Новое применение эритропоэтина при сердечных заболеваниях

Предложено применение человеческого эритропоэтина альфа или бета либо его конъюгата для приготовления лекарственного средства для лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях, способ соответствующего лечения и лекарственное средство. Показано улучшение нарушенного распределения железа по показателям С-реактивного белка, ферритина и рецептора растворимого трансферрина у больных ишемической болезнью сердца, атеросклерозом, коронарным атеросклерозом, острым коронарным синдромом, сердечной недостаточностью под действием рекормона. 3 н. и 10 з.п. ф-лы.

 

Настоящее изобретение относится к новому применению эритропоэтина, в частности к лечению нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях.

Известны различные заболевания, при которых метаболизм железа не является нормальным. При анемии не может образовываться достаточное количество крови из-за полного недостатка железа в организме. Другим метаболическим состоянием, связанным с железом, является гемохроматоз, при котором общая концентрация железа в организме выше нормальной, что приводит к различным состояниям, как, например, деструкция органов.

Нарушения распределения железа отличаются от описанных выше анемии и гемохроматоза, потому что общая концентрация железа в организме нормальная. С одной стороны, железо аккумулируется в различных органах и может привести к повреждениям и даже деструкции этих органов. С другой стороны, применение железа, которое присутствует в нормальных количествах при кроветворении, является нарушенным, что приводит к побочным эффектам, сравнимым с таковыми при анемии.

До настоящего времени не было известно, что больные, страдающие сердечными заболеваниями, имеют большую возможность быть подверженными воздействию нарушений распределения железа. Нарушения распределения железа могут диагностироваться с помощью различных параметров, которые обычно используются для диагностики содержания железа. Основываясь на измерениях ферритина и рецептора растворимого трансферрина, возможно оценить, является ли нормальной общая концентрация железа у больного, страдающего сердечными заболеваниями. Если дело в этом, тогда пониженная концентрация гемоглобина в ретикулоцитах является индикатором нарушений распределения железа. Другим индикатором является постоянная затянувшаяся повышенная концентрация С-реактивного белка (CRP) у больных, страдающих сердечными заболеваниями и у которых наблюдается нормальная общая концентрация железа. Способ диагностики нарушений распределения железа описан Р.Lehmann, M.Volkmann, J.Lotz, A.Baldauf, R.Roeddiger, постер, представленный на конференции AACC/CSCC, ежегодная конференция, 29 июля - 2 августа, 2001, Чикаго, Иллинойс.

До сих пор, однако, никакого лечения не было предложено больным с сердечными заболеваниями, страдающим от нарушений распределения железа. Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, состоит поэтому в обеспечении лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях для минимизации или подавления вышеуказанных неблагоприятных явлений. Неожиданно было обнаружено, что эритропоэтин оказывает благоприятный эффект на нарушения распределения железа при сердечных заболеваниях. Проблема, таким образом, решается согласно настоящему изобретению путем обеспечения эритропоэтина для применения при лечении нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях.

Если не указано иначе, следующие определения представлены для иллюстрации и определения значения и области различных терминов, используемых для описания представленного здесь изобретения.

Термин "низший алкил", как это используется в контексте, означает алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, содержащую от одного до шести атомов углерода. Примеры низших алкильных групп включают метил, этил и изопропил, предпочтительно метил.

Термин "(низш.)алкокси", как это используется в контексте, означает группу R'-O-, где R' является низшим алкилом, как описано выше.

Термин "нарушения распределения железа при сердечных заболеваниях" относится к нарушению распределения железа, которое встречается у больных, страдающих сердечными заболеваниями. Нарушение распределения железа может, например, быть охарактеризовано, как описано выше. В частности, нарушение распределения железа характеризуется следующими параметрами: концентрация рецептора растворимого трансферрина [мг/л], разделенная на log(концентрация ферритина [мкг/л]), меньше 3,5 и одновременно концентрация С-реактивного белка выше 5 мг/л.

Термин "эритропоэтин" или "эритропоэтиновый белок" относится к белку с in vivo биологической активностью, побуждающей клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, который выбирается из группы, состоящей из человеческого эритропоэтина и аналогов, определенных ниже.

Термин "модифицированный полиэтиленгликолем эритропоэтин (Peg-EPO или PEG-EPO)" относится к эритропоэтиновому белку, ковалентно связанному с 1-3 производными полиэтилена, как описано ниже.

Описание чертежей:

Фигура 1: Первичная структура человеческого эритропоэтина (ЕРО) (165 аминокислот) (Последовательность №1 / Посл. №1/).

Фигура 2: Первичная структура человеческого эритропоэтина (ЕРО) (166 аминокислот) (Последовательность №2 / Посл. №2/).

Более подробно настоящее изобретение относится к применению эритропоэтина для приготовления лекарственного средства для лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях. Примерами сердечных заболеваний являются, например, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, коронарный атеросклероз, острый коронарный синдром, сердечная недостаточность, застойная сердечная недостаточность и/или сердечная недостаточность. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению, как указано выше, когда сердечным заболеванием является сердечная недостаточность.

