмент человеческого IgG1, экспрессировали в клетках Cos-7, трансфецированных рекомбинантным аденовирусным вектором. Гибридный белок очищали на аффинной колонке с белком А. Мышей Balb/с иммунизировали очищенным гибридным белком, описанным выше. Один гибридомный клон, 2Е12 (IgG1, κ), обладающий способностью специфически связываться с DR4 и индуцировать апоптоз человеческих клеток лимфомы В Ramos, субклонировали три раза. Специфичность связывания 2Е12 определяли с помощью ELISA и Вестерн-блот-анализа с использованием гибридных белков DR5, DcR1 и DcR2 и IgG1 в качестве контрольных антигенов. Связывание 2Е12 с DR4 клеточной поверхности определяли с помощью проточного цитометрического анализа клеток Cos-7, трансфецированных полноразмерной кДНК, кодирующей человеческий DR4. Апоптоз-индуцирующую активность определяли путем инкубирования клеток Ramos с 1 мкг/мл 2Е12 в присутствии козьего антитела против мышиных IgG1. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite, описанного выше.

Пример 28. Характеризация антитела против DR4

Моноклональное антитело против DR4 (2Е12) является специфическим для человеческого DR4, поскольку оно не связывается с другими TRAIL-рецепторами, такими как DR5, DcR1 и DcR2 в ELISA (фиг.19а). 2Е12 распознавало DR4 клеточной поверхности, как было продемонстрировано с помощью проточного цитометрического анализа DR4-трансфецированных клеток Cos-7 (фиг.19b). 2Е12 было способно индуцировать апоптоз клеток лимфомы Ramos в присутствии "второго" перекрестносвязывающего антитела дозозависимым образом (фиг.19с). In vitro-обработка клеток Ramos антителом 2Е12 приводила к зависимой от времени активации каспаз 8, 9 и 3 и к расщеплению PARP (фиг.19d). Эти результаты показали, что 2Е12 представляет собой анти-DR4 антитело-агонист, которое индуцирует апоптоз каспазо-зависимым образом.

С использованием анти-DR4 антитела (2Е12), а затем PE-конъюгированного козьего антитела против мышиных IgG1 и проточной цитометрии было показано, что антитело против DR4 связывается с клетками клеточной линии фибросаркомы (Hs913Т) и с клетками нескольких клеточных линий рака молочной железы (2LМР.MDA-МВ-231 и MDA-МВ-453), но при этом оно обнаруживало очень незначительное связывание или вообще не связывалось с нормальной клеточной линией человеческих фибробластов кожи (Malme-3).

Пример 29. Опухолецидная активность антител против DR4

Опухолецидную активность 2Е12 тестировали на моделях раковых опухолей молочной железы. "Голых" мышей инокулировали s.c. человеческой клеточной линией рака молочной железы 2LMP. После инъекции опухолевых клеток проводили обработку i.p. дозами 200 мкг 2Е12 в дни 7, 10, 14, 17, 21 и 24. Животным вводили i.v. адриамицин (доксорубицин) (6 мг/кг) в дни 8, 12 и 16. Обработка 2Е12 и адриамицином (фиг.20) приводила к более сильному ингибированию роста опухоли, чем ингибирование антителом 2Е12 или адриамицином, вводимыми отдельно.

Опухолецидную активность TRA-8 в комбинации с 2Е12 тестировали на тех же самых моделях раковых опухолей молочной железы. После инъекции опухолевых клеток проводили обработку i.p. дозами 200 мкг TRA-8 и 2Е12 в дни 7, 10, 14, 17, 21 и 24. Животным вводили i.v. адриамицин (6 мг/кг) в дни 8, 12 и 16. Обработка TRA-8 + 2Е12 или TRA-8 + 2Е12 и адриамицином приводила к 88%-й и к полной 100%-й регрессии опухоли соответственно (фиг.21).

Пример 30. Опухолецидная активность антител против DR4/DR5 в комбинации с другими терапевтическими средствами

(1) Клеточные линии и реагенты

Субклон 2LMP человеческой клеточной линии рака молочной железы MDA-МВ-231, субклон LСС6 MDA-МВ-435 и субклон DY36Т2 MDA-МВ-361 получали от Dr. Marc Lipmann (Georgetown University, Washington, D.C.) и поддерживали в дополненной среде МЕМ, в которую было добавлено 10% FBS (Hyclone, Logan, UT). Человеческие клеточные линии рака молочной железы MDA-МВ-231, MDA-МВ-453, MDA-МВ-468, BT-474, SK-BR-3 и ZR-75-1 получали из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA). Клетки MDA-МВ-231, MDA-МВ-453 и MDA-МВ-468 культивировали в среде DMEM, в которую были добавлены МЕМ с витаминами, МЕМ с заменимыми аминокислотами, 1 мМ пируват натрия и 10% FBS. Клетки BT-474 культивировали в среде RPMI 1640, в которую было добавлено 10 мкг/мл инсулина, 4,5 г/л глюкозы, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия и 10% FBS. Клетки SK-BR-3 культивировали в среде McCoy с 15% FBS. Клетки ZR-75-1 культивировали в среде Хэма F12K с 20% FBS. Все клеточные линии поддерживали в не содержащей антибиотиков среде при 37°С в атмосфере 5% СО₂ и подвергали рутинному скринингу на примеси микоплазмы.

