Питательная среда для выделения из биологического материала и культивирования микобактерий

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в бактериологической диагностике туберкулеза. Питательная среда содержит в качестве питательной основы водный раствор желтка куриного яйца, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, малахитовый зеленый, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, гумивит, агар и дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить скорость роста микобактерий туберкулеза и увеличить чистоту их индикации из биологического материала. 3 табл.

 

Изобретение относится к микробиологии, касается питательной среды для выделения из патологического материала и культивирования микобактерий и может быть использовано в бактериологической диагностике туберкулеза.

Бактериологический метод, в частности посев биологического материала на специальные питательные среды, позволяет не только получать чистую культуру микобактерий, но и проводить их идентификацию, определять вирулентность, биологические и биохимические свойства.

В бактериологической практике наиболее часто используются плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Петраньяни, Финн-2 и ФАСТ-3Л /1/, обеспечивающие сравнимые показатели скорости и интенсивности роста, а также высеваемости микобактерий из патологического материала.

В качестве предпочтительного аналога нами рассматривается яичная среда Левенштейна-Йенсена, содержащая питательную основу из яиц, двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимоннокислый магний, L-аспарагин, глицерин химически чистый, малахитовый зеленый и воду дистиллированную. Среда Левенштейна-Йенсена обеспечивает наилучшие результаты культивирования бычьего и человеческого видов микобактерий /2/.

Цель изобретения - повышение скорости роста и частоты индикации микобактерий из биологического материала.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, содержащая питательную основу из яиц, двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимоннокислое аммиачное железо, L-аспарагин, глицерин химически чистый, малахитовый зеленый и воду дистиллированную, дополнительно содержит лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, гумивит и агар, а в качестве питательной основы из яиц - водный раствор желтка куриного яйца (1:1) при следующем соотношении компонентов:

двузамещенный фосфорнокислый калий	0,5 г
сернокислый магний	0,5 г
L-аспарагин	4,0 г
глицерин химически чистый	40,0 г
малахитовый зеленый	20,0 мл
лимонная кислота	2,0 г
лимоннокислое аммиачное железо	0,05 г
гумивит	90,0-95,0 мл
агар	30,0 г
водный раствор желтка куриного яйца	250,0 мл
дистиллированная вода	до 1000,0 мл

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот /3/. Раствор солей гуминовых кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /4, 5/. Гумивит - жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 20,0 мл малахитового зеленего, 40,0 г глицерина химически чистого, 90,0 мл гумивита и 30,0 г агара. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до 750,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали рН=7,1-7,2 добавлением 1н NaOH или 1н HCl. Раствор автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывали в проточной воде, протирали 96° этиловым спиртом, разбивали в стерильных условиях и отделяли белок от желтка. В стерильной колбе смешивали желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1 и 250,0 мл полученного раствора добавляли в расплавленную агаровую среду, перемешивали, разливали по пробиркам по 3 мл и скашивали.