Настоящее изобретение особенно полезно для приготовления фармацевтических композиций, включающих эритропоэтин в качестве фармацевтически активного ингредиента. Термин "эритропоэтин", или "эритропоэтиновый белок", или "ЕРО" означает следующее: в частности, термины относятся к гликопротеину, например к человеческому эритропоэтину, например имеющему аминокислотную последовательность, представленную в (Посл. №1) или (Посл. №2), или аминокислотную последовательность, в основном гомологичную указанной, биологические свойства которого связаны со стимуляцией продуцирования эритроцитов и со стимуляцией деления и дифференциации коммитированных эритроидных клеток-предшественников в костном мозге. Как это используется в контексте, эти термины включают такие протеины, сознательно модифицированные, например, путем направленного мутагенеза, или случайно путем мутаций. Эти термины также включают аналоги с 1-6 дополнительными сайтами для гликозилирования, аналоги, содержащие, как минимум, одну дополнительную аминокислоту при концевом карбоксиле гликопротеина, где дополнительная аминокислота включает, как минимум, один сайт гликозилирования, и аналоги с аминокислотной последовательностью, включающей перегруппировку, как минимум, одного сайта для гликозилирования. Эти термины включают как природный, так и рекомбинантно продуцированный человеческий эритропоэтин. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эритропоэтиновым белком является человеческий эритропоэтин.

Как в деталях представлено ниже, получение и очистка эритропоэтина хорошо известны в данной области. Под эритропоэтином подразумевается природный или рекомбинантный белок, предпочтительно человеческий; например эпоэтин альфа или эпоэтин бета, полученный из любого обычного источника, как, например, ткани, путем синтеза белка, из культуры клеток с природными и рекомбинантными клетками. Охватывается любой белок с активностью эритропоэтина, как, например, мутеины или иным путем модифицированные белки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эритропоэтиновым белком является эпоэтин альфа или эпоэтин бета. Рекомбинантный эритропоэтин может быть получен путем экспрессии в СНО-, ВПК- или HeLa-клеточных линиях по технологии с рекомбинантной ДНК или путем эндогенной активации гена. Экспрессия белков, включающая экспрессию путем эндогенной активации гена, хорошо известна в данной области и раскрывается, например, в патентах США №№5733761, 5641670 и 5733746 и в международных заявках на патенты WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955, содержание каждой из которых включено в контекст в виде ссылок. Предпочтительно применение, как определено выше, когда эритропоэтиновый белок экспрессируется путем эндогенной активации гена. Предпочтительными видами эритропоэтина для получения эритропоэтиновых гликопротеиновых продуктов являются виды человеческого эритропоэтина. Более предпочтительными видами эритропоэтина является человеческий эритропоэтин с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ IN NO: 1 или SEQ IN NO: 2 более предпочтительна аминокислотная последовательность Посл. №1. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится поэтому к описанному выше применению, где эритропоэтиновый белок имеет аминокислотную последовательность SEQ IN NO: 1 или SEQ IN NO: 2.

Кроме того, эритропоэтин может быть аналогом гликопротеина с 1-6 дополнительными сайтами для гликозилирования. Поэтому настоящее изобретение также относится к применению, как описано выше, где эритропоэтиновый белок имеет последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированного добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования. Гликозилирование белка с одной или несколькими олигосахаридными группами происходит по специфическим локализациям вдоль полипептидного остова и в высокой степени влияет на физические свойства белка, как, например, стабильность белка, секреция, субклеточная локализация, и на биологическую активность. Гликозилирование обычно бывает двух типов.

Связанные с атомом кислорода олигосахариды присоединяются к остаткам серина или треонина, а связанные с атомом азота олигосахариды присоединяются к остаткам аспарагина. Одним видом олигосахарида, обнаруженного как в связанных с азотом, так и в связанных с кислородом олигосахаридах, является N-ацетилнейраминовая кислота (сиаловая кислота), представляющая семейство аминосахаров, содержащих 9 или более атомов углерода. Сиаловая кислота является обычно терминальным остатком как в случае связанных с азотом олигосахаридов, так и в случае связанных с кислородом олигосахаридов, и, поскольку она несет отрицательный заряд, придает кислотные свойства гликопротеину. Человеческий эритропоэтин, имеющий 165 аминокислот, содержит три связанные с азотом и одну связанную с кислородом олигосахаридные цепи, которые составляют около 40% общей молекулярной массы гликопротеина. Гликозилирование с образованием связи по атому азота происходит при аспарагиновых остатках, расположенных в положениях 24, 38 и 83, и гликозилирование с образованием связи по атому кислорода происходит при остатке серина, расположенном в положении 126. Олигосахаридные цепи модифицируются с помощью терминальных остатков сиаловой кислоты. Ферментативное удаление всех остатков сиаловой кислоты с гликозилированного эритропоэтина приводит к потере активности in vivo, но не in vitro активности, поскольку сиалилирование эритропоэтина предотвращает его связывание и последующий клиренс печеночным связывающим белком.