Очищенное mAb TRA-8 (IgG1) было получено в UAB и также поставлялось фирмой Sankyo Co., Ltd. (Tokyo, Japan). Конъюгированное с фикоэритрином козье антитело против мышиных IgG1 и контрольное антитело, специфическое к изотипу IgG1, получали от Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL). Адриамицин и паклитаксел закупали у Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO) и приготавливали в виде 10 мМ маточных растворов в дистиллированной H₂O или ДМСО соответственно. Для исследований на животных клинический препарат паклитаксела (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ) получали из аптеки Бирмингемской больницы при Алабамском Университете (University of Alabama at Birmingham Hospital Pharmacy (Birmingham, AL)). Этот препарат разводили 1:5 в PBS непосредственно перед использованием.

(2) Непрямой иммунофлуоресцентный анализ и проточный цитометрический анализ на экспрессию DR5

Клетки в фазе экспоненциального роста один раз промывали PBS Дульбекко (дефицитным по Ca²⁺ и Mg²⁺) и собирали с использованием 4 мМ ЭДТА/0,5% KCl при 37°С. Клетки собирали центрифугированием при 4°С в течение 5 мин при 1000 об/мин, один раз промывали и ресуспендировали в PBS, содержащем 1% BSA и 0,01% азида натрия (FACS-буфер) при 4°С. Клетки инкубировали с 10 мкг/мл очищенного TRA-8 или контрольного антитела, специфического к изотипу IgG1, в течение 60 минут при 4°С, один раз промывали буфером, а затем инкубировали с 10 мкг/мл PE-конъюгированного козьего антитела против мышиных IgG1 в течение 20 минут при 4°С. После окрашивания антителом клетки один раз промывали FACS-буфером и фиксировали в 1% параформальдегиде в течение 15 минут на льду. Образцы анализировали на Becton Dickinson FACScan (San Jose, CA), и данные анализировали с помощью программы CellQuest.

(3) Анализы на жизнеспособность клеток с использованием ATPLite

Клетки трипсинизировали и ресуспендировали в полной культуральной среде. Одну тысячу клеток на лунку культивировали в оптически прозрачных 96-луночных черных планшетах (Costar #3904, Corning, NY) и инкубировали в течение ночи при 37°С перед началом обработки. Лекарственные средства и антитело разводили в культуральной среде непосредственно перед использованием, и конечная концентрация ДМСО всегда составляла ≤0,001%. Жизнеспособность клеток оценивали после 24-часовой обработки отдельно взятым TRA-8. Для комбинированной обработки цитотоксическими лекарственными средствами клетки предварительно обрабатывали лекарственным средством за 24 часа до добавления антитела и инкубировали еще 24 часа, а затем проводили анализ на жизнеспособность клеток путем измерения уровней клеточного АТР с использованием люминесцентного анализа ATPLite (Packard Instruments, Meriden, CT). Анализ осуществляли в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем, за исключением того, что все реакционные объемы (культуральная среда и реагенты) были уменьшены на половину. Все образцы анализировали с тремя повторениями, и данные, полученные от минимум 3 независимых экспериментов, выражали как среднее ± среднеквадратичное отклонение.

(4) Исследования по терапии с использованием TRA-8, взятого отдельно или в комбинации с химиотерапией или лучевой терапией у бестимусных "голых" мышей, несущих ксенотрансплантаты рака молочной железы

Бестимусным "голым" мышам инъецировали s.c. 3×10⁷ клеток 2LMP. Через 7 дней после инъекции опухолевых клеток мышам вводили i.p. 200 или 600 мкг (10 или 30 мг/кг) TRA-8, а затем делали пять дополнительных инъекций в дни 10, 14, 17, 21 и 24. В течение всего этого времени проводили мониторинг роста опухолей. В последующих исследованиях животным, несущим подкожные опухоли 2LMP, инъецировали i.р. 200 мкг TRA-8 в дни 7, 10, 14, 17, 21 и 24 отдельно или в комбинации с адриамицином (6 мг/кг, i.v., дни 8, 12 и 16) или с паклитакселом (20 мг/кг, i.р., дни 8, 12, 16, 20 и 24). Определяли размеры опухолей и скорость их регрессии. Кроме того, проводили исследования с использованием TRA-8 и адриамицина в соответствии с режимом, описанным выше, в комбинации с облучением ксенотрансплантатов 2LMP 3 Гр (Грей, Gy) ⁶⁰Со в дни 9 и 17.