Пример 2. Для сравнительного изучения информативности четырех вариантов среды в соответствии с изобретением, различавшихся содержанием гумивита, и сред Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-3Л и Петраньяни использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee, Ravenal БЦЖ), M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК и 659), M.smegmatis (шт.4), M.fortuitum и биологический материал от положительно реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств с характерными поражениями в органах и лимфатических узлах. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Биологический материал предварительно обрабатывали по методу А.П.Аликаевой. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ, при посеве на известные среды и на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний и изучали культурально-морфологические свойства. Интенсивность роста изучали при посеве культуры M.bovis (urr.Vallee) на все анализируемые среды. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1.
Скорость роста микобактерий разных видов на плотных питательных средах
Питательная среда	Скорость роста, сут.
М.bovis шт Vallee	М.bovis шт.Ravenal	М.bovis шт.БЦЖ	М.tuberculosis шт.Academia	М.avium шт.ГИСК	М.avium шт.659	М.smegmatis шт.4	М.fortuitum	Биоматериал от крупного рогатого скота
Левенштейна-Йенсена	13-15	14-16	16-17	13-15	10-12	11-13	3-4	6-7	29-33
Финн-2	13-15	14-16	16-17	13-15	10-11	11-12	3-4	5-8	29-33
Гельберга	17-19	17-19	20-21	17-19	11-12	13-13	2-3	7	33-37
ФАСТ-3Л	16-18	16-18	18-19	15-17	10	11	3	6	30-34
Петраньяни	19-21	19-21	19-21	16-18	10-12	11-13	4-5	9-10	36-40
Заявленная среда с содержанием гумивита, мл			ч
вариант 1 - 85,0	14-16	17-19	20-21	17-19	12-14	13-15	4-5	11	35-39
вариант 2 - 90,0	11-12	14-16	16-17	13-15	10-11	10-11	2	6	26-28
вариант 3 - 95,0	11-12	12-14	16-17	12-13	10-11	10-11	2	5	26-28
вариант 4 - 100,0	11-12	12-14	16-17	12-13	10-11	10-11	2	5	26-28

Таблица 2.
Интенсивность роста М.bovis (шт.Vallee) на плотных питательных средах
Питательная среда	Сутки
7	9	10	11	12	13	14	15	16	24
Левенштейна-Йенсена	-	-	-	-	-	+	+	++	++	+++
Финн-2	-	-	-	-	-	+	+	++	++	+++
Гельберга	-	-	-	-	-	-	++	++	++	+++
ФАСТ-3Л	-	-	-	-	-	-	+	++	+++	+++
Петраньяни	-	-	=	=	-	-	+	++	+++	+++
Заявленная среда с содержанием гумивита, мл вариант 1 - 85,0
вариант 2 - 90,0	-	-	-	-	++	++	++	++	+++	+++
вариант 3 - 95,0	-	-	-	+	++	++	++	+++	+++	++++
вариант 4 - 100,0	-	-	-	+	++	++	++	+++	+++	++++
Примечание: + - единичные колонии; ++ - 10-20 колоний: +++ - 21-50 колоний; ++++ - сплошной рост

По скорости первичного роста чистых культур на плотных питательных средах наилучшие показатели наблюдали на заявленной среде с содержанием гумивита 90,0-100,0 мл (таблица 1). Учитывая то, что увеличение количества гумивита выше 95,0 мл (вариант 4) не влияло на скорость роста, для практического применения рекомендованы варианты 2 и 3 с содержанием гумивита 90,0 и 95,0 мл соответственно. Культура М.bovis на средах Левенштейна-Йенсена, Гельберга и в соответствии с изобретением росла в виде отдельных, мелких, гладких, шаровидных, цвета слоновой кости колоний; на Финн-2, ФАСТ-3Л и Петраньяни - чаще в виде сухих морщинистых колоний. М.tuberculosis на этих же средах чаще всего росла в виде мелких, узелковоподобных, морщинистых, сухих, цвета слоновой кости колоний, a M.avium, M.fortuitum и М.smegmatis - в виде мягких, слизистых, серовато-белых колоний. На среде ФАСТ-3Л культура M.avium росла скудно - единичные колонии. По показателю интенсивности роста культуры М. bovis наиболее информативной оказалась среда в соответствии с изобретением (варианты 2-4), на которой интенсивный рост культур (++) проявлялся на 12-е, значительное накопление бактериальной массы - на 15-е, а сплошной рост колоний - на 24-е сутки (таблица 2). Интенсивность роста культуры микобактерий была значительно ниже на средах Гельберга, ФАСТ-3Л и Петраньяни.

