Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты



Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты
Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты
Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты
Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты
Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты
Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты
Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты
Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты
Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты
Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты
Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты

Владельцы патента RU 2336306:

Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH)

Изобретение относится к биотехнологии. Описан вариант растворимой зависимой от пирролохинолинхинона (PQQ) глюкозодегидрогеназы (s-GDH), содержащей инсерцию аминокислотного остатка между положениями 428 и 429, которые соответствуют аминокислотной последовательности дикого типа, известной для Acinetobacter calcoaceticus, и может содержать одну или несколько дополнительных аминокислотных замен. Представлен полинуклеотид, кодирующий описанный вариант s-GDH. Описан вектор экспрессии, содержащий представленный полинуклеотид. Описана клетка-хозяин E.coli, содержащая описанный вектор. Описан способ получения указанного варианта s-GDH, включающий в себя культивирование клетки-хозяина E.coli в условиях, подходящих для получения варианта фермента. Предложен способ выявления, определения или измерения глюкозы в образце с использованием описанного варианта s-GDH, который включает приведение в контакт образца с указанным вариантом. Изобретение позволяет эффективно определять концентрации сахаров, особенно глюкозы в образце, так как обладает повышенной субстратной специфичностью по отношению к глюкозе. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

 

Описание

Настоящее изобретение относится к улучшенным вариантам растворимых зависимых от пирролохинолинхинона (PQQ) глюкозодегидрогеназ (s-GDH), содержащих инсерцию аминокислоты между положениями 428 и 429, которые соответствуют аминокислотной последовательности, известной для Acinetobacter calcoaceticus, к генам, кодирующим такой вариант s-GDH, к белкам таких вариантов s-GDH с улучшенной субстратной специфичностью в отношении глюкозы и к различным применениям указанных вариантов s-GDH, в частности, для определения концентраций сахаров, особенно глюкозы, в образце.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Определение концентрации глюкозы в крови очень важно для клинической диагностики и терапии диабета. Примерно 150 миллионов людей во всем мире страдают хроническим заболеванием сахарным диабетом, и согласно ВОЗ эта цифра может удвоиться к 2025 году. Хотя диабет легко диагностируется и поддается лечению, но для успешной долговременной терапии требуются недорогиие диагностические средства, которые быстро и точно представляют данные о концентрациях глюкозы в крови. PQQ-зависимые глюкозодегидрогеназы (EC 1.1.99.17) катализируют реакцию, в которой глюкоза окисляется до глюконолактона. Поэтому указанный тип фермента используют для измерения сахара в крови. Одним из таких средств является диагностическая полоска на основе растворимой глюкозодегидрогеназы (s-GlucDOR, EC 1.1.99.17), фермента, содержащего пирролохинолинхинон, исходно полученного из Acinetobacter calcoaceticus.

Хинопротеины используют хинон в качестве кофактора для окисления спиртов, аминов и альдоз до соответствующих лактонов, альдегидов и альдоновых кислот (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Duine, J. A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-284; Davidson, V. L., in "Principles and applications of quinoproteins" (1993) the whole book, New York, Marcel Dekker; Anthony, C., Biochem. J. 320 (1996) 697-711; Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C., Biochem. Soc. Trans. 26 (1998) 413-417; Anthony, C. and Ghosh, M., Prog. Biophys. Mol. Biol. 69 (1998) 1-21. Среди хинопротеинов самую большую подгруппу составляют хинопротеины, содержащие нековалентно связанный кофактор 2,7,9-трикарбокси-1H-пирроло[2,3-f]хинолин-4,5-дион (PQQ) (Duine 1991, выше). Все известные до настоящего времени бактериальные хинон-глюкозодегидрогеназы относятся к данной подгруппе с PQQ в качестве кофактора (Anthony and Ghosh 1997 выше, Goodwin, P.M. and Anthony, C., Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80; Anthony, C., Adv. in Phot. and Resp. 15 (2004) 203-225).

Два типа PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы (EC 1.1.99.17) были описаны у бактерий: одна является мембраносвязанной (m-GDH), другая - растворимой (s-GDH). Оба типа не имеют какой-либо существенной гомологии последовательностей (Cleton-Jansen, A. M., et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436; Cleton-Jansen, A. M., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-79; Oubrie, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96 (1999) 11787-11791. Они также отличаются как кинетическими, так и иммунологическими свойствами (Matsushita, K., et al., Bioscience Biotechnol. and Biochem. 59 (1995) 1548-1555). m-GDH широко распространены у грамотрицательных бактерий, тогда как s-GDH были обнаружены только в периплазматическом пространстве штаммов Acinetobacter, таких как A. calcoaceticus (Duine, J.A., 1991a; Cleton-Jansen, A.M. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125; Matsushita and Adachi, 1993) и A. baumannii (JP 11243949).

Посредством поиска в базах данных последовательностей были идентифицированы две последовательности, гомологичные полноразмерной s-GDH A. calcoaceticus в E.coli K-12 и видах Synechocystis. Кроме того, две неполные последовательности, гомологичные s-GDH A. calcoaceticus, также были обнаружены в геноме P. aeruginosa и Bordetella pertussis (Oubrie et al. 1999 a, b, c) и Enterobacter intermedium (Kim, C.H. et al., Current Microbiol. 47 (2003) 457-461), соответственно. Установленные аминокислотные последовательности этих четырех не охарактеризованных белков являются близко родственными s-GDH A. calcoaceticus, при этом большое количество остатков в предполагаемом активном сайте является абсолютно консервативным. Вероятно, эти гомологичные белки имеют сходную структуру и катализируют сходные PQQ-зависимые реакции (Oubrie et al., 1999 a, b, c; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151; Reddy, S., and Bruice, T.C., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438; Yamada, M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192).

Было обнаружено, что бактериальные s-GDH и m-GDH обладают довольно разными последовательностями и имеют разную субстратную специфичность. Например, A. calcoaceticus содержит две разные PQQ-зависимые глюкозодегидрогеназы, одну m-GDH, которая активна in vivo, а другая, - названная s-GDH, для которой может быть показана только активность in vitro. Cleton-Jansen et al., 1988; 1989 a, b клонировали гены, кодирующие два фермента GDH, и определили последовательности ДНК обоих указанных генов GDH. Не существует явной гомологии между m-GDH и s-GDH, что подтверждает тот факт, что m-GDH и s-GDH представляют собой две совершенно разные молекулы (Laurinavicius, V., et al, Biologija (2003) 31-34).