(5) Анализ на апоптоз в ксенотрансплантатах

Бестимусным "голым" мышам, которым на день 0 инъецировали s.c. 3×10⁷ клеток 2LMP, вводили i.p. 100 мкг TRA-8 на дни 7 и 10. Каждой группе из 2 мышей вводили адриамицин (3 мг/кг) на дни 8 и 11, паклитаксел (10 мг/кг) на дни 8 и 11 или комбинацию TRA-8 и адриамицина или паклитаксела в той же самой дозе и по той же самой схеме. Одну группу мышей не обрабатывали. После инъекции опухолевых клеток на день 14 ксенотрансплантаты иссекали для исследования апоптоза. Для получения адекватной опухолевой ткани в целях проведения анализа на день 14 целесообразно значительно уменьшить интенсивность обработки по сравнению с обработкой, предусматриваемой стандартным протоколом авторов настоящего изобретения. Анализ Tunel на апоптоз в опухолевых ксенотрансплантатах осуществляли следующим образом. 5-микронные парафиновые срезы ткани наносили на покровные стекла Superfrost/Plus и нагревали при 58°С в течение 1 ч. Тканевые срезы депарафинизировали с тремя заменами ксилола и подвергали регидратации с одной заменой абсолютного этанола, 95% этанола и 70% этанола, каждый раз с 5-минутным увеличением времени. Затем срезы помещали в забуференный трисом физиологический раствор (0,5 М трис-основа, 0,15 М NaCl, 0,0002% тритон Х-100, рН 7,6). Апоптотические ядра детектировали с использованием набора с пероксидазной меткой Apop Tag Peroxidase (Intergen, Purchase, NY). К образцам ткани добавляли протеиназы К (20 мкг/мл в дистиллированной деионизованной H₂O) и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Эндогенную пероксидазную активность гасили водным раствором 3% перекиси водорода в течение 5 минут. Срезы обрабатывали уравновешивающим буфером в течение 30 минут, а затем инкубировали с TdT-ферментом (разведенным в реакционной смеси для мечения) в течение 1 часа при 37°С с использованием парафиновых покрытий. В процессе такого инкубирования TdT-фермент связывается в 3'ОН-концами ДНК-фрагментов и катализирует присоединение меченных дигоксигенином и немеченных дезоксинуклеотидов. Негативный контроль инкубировали с дистиллированной H₂O (разведенной в реакционной смеси для мечения) вместо TdT-фермента. Для прекращения реакции мечения добавляли блокирующий буфер в течение 10 минут при комнатной температуре. К каждому предметному стеклу в течение 30 минут добавляли конъюгат с антителом против дигоксигенина. Для визуализации меченного 3'ОН-конца ДНК-фрагментов использовали хромаген 3,3' DAB. Затем предметные стекла промывали в деионизованной воде и подвергали слабому контрастному окрашиванию гематоксилином, дегидратировали с использованием набора спиртов повышающейся концентрации и ксилола и закрывали покровными стеклами с использованием Permount. Приблизительно 10 произвольно выбранных полей оценивали процент окрашивания Tunel и процент интенсивно окрашенных апоптотических телец по всей ткани.

(6) Статистические анализы

(А) Анализ на цитотоксичность взаимодействия TRA-8 с лекарственным средством in vitro

Данные цитотоксичности были проанализированы для того, чтобы выяснить, обладает ли данная комбинация аддитивным, менее чем аддитивным (антагонистическим) или более чем аддитивным (синергическим) цитотоксическим действием. Зависимость "доза-ответ" для агентов, взятых отдельно и в комбинации, моделировали с использованием модели поверхностного ответа второго порядка с линейным, квадратичным и интерактивным (характеризующим взаимодействие) для каждой из 9 клеточных линий (Montgomery, D.C. Design and Analysis of Experiments, New York: Wiley, 2001) в соответствии с рекомендациями Gennings (On Testing for Drug/Chemical Interactions: Definitions and Inference, pp.457-468, 2000). Значимый интерактивный член был классифицирован либо как синергический, либо как антагонистический в зависимости от того, является ли этот интерактивный член отрицательным с более чем аддитивной цитотоксичностью или положительным с менее чем аддитивной цитотоксичностью. Если этот интерактивный член не является значимым, то взаимодействие между TRA-8 и адриамицином или TRA-8 и паклитакселом должно рассматриваться как аддитивное, при условии, что аддитивные члены являются значимыми.

(В) Анализ TRA-8-терапии, химиотерапии, лучевой терапии и комбинированной терапии в отдельных экспериментах на животных

Данные, полученные из 6 независимых экспериментов, анализировали в отдельном эксперименте. Комбинации, используемые для обработки, сравнивали с точки зрения противоопухолевой эффективности in vivo, то есть ингибирования роста опухоли, которое было измерено по трем конечным точкам: по интервалу времени, за который опухоль увеличивалась в два раза; по проценту регрессии опухоли и по скорости роста опухоли с течением времени. В анализе на время удвоения размера опухоли использовали фактическое число дней, за которые поверхность опухоли увеличивалась в два раза (произведение двух диаметров) по сравнению с ее начальным размером на день 7 после инъекции опухолевых клеток. Для сравнения срединного времени удвоения размера опухоли для различных групп обработки использовали непараметрический критерий Крускала-Уоллиса. Для сравнения степени регрессии опухолей и регрессии опухолей без рецидивов для различных групп обработки использовали точный критерий Фишера. Для того чтобы определить, приводит ли любая комбинированная терапия к значимому синергическому, то есть к более чем аддитивному ингибированию роста опухоли, проводили сравнение кривых роста путем последовательных измерений площади с использованием линейной смешанной модели в течение первых 3 недель после начала терапии (Lindsey, J.K. Models for Repeated Measurments, pp.100-142, Oxford, 1993). Для тестирования на синергические эффекты комбинированной терапии в эту модель включали интерактивный член. Если этот интерактивный член был значимым, а указанным эффектом было ингибирование роста опухоли на уровне, превышающем аддитивный, то такое взаимодействие рассматривалось как синергическое.

(С) Общий анализ на терапевтическое действие

В общем анализе было использовано всего 166 животных, 10 групп обработки, и проведено 6 независимых экспериментов. Комбинации, используемые для обработки, сравнивали в отношении их противоопухолевой эффективности in vivo. Среднее время удвоения опухоли анализировали с использованием критерия Крускала-Уоллиса, а для сравнения степени регрессии опухолей и регрессии опухолей без рецидивов для различных групп обработки использовали точный критерий Фишера.

Все статистические анализы проводили с использованием SAS® (Sas/Stat User's Guide, SAS OnlineDoc, Version 8, Cary NC: SAS Institute Inc., 1999).