Пример 3. Для определения высеваемости микобактерий исследовали 12 проб биоматериала от крупного рогатого скота с характерными поражениями внутренних органов и лимфатических узлов. При посевах готовили общую однородную пробу, смешивая и тщательно гомогенизируя все 12 отдельных проб. После обработки материала по методу Аликаевой пробы высевали на 40 пробирок каждой среды - Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-3Л, Петраньяни, в соответствии с изобретением (с содержанием гумивита 95,0 мл). Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3.
Высеваемость культур микобактерий из биоматериала от крупного рогатого скота на разных питательных средах
Питательная среда	Число посевов, пробирки	Рост культур	Пророст посторонней микрофлоры
пробирки	%	пробирки	%
Левенштейна-Йенсена	40	23	57	2	5
Финн-2	40	22	54	1	2
Гельберга	40	11	27,5	3	7,5
ФАСТ-3Л	40	11	27,5	4	10,0
Петраньяни	40	5	12,5	5	12,5
в соответствии с изобретением	40	30	73	1	2

По показателю высеваемости микобактерий из биоматериала от животных наиболее информативными были среды в соответствии с изобретением, Левенштейна-Йенсена и Финн-2 - 73, 57 и 54% соответственно (таблица 3). Наименьший пророст посторонней микрофлоры наблюдали на средах в соответствии с изобретением и Финн-2 - 2%. Высеваемость микобактерий на остальных средах была в 2-4 раза ниже.

Основные характеристики известных твердых питательных сред и среды в соответствии с изобретением, подтвержденные результатами исследований:

Левенштейна-Йенсена - стандартная унифицированная, промышленного производства, доводка в условиях бактериологических лабораторий. Характер роста культур соответствует морфологическим свойствам разных видов микобактерий;

Гельберга - качество среды зависит от квалификации и опыта специалиста, часто принимает бледно-салатный цвет, что затрудняет просмотр колоний. Рост соответствует основным классическим характеристикам культур микобактерий;

Финн-2 - в состав входит дефицитный и дорогостоящий гликокол, по высеваемости и скорости роста при первичной индикации микобактерий сравнима со средой Левенштейна-Йенсена;

Петраньяни - по информативности, скорости и интенсивности роста микобактерий уступает всем остальным средам, но позволяет выявлять микобактерии из объектов внешней среды из-за способности длительно удерживать уровень рН 7,0;

ФАСТ-3Л - стандартная, промышленного производства, по ростовым свойствам не уступает среде Гельберга. Культуры, выросшие на ней, не дают роста при пересеве на другие питательные среды;

в соответствии с изобретением - технологична в приготовлении, по информативности, скорости и интенсивности роста и высеваемости микобактерий превосходит испытанные среды, включая Левенштейна-Йенсена. Высоко результативна для накопления биомассы первичных культур микобактерий. Характер роста культур соответствует морфологическим свойствам разных видов микобактерий. Интенсивно коричневый цвет среды позволяет обнаружить мелкие колонии в начальной стадии роста.

Источники информации, принятые во внимание:

1. Туберкулез сельскохозяйственных животных / Под ред. Шишкова В.П., Урбана В.П. - М.: Агропромиздат, 1991. - С.120-121.

2. RU 2268298 С1, 20.01.2006.

3. Гришин Г.И., Слинина К.Н. Дар природы - гумивит // Практик. - 2004. - № 3-4. - С.80-82.

4. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Макаров С.Е., 1999. - 198 с.

5. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа // Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.

Питательная среда для выделения из биологического материала и культивирования микобактерий, содержащая питательную основу из яиц, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, малахитовый зеленый и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, гумивит и агар, а в качестве питательной основы она содержит водный раствор желтка куриного яйца при следующем соотношении компонентов:

калий фосфорнокислый двузамещенный	0,5 г
сернокислый магний	0,5 г
L-аспарагин	4,0 г
глицерин	40,0 г
малахитовый зеленый	20,0 мл
лимонная кислота	2,0 г
лимоннокислое аммиачное железо	0,05 г
гумивит	90,0-95,0 мл
агар	30,0 г
водный раствор желтка куриного яйца	250,0 мл
дистиллированная вода	до 1000,0 мл