Гены s-GDH A. calcoaceticus клонированы в E. coli. После образования в клетке s-GDH перемещается через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство (Duine, J. A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Matsushita, K. and Adachi, O., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker). Подобно нативной s-GDH A. Calcoaceticus рекомбинантная s-GDH, экспрессированная в E. coli, представляет собой гомодимер с одной молекулой PQQ и тремя ионами кальция на мономер (Dokter, P. et al., Biochem. J. 239 (1986) 163-167; Dokter, P. et al., FEMS Microbiol. Lett. 43 (1987) 195-200; Dokter, P. et al., Biochem. J. 254 (1988) 131-138; Olsthoorn, A. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333, Oubrie, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96 (1999) 11787-11791, Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194). s-GDH окисляет большое число моно- и дисахаридов до соответствующих кетонов, которые затем гидролизуются до альдоновых кислот, и s-GDH также может быть донором электронов для PMS (феназинметосульфат), DCPIP (2,6-дихлорфенолиндофенол), WB (голубой Вюрстера) и убихинонов с короткой цепью, таких как убихинон Q1 и убихинон Q2 (Matsushita, K., et al., Biochem. 28 (1989) 6276-6280; Matsushita, K., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), нескольких искусственных акцепторов электронов, таких как метилсульфат N-метилфеназония (Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Biochem. 37 (1998) 13854-13861) и электропроводящие полимеры (Ye, L., et al., Anal. Chem. 65 (1993) 238-241). Ввиду высокой специфичной активности s-GDH по отношению к глюкозе (Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., (1996) выше) и своей широкой специфичности по отношению к искусственным акцепторам электронов фермент подходит для аналитического использования, особенно для применения в (био)сенсоре или индикаторных полосках для определения глюкозы в случае диагностических применений (Kaufmann, N. et al., Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinised blood in "Glucotrend" (1997) 1-16, Boehringer Mannheim GmbH; Malinauskas, A.; et al., Sensors and Actuators, B: Chemical B100 (2004) 395-402).

Окисление глюкозы может катализировать по меньшей мере три совершенно разные группы ферментов, т.е. NAD/P-зависимые глюкозодегидрогеназы, флавопротеиновые глюкозооксидазы или хинопротеиновые GDH (Duine, J.A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23). Наблюдали довольно медленное автоокисление восстановленной s-GDH, что свидетельствует о том, что кислород является очень плохим акцептором электронов для s-GDH (Olsthoorn and Duine, 1996). s-GDH может быть эффективным донором электронов от восстановленного хинона к таким переносчикам, как PMS, DCPIP, WB и убихиноны с короткой цепью, такие как Q1 и Q2, но не может эффективно отдавать электроны непосредственно на кислород.

В общепринятых индикаторных полосках и сенсорах для наблюдения за уровнем глюкозы в крови, сыворотке и моче, например, больных диабетом, используют глюкозооксидазу. Эффективность фермента зависит от концентрации кислорода. Измерение глюкозы на разной высоте над уровнем моря при разных концентрациях кислорода в воздухе может приводить к ошибочным результатам. Основным преимуществом PQQ-зависимых глюкозодегидрогеназ является их независимость от кислорода. Такое важное свойство описано, например, в патенте US 6103509, в котором исследованы некоторые свойства мембраносвязанной GDH.

Важным вкладом в данную область стало использование s-GDH вместе с подходящими переносчиками. Способы анализа и устройства в виде индикаторных полосок на основе s-GDH подробно описаны в патенте US 5484708. Указанный патент также содержит подробную информацию о проведении анализов и получении основанных на s-GDH индикаторных полосках для измерения глюкозы. Способы, описанные в этой публикации, а также в цитированных документах, приведены в настоящее описание в качестве ссылки.

Другими патентами или заявками, относящимися к данной области и содержащими конкретную информацию о различных способах применения ферментов с глюкозодегидрогеназной активностью, являются US 5997817; US 6057120; EP 0 620 283 и JP 11-243949-A.

Коммерческой системой, в которой используют s-GDH, и индикатор, который вызывает изменение окраски в том случае, когда происходит реакция (Kaufmann et al. 1997 выше), является система Glucotrend®, распространяемая Roche Diagnostics GmbH.

Несмотря на обсуждаемые выше преимущества в случае применения PQQ-зависимой s-GDH, при определении глюкозы также необходимо учитывать некоторые недостатки. Фермент имеет довольно широкий спектр субстратов по сравнению с m-GDH. То есть s-GDH окисляет не только глюкозу, но также некоторые другие сахара, включая мальтозу, галактозу, лактозу, маннозу, ксилозу и рибозу (Dokter et al. 1986 a; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151). Реактивность по отношению к другим сахарам, отличным от глюкозы, может в некоторых случаях снижать точность определения уровней глюкозы в крови. В частности, у пациентов, находящихся на перитонеальном диализе, получающих лечение икодекстрином (полимером глюкозы), в жидкостях организма, например, в крови, могут находиться высокие уровни других сахаров, особенно мальтозы (Wens, R., et al., Perit. Dial. Int. 18 (1998) 603-609).

Поэтому клинические образцы, которые, например, получены у больных диабетом, особенно у пациентов с почечными осложнениями и особенно у пациентов, находящихся на диализе, могут быть значительные уровни других сахаров, особенно мальтозы. Определения глюкозы в образцах, полученных у таких пациентов в критическом состоянии, могут быть искажены за счет мальтозы (Davies, D., Perit. Dial. Int. 14 (1994) 45-50; Frampton, J. E.; and Plosker, G. L., Drugs 63 (2003) 2079-2105).

В литературе имеется мало сообщений о попытках получить модифицированные PQQ-зависимые s-GDH с измененной субстратной специфичностью. В статье Igarashi, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824 указано, что введение точечной мутации в положение Glu277 приводит к мутантам с измененным профилем субстратной специфичности.

Sode в патенте EP 1 176 202 указывает, что некоторые аминокислотные замены в s-GDH приводят к образованию мутанта s-GDH с повышенной аффинностью к глюкозе. В патенте EP 1 167 519 тот же автор сообщает о мутанте s-GDH с повышенной стабильностью. Кроме того, тот же автор в патенте JP2004173538 сообщает о других мутантах s-GDH с повышенной аффинностью к глюкозе.

Kratzsch, P. et al. в WO 02/34919 указывают, что специфичность s-GDH в отношении глюкозы по сравнению с другими сахарами-субстратами, особенно по сравнению с мальтозой, может быть повышена посредством аминокислотных замен в некоторых положениях s-GDH.