(6) Экспрессия DR5 и TRA-8-индуцированная цитотоксичность в клеточных линиях рака молочной железы

Как проиллюстрировано на фиг.22А, все девять клеточных линий рака молочной железы были DR5-позитивными с различными степенями экспрессии от сильно позитивной (LCC6 и MDA-МВ-453) до слабо позитивной (MDA-МВ-468 и SK-BR-3). На фиг.22В проиллюстрирована TRA-8-индуцированная цитотоксичность для девяти клеточных линий. Четыре клеточных линии были чувствительными к TRA-8-индуцированной цитотоксичности с IC₅₀-концентрациями, составляющими от 17 до 299 нг/мл (LСС6, 2LМР, MDA-МВ-231, MDA-МВ-468), а другие были полностью резистентными (DY362Т2, ВТ-474, MDA-МВ-453). Какой-либо хорошей корреляции между экспрессией DR5 и степенью TRA-8-индуцированной цитотоксичности не наблюдалось, как было проиллюстрировано на клеточных линиях MDA-МВ-453 и MDA-МВ-468.

Действие TRA-8 на индуцированную химиотерапией цитотоксичность оценивали с использованием адриамицина (фиг.23А) и паклитаксела (фиг.23В). Данные анализа для тестирования на взаимодействие между антителом и лекарственным средством систематизированы в таблице 5. Какого-либо значимого синергического взаимодействия между TRA-8 и паклитакселом не наблюдалось, при этом большинство таких взаимодействий было аддитивными. Четыре из девяти клеточных линий удовлетворяли критериям на синергическое взаимодействие между TRA-8 и адриамицином. Клеточная линия 2LMP продемонстрировала хорошую чувствительность к TRA-8, а также чувствительность либо к адриамицину, либо к паклитакселу. Эта клеточная линия была выбрана для исследования in vivo-эффективности антитела и/или лекарственных средств.

Таблица 5 Эффекты взаимодействий in vitro для комбинированной обработки
	TRA-8+адриамицин	TRA-8+паклитаксел
Клеточная линия	Взаимодействие	р-величинаа	Взаимодействие	р-величинаа
LCC6	Синергический	<0,001	Аддитивный	0,624
MDA-MB-453	Синергический	<0,001	Отсутствие ответаc	0,615
2LMP	Аддитивный	0,153	Аддитивный	0,937
MDA-MB-231	Аддитивный	0,663	Аддитивный	0,064
BT-474	Синергический	<0,001	NDb	0,992
ZR-75-1	Синергический	0,013	Аддитивный	0,172
DY36T2	NDb	0,808	NDb	0,798
MDA-MB-468	Аддитивный	0,184	Аддитивный	0,724
SK-BR-3	Аддитивный	0,361	Отсутствие ответаc	0,871
а) р-величина означает значимость синергического интерактивного члена. Если совместное действие TRA-8 и лекарственного средства является значимым и интерактивный член является значимым, то действие этой комбинации рассматривается как синергическое. Если р-величина взаимодействия не составляет <0,05, то действие данной комбинации рассматривается как аддитивное. b) Не определяли, поскольку эффект TRA-8 является незначимым, а эффект адриамицина/паклитаксела является значимым. с) Какого-либо значимого дозозависимого ответа для любого из этих агентов не наблюдалось.

(7) In vivo противоопухолевое действие TRA-8, вводимого отдельно или в комбинации с химиотерапией и/или с лучевой терапией

TRA-8, вводимое в 6 дозах по 200 мкг и 600 мкг два раза в неделю, оказывало аналогичное ингибирующее действие на рост хорошо укоренившихся (s.c.) опухолей 2LMP (фиг.24). В трех дополнительных независимых экспериментах доза 200 мкг/схема введения давала статистически значимое ингибирование роста опухоли (р<0,004, критерий Крускала-Уоллиса для времени увеличения размера опухоли в два раза) по сравнению с необработанным контролем, и эта доза и схема введения были выбраны для последующих исследований. На фиг.25 проиллюстрированы эффекты TRA-8, адриамицина или комбинации TRA-8 и адриамицина в отношении противоопухолевой эффективности. По сравнению с необработанным контролем терапия с использованием одного TRA-8 или TRA-8 вместе с адриамицином приводили к значимому ингибированию роста опухоли (р=0,002, критерий Крускала-Уоллиса), тогда как действие адриамицина не отличалось от контроля. Комбинация TRA-8 вместе с адриамицином давала большее ингибирование роста, чем любой из агентов, вводимых отдельно (р=0,002), а также значительно более полную регрессию опухоли (четыре), чем любой из агентов, вводимых отдельно, где полной регрессии опухоли не наблюдалось (р<0,001, точный критерий Фишера). In vivo синергическое действие TRA-8 и адриамицина оценивали с помощью анализа кривой роста на ранней стадии. Интерактивный член был значимым (р<0,001) и указывал на синергическое действие. Синергическое взаимодействие исследовали во втором независимом эксперименте.

Действие TRA-8 и паклитаксела исследовали на той же самой модели с аналогичными наблюдениями (фиг.26). По сравнению с необработанным контролем TRA-8 и TRA-8 вместе с паклитакселом давали значимое ингибирование роста опухоли (р<0,001, критерий Крускала-Уоллиса). Рост опухоли у животных, обработанных TRA-8 вместе с паклитакселом, значительно отличался от роста опухоли, обработанной одним паклитакселом (р=0,008), при этом полная регрессия опухоли наблюдалось у 3/8 в отличие от групп, обработанных любым одним из агентов, где вообще не наблюдалось регрессии. Анализ кривых роста опухолей на ранней стадии продемонстрировал, что синергический эффект был близок к значимому (р=0,063), а аддитивные эффекты были значимыми (р<0,001).