Термин "эритропоэтин" включает аналоги человеческого эритропоэтина с одним или несколькими изменениями в аминокислотной последовательности человеческого эритропоэтина, которые обеспечивают в результате увеличение числа сайтов для присоединения сиаловой кислоты. Такие гликопротеиновые аналоги могут быть генерированы путем сайт-направленного мутагенеза, включающего добавления, делеции или замещения аминокислотных остатков, которые увеличивают или изменяют сайты, доступные для гликозилирования. Аналоги гликопротеина с уровнями сиаловой кислоты, большими, чем обнаруживаемые в человеческом эритропоэтине, генерируются путем добавления сайтов гликозилирования, которые не нарушают вторичную или третичную конформацию, требующуюся для биологической активности. Гликопротеины по настоящему изобретению также включают аналоги с повышенными уровнями присоединения углеводов при сайте гликозилирования, которые обычно включают замещение одной или нескольких аминокислот в непосредственной близости к связанному с азотом или кислородом сайту. Гликопротеины по настоящему изобретению также включают аналоги, содержащие одну или несколько аминокислот, тянущиеся от карбоксильного конца эритропоэтина и обеспечивающие, как, минимум, один дополнительный углеводный сайт. Эритропоэтиновые белки настоящей композиции также включают аналоги, имеющие аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку, как минимум, одного сайта для гликозилирования. Такая перегруппировка сайта гликозилирования включает делецию одного или нескольких сайтов гликозилирования в человеческом эритропоэтине и добавление одного или нескольких не встречающихся в природе сайтов гликозилирования. Увеличение числа углеводных цепей в эритропоэтине и, следовательно, числа сиаловых кислот на молекулы эритропоэтина может придать полезные свойства, как, например, повышенную растворимость, большую устойчивость к протеолизу, уменьшенную иммуногенность, повышенное время полужизни сыворотки, и повышенную биологическую активность. Аналоги эритропоэтина с дополнительными сайтами гликозилирования раскрываются более подробно в заявке на европейский патент 640619, опубликованной Elliot, 1 марта, 1995.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает эритропоэтиновые белки с аминокислотной последовательностью, которая включает, как минимум, один дополнительный сайт для гликозилирования, как, например, но не ограничивая этим, эритропоэтины, включающие последовательность человеческого эритропоэтина, видоизмененную путем модификации, выбранную из следующих последовательностей:

Asn³⁰Thr³²;

Asn⁵¹Thr⁵³;

Asn⁵⁷Thr⁵⁹;

Asn⁶⁹;

Asn⁶⁹Thr⁷¹;

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹;

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²;

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Asn³⁰Thr³²Ser⁸⁷Val⁸⁷Thr⁹⁰;

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;

Asn¹³⁶Thr¹³⁸;

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰;

Thr¹²⁵ и

Pro¹²⁴Thr¹²⁵.

Используемая в контексте система обозначений для модификации аминокислотной последовательности означает, что положение(я) соответствующего немодифицированного белка (например, человеческий эритропоэтин с SEQ IN NO: 1 или SEQ IN NO: 2), указанное надстрочным номером (номерами), меняется по отношению к аминокислоте (аминокислотам), которые непосредственно предшествуют соответствующему надстрочному номеру (номерам).

Эритропоэтиновый белок может также представлять аналог, содержащий, как минимум, одну дополнительную аминокислоту при карбоксильном конце гликопротеина, где дополнительная аминокислота включает, как минимум, один сайт гликозилирования. Дополнительная аминокислота может включать пептидный фрагмент, производный от концевого карбоксила человеческого хорионического гонадотропина. Предпочтительно гликопротеин является аналогом, выбранным из группы, состоящей из (а) человеческого эритропоэтина, имеющего аминокислотную последовательность, Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro IIe Leu Pro Gln, тянущуюся от карбоксильного конца; (б) аналога по (а), включающего также Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO, и (в) аналога по (а), включающего, кроме того, Asn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.

Эритропоэтиновый белок может также представлять аналог с аминокислотной последовательностью, который включает перегруппировку, как минимум, одного сайта для гликозилирования. Перегруппировка может включать делецию любого из связанных с атомом азота углеводных сайтов в человеческом эритропоэтине и добавление связанного с атомом азота углеводного сайта в положении 88 аминокислотной последовательности человеческого эритропоэтина. Предпочтительно гликопротеин является аналогом, выбранным из группы, состоящей из Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO и Gin⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO. Другим аналогом является дарбэпоэтин альфа. Предпочтительным эритропоэтиновым белком при описанном ранее применении является дарбэпоэтин альфа.

В частности, эритропоэтиновый белок представленной фармацевтической композиции, как описано выше, может также включать его модифицированные полиэтиленгликолем производные. Модифицированные полиэтиленгликолем производные эритропоэтина и их получение известны в данной области и описаны, например, в международной заявке на патент WO 01/02017, заявках на европейские патенты ЕР-А-1064951, ЕР-А-539167, ЕР-А-605963, в международных заявках на патенты WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, в патенте США №556, в заявке на европейский патент ЕР-А-584876, в международных заявках на патенты WO 92/16555, WO 94/28024. WO 97/04796, в патентах США №№5359030 и 5681811, в патенте США №4179337, в патенте Японии, в международной заявке на патент WO 98/32466, в патенте США №5324650. Предпочтительно при описанном выше применении эритропоэтиновый белок модифицирован полиэтиленгликолем. Предпочтительный вариант воплощения видов модифицированного полиэтиленгликолем эритропоэтина относится к описанным ниже производным.

Соответственно настоящее изобретение также относится к описанному выше применению, где эритропоэтиновый белок представляет конъюгат, упомянутый конъюгат включает эритропоэтиновый белок, как описано выше, содержащий, как минимум, одну свободную аминогруппу и обладающий in vivo биологической активностью, побуждающей клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, и выбирается из группы, состоящей из человеческого эритропоэтина и его аналогов, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированного прибавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или перегруппировкой, как минимум, одного сайта гликозилирования; упомянутый эритропоэтин является ковалентно связанным с числом n полиэтиленгликольных групп формулы -СО-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR, при этом -СО (т.е. карбонил) каждой полиэтиленгликольной группы образует амидную связь с одной из упомянутых аминогрупп; где R означает низший алкил; х означает число 2 или 3; m означает число примерно от 450 до 900; n означает число от 1 до 3 и n и m выбираются таким образом, чтобы молекулярная масса конъюгата минус эритропоэтиновый белок составляла от 20 кД до 100 кД. Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие описанные здесь конъюгаты, в которых процент конъюгатов, где n означает 1, составляет, как минимум, 90%, предпочтительно, как минимум, 92%, более предпочтительно 96% от всех конъюгатов композиции.