Takeshima, S., et al. (EP 1 367 120) сообщали о мутантной s-GDH, содержащей некоторые аминокислотные замены или инсерцию аминокислоты между положениями 427 и 428 в соответствии с аминокислотной последовательностью, известной для Acinetobacter calcoaceticus.

Однако, несмотря на сообщения о некоторых усовершенствованиях в создании мутантов или вариантов s-GDH с улучшенными свойствами, все еще требуются дальнейшие, альтернативные и/или дополнительные усовершенствования.

Следовательно, существует потребность и клиническая необходимость в дополнительных мутантных или вариантных формах s-GDH, которые самостоятельно или в комбинации с уже известными мутациями могут привести к улучшенной специфичности в отношении глюкозы в качестве субстрата.

Целью настоящего изобретения было получение новых мутантов или вариантов s-GDH, которые либо самостоятельно, либо в комбинации с уже известными мутациями приводят к существенно улучшенной субстратной специфичности в отношении глюкозы по сравнению с другими выбранными молекулами сахаров, например, такими как галактоза или мальтоза.

Неожиданно было обнаружено, что можно значительно улучшить субстратную специфичность s-GDH в отношении глюкозы по сравнению с другими сахарами путем вставки аминокислоты между положениями 428 и 429 s-GDH, соответствующим аминокислотной последовательности, известной для Acinetobacter calcoaceticus, и, таким образом, по меньшей мере частично решить описанные выше проблемы, известные в данной области.

Субстратная специфичность в отношении к глюкозе по сравнению с другими выбранными молекулами сахаров была значительно повышена в результате получения инсерционных вариантов s-GHD согласно настоящему изобретению и как описано в данной публикации ниже и в прилагаемой формуле изобретения.

Благодаря повышенной субстратной специфичности новых форм s-GDH возможен значительный технический прогресс в определении глюкозы в случае применения в различных областях. Улучшенные варианты s-GDH можно использовать с большим преимуществом для специфичного определения или измерения глюкозы в биологических образцах, особенно в устройствах на основе индикаторных полосок или в биосенсорах.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к варианту растворимой формы EC 1.1.99.17, также известной, как PQQ-зависимая растворимая глюкозодегидрогеназа (s-GDH), при этом указанный вариант содержит по меньшей мере одну инсерцию аминокислотного остатка между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и необязательно дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, предпочтительно замен в положении 348 и 428.

Также настоящее изобретение относится к предпочтительным вариантам s-GDH, обладающим улучшенными свойствами, особенно повышенной специфичностью по отношению к глюкозе, а также к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим такие варианты, к экспрессирующему вектору, содержащему такую полинуклеотидную последовательность, и к клетке-хозяину, содержащей указанный экспрессирующий вектор.

Изобретение, кроме того, относится к применению варианта по настоящему изобретению в способе измерения глюкозы, особенно с помощью устройства на основе индикаторных полосок или биосенсора.

Следующие примеры, ссылки, список последовательностей и фигуры предлагаются для большего понимания настоящего изобретения, действительный объем которого указан в прилагаемой формуле изобретения. Понятно, что могут быть осуществлены модификации в указанных способах, не отходя от сути изобретения.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 - Последовательности белков PQQ-зависимой s-GDH A. calcoaceticus (вверху) и s-GDH A. baumannii (внизу), выровненные в соответствии с гомологией последовательностей.

Фиг.2 - Иллюстрация вектора pACSGDH, указанного в примере 1, содержащего соответственно последовательность ДНК дикого типа или мутантную последовательность ДНК растворимой PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы.

Фиг.3 - Нуклеотидная последовательность (ДНК) вектора pACSGDH, указанного в примере 1, содержащего последовательность ДНК дикого типа растворимой PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как обсуждалось выше, два совершенно разных типа хинопротеидных ферментов с глюкозодегидрогеназной активностью (мембраносвязанный и растворимый) объединяют в группу с названием EC 1.1.99.17. По-видимому, указанные два типа не являются родственными друг другу.

В целях настоящего изобретения подходит только растворимая форма GDH (s-GDH), и ниже в описании обсуждаются ее улучшенные варианты.

В первом варианте осуществления изобретение относится к варианту растворимой формы EC 1.1.99.17, так же известной, как PQQ-зависимая растворимая глюкозодегидрогеназа (s-GDH), при этом указанный вариант содержит по меньшей мере одну инсерцию аминокислотного остатка между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и необязательно дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен.

Предпочтительно только одна аминокислота встроена между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

Кроме того, предпочтительно вариант s-GDH, содержащий инсерцию аминокислоты между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), отличается тем, что указанная встроенная аминокислота выбрана из группы, состоящей из лейцина, фенилаланина, метионина и пролина. Предпочтительно встроенной аминокислотой является пролин.

В данной области известно, что ДНК-последовательность дикого типа растворимой PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы может быть выделена из штаммов Acinetobacter. Наиболее предпочтительным является выделение из штамма типа Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41. Последовательность s-GDH дикого типа (зрелого белка) приведена в SEQ ID NO: 2. Также можно использовать другие LMD-штаммы Acinetobacter в качестве источника s-GDH дикого типа. Такие последовательности могут быть выровнены с последовательностью, полученной из A. calcoaceticus, и могут быть проведены сравнения последовательностей. Очевидно, также можно провести скрининг ДНК-библиотек других бактериальных штаммов, например, как описано для E. coli K-12 (Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333), и в таких геномах идентифицировать последовательности, родственные s-GDH. Такие последовательности и еще не идентифицированные гомологичные последовательности можно использовать для создания вариантов s-GDH с улучшенной субстратной специфичностью.

Термин «вариант», используемый в настоящем изобретении, относится к белку s-GDH, который по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа имеет инсерцию аминокислоты между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

Термин «мутант», используемый в настоящем изобретении, относится к белку s-GDH, который по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с последовательностью s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO:2).

Следовательно, оба термина «вариант» или «мутант» вместе могут использоваться в отношении белка s-GDH, который по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа имеет инсерцию аминокислоты между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) и, дополнительно, по меньшей мере одну аминокислотную замену.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения ферментативные или функциональные свойства улучшенного варианта s-GDH сравнивают с ферментом дикого типа или мутантами без инсерции аминокислоты между положениями 428 и 429, соответственно.

Предпочтительный вариант настоящего изобретения отличается тем, что по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа он обладает по меньшей мере в два раза повышенной субстратной специфичностью по отношению к глюкозе, по сравнению с по меньшей мере одним другим выбранным в качестве субстрата сахаром.

