Питательная среда для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел

Авторы патента:

C12Q1/04 - установление присутствия и(или) вида микроорганизма; использование селективных сред для испытания антибиотиков или бактерицидов; составы, содержащие химический индикатор для этих целей

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

Владельцы патента RU 2303059:

Государственное научное учреждение (ГНУ) Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования и длительного сохранения в музейных условиях возбудителей гнильцовых болезней пчел. Питательная среда в 1 л гидролизата казеина с содержанием аминного азота 140-150 мг% содержит агар-агар или агар Дифко. Изобретение позволяет увеличить выход биомассы, повысить спорообразование питательной среды, способствует длительному сохранению возбудителей гнильцовых болезней пчел. 2 табл.

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и может быть применено в пчеловодстве для культивирования и длительного сохранения в музейных условиях возбудителей гнильцовых болезней пчел.

Европейский гнилец - болезнь открытого расплода. Возбудители: Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus (доброкачественный гнилец); Enterococcus faecalis (кислый гнилец) культивируются на мясопептонных средах (МПА, МПБ).

Парагнилец - инфекционное заболевание личинок позднего возраста и куколок. Возбудитель - Bacillus paraalvei, культивируется на мясопептонных средах (МПА, МПБ).

Американский гнилец (злокачественный гнилец) - инфекционное заболевание пчелиных семей, приводящее к ослаблению и гибели печатного расплода (взрослые личинки и предкуколки), вызываемое спорообразующим микроорганизмом Paenibacillus larvae subsp. larvae, для культивирования которого требуются специальные среды, т.к. для его роста и споруляции необходимы дополнительные питательные вещества. Переход вегетативных клеток в спорулирующие необходим для сохранения музейных культур возбудителя американского гнильца.

Для культивирования возбудителя американского гнильца в настоящее время применяют среды: Бейли, Томашеца, молочно-желточную среду Уиллиса-Гоббза.

СРЕДА БЕЙЛИ: имеет в составе: 10% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, 1% крахмала, 0,1360 г КН₂PO₄, 1% агар (рН 6,6) [1].

СРЕДА ТОМАШЕЦА: мясопептонная среда с добавлением 10% нормальной лошадиной сыворотки (рН 6,8-7,0) [2].

СРЕДА УИЛДИСА-ГОББЗА - молочно-желточная эмульсия, 2% мясопептонный агар (рН 7,0-7,2) [3].

Известна также среда, имеющая в составе: казеин 1-3,65%; кукурузный настой 1,0-5%; крахмал 0-9,2%; сахарозу 0,6-3,5%; неочищенную патоку 0-9,2%; дрожжи 0,5-0,8%; Na₂PO₄ 0,42-0,60%; КН₂PO₄ 0,17-0,24%. (рН 6,5-7,5). Ближайший аналог [4].

Недостаток среды - трудоемкий технологический процесс приготовления (рецептура состава: 8 компонентов). Среда не обеспечивает ранний рост, спорообразование и длительную сохранность возбудителя американского гнильца пчел.

В задачу исследований входило создание универсальной питательной среды, которая давала бы быстрый рост, максимальное накопление биомассы, раннее и интенсивное спорообразование, способствовала длительному сохранению возбудителей гнильцовых болезней пчел в музейных условиях, в частности для труднокультивируемого возбудителя американского гнильца.

Предложенная нами среда содержит гидролизат казеина, полученный путем разбавления дистиллированной водой до содержания аминного азота 140-150 мг%, кипячения при перемешивании 5 минут; добавления 5% NaOH и доведения рН 7,8-8,0; добавления агара "Дифко" - 15 г/л или агар-агара (одесского) - 20 г/л; смесь кипятят при перемешивании 5 минут; доводят рН 7,2-7,4 20% HCl; среду фильтруют и стерилизуют при 121°С 20 минут. После стерилизации рН 7,0-7,2. Среда применена для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел, преимущественно для трудно культивируемого возбудителя американского гнильца Paenibacillus larvae subsp. larvae, показав преимущественные результаты в сравнении с рекомендуемым средами: (Бейли, Томашеца, молочно-желточной средой Уиллиса-Гоббза).