Более конкретно упомянутые выше конъюгаты могут быть представлены формулой (I)

где Р означает остаток эритропоэтинового белка, как здесь описано, (т.е. без амино-группы или аминогрупп, которые образуют амидную связь с карбонилом, представленном в формуле I), проявляющего in vivo биологическую активность, побуждающую клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, и где R означает низший алкил, х означает 2 или 3, m означает число от 450 до 900, n означает число от 1 до 3, и n и m выбираются таким образом, чтобы молекулярная масса конъюгата минус эритропоэтиновый гликопротеин составляла от 20 кД до 100 кД. Согласно данному изобретению R является любым низшим алкилом. Предпочтительны конъюгаты, в которых R означает метил.

Символ "m" представляет число остатков окиси этилена (ОСН₂СН₂) в поли-этиленоксидной группе. Одна этиленоксидная субъединица полиэтиленгликоля (PEG) имеет молекулярную массу примерно 44 Д. Таким образом, молекулярная масса конъюгата (исключая молекулярную массу ЕРО) зависит от числа "m". В конъюгатах по данному изобретению "m" составляет примерно от 450 до 900 (что соответствует молекулярной массе примерно от 20 кД до 40 кД), предпочтительно примерно от 650 до 750 (что соответствует молекулярной массе примерно 30 кД). Число m выбирают так, чтобы получающийся в результате конъюгат по изобретению обладал физиологической активностью, сравнимой с активностью немодифицированного ЕРО, активность которого может быть такой же, большей или составлять часть соответствующей активности немодифицированного эритропоэтина. Молекулярная масса, упоминаемая как "примерно" определенной величины, означает, что она находится в разумных пределах этой величины, что определяется с использованием общепринятых аналитических методик. Число "m" выбирают таким образом, что молекулярная масса каждой полиэтиленгликольной группы, ковалентно связанной с эритропоэтиновым гликопротеином, составляет примерно от 20 кД до 40 кД и предпочтительно составляет 30 кД.

В конъюгатах по данному изобретению число "n" означает число полиэтиленгликольных групп, ковалентно связанных со свободными аминогруппами (включая 8-аминогруппы лизина и/или амино-терминальную аминогруппу) эритропоэтинового белка амидной связью (связями). Конъюгат по данному изобретению может содержать одну, две или три группы PEG на молекулу ЕРО. Число "n" является целым числом от 1 до 3, предпочтительно "n" означает 1 или 2 и более предпочтительно "n" является 1. Предпочтительный конъюгат из описанных выше конъюгатов включает соединения, где х означает 2, m означает число от 650 до 750, n является 1 и R означает метил.

Соединение формулы (I) может быть получено из известного полимерного продукта:

,

в котором R и m являются такими, как описано выше, при конденсации соединения формулы II с эритропоэтиновым гликопротеином. Соединения формулы (II), в которых х означает 3, являются эфирами N-сукцинимидилбутирата и α-(низш.)алкокси-полиэтиленгликоля ((низш.)алкокси-PEG-SBA). Соединения формулы (II), в которых х означает 2, являются эфирами N-сукцинимидилпропионата и α-(низш.)алкокси-полиэтиленгликоля ((низш.)алкокси-PEG-SPA). Может быть применен любой общепринятый способ взаимодействия активированного сложного эфира с амином для образования амида. В реакции, описанной выше, приведенный в качестве примера сукцинимидильный сложный эфир является уходящей группой, способствующей образованию амида. Применение сложных сукцинимидильных эфиров, как, например, соединения формулы II, для получения конъюгатов с белками раскрываются в патенте США №5672662, выданном 30 сентября, 1997 (Harris и др.).

Человеческий эритропоэтин содержит девять свободных аминогрупп, амино-терминальную аминогруппу и ε-аминогруппы 8 остатков лизина. Когда реагент для модификации полиэтиленгликолем соединяли с производным N-сукцинимидил-бутирата (SBA) формулы II, было найдено, что при рН 7,5, при соотношении белок : PEG, равном 1:3, и температуре реакции 20-25°C получали смесь моно-, ди- и следовых количеств три-модифицированных полиэтиленгликолем видов. Когда реагентом для модификации полиэтиленгликолем было производное N-сукцинимидилпропионата (SPA) формулы II, при аналогичных условиях, за исключением того, что соотношение белок:PEG составляло 1:2, получали главным образом мономодифицированные полиэтиленгликолем виды. Модифицированный полиэтиленгликолем эритропоэтин может применяться в виде смеси или в виде различных разделенных с помощью катионообменной хроматографии образцов. При изменении условий реакции (например, соотношения реагентов, рН, температуры, концентрации белка, времени реакции и т.д.) относительные количества различных модифицированных полиэтиленгликолем видов могут варьироваться.

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению, как определено выше, где эритропоэтиновый белок является конъюгатом, упомянутый конъюгат включает эритропоэтиновый белок, как определено выше, содержащий, как минимум, одну свободную аминогруппу и обладающий in vivo биологической активностью, побуждающей клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, и выбирается из группы, состоящей из человеческого эритропоэтинового белка и его аналогов, которые имеют первичную структуру человеческого эритропоэтинового белка, модифицированного добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования; упомянутый эритропоэтиновый белок является ковалентно связанным с 1-3 (низш.)алкоксиполиэтиленгликольными группами, каждая полиэтиленгликольная группа ковалентно связана с эритропоэтиновым белком линкером формулы -C(O)-X-S-Y-, где группа С(O) линкера образует амидную связь с одной из упомянутых аминогрупп, Х означает -(CH₂)_k- или -СН₂(O-СН₂-CH₂)_k-, k означает число от 1 до 10, Y является ;;

или ,

средняя молекулярная масса каждой полиэтиленгликольной составляющей составляет примерно от 20 кД до 40 кД, и молекулярная масса конъюгата составляет примерно от 51 кД до 175 кД.