Для расчета субстратной специфичности или перекрестной реактивности один из простых способов заключается в том, чтобы принять активность, измеренную с глюкозой в качестве субстрата, за 100% и сравнить активность, измеренную с другим выбранным сахаром, со значением для глюкозы. Иногда, чтобы не быть многословными, термин специфичность просто используют без специальной ссылки на глюкозу, с одной стороны, и выбранный в качестве субстрата сахар, с другой стороны.

Специалисту в данной области понятно, что сравнение ферментативных активностей лучше всего осуществлять при эквимолярных концентрациях исследуемых молекул субстратов, используя хорошо определенные условия анализа. В противном случае необходимо делать корректировку в отношении различий в концентрациях.

Необходимо выбрать стандартизованные и хорошо определенные условия анализа, чтобы оценить субстратную специфичность (улучшения). Ферментативную активность s-GDH по отношению к глюкозе в качестве субстрата, а также по отношению к другим выбранным в качестве субстратов сахарам измеряют, как описано в примере 7.

На основании таких измерений ферментативной активности по отношению к глюкозе или другому выбранному сахару, предпочтительно мальтозе, анализируют перекрестную реактивность (и ее улучшения).

(Перекрестную) реактивность s-GDH к выбранному сахару в процентах рассчитывают следующим образом

Перекрестная реактивность [%] = (активность к выбранному сахару/активность к глюкозе) x 100%.

Определена (перекрестная) реактивность по отношению к мальтозе s-GDH дикого типа согласно указанной выше формуле, составляющая примерно 105%. Измерена (перекрестная) реактивность s-GDH дикого типа к галактозе, составляющая примерно 50% (сравнение в таблице).

(Повышенную) специфичность рассчитывают согласно следующей формуле:

Активность мутанта к глюкозеАктивность дикого типа к выбранному сахару
Специфичность (повышенная) =-----------------×----------------------
Активность дикого типа к глюкозеАктивность мутанта к выбранному сахару

По сравнению с ферментом дикого типа форма s-GDH по меньшей мере с 10-кратным повышением специфичности по отношению к глюкозе по сравнению с мальтозой (мальтоза/глюкоза) соответственно при использовании мальтозы в качестве субстрата обладает не больше, чем 10,5% активности от активности, измеряемой при использовании в качестве субстрата глюкозы. Или, если, например, мутантная s-GDH обладает перекрестной реактивностью к мальтозе, составляющей 20% (определенной и рассчитанной, как описано выше), то указанный мутант по сравнению с s-GDH дикого типа имеет увеличенную в 5,25 раз субстратную специфичность (мальтоза/глюкоза).

Термин «удельная активность» по отношению к субстрату хорошо известен в данной области, предпочтительно его используют для описания ферментативной активности на количество белка. В данной области известны различные способы определения удельной активности молекул GDH с использованием глюкозы или других сахаров в качестве субстратов (Igarashi, S., et al., (1999) выше). Один из имеющихся способов измерения подробно описан в разделе «Примеры».

Хотя можно выбрать много разных молекул сахаров и исследовать специфичность s-GDH к глюкозе по сравнению с любой такой выбранной молекулой сахара, предпочтителен выбор клинически важной молекулы сахара для такого сравнения. Предпочтительные выбранные сахара выбраны из группы, состоящей из маннозы, аллозы, галактозы, ксилозы и мальтозы. Предпочтительно выбирают мальтозу или галактозу и мутантную s-GDH тестируют в отношении повышенной субстратной специфичности по отношению к глюкозе по сравнению с галактозой или мальтозой. В следующем предпочтительном варианте выбранным сахаром является мальтоза.

Обнаружено, что повышение специфичности к глюкозе вариантов s-GDH согласно данному изобретению, например, к мальтозе по сравнению с глюкозой, довольно значительно. Поэтому более предпочтительно, чтобы указанная субстратная специфичность по отношению к глюкозе по сравнению с субстратной специфичностью по меньшей мере к одному другому выбранному в качестве субстрата сахару повышена по меньшей мере в три раза. Другие предпочтительные варианты осуществления изобретения включают мутанты s-GDH, характеризующиеся повышенной субстратной специфичностью по отношению к глюкозе, которая по меньшей мере в 5 раз выше или также предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше, чем к другой выбранной молекуле сахара.

Мутации в s-GDH во многих случаях приводят к вариантам фермента с сильно пониженной удельной активностью по отношению к субстрату глюкозе. Однако более чем 10-кратное снижение (абсолютной или общей) удельной активности по отношению к субстрату глюкозе может быть критическим для обычных применений. Поэтому предпочтительно, чтобы s-GDH с повышенной специфичностью к субстрату глюкозы обладал по меньшей мере 10% удельной активностью по отношению к глюкозе, измеренной с использованием фермента дикого типа. Конечно, более предпочтительно, чтобы такие мутантные ферменты обладали по меньшей мере 20% или более предпочтительно по меньшей мере 30% от соответствующей активности на глюкозе s-GDH дикого типа.

Более предпочтительны такие мутанты, для которых удельная активность к мальтозе составляет 10% или меньше или даже только 5% или меньше от удельной активности к мальтозе, измеренной для соответствующего фермента дикого типа на индикаторных полосках или в тестах в жидкой фазе, тогда как удельная активность по отношению к глюкозе составляет ≥ 10% по сравнению с удельной активностью по отношению к глюкозе соответствующего фермента дикого типа.

Обнаружено, что можно дополнительно повысить субстратную специфичность варианта s-GDH, содержащего инсерцию между положениями 428 и 429, посредством дальнейшей модификации такого варианта так, чтобы он дополнительно содержал одну или несколько аминокислотных замен в некоторых определенных положениях аминокислот.

Осуществление настоящего изобретения очень подробно описано с указанием положений аминокислот, известных, исходя из SEQ ID NO: 2, последовательности s-GDH дикого типа, которая выделена из штамма типа Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41. Положения аминокислот в разных изолятах s-GDH, соответствующие положениям в последовательности SEQ ID NO: 2, легко идентифицируют с помощью подходящего сравнения последовательностей.