И, наконец, были проанализированы эффекты TRA-8, адриамицина и облучения ⁶⁰Со, применяемых отдельно и в различных комбинациях, как проиллюстрировано на фиг.27. При этом наблюдались значимые различия по времени увеличения размера опухоли в два раза (р<0,001), и множественные сравнения показали, что тройная терапия с использованием TRA-8, адриамицина и ⁶⁰Со приводила к ингибированию роста опухоли, который значительно отличался от роста опухолей во всех других группах обработки, а две группы, подвергнутые двойной терапии (адриамицин+TRA-8 или ⁶⁰Со+TRA-8), давали результаты, отличающиеся от результатов, полученных для группы, обработанной одним агентом (р<0,001). Животные, подвергнутые только облучению ⁶⁰Со, давали результаты, не отличающиеся от необработанного контроля (р=0,926). Все обработки двойными комбинациями давали значимые синергические эффекты (р<0,001). Полная регрессия опухолей наблюдалась у 6/8 животных, подвергавшихся тройной терапии, и у 4 животных не наблюдалось рецидивов опухолей в течение 180-дневного наблюдения.

(8) Общий анализ терапевтических эффектов

В исследованиях на противоопухолевую терапию in vivo использовали 166 животных и анализировали время удвоения размера опухоли и частоту полной регрессии опухоли у всех животных в каждой группе обработки (таблица 6). Анализ ANOVA на среднее время удвоения размера опухоли показал значимые различия для групп обработки (р<0,001), при этом множественные сравнения показали, что комбинации TRA-8+паклитаксел, TRA-8+адриамицин и TRA-8+адриамицин+⁶⁰Со давали значительно большее среднее время удвоения размера опухоли, чем среднее время для любой группы обработки без введения TRA-8. Добавление TRA-8 к любому терапевтическому средству приводило к увеличению времени удвоения размера опухоли по сравнению с обработкой без использования TRA-8. Аналогичным образом, критерий Крускала-Уоллиса для оценки срединного значения времени удвоения размера опухоли показал, что эти срединные значения имели абсолютно значимые отличия (р<0,001). Попарные сравнения, проводимые с использованием критерия знаковых рангов Уилкоксона, давали такое же срединное время удвоения размеров опухоли, как множественные сравнения, проводимые с помощью ANOVA. Этот анализ давал заниженную оценку ингибирования роста опухоли при наиболее эффективной обработке для тех групп, в которых не достигалось удвоения размера опухоли в конце эксперимента, которое им приписывалось на день прекращения эксперимента. В таблице 6 также приводится частота полной регрессии опухоли и степень длительности такой регрессии до окончания эксперимента. Полной регрессии опухоли не наблюдалось у животных, подвергнутых либо химиотерапии, либо облучению, что свидетельствовало о хорошо развившейся опухоли и ее агрессивности. Точный критерий Фишера указывал на значимые различия в частоте полной регрессии опухоли для групп обработки (р<0,001). У тридцати животных из 166 наблюдалась полная регрессия опухоли, причем 28 животным из них вводили либо одно антитело TRA-8, либо TRA-8 в комбинации с другими терапевтическими средствами. Полная регрессия опухоли наблюдалась у 1/42 контрольных животных: 1/54 животных были подвергнуты химиотерапии, облучению или их комбинации; а 28/68 животным вводили одно антитело TRA-8 или их подвергали комбинированной терапии с использованием TRA-8. У TRA-8-обработанных групп наблюдалась значимо (р<0,001) более высокая частота полной регрессии. Аналогичным образом, 14/68 животных, подвергавшихся обработке TRA-8 или комбинациями с TRA-8, не обнаруживали рецидивов роста опухоли, в отличие от контрольных 1/42 животных и 0/52 животных, подвергнутых химиотерапии и/или облучению. Регрессия опухоли без рецидивов наблюдалась в периоды от 99 до 171 дней (146±24 дня).

Таблица 2 Общие результаты, полученные для времени удвоения размера опухолей и полной регрессии опухолей 2LMP
			Полная регрессия
Обработка	№ животного	Время удвоения размера опухоли (дни) (среднее/срединное значение)	Общая (%)	Без рецидивов (%)	Средний период наблюдения (d
Необработанный контроль	44(42)а	12/8	1(2%)	1(2%)	177
60Co	8(7)	14/10	0	0	186
Адриамицин	31(28)	17/18	0	0	197
Паклитаксел	7(5)	25/20	0	0	-
Адриамицин+60Co	8(8)	39/36	1(13%)	0	197
TRA-8	30(26)	47/23	6(20%)	5(17%)	159
TRA-8+60Co	8(8)	65/50	3(38%)	1(13%)	186
TRA-8+ Паклитаксел	8(8)	71/62	3(38%)	1(13%)	148
TRA-8+ Адриамицин	14(12)	81/64	10(71%)	3(21%)	185
TRA-8+ Адриамицин+60Co	8(6)	>140/179	6(75%)	4(50%)	192
а) Цифры в скобках означают число невосприимчивых животных

(9) Апоптоз в обработанных опухолях

Индуцирование апоптоза в ксенотрансплантатах после обработки TRA-8, адриамицином, паклитакселом, комбинацией TRA-8+адриамицин и комбинацией TRA-8+паклитаксел оценивали с использованием техники TUNEL. У необработанных животных опухоли имели 4% (1% интенсивно) окрашенных клеток, а животные, обработанные адриамицином или паклитакселом, имели 8% (6% интенсивно) окрашенных клеток и 7% (2% интенсивно) окрашенных клеток. Животные, обработанные лишь одним TRA-8, обнаруживали высокий уровень апоптоза с 25% (15% интенсивно) окрашенными клетками. Животные, обработанные комбинацией TRA-8+адриамицин, имели 28% (22% интенсивно) окрашенных клеток, а животные, обработанные комбинацией TRA-8+паклитаксел, имели 26% (12% интенсивно) окрашенных клеток.