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1
Сравнительная оценка биологических свойств возбудителя американского гнильца пчел Paenibacillus larvae subsp. larvae
№ п	Показатели	Среда Томашеца	Среда Бейли	Среда Уиллиса-Гоббза	Предложенная среда
1	2.	3.	4	5	6
1	Первичный рост	72-96 ч	48-72 ч	48 ч	18-24 ч
2	Интенсивность роста	++	++	+++	+++
3	Накопление биомассы (концентрация смыва)	500 млн/см³	500 млн/см³	1 млрд/см³	2 млрд/см³
4	Спорообразование	отсутствует	96 ч. 200-300 спор/см³	72 ч. 500-550 спор/см³	72 ч. 800-1000 спор/см³
5	Биологические свойства (культурально-морфологические, гемолитические, биохимические). 10 пересевов	Изменение биологических свойств	Не изменялись	Не изменялись	Не изменялись
6	Цикл пересевов	2 недели	4 недели	1,5 мес.	3 мес.

Установлено, что предложенная среда в отличие от рекомендованных способствует раннему проявлению первичного роста (18-24 ч); максимальному накоплению биомассы (48 ч - 2 млрд/см³); быстрому спорообразованию (72 ч - 800-1000 спор/см³); многократные пересевы не изменяли биологических свойств возбудителя американского гнильца пчел, а жизнеспособность музейных культур увеличивалась до 3 месяцев.

Установлено, что возбудители европейского гнильца (Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterospores, Enterococcus faecalis) и парагнильца (Bacillus paraalvei) при культивировании на предложенной среде при многократных пересевах (10 пассажей) не изменяли биологических свойств, наблюдалось усиленное накопление биомассы (2-2,2 млрд/см³, быстрое спорообразование (48 ч - 800-1000 спор/см³), ранний первичный рост (18-24 ч), увеличивался цикл пересевов возбудителей (3 мес) при хранении в музейных условиях.

Результаты исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2
Сравнительная оценка биологических свойств возбудителей европейского гнильца (Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus Enterococcus faecalis) и парагнильца (Bacillus paraalvei)
№	Показатели	Мясопептонные среды: (мпа,мпб)	Предложенная среда
1.	2.	3.	4.
1.	Первичный рост	24 ч	18-24 ч
2.	Интенсивность роста	+++	+++
3.	Накопление биомассы (концентрация смыва)	1-1,8 млрд/см³	2-2,2 млрд/ см³
4.	Спорообразование	72 ч. 500-700 спор/см³	48 ч. 800-1000 спор/см³
5.	Биологические свойства (культурально-морфологические, гемолитические, биохимические). 10 пересевов	Не изменялись	Не изменялись
6.	Цикл пересевов	2 мес	3 мес

Апробация предложенной среды проведена на 100 музейных штаммах возбудителей гнильцовых болезней пчел с положительными результатами.

Преимущество среды - универсальность, упрощение и удешевление технологического процесса изготовления (рецептура содержит 2 компонента). Среда дает возможность длительного сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел в музейных условиях.

Предложенная среда найдет применение в бактериологических лабораториях, для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел, в диагностических исследованиях и в производстве биопрепаратов.

Источники информации

1. Книга: «Опасные болезни и вредители пчел.», под редакцией О.Ф.Гробова и других, М.: Нива России, с.5.

2, 3. Там же, с.6.

4. GB №1003977 от 08.09.1965 - ближайший аналог.

Питательная среда для культивирования и сохранения возбудителя гнильцовой болезни пчел - американского гнильца - Paenibacillus larvae subsp. larvae, европейского гнильца Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus, Enterococcus faecalis, содержащая в 1 л гидролизата казеина с содержанием аминного азота 140-150 мг% 15-2,0 г агар-агара или агара Дифко, рН среды 7,2±0,2.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении питательных сред для выделения и культивирования холерного вибриона. .