Множественное выравнивание и сравнение последовательности s-GDH с последовательностью SEQ ID NO: 2 дикого типа осуществляют с использованием программы PileUp пакета программ GCG, версия 10.2 (Genetics Computer Group, Inc.). PileUp создает множественное выравнивание последовательностей с использованием упрощения способа последовательного выравнивания Feng, D. F. and Doolittle, R. F., J. Mol. Evol. 25 (1987) 351-360, и соответственно задают матрицы оценок для идентичных, сходных или разных аминокислотных остатков. Указанный способ начинается с попарного выравнивания двух наиболее сходных последовательностей с получением кластера из двух выровненных последовательностей. Указанный кластер затем можно выравнивать со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей могут быть выровнены простым удлинением попарного выравнивания двух отдельных последовательностей. Конечное выравнивание осуществляют с помощью серии последовательных попарных выравниваний, которые включают все больше и больше отличающиеся последовательности и кластеры вплоть до того, пока в конечное попарное выравнивание не будут включены все последовательности. Таким образом, положения в других гомологичных молекулах s-GDH могут быть легко идентифицированы как соответствующие положениям, установленным для s-GDH A. Calcoaceticus в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. Вот почему положения аминокислот, приведенные в данном описании, следует понимать как положения аминокислот в последовательности SEQ ID NO: 2 или как положения, соответствующие им в другой гомологичной молекуле s-GDH.

Обнаружено, что мутанты s-GDH, содержащие аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 348, в комбинации с инсерцией аминокислоты между положениями 428 и 429 в s-GDH, проявляют удивительный позитивный эффект в отношении специфичности к глюкозе. Как показано в таблице, было идентифицировано и создано множество вариантов s-GDH с повышенной специфичностью по отношению к глюкозе. Повышение специфичности к глюкозе в случае варианта s-GDH наблюдается при условии, что аминокислота в положении треонина 348 заменена другой подходящей аминокислотой и подходящая аминокислота встроена между положениями 428 и 429. Поэтому очень предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к варианту белка PQQ-зависимой s-GDH, содержащему инсерцию между аминокислотами 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и дополнительно содержащему замену аминокислотного остатка в положении аминокислоты, соответствующем положению 348.

Также обнаружено, что дополнительные замены в положении аминокислот, соответствующем положениям 169, 171, 245, 341, 349 и/или 428 последовательности SEQ ID NO: 2, являются полезными при попытках дополнительно повысить специфичность по отношению к глюкозе варианта s-GDH, содержащего инсерцию между аминокислотами 428 и 429 и замену аминокислотного остатка в положении 348.

В данной области известно, что ни остаток треонина в положении 348, ни инсерция аминокислоты между положениями 428 и 429 s-GDH, которая выделена из штамма типа Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41, не вносят вклада в связывание субстрата молекулой s-GDH (Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194; Oubrie, A. и Dijkstra, B. W., Protein Sci. 9 (2000) 1265-1273). Не имеется ни химического, ни физического объяснения, почему указанные две модификации s-GDH особенно повышают субстратную специфичность по отношению к глюкозе по сравнению с другими представляющими интерес молекулами сахаров, особенно по сравнению с мальтозой.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант s-GDH отличается тем, что аминокислотный остаток треонина в положении 348 заменен аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из аланина, глицина и серина. В более предпочтительном варианте используют глицин для замены треонина в положении 348. Терминология T348G известна специалисту в данной области и указывает, что треонин в положении 348 заменен глицином.

Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления изобретения является вариант растворимой формы EC 1.1.99.17, так же известной, как PQQ-зависимая растворимая глюкозодегидрогеназа (s-GDH), при этом указанный вариант содержит по меньшей мере одну инсерцию аминокислотного остатка между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка в положении аминокислоты, соответствующем положению 428. Предпочтительно замену аспарагина в положении 428 осуществляют лейцином, пролином и валином. Более предпочтительной заменой в положении 428 является пролин.

Одна группа предпочтительных вариантов s-GDH по данному изобретению содержит замену аминокислотного остатка в положении 348 и/или замену аминокислоты в положении 428 и инсерцию аминокислоты между положениями 428 и 429. Указанные варианты необязательно могут быть дополнительно модифицированы так, чтобы они содержали одну или несколько аминокислотных замен в положениях аминокислот, соответствующих положениям 169, 171, 245, 341 и/или 349 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 169 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), заменяют в варианте согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы встречающаяся в природе аминокислота лейцин была заменена фенилаланином, тирозином или триптофаном. Более предпочтительно замену в положении 169 осуществляют фенилаланином.

В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 171 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), заменяют в варианте согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы встречающаяся в природе аминокислота тирозин была заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аланина, метионина, глицина. Более предпочтительно замену в положении 171 осуществляют глицином.

В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 245 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), заменяют в варианте согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы встречающаяся в природе аминокислота глутаминовая кислота была заменена аспарагиновой кислотой, аспарагином или глутамином. Более предпочтительно замену в положении 245 осуществляют аспарагиновой кислотой.

В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 341 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), заменяют в варианте согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы встречающаяся в природе аминокислота метионин была заменена валином, аланином, лейцином или изолейцином. Более предпочтительно замену в положении 341 осуществляют валином.

В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 349 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), заменяют в варианте согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы встречающаяся в природе аминокислота валин была заменена аланином, глицином. Более предпочтительно замену в положении 349 осуществляют аланином.

Как описано в WO 02/34919, замену аминокислоты в положении 348 последовательности s-GDH, соответствующей последовательности дикого типа, выделенной из A. calcoaceticus, можно использовать для существенного повышения специфичности s-GDH к глюкозе. Специалист в данной области найдет в WO 02/34919 другие подходящие положения, которые можно заменять и комбинировать с инсерцией согласно настоящему изобретению.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант s-GDH согласно настоящему изобретению дополнительно к инсерции между аминокислотными остатками 428 и 429 содержит по меньшей мере две аминокислотные замены, выбранные из группы, состоящей из положений 171, 245, 341, 348 и 349, которые соответствуют положениям аминокислот в последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант s-GDH согласно настоящему изобретению дополнительно к инсерции между аминокислотными остатками 428 и 429 содержит по меньшей мере три аминокислотные замены, выбранные из группы, состоящей из положений 171, 245, 341, 348 и 349, которые соответствуют положениям аминокислот в последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

Как будет понятно специалисту в данной области, можно осуществить аминокислотные замены, например, молчащие мутации, которые не влияют на свойства s-GDH в значимой степени. Однако вариант согласно настоящему изобретению будет иметь не более 45 изменений аминокислот по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 2. Предпочтительно вариант будет содержать 20 или меньше аминокислотных замен, более предпочтительно будут присутствовать только 10 аминокислотных замен или меньше замен.