Все патенты или публикации, упомянутые в данной заявке, характеризуют предшествующий уровень техники в области, к которой относится настоящее изобретение. Эти патенты и публикации вводятся в настоящее описание посредством ссылки так, как если бы каждая отдельная публикация была введена посредством ссылки.

Настоящее изобретение не ограничено вышеуказанным депозитом или вариантами его осуществления, описанными в примерах, которые лишь иллюстрируют несколько аспектов настоящего изобретения, а поэтому в объем настоящего изобретения входят любые варианты, которые являются функциональными эквивалентами настоящего изобретения. Помимо описанных и упомянутых здесь вариантов в настоящее изобретение могут быть внесены различные модификации, очевидные для каждого специалиста и не выходящие за рамки прилагаемой формулы изобретения.

Библиография

1. Способ селективной индукции апоптоза в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, включающий стадии (a) контактирования клеток-мишеней с терапевтическим количеством антитела, которое специфически связывается с TRAIL-рецептором DR5, при этом указанное антитело в его растворимой форме при концентрациях менее 1 мкг/мл обладает in vivo апоптоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, и in vitro апоптоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, и

(b) контактирования клеток-мишеней с терапевтическим количеством одного или более терапевтических средств.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по крайней мере, одну стадию контактирования осуществляют in vivo.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по крайней мере, одну стадию контактирования осуществляют in vitro.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются химиотерапевтические средства.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что химиотерапевтическое средство или средства выбраны из группы, состоящей из блеомицина, карбоплатина, хлорамбуцила, цисплатина, колхицина, циклофосфамида, даунорубицина, актиномицина, диэтилстилбестрола, доксорубицина, этопозида, 5-фторурацила, флоксуридина, мелфалана, метотрексата, митомицина, 6-меркаптопурина, тенипозида, 6-тиогуанина, винкристина и винбластина.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что химиотерапевтическое средство или средства выбраны из группы, состоящей из лефлуномида, дактиномицина, тамоксифена, интерферона α-2b, глутаминовой кислоты, пликамицина, меркаптопурина, 6-тиогуанинина, кармустина, BCNU, ломустина, CCNU, арабозида цитозина, эстрамустина, гидроксимочевины, прокарбазина, бисульфана, медроксипрогестерона, эстрамустинфосфата натрия, этинилэстрадиола, эстрадиола, ацетата мегестрола, метилтестостерона, дифосфата диэтилстилбестрола, хлортрианизена, тестолактона, мефалена, хлорамбуцила, мехлоретамина, тиотепы, бетаметазон-натрийфосфата, дикарбазина, аспарагиназы, митотана, сульфата винкристина и сульфата винбластина.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что химиотерапевтическими средствами являются циклофосфамид, доксорубицин и винкристин или его субсерия.

8. Способ по п.7, дополнительно включающий введение ритуксимаба.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются члены семейства TNF.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что членом или членами семейства TNF являются лиганды CD40, или лиганды Fas, или их фрагменты, или производные.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются противовоспалительные средства.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что противовоспалительным средством или средствами являются стероидные или нестероидные противовоспалительные средства.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что нестероидными противовоспалительными средствами являются ингибиторы СОХ-1 или ингибиторы СОХ-2.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются противовирусные средства.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются противоретровирусные средства.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются средства, направленные против условно-патогенных инфекций.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтическим средством является апоптоз-индуцирующее соединение.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что апоптоз-индуцирующим соединением является бисиндолилмалеимид VIII (BisVIII), SN-50 или LY294002.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтическим средством является "второе" антитело, которое стимулирует апоптоз или блокирует пролиферацию клеток-мишеней.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что "второе" антитело выбрано из группы, состоящей из антитела против DR4, антитела против TNF, антитела против В7, антитела против лиганда CD40, антитела против CD40, антитела против CD20 и антитела против Fas.

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтическое средство или средства выбраны из группы, состоящей из химиотерапевтических средств, членов семейства TNF, противовоспалительных средств, противовирусных средств, противоретровирусных средств, средств, направленных против условно-патогенных инфекций, антибиотиков, иммуносупрессорных агентов, иммуноглобулинов, противомалярийных средств, средств против ревматоидного артрита, цитокинов, хемокинов, факторов роста и "второго" антитела, которое стимулирует апоптоз или блокирует пролиферацию клеток-мишеней.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеткой-мишенью является аномально пролиферирующаяся синовиальная клетка.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что синовиальной клеткой является синовиальная клетка ревматоидного артрита.

24. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеткой-мишенью является активированная иммунная клетка.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что активированной иммунной клеткой является активированный лимфоцит.

26. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеткой-мишенью является нейтрофил.

27. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеткой-мишенью является инфицированная вирусом клетка.

28. Способ по п.1, дополнительно включающий облучение клеток-мишеней.

29. Способ ингибирования пролиферации клеток-мишеней, экспрессирующих DR5, включающий стадии (a) контактирования клеток-мишеней с терапевтическим количеством антитела, которое специфически связывается с TRAIL-рецептором DR5, при этом указанное антитело в его растворимой форме при концентрациях менее 1 мкг/мл обладает in vivo апоптоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, и in vitro апоптоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, и (b) контактирования клеток-мишеней с терапевтическим количеством одного или более терапевтических средств.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что по крайней мере одну стадию контактирования осуществляют in vivo.