Такие виды эритропоэтина могут быть представлены формулой (III)

где R может быть любым низшим алкилом. Предпочтительным низшим алкилом является метил. Х может быть -(CH₂)_k- или -СН₂(O-CH₂-CH₂)_k-, где k является числом от 1 до примерно 10. Предпочтительно k означает число от 1 до примерно 4, более предпочтительно k означает 1 или 2. Наиболее предпочтительно Х означает -(СН₂).

В формуле 1 Y означает

; ;

или ,

предпочтительно

или ,

более предпочтительно

.

В формуле (III) число m выбирают таким образом, чтобы в результате конъюгат формулы (III) обладал физиологической активностью, сравнимой с активностью немодифицированного эритропоэтина, активность которого может быть такой же, большей или составлять часть соответствующей активности немодифицированного эритропоэтина. Символ m означает число остатков окиси этилена в единице PEG. Одна субъединица PEG, представляющая -(ОСН₂СН₂)-, имеет молекулярную массу примерно 44 Д. Таким образом, молекулярная масса конъюгата (исключая молекулярную массу эритропоэтина) зависит от числа m. Молекулярная масса "примерно" такой величины означает, что она находится в разумных пределах величины, определенной с помощью обычных аналитических методик. Число m является целым, составляющим примерно от 450 до примерно 900 (что соответствует молекулярной массе от 20 до 40 кД), предпочтительно m представляет число примерно от 550 до примерно 800 (примерно от 24 до 35 кД) и наиболее предпочтительно m является числом примерно от 650 до 700 (примерно от 29 до 31 кД).

В формуле (III) число n означает число ε-аминогрупп аминокислоты лизина в эритропоэтиновом белке, ковалентно связанных с полиэтиленгликольной единицей амидной связью. Конъюгат по настоящему изобретению может содержать одну, две или три полиэтиленгликольные единицы на молекулу ЕРО. Число n является целым числом от 1 до 3, предпочтительно n означает 1 или 2 и более предпочтительно n является 1.

Предпочтительные эритропоэтиновые белки формулы (III) представлены формулами:

и

.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эритропоэтиновый конъюгат представлен формулой:

,

где в представленной выше формуле

n является целым числом от 1 до 3;

m означает целое число от 450 до 900;

R означает низший алкил;

Х означает -(CH₂)_k- или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k- и

Р является остатком эритропоэтинового белка без аминогруппы или групп, которые образуют амидную связь с X.

Другие предпочтительные эритропоэтиновые гликопротеиновые продукты представлены формулами:

и

.

Более предпочтительные эритропоэтиновые гликопротеиновые продукты представлены формулой:

Такие эритропоэтиновые белки могут быть получены путем

(а) ковалентного связывания ε-аминогруппы аминокислоты лизина эритропоэтинового белка, представленного формулой P-[NH₂]_n, cбифункциональным реагентом формулы Z-CO-X-S-Q с целью образования промежуточного соединения с амидной связью, представленного формулой:

P-[NH-CO-X-S-Q]_n,

где Р является эритропоэтиновым белком без аминогруппы, которая образует амидную связь; n означает целое число в диапазоне от 1 до 3; Z является реакционноспособной группой, например, сложноэфирной группой эфира N-гидроксисукцинимида и карбоновой кислоты; Х означает -(CH₂)_k- или -СН₂(O-CH₂-CH₂)_k-, где k означает число от 1 до примерно 10 и Q является защитной группой, подобной алканоильной, например, ацетилом.

(б) реакции с образованием ковалентной связи между промежуточным соединением с амидной связью со стадии (а) и активированным производным полиэтиленгликоля, представленным формулой W-[OCH₂CH₂]_m-OR, для образования эритропоэтинового гликопротеинового продукта, представленного формулой:

,

где W является сульфгидрильной реакционноспособной формой Y; m является целым числом в диапазоне от 450 до 900; R означает низший алкил и Y является таким, как установлено выше.

В этом варианте осуществления изобретения бифункциональным реагентом является предпочтительно N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат или N-сукцинимидил-5-ацетилтиоацетат, Z означает предпочтительно N-гидроксисукцинимид и активированное производное полиэтиленгликоля W-[OCH₂CH₂]_m-OR предпочтительно выбирают из группы, состоящей из иодацетилметокси-PEG, метокси-PEG-винил-сульфона и метокси-PEG-имида малеиновой кислоты.

Если рассматривать более подробно, эритропоэтиновые белки формулы (III) могут быть получены путем ковалентного связывания тиольных групп с ЕРО ("активация") и сочетания полученного в результате активированного ЕРО с производным полиэтиленгликоля (PEG). Первая стадия получения модифицированного полиэтиленгликолем ЕРО согласно настоящему изобретению включает ковалентное связывание тиольных групп посредством NH₂-групп ЕРО. Активирование ЕРО проводят с помощью бифункциональных реагентов, которые служат носителями защищенной тиольной группы и дополнительной реакционноспособной группы, как, например, активированные сложные эфиры (например, сложный сукцинимидильный эфир), ангидриды, сложные эфиры сульфокислот, галогениды карбоновых кислот и сульфокислот соответственно. Тиольную группу защищают известными в данной области группами, например ацетильными группами. Такие бифункциональные реагенты способны взаимодействовать с ε-аминогруппами лизиновых аминокислот с образованием амидной связи. Первая стадия реакции представлена ниже:

,

ЕРО, n и X являются такими, как указано выше, и Z является известной в данной области реакционноспособной группой, например N-гидроксисукцинимидным (NHS) заместителем формулы

В предпочтительном варианте осуществления изобретения активацию ε-аминогрупп лизина осуществляют при реакции с бифункциональными реагентами, содержащими сукцинимидильную составляющую. Бифункциональные реагенты могут служить носителями различных видов спейсеров, например составляющих -(CH₂)_k- или -СН₂-(O-СН₂-СН₂-)_k-, где k означает число от 1 до примерно 10, предпочтительно от 1 до примерно 4 и более предпочтительно 1 или 2, и наиболее предпочтительно 1. Примерами таких реагентов являются N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат (SATP) и N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA)

или

с k, являющимся таким, как определено выше.

Получение бифункциональных реагентов известно в данной области. Предшественники сложных эфиров 2-(ацетилтио)(этокси)_kуксусной кислоты и N-гидроксисукцинимида описываются в патенте Германии DE-3924705, в то время как превращение в ацетилтиопроизводное описывается March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA коммерчески доступен (Molecular Probes, Юджин, Орегон, США, и Pierce, Рокфорд, Иллинойс).

Число тиольных групп, которые следует добавить к молекуле ЕРО, можно выбрать путем регулирования параметров реакции, то есть концентрации белка (ЕРО) и соотношения белок/бифункциональный реагент. Предпочтительно ЕРО активируют путем ковалентного связывания с 1-5 тиольными группами на молекулу ЕРО, более предпочтительно с 1,5-3 тиольными группами на молекулу ЕРО. Такие диапазоны объясняют статистическим распределением тиольных групп в популяции белка ЕРО.

Реакцию проводят, например, в водном буферном растворе, рН 6,5-8,0, например, в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, рН 7,3. Бифункциональный реагент может добавляться в диметилсульфоксиде. После завершения реакции, предпочтительно через 30 минут, реакцию останавливают путем прибавления лизина. Избыток бифункционального реагента может быть удален известными в данной области способами, например, при диализе или фильтрации через колонку. Среднее число тиольных групп, добавленных к эритропоэтину, может быть определено фотометрическими способами, описанными, например, Grasetti, D.R. и Murray, J.F. в J. Appl. Biochem. Biotechnol., 119, 41-49 (1967).

Описанная выше реакция сопровождается ковалентным связыванием активированного производного полиэтиленгликоля. Подходящими производными полиэтиленгликоля являются активированные молекулы полиэтиленгликоля со средней молекулярной массой примерно от 20 до 40 кД, более предпочтительно примерно от 24 до 35 кД и наиболее предпочтительно примерно 30 кД.

Активированные производные PEG известны в данной области и описываются, например, Morpurgo, М. и др. в J. Bioconj. Chem., (1996) 7, с.с.363 и следующие, для PEG-винилсульфона. Типы PEG с прямой и разветвленной цепью годятся для получения соединений формулы 1. Примерами реакционноспособных реагентов PEG являются иодацетилметокси-PEG и метокси-РЕС-винилсульфон:

или

Применение таких активированных иодом веществ известно в данной области и описано Hermanson, G.T. в Bioconjugate Techniques, изд. Academic Press, Сан-Диего (1996), с.с.147-148.

Наиболее предпочтительно виды PEG активируются имидом малеиновой кислоты при использовании (низш.)алкокси-PEG-имида малеиновой кислоты, как, например, метокси-PEG-имид малеиновой кислоты (М.м. 30000; Shearwater Polymers, Inc.). Строение (низш.)алкокси-PEG-имида малеиновой кислоты следующее:

или

,

где R и m являются такими, как определено выше, предпочтительно

Реакция сочетания с (низш.)алкокси-PEG-имидом малеиновой килоты происходит после in situ расщепления тиольной защитной группы в водном буферном растворе, например, 10 мМ фосфат калия, 50 мМ NaCl, 2 мМ этилендиамин-тетрауксусная кислота (ЭДТК), рН 6,2. Расщепление защитной группы может быть осуществлено, например, с помощью гидроксиламина в диметилсульфоксиде при 25°C, рН 6,2 в течение примерно 90 минут. Для модификации полиэтиленгликолем молярное соотношение активированный ЕРО/(низш.)алкокси-PEG-имид малеиновой кислоты должно составлять примерно от 1:3 до примерно 1:6 и предпочтительно 1:4. Реакция может быть остановлена с помощью прибавления цистеина и реакции оставшихся тиольных (-SH) групп с N-метилимидом малеиновой кислоты или другими подходящими соединениями, способными образовывать дисульфидные связи. Из-за реакции любых оставшихся активных тиольных групп с защитной группой, как, например, N-метилимид малеиновой кислоты или другая подходящая защитная группа, эритропоэтиновые гликопротеины в конъюгатах по настоящему изобретению могут содержать такие защитные группы. Обычно описанные здесь методики приводят к смеси молекул с варьирующимися числами тиольных групп, защищенных разными числами защитных групп в зависимости от числа активированных тиольных групп в гликопротеине, которые не были конъюгированы с PEG-имидом малеиновой кислоты.