Варианты s-GDH согласно настоящему изобретению приведены в разделе «Примеры». Указанные варианты также представляют собой предпочтительные варианты осуществления изобретения. Варианты, в случае которых существует меньше всего взаимовлияний при определении глюкозы, обнаруженные до настоящего времени, содержат инсерцию между аминокислотами 428 и 429, предпочтительно пролина, и мутации Y171G, E245D, M341V и T348G или мутации L169F, Y171G, E245D, M341V и T348G, соответственно. Указанные два варианта также являются дополнительными предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения.

Анализ аминокислотной последовательности показал, что мотивы последовательности, обнаруженные в s-GDH дикого типа из A. Calcoaceticus, с одной стороны, и A. Baumannii, с другой стороны, по-видимому, являются высоко консервативными вблизи положений, особенно важных для повышения специфичности по отношению к глюкозе, которые идентифицированы в настоящем изобретении, т.е. сайт инсерции вблизи положений 428 и 429, которые соответствуют s-GDH дикого типа из A. calcoaceticus.

Вариант PQQ-зависимой s-GDH, содержащий аминокислотную последовательность AGNXaaVQK (SEQ ID NO: 2), представляет собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. Последовательность SEQ ID NO: 2 соответствует положениям 426-431 s-GDH дикого типа A. calcoaceticus или положениям 427-432 s-GDH дикого типа A. baumannii, но содержит инсерцию одной аминокислоты (Xaa) между положениями 428 и 429 (A. calcoaceticus) или между 429 и 430 (A. baumannii), соответственно.

В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к варианту s-GDH, содержащему последовательность G-N-Xaa-V-Q-K-D (SEQ ID NO: 11). Предпочтительно вариант s-GDH, содержащий последовательность SEQ ID NO: 11, дополнительно отличается тем, что указанная встроенная аминокислота Xaa выбрана из группы, состоящей из лейцина, пролина, фенилаланина и метионина, более предпочтительно Xaa является остатком пролина.

Как объясняется выше, аминокислота аспарагин в положении 428 s-GDH дикого типа может быть подвергнута аминокислотной замене. В данном случае последовательность SEQ ID NO: 11 будет содержать заменяющую аминокислоту вместо P428.

В данной области известны многочисленные возможности для получения мутантных белков. На основании важного открытия согласно настоящему изобретению, выявления критической важности инсерции аминокислоты между положениями 428 и 429, специалист в данной области теперь может легко получить следующие подходящие варианты s-GDH. Такие варианты, например, могут быть получены способами, известными как случайный мутагенез (Leung, D. W., et al., Technique 1 (1989) 11-15) и/или направленный мутагенез (Hill, D. E., et al., Methods Enzymol. 155 (1987) 558-568). Альтернативным способом получения белка с требуемыми свойствами является получение химерных конструкций, которые содержат элементы последовательностей по меньшей мере из двух разных источников, или полный синтез подходящего гена s-GDH. Такие способы, известные в данной области, могут быть использованы вместе с информацией, раскрытой в настоящем изобретении, для получения мутантов или вариантов s-GDH, содержащих, например, дополнительные аминокислотные замены в комбинации с описанной инсерцией между положениями 428 и 429 последовательности SEQ ID NO: 2.

Вариант s-GDH согласно настоящему изобретению, например, может быть получен, начиная с гена s-GDH, который выделен из штамма типа Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41, а также начиная с гомологичной последовательности. В контексте данной заявки подразумевается, что термин «гомологичная» включает аминокислотную последовательность s-GDH по меньшей мере с 90% идентичностью по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 2. Другими словами, после соответствующего выравнивания с использованием программы PileUp по меньшей мере 90% аминокислот такой гомологичной s-GDH идентичны аминокислотам, описанным в виде SEQ ID NO: 2.

Будет понятно, что изменения последовательностей ДНК и аминокислот существуют в природе или могут быть намеренно введены с использованием способов, известных в данной области. Указанные изменения могут в результате давать различия до 10% аминокислот в полной последовательности вследствие делеций, замен, инсерций, инверсий или присоединений одного или нескольких аминокислотных остатков в указанной последовательности по сравнению с SEQ ID NO: 2. Такие аминокислотные замены могут быть осуществлены, например, на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы вовлеченных остатков. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; аминокислоты с группами незаряженных полярных головок или группами неполярных головок, имеющие сходные значения гидрофобности, включают следующие аминокислоты: лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин, тирозин. Другие предполагаемые варианты включают соли и сложные эфиры указанных выше полипептидов, а также предшественники указанных выше полипептидов, например, предшественники, имеющие N-концевую замену, такую как метионин, N-формилметионин, используемый в качестве лидерных последовательностей. Такие варианты могут быть получены, не выходя за рамки объема и не отходя от сути настоящего изобретения.

Согласно способам, известным в данной области, или согласно способам, приведенным в разделе «Примеры», можно получить полинуклеотидные последовательности, кодирующие любой из мутантов s-GDH, которые обсуждаются выше. Поэтому изобретение также относится к изолированным полинуклеотидным последовательностям, кодирующим мутантные белки s-GDH, которые описаны выше.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к экспрессирующему вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, оперативно связанную с последовательностью промотора, способного управлять ее экспрессией в клетке-хозяине.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к экспрессирующему вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, оперативно связанную с последовательностью промотора, способного управлять ее экспрессией в клетке-хозяине. Предпочтительными векторами являются плазмиды, такие как pACSGDH, показанная на фигурах 2 и 3.

Экспрессирующие векторы, применимые в настоящем изобретении, обычно содержат начало репликации, ген резистентности к антибиотику для селекции, промотор для экспрессии и полный или часть варианта гена s-GDH. Экспрессирующие векторы также могут содержать другие последовательности ДНК, известные в данной области, подобные сигнальным последовательностям (для лучшей укладки, транспорта в периплазму или секреции), индукторы для лучшего модулирования экспрессии или сайты расщепления для клонирования.

Характеристики выбранного экспрессирующего вектора должны быть совместимы с клеткой-хозяином, который необходимо использовать. Например, при клонировании в системе клеток E. coli экспрессирующий вектор должен содержать промоторы, выделенные из генома клеток E. coli (например lac или trp). Могут быть использованы подходящие начала репликации, подобные началу репликации плазмиды ColE1. К подходящим промоторам относятся, например, lac и trp. Также предпочтительно, чтобы экспрессирующий вектор содержал последовательность, кодирующую маркер для селекции, подобный гену резистентности к антибиотику. В качестве селектируемых маркеров легко можно использовать резистентность к ампициллину или резистентность к канамицину. Все указанные материалы известны в данной области и являются коммерчески доступными.