31. Способ по п.29, отличающийся тем, что по крайней мере одну стадию контактирования осуществляют in vitro.

32. Способ по п.29, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются химиотерапевтические средства.

33. Способ по п.32, отличающийся тем, что химиотерапевтическое средство или средства выбраны из группы, состоящей из блеомицина, карбоплатина, хлорамбуцила, цисплатина, колхицина, циклофосфамида, даунорубицина, актиномицина, диэтилстилбестрола, доксорубицина, этопозида, 5-фторурацила, флоксуридина, мелфалана, метотрексата, митомицина, 6-меркаптопурина, тенипозида, 6-тиогуанина, винкристина и винбластина.

34. Способ по п.32, отличающийся тем, что химиотерапевтическое средство или средства выбраны из группы, состоящей из дактиномицина, тамоксифена, интерферона α-2b, глутаминовой кислоты, пликамицина, меркаптопурина, 6-тиогуанинина, кармустина, BCNU, ломустина, CCNU, арабозида цитозина, эстрамустина, гидроксимочевины, прокарбазина, бисульфана, медроксипрогестерона, эстрамустин-фосфата натрия, этинилэстрадиола, эстрадиола, ацетата мегестрола, метилтестостерона, дифосфата диэтилстилбестрола, хлортрианизена, тестолактона, мефалена, хлорамбуцила, мехлоретамина, тиотепы, бетаметазон-натрийфосфата, дикарбазина, аспарагиназы, митотана, сульфата винкристина и сульфата винбластина.

35. Способ по п.32, отличающийся тем, что химиотерапевтическими средствами являются циклофосфамид, доксорубицин и винкристин или его субсерия.

36. Способ по п.35, дополнительно включающий введение ритуксимаба.

37. Способ по п.29, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются члены семейства TNF.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что членом или членами семейства TNF являются лиганды CD40, или лиганды Fas, или их фрагменты, или производные.

39. Способ по п.29, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются противовоспалительные средства.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что противовоспалительным средством или средствами являются стероидные или нестероидные противовоспалительные средства.

41. Способ по п.40, отличающийся тем, что нестероидными противовоспалительными средствами являются ингибиторы СОХ-1 или ингибиторы СОХ-2.

42. Способ по п.29, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются противовирусные средства.

43. Способ по п.29, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются противоретровирусные средства.

44. Способ по п.29, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются средства, направленные против условно-патогенных инфекций.

45. Способ по п.29, отличающийся тем, что терапевтическим средством является "второе" антитело, которое стимулирует апоптоз или блокирует пролиферацию клеток-мишеней.

46. Способ по п.45, отличающийся тем, что "второе" антитело выбрано из группы, состоящей из антитела против DR4, антитела против TNF, антитела против В7, антитела против лиганда CD40, антитела против CD40, антитела против CD20 и антитела против Fas.

47. Способ по п.29, отличающийся тем, что терапевтическим средством является апоптоз-индуцирующее соединение.

48. Способ по п.47, отличающийся тем, что апоптоз-индуцирующим соединением является бисиндолилмалеимид VIII (BisVIII), SN-50 или LY294002.

49. Способ по п.29, отличающийся тем, что терапевтическое средство или средства выбраны из группы, состоящей из химиотерапевтических средств, членов семейства TNF, противовоспалительных средств, противовирусных средств, противоретровирусных средств, средств, направленных против условно-патогенных инфекций, антибиотиков, иммуносупрессорных агентов, иммуноглобулинов, противомалярийных средств, средств против ревматоидного артрита, цитокинов, хемокинов, факторов роста и "второго" антитела, которое стимулирует апоптоз или блокирует пролиферацию клеток-мишеней.

50. Способ по п.29, отличающийся тем, что клеткой-мишенью является аномально пролиферирующаяся синовиальная клетка.

51. Способ по п.50, отличающийся тем, что синовиальной клеткой является синовиальная клетка ревматоидного артрита.

52. Способ по п.29, отличающийся тем, что клеткой-мишенью является активированная иммунная клетка.

53. Способ по п.29, отличающийся тем, что клеткой-мишенью является активированный лимфоцит.

54. Способ по п.29, отличающийся тем, что клеткой-мишенью является нейтрофил.

55. Способ по п.29, отличающийся тем, что клеткой-мишенью является инфицированная вирусом клетка.

56. Способ по п.29, дополнительно включающий облучение клеток-мишеней.

57. Способ лечения индивидуума, страдающего воспалительным или аутоиммунным заболеванием, включающий (a) контактирования клеток-мишеней с терапевтическим количеством антитела, которое специфически связывается с TRAIL-рецептором DR5, при этом указанное антитело в его растворимой форме при концентрациях менее 1 мкг/мл обладает in vivo апоптоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, и in vitro апоптоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, и

(b) введения индивидууму терапевтического количества терапевтического средства.

58. Способ по п.57, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются химиотерапевтические средства.

59. Способ по п.58, отличающийся тем, что химиотерапевтическое средство или средства выбраны из группы, состоящей из блеомицина, карбоплатина, хлорамбуцила, цисплатина, колхицина, циклофосфамида, даунорубицина, актиномицина, диэтилстилбестрола, доксорубицина, этопозида, 5-фторурацила, флоксуридина, мелфалана, метотрексата, митомицина, 6-меркаптопурина, тенипозида, 6-тиогуанина, винкристина и винбластина.