В то время как N-метилимид малеиновой кислоты образует тот же тип ковалентной связи, когда используется для блокирования оставшихся тиольных групп на модифицированном полиэтиленгликолем белке, дисульфидные соединения приведут в ходе межмолекулярной обменной реакции сульфид/дисульфид обменной реакции к связыванию блокирующего реагента с помощью дисульфидного мостика. Предпочтительными блокирующими реагентами для такого типа реакции блокирования являются окисленный глутатион (GSSG), цистеин и цистамин. В то время как с цистеином не вводится дополнительный суммарный заряд в модифицированный полиэтиленгликолем белок, применение блокирующих агентов GSSG или цистамина приводит к дополнительному отрицательному или положительному заряду.

Дальнейшая очистка соединений формулы (III), включая разделение моно-, ди- и три-модифицированных полиэтиленгликолем видов ЕРО, может быть осуществлена способами, известными в данной области, например с помощью колоночной хроматографии.

Модифицированные полиэтиленгликолем производные эритропоэтина содержат, как минимум, 90% моно-PEG-конъюгатов. Обычно моно-PEG-конъюгаты эритропоэтиновых гликопротеинов желательны, так как они обладают более высокой активностью, чем ди-PEG-конъюгаты. Процент моно-PEG-конъюгатов, а также соотношение моно- и ди-PEG-видов может регулироваться путем объединения более широких фракций вблизи пика элюирования для уменьшения процента моно-PEG-конъюгатов или более узких фракций с целью увеличения процента моно-PEG-конъюгатов в композиции. Около 90% моно-PEG-конъюгатов представляет хороший баланс выхода и активности. Иногда могут быть желательны композиции, в которых, например, как минимум, девяносто два процента или, как минимум, девяносто шесть процентов конъюгатов являются моно-PEG-видами (n равно 1). В одном варианте осуществления настоящего изобретения процент конъюгатов, где n означает 1, составляет от девяносто до девяносто шести процентов.

Фармацевтические композиции, включающие модифицированный полиэтиленгликолем эритропоэтин, известны в данной области и описываются в международной заявке на патент WO 01/87329. Композиции могут включать от 10 до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, как определено выше. Предпочтительно композиции включают от 10 до 1000 мкг, например, 10, 50, 100, 400, 800 или 2500 мкг на мл. Далее композиции могут включать от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, сульфат в концентрации 10-200 ммолей/л, фосфат в концентрации от 10 до 50 ммолей/л, рН от 6,0 до 6,5. Такая композиция может также включать метионин вплоть до 20 мМ, 1-5% полиола (мас./об.), вплоть до 0,1% плуроника F68 (мас./об.) и необязательно до 1 мМ CaCl₂. Пример такой композиции включает от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, сульфат 40 ммолей/л, фосфат 10 ммолей/л, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроника F68 (мас./об.), рН 6,2. Альтернативно композиция может включать от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, NaCl от 10 до 100 ммолей/л, фосфат от 10 до 50 ммолей/л, рН от 6,0 до 7,0, необязательно 1-5% (мас./об.) полиола. Также такая композиция может включать метионин вплоть до 20 мМ, до 0,1% плуроника F68 (мас./об.) и необязательно CaCl₂ 7,5 мкмолей/л. Конкретно такая композиция может включать от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, NaCl 100 ммолей/л, 10 мМ метионин, 0,01% плуроника F68 (мас./об.) и фосфат 10 ммолей/л, рН 7,0.

Настоящее изобретение также относится к упомянутой выше композиции, включающей от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, аргинин от 10 до 50 ммолей/л, рН от 6 до 6,5, сульфат натрия от 10 до100 ммолей/л. Дополнительно такая композиция может включать метионин до 20 мМ, до 0,1% плуроника F68 (мас./об.), необязательно CaCl₂ до1 ммоля/л и необязательно 1-5% (мас./об.) полиола. Конкретно, такая композиция может включать от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, аргинин 40 ммолей/л, рН 6,2, сульфат натрия 30 ммолей/л, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроника F68 (мас./об.) и необязательно CaCl₂ 1 ммоль/л.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к композициям, включающим эритропоэтин от 10 до 10000 мкг/мл, предпочтительно эритропоэтин от 25 до 2500 мкг/мл, и

а) 10 мМ фосфат натрия/калия, 100 мМ хлористый натрий, рН 7,0, или

б) 10 мМ фосфат натрия, 120 мМ сульфат натрия, рН 6,2, или

в) 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), рН 6,2, или

г) 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроника F68 (мас./об.), рН 6,2, или

д) 40 мМ аргинин, 30 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), рН 6,2, или

е) 40 мМ аргинин, 30 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроника F68 (мас./об.), рН 6,2.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения композиции включают количество эритропоэтинового белка в 50, 100, 400, 800 или 2500 мкг/мл. Наиболее предпочтительные композиции включают либо 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ сульфата натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионина, 0,01% плуроника F68 (мас./об.), рН 6,2, либо 40 мМ аргинина, 30 мМ сульфата натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионина, 0,01% плуроника F68 (мас./об.), рН 6,2. Другие детали таких композиций известны из международной заявки на патент WO 01/87329.

Изобретение также относится к способу лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях, включающему введение эффективного количества эритропоэтинового белка, как указано выше. Кроме того, изобретение относится к лекарственному средству для лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях, отличающемуся тем, что оно содержит эффективное количество эритропоэтинового белка. Примерами сердечных заболеваний являются, например, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, коронарный атеросклероз, острый коронарный синдром, сердечная недостаточность, застойная сердечная недостаточность и/или сердечная недостаточность. В контексте с описанным выше способом и лекарственным средством сердечная недостаточность является предпочтительной формой сердечных заболеваний. Предпочтительными способами и лекарственными средствами, как описано выше, являются те, где эритропоэтиновый белок является таким, как определено выше.