Способ иммунохроматографического определения бактерии escherichia coli в воде // 2300768

Изобретение относится к биотехнологии. .

Питательная среда для выделения микобактерий // 2300571

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ранней диагностики туберкулеза. .

Способ получения питательной среды для культивирования yersinia enterocolitica // 2300560

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования микроорганизмов, накопления биомассы микроорганизмов, а также приготовления биопрепаратов.

Жидкая питательная среда для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза // 2300559

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза. .

Питательная среда для культивирования бруцелл // 2299238

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в получении питательных сред для выращивания бруцеллезного микроба. .

Способ исследования демодекоза у собак // 2298583

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности для лабораторной диагностики демодекоза у собак. .

Способ диагностики госпитальных микробных ассоциаций при микробиологическом мониторинге в рамках эпидемиологического надзора за гнойно-септическими инфекциями // 2298037

Изобретение относится к медицине, в частности к эпидемиологии и микробиологии, и может быть использовано при эпидемиологическом надзоре за гнойно-септическими инфекциями для выявления госпитальных микробных ассоциаций.

Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента // 2298036

Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии при испытании различных сорбентов (например, аппликационных, используемых для лечения ран), а именно к оценке уровня сорбционной активности сорбентов в отношении микробных токсинов.

Способ микробиологической диагностики дисбактериозов влагалища // 2293986

Изобретение относится к микробиологии, может быть использовано для диагностики неспецифических инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища. .

Средство для лечения кишечных инфекций, осложненных дисбактериозом "биобаланс-к" // 2303058

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологически активным комплексам, препаратам для медицины, сельского хозяйства и пищевой промышленности, и может быть использовано для приготовления лечебно-профилактических препаратов на основе живых лакто- и бифидобактерий.

Способ биологической очистки воды от нефтяных загрязнений // 2303003

Изобретение относится к области биотехнологии и экологии. .

Биологическая активная добавка к пище для лечения и профилактики кишечных инфекций, осложненных дисбактериозом, и повышения неспецифической резистентности организма // 2302877

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к бактериальным препаратам для медицины, сельского хозяйства и пищевой промышленности, и касается средства, воздействующего на заболевания желудочно-кишечного тракта.

Продукт питания из злаков, содержащий пробиотический микроорганизм, продукт питания из злаков, содержащий метаболиты, продуцированные пробиотическими микроорганизмами, и способы их получения // 2302747

Способ разработки нефтяного месторождения // 2302521

Изобретение относится к биотехнологиям в нефтедобывающей промышленности, в частности к третичным методам повышения нефтеотдачи пластов путем комплексного воздействия на пласт микроорганизмами и химическими реагентами.

Способ получения липополисахаридной композиции, содержащей липид а, липополисахаридная композиция, содержащая липид а, 3-o-дезактивированный 4 -монофосфориллипид а // 2302463

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности. .

Штамм бактерии arthrobacter species mn372-продуцент эндонуклеазы рестрикции asi372i, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 -atgcat-3 // 2302459

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности и в генной инженерии. .

Пробиотический штамм lactobacillus salivarius (варианты), пробиотический препарат на их основе и способ лечения или предупреждения с использованием штаммов lactobacillus salivarius // 2302458

Изобретение относится к штаммам Lactobacillus salivarius и их использованию в качестве пробиотических бактерий, в частности в качестве иммуномодулирующих биотерапевтических агентов.

Биопрепарат для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов // 2302303

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами и может быть использовано, например, при ликвидации нефтяных загрязнений.

Препарат "экстрагран" для стимуляции роста и защиты растений от болезней // 2302114

Изобретение относится к биотехнологии, в частности препарату, используемому в качестве биологического средства борьбы с возбудителями болезней растений и стимуляции их роста, и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода listeria // 2303060

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в бактериологическом контроле за инфицированностью пищевых продуктов, а также животных и человека