Подходящие экспрессирующие векторы, содержащие требуемую кодирующую и регуляторную последовательности, могут быть сконструированы с использованием стандартных способов рекомбинантной ДНК, известных в данной области, многие из которых описаны в Sambrook et al., в «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» (1989) Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Настоящее изобретение дополнительно относится к клеткам-хозяевам, содержащим экспрессирующий вектор, который содержит последовательность ДНК, кодирующую всю или часть мутантной s-GDH. Клетки-хозяева предпочтительно содержат экспрессирующий вектор, который включает в себя всю или часть одной из последовательностей ДНК, имеющих одну или несколько мутаций, показанных в примерах 2-8. Подходящие клетки-хозяева включают, например, E. coli HB101 (ATCC 33694), доступные из Pomega (2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, USA), XL1-Blue MRF, доступные из Stratagene (11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA), и тому подобные.

Экспрессирующие векторы могут быть внедрены в клетки-хозяева различными способами, известными в данной области. Например, трансформация клеток-хозяев экспрессирующими векторами может быть осуществлена способом трансформации протопластов, опосредованной полиэтиленгликолем (Sambrook et al. 1989, выше). Однако также могут быть использованы другие способы введения экспрессирующих векторов в клетки-хозяева, например, электропорация, биолистическая инъекция или слияние протопластов.

После введения в подходящую клетку-хозяина экспрессирующего вектора, содержащего вариант s-GDH, клетку-хозяина можно культивировать в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии требуемых вариантов s-GDH. Клетки-хозяева, содержащие требуемый экспрессирующий вектор с последовательностью ДНК, кодирующей всю или часть мутантной s-GDH, легко можно идентифицировать, например, селекцией на антибиотиках. Экспрессию вариантов s-GDH можно идентифицировать разными способами, подобными измерению образования транскриптов мРНК s-GDH mRNA, регистрации генного продукта иммунологически или регистрации ферментативной активности генного продукта. Предпочтительно используют ферментный анализ.

Настоящее изобретение также содержит инструкции относительно создания и скрининга вариантов s-GDH. Осуществляют случайный мутагенез и насыщающий мутагенез, как известно в данной области. Варианты подвергают скринингу в отношении субстратной специфичности (активность с глюкозой по сравнению с мальтозой) и значения KM для глюкозы. Выбранные условия анализа адаптируют, чтобы гарантировать, что ожидаемые небольшие усиления, вызванные, например, единственной аминокислотной заменой, можно измерить. Один из способов селекции или скрининга подходящих мутантов приведен в примере 3. Таким способом можно ясно выявить любое изменение или улучшение по сравнению с ферментом дикого типа.

Конечно следует понимать, что не все экспрессирующие векторы и регуляторные последовательности ДНК могли бы функционировать одинаково хорошо, чтобы экспрессировать последовательности ДНК согласно настоящему изобретению. И не все клетки-хозяева функционируют одинаково хорошо с одной и той же системой экспрессии. Однако специалистом в данной области проведен соответствующий отбор среди экспрессирующих векторов, регуляторных последовательностей ДНК и клеток-хозяев, используя руководство, приведенное в данном описании без чрезмерного экспериментирования.

Изобретение также относится к способу получения вариантов s-GDH согласно настоящему изобретению, включающему в себя культивирование клетки-хозяина согласно изобретению в условиях, подходящих для получения мутантной s-GDH согласно изобретению. Для бактериальных клеток-хозяев обычными условиями культивирования являются: жидкая среда, содержащая источники углерода и азота, подходящий антибиотик и индуцирующий агент (в зависимости от используемого экспрессирующего вектора). Обычные подходящие антибиотики включают ампициллин, канамицин, хлорамфеникол, тетрациклин и тому подобные. Обычные индукторы включают IPTG, глюкозу, лактозу и тому подобные.

Предпочтительно полипептиды согласно настоящему изобретению получают посредством продуцирования в клетках-хозяевах, экспрессирующих последовательность ДНК, кодирующую мутантную s-GDH. Полипептиды согласно настоящему изобретению также могут быть получены посредством трансляции in vitro мРНК, кодируемой последовательностью ДНК, кодирующей мутантную s-GDH, например, последовательности ДНК могут быть синтезированы, как описано выше и встроены в подходящий экспрессирующий вектор, который, в свою очередь, может быть использован в системе транскрипции/трансляции in vitro.

Экспрессирующий вектор, содержащий изолированный полинуклеотид, который определен и описан выше, оперативно связанный с последовательностью промотора, способного стимулировать его экспрессию в бесклеточной системе синтеза пептидов, представляет собой другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения.

Полипептиды, полученные, например, способами, которые описаны выше, затем могут быть выделены и очищены с использованием различных стандартных способов очистки белка. Например, можно использовать хроматографические способы, такие как ионообменная хроматография, гель-фильтрационная хроматография и аффинная хроматография.

Одним из основных применений улучшенных вариантов s-GDH согласно данному изобретению является применение в индикаторных полосках для мониторинга уровней глюкозы в крови у диабетических пациентов. Нечувствительность PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы к кислороду является, как обсуждалось выше, большим преимуществом по сравнению с глюкозооксидазой. Более важно, что так как варианты s-GDH имеют повышенную специфичность к глюкозе и существенно сниженную ферментативную активность по отношению к другим сахарам, то мешающее воздействие вследствие мальтозы, галактозы и/или других родственных сахаров, которые могут присутствовать в анализируемом образце, существенно снижено. Конечно, могут быть исследованы многие виды образцов. Жидкости организма, подобные сыворотке, плазме, кишечному соку или моче, являются предпочтительными источниками для таких образцов.

Изобретение также относится к способу выявления, определения или измерения глюкозы в образце с использованием мутанта s-GDH согласно настоящему изобретению. Особенно предпочтительно, что усовершенствованный способ выявления глюкозы в образце отличается тем, что указанное выявление, определение или измерение глюкозы осуществляют с использованием сенсора или устройства на основе индикаторных пластинок.

Также, в объем настоящего изобретения входит устройство для выявления или измерения глюкозы в образце, содержащее мутант s-GDH согласно данному изобретению, а также другие реагенты, требуемые для указанного измерения.

Варианты s-GDH с улучшенной субстратной специфичностью согласно данному изобретению также можно использовать с большим преимуществом в биосенсорах (D'Costa, E. J., et al., Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavicius, V., et al., Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V., et al., Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281; Malinauskas, A. et al., Sensors and Actuators, B: Chemical 100 (2004) 395-402) для оперативного мониторинга глюкозы в образце или реакторе. С этой целью варианты s-GDH можно, например, использовать для покрытия нечувствительного к кислороду стеклянного электрода с использованием комплекса осмия, содержащего окислительно-восстановительную проводящую эпоксидную сеть (Ye et al., 1993 выше) для более точного определения концентрации глюкозы.

Также имеются другие возможные применения вариантов s-GDH с улучшенной субстратной специфичностью согласно данному изобретению. Например, указанные варианты s-GDH можно использовать в способе получения альдоновых кислот. s-GDH дикого типа имеет высокий оборот при окислении субстрата, продуцируя глюконовую и другие альдоновые кислоты. При использовании вариантов s-GDH, которые являются более специфичными по отношению к глюкозе, получение глюконовой кислоты будет давать намного меньше побочных продуктов. С использованием других вариантов s-GDH с разной субстратной специфичностью можно получать разные альдоновые кислоты, которые необходимы.

В следующих примерах все реагенты, ферменты рестрикции и другие материалы получены из Roche Diagnostics Germany, если конкретно не указаны другие коммерческие источники, и использованы согласно инструкциям, предлагаемым поставщиками. Процессы и способы, используемые для очистки, характеристики и клонирования ДНК, хорошо известны в данной области (Ausubel, F., et al., в «Current protocols in molecular biology» (1994) Wiley Verlag) и при необходимости могут быть адаптированы специалистом в данной области.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение. Указанные примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, а обеспечивают дальнейшее понимание изобретения.

Пример 1

Клонирование и экспрессия растворимой PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы дикого типа A. calcoaceticus в E. coli

Ген s-GDH выделяли из штамма Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41 согласно стандартным способам. Ген s-GDH дикого типа субклонировали в плазмиде, содержащей промотор mgl для регулируемой экспрессии (сравни заявку на выдачу патента WO 88/09373). Новую конструкцию назвали pACSGDH (смотри фигуры 2 и 3). Рекомбинантные плазмиды вводили в организм хозяина, выбранный из группы E.coli. Затем указанные организмы культивировали в подходящих условиях и отбирали колонии, проявляющие активность s-GDH.

Плазмиду pACSGDH выделяли из 200 мл ночной культуры клона, указанного выше, с использованием набора QIAGEN Plasmid Maxi (Qiagen) согласно протоколу производителя. Плазмиду ресуспендировали в 1 мл дважды дистиллированной воды. Концентрацию плазмиды определяли с использованием фотометра Beckman DU 7400.

Выход составлял 600 мкг. Затем определяли качество плазмиды электрофорезом в агарозном геле.

Пример 2

Создание мутанта T348G

В качестве важной исходной матрицы для создания инсерционных вариантов получали мутант s-GDH с мутацией T348G. Указанный мутант s-GDH был выбран потому, что он, как известно, имеет пониженную активность по отношению к мальтозе по сравнению с глюкозой (смотри WO 02/34919).

Использовали набор для сайт-направленного мутагенеза QuickChange (Stratagene, номер в каталоге 200518), чтобы заменить треонин в положении 348 глицином. Конструировали подходящие праймеры.

5'- и 3'-праймеры, используемые для мутагенеза, были комплементарны друг другу и содержали модифицированный кодон для замены треонин на глицин (ACA на GGG) в центральном положении. Указанные нуклеотиды фланкировали 12-16 нуклеотидами на каждом конце. Последовательности нуклеотидов были идентичны смысловой и антисмысловой нити ДНК, фланкирующей кодон, используемый для аминокислотной замены. Вместо кодона ACA = треонину для смысловой и TGT для антисмысловой нити праймеры содержали GGG = глицину для смысловой и CCC для антисмысловой нити (смотри SEQ ID NO:3 и 4).

ПЦР-реакцию и расщепление DpnI осуществляли согласно руководству. После этого 1 мкл образца использовали для электропорации клеток XL-MRF'. Электропорацию осуществляли с использованием 2,5 кВ в 0,2 см-кювете, используя импульсный генератор BioRad E. coli (BioRad). После выращивания в 1 мл LB при 37°C в течение одного часа бактерии высевали на чашки с агаром и LB-ампициллином (100 мкг/мл ампициллина) и выращивали в течение ночи при 37°C. Клоны с мутантной s-GDH исследовали, используя способ скрининга.

Пример 3

Скрининг

Мутантные колонии на чашках с агаром, описанных выше, собирали в планшеты для микротитрования (MTP), содержащие 200 мкл среды LB с ампициллином/лунку и инкубировали в течение ночи при 37°C. Такие планшеты названы матричными планшетами.

Из каждого матричного планшета по 5 мкл образца/лунку переносили в MTP, содержащие 5 мкл на лунку B (B = реагент для экстракции бактериального белка; Pierce No. 78248) для разрушения клеток и добавляли 240 мкл 0,0556 мМ пирролохинолинхинона (PQQ); 50 мМ Hepes; 15 мМ CaCl2 pH 7,0/лунку для активации s-GDH. Чтобы завершить образование голофермента, MTP инкубировали при 25°C в течение 2 часов и при 10°C в течение ночи. Такой планшет назван рабочим планшетом.

Из рабочего планшета 3×10 мкл образца/лунку переносили в три пустых MTP. После этого один планшет подвергали тестированию с использованием глюкозы в стандартной концентрации, второй планшет с использованием пониженной концентрации глюкозы (1,9 мМ вместо 30 мМ) и третий с использованием мальтозы или другой выбранной молекулы сахара в качестве субстрата. Все другие выбранные молекулы сахаров использовали в эквимолярной стандартной концентрации, т.е. при 30 мМ. Для всех анализов использовали 90 мкл раствора переносчика (смотри пример 7), уже содержащего анализируемый сахар.

Рассчитывали dE/мин и значение, полученное при использовании в качестве субстрата 30 мМ глюкозы, принимали за 100% активности. Значение, полученное с использованием другого сахара, сравнивали со значением для глюкозы и рассчитывали в процентах активности ((например, для мальтозы в виде: dE/мин для мальтозы/dE для глюкозы)·100). Это эквивалентно перекрестной реактивности для (варианта) фермента.

Значение, полученное с использованием 1,9 мМ глюкозы, сравнивали со значением для 30 мМ глюкозы и рассчитывали в виде процента активности ((dE/мин для 1,9 мМ глюкозы/значение для 30 мМ глюкозы)·100). В результате, получали %-значение, которое является непрямым показателем значения KM для анализируемого варианта