При лечении нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях ЕРО может, например, быть введен в дозе 150 ЕД/кг массы тела дважды в неделю. Доза может варьироваться в соответствии с потребностями отдельного пациента и может также быть в пределах, например, от 100-200 ЕД/кг. В зависимости от периода полураспада используемого производного эритропоэтина доза может быть введена, например, от 1 до 3 раз в неделю. В зависимости от потребностей отдельного больного врач может также выбрать другую дозу.

Специфическая активность ЕРО или ЕРО-конъюгатов согласно настоящему изобретению может быть определена с помощью различных анализов, известных в данной области. Биологическая активность очищенных эритропоэтиновых белков по настоящему изобретению проявляется в том, что введение эритропоэтинового белка путем инъекции больным людям приводит к повышенному продуцированию в клетках костного мозга ретикулоцитов и эритроцитов по сравнению с неинъецируемыми или контрольными группами субъектов. Биологическая активность эритропоэтиновых белков или их фрагментов, полученных и очищенных согласно настоящему изобретению, может быть исследована с помощью методов согласно Annable и др.. Bull. Wid. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112, и Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1997 [2]. Другой биологический анализ для определения активности эритропоэтинового белка, анализ на мышах со зрелыми эритроцитами, описывается в литературе (например, Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1997 [2], и в монографии об эритропоэтине Ph. Eur. BRP).

Изобретение будет лучше понято при ссылке на следующие примеры, которые иллюстрируют, но не ограничивают описанное здесь изобретение.

Примеры

Мужчину средних лет с сердечным заболеванием исследуют после сердечного катетера на нарушения распределения железа, определяя следующие параметры - CRP (С-реактивный белок), ферритин и рецептор растворимого трансферрина - как описано Р.Lehmann, M.Volkmann, J.Lotz, A.Baldauf, R.Roeddiger, постер, представленный на конференции ААСС/CSCC, ежегодная конференция, 29 июля - 2 августа, 2001, Чикаго, Иллинойс. Результаты показывают нарушения распределения железа. Больному вводят 150 ЕД/кг подкожно рекормон^ТМ (коммерчески доступный эритропоэтиновый белок) дважды в неделю максимум в течение 12 недель. Затем определение описанных выше параметров указывает на улучшение нарушения недостаточности железа.

1. Применение человеческого эритропоэтина альфа или бета, либо его конъюгата для лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях.

2. Применение по п.1, где сердечным заболеванием является сердечная недостаточность.

3. Применение по п.1 или 2, где эритропоэтин экспрессируется путем эндогенной активации гена.

4. Применение по п.1 или 2, где эритропоэтин имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

5. Применение по п.1 или 2, где эритропоэтин имеет последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную прибавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования.

6. Применение по п.1 или 2, где эритропоэтин представляет собой дарбэпоэтин альфа.

7. Применение по п.1 или 2, где эритропоэтин, определенный в любом из пп.3-6, подвергают модификации полиэтиленгликолем.

8. Применение по п.7, где эритропоэтин представляет собой конъюгат, указанный конъюгат включает эритропоэтиновый белок, содержащий как минимум одну свободную аминогруппу и проявляющий in vivo биологическую активность, побуждающую клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, и который выбирают из группы, состоящей из человеческого эритропоэтина и его аналогов, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированного добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или перегруппировкой как минимум одного сайта гликозилирования; упомянутый эритропоэтиновый белок является ковалентно связанным с n полиэтиленгликольными группами формулы -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR и группа -СО каждой полиэтиленгликольной группы образует амидную связь с одной из упомянутых аминогрупп; где R означает низший алкил; х означает 2 или 3; m означает число примерно от 450 до 900; n означает число от 1 до 3 и n и m выбирают таким образом, что молекулярная масса конъюгата минус эритропоэтиновый белок составляет от 20 до 100 кД.

9. Применение по п.8, где х означает 2, m означает число от 650 до 750, n равно 1 и R означает метил.

10. Применение по п.7, где эритропоэтин представляет конъюгат, указанный конъюгат включает эритропоэтиновый белок, содержащий как минимум одну свободную аминогруппу и проявляющий in vivo биологическую активность, побуждающую клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, и который выбирают из группы, состоящей из человеческого эритропоэтинового белка и его аналогов, которые имеют первичную структуру человеческого эритропоэтинового белка, модифицированного добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования; упомянутый эритропоэтиновый белок является ковалентно связанным с 1-3 (низш.) алкоксиполиэтиленгликольными группами, каждая полиэтиленгликольная группа ковалентно связана с эритропоэтиновым белком линкером формулы -C(O)-X-S-Y и группа С(O) линкера образует амидную связь с одной из упомянутых аминогрупп, Х означает (СН₂)_k- или -CH₂(О-СН₂-СН₂)_k-, k означает число от 1-10, Y означает

; ; ;

или

,

средняя молекулярная масса каждой полиэтиленгликольной составляющей составляет примерно от 20 до 40 кД, а средняя молекулярная масса конъюгата составляет примерно от 51 до 175 кД.

11. Применение по п.10 эритропоэтинового конъюгата формулы

где n означает целое число от 1 до 3; m означает целое число от 450 до 900; R означает низший алкил; Х означает -(CH₂)_k- или -СН₂(O-СН₂-СН₂)_k, k означает число от 1 до 10 и Р является остатком эритропоэтинового белка без числа n аминогрупп, которые образуют амидную связь с X.

12. Способ лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях, включающий введение эффективного количества эритропоэтина альфа или бета, либо его конъюгата.

13. Лекарственное средство для лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях, отличающееся тем, что оно содержит эффективное количество эритропоэтина альфа или бета, либо его конъюгата.