60. Способ по п.58, отличающийся тем, что химиотерапевтическое средство или средства выбраны из группы, состоящей из дактиномицина, тамоксифена, интерферона α-2b, глутаминовой кислоты, пликамицина, меркаптопурина, 6-тиогуанинина, кармустина, BCNU, ломустина, CCNU, арабозида цитозина, эстрамустина, гидроксимочевины, прокарбазина, бисульфана, медроксипрогестерона, эстрамустин-фосфата натрия, этинилэстрадиола, эстрадиола, ацетата мегестрола, метилтестостерона, дифосфата диэтилстилбестрола, хлортрианизена, тестолактона, мефалена, хлорамбуцила, мехлоретамина, тиотепы, бетаметазон-натрийфосфата, дикарбазина, аспарагиназы, митотана, сульфата винкристина и сульфата винбластина.

61. Способ по п.58, отличающийся тем, что химиотерапевтическими средствами являются циклофосфамид, доксорубицин и винкристин или его субсерия.

62. Способ по п.61, дополнительно включающий введение ритуксимаба.

63. Способ по п.57, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются члены семейства TNF.

64. Способ по п.63, отличающийся тем, что членом или членами семейства TNF являются лиганды CD40, или лиганды Fas, или их фрагменты, или производные.

65. Способ по п.57, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются противовоспалительные средства.

66. Способ по п.65, отличающийся тем, что противовоспалительным средством или средствами являются стероидные или нестероидные противовоспалительные средства.

67. Способ по п.66, отличающийся тем, что нестероидными противовоспалительными средствами являются ингибиторы СОХ-1 или ингибиторы СОХ-2.

68. Способ по п.57, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются противовирусные средства.

69. Способ по п.57, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются противоретровирусные средства.

70. Способ по п.57, отличающийся тем, что терапевтическим средством или средствами являются средства, направленные против условно-патогенных инфекций.

71. Способ по п.57, отличающийся тем, что терапевтическим средством является "второе" антитело, которое стимулирует апоптоз или блокирует пролиферацию клеток-мишеней.

72. Способ по п.71, отличающийся тем, что "второе" антитело выбрано из группы, состоящей из антитела против DR4, антитела против TNF, антитела против В7, антитела против лиганда CD40, антитела против CD40, антитела против CD20 и антитела против Fas.

73. Способ по п.57, отличающийся тем, что терапевтическим средством является апоптоз-индуцирующее соединение.

74. Способ по п.73, отличающийся тем, что апоптоз-индуцирующим соединением является бисиндолилмалеимид VIII (BisVIII), SN-50 или LY294002.

75. Способ по п.57, отличающийся тем, что терапевтическое средство или средства выбраны из группы, состоящей из химиотерапевтических средств, членов семейства TNF, противовоспалительных средств, противовирусных средств, противоретровирусных средств, средств, направленных против условно-патогенных инфекций, антибиотиков, иммуносупрессорных агентов, иммуноглобулинов, противомалярийных средств, средств против ревматоидного артрита, цитокинов, хемокинов, факторов роста и "второго" антитела, которое стимулирует апопотоз или блокирует пролиферацию клеток-мишеней.

76. Способ по п.57, отличающийся тем, что воспалительное или аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из системной красной волчанки, болезни Хашимото, ревматоидного артрита, реакции "трансплантат против хозяина", синдрома Сьегрена, пернициозной анемии, болезни Адиссона, склеродермии, синдрома Гудпасчера, болезни Крона, аутоиммунной гемолитической анемии, бесплодия, тяжелой псевдопаралитической миастении, рассеянного склероза, базедовой болезни, тромботической тромбоцитопении, тромбоцитопенической пурпуры, инсулинзависимого сахарного диабета, аллергии, астмы, атопической болезни, артериосклероза, миокардита, кардиомиопатии, гломерулярного нефрита, гипопластической анемии.

77. Способ по п.57, дополнительно включающий применение субъекту лучевой терапии.

78. Композиция для селективной индукции апоптоза в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, содержащая (a) антитело, которое специфически связывается с TRAIL-рецептором DR5, при этом указанное антитело в его растворимой форме при концентрациях менее 1 мкг/мл обладает in vivo апоптоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, и in vitro апоптоз-индуцирующей активностью в клетках-мишенях, экспрессирующих DR5, и (b) один или несколько терапевтических средств.

79. Композиция по п.78, отличающаяся тем, что терапевтическое средство или средства выбраны из группы, состоящей из химиотерапевтических средств, членов семейства TNF, противовоспалительных средств, противовирусных средств, противоретровирусных средств, средств, направленных против условно-патогенных инфекций, антибиотиков, иммуносупрессорных агентов, иммуноглобулинов, противомалярийных средств, болезнь-модифицирующих противоревматических средств, цитокинов, хемокинов, факторов роста и "второго" антитела, которое стимулирует апоптоз или блокирует пролиферацию клеток-мишеней.

80. Композиция по п.78, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.

Приоритет по пунктам:

01.11.2001 - пп.1-5, 6-17, 18 (в части SN-50 LY29400), 19, 20 (в части антитела DR4), 21 (в части хемотерапевтических агентов, противовоспалительных препаратов, иммуноглобулинов и вторичных антител, вызывающих апоптоз и блокирующих пролиферацию мишеневых клеток), 22-44.

24.06.2002 - пп.6, 8-10, 12-16, 18 (в части бисиндолилмалемид VII), 20 (в части других антител), 21 (в части других агентов), 34, 36-38, 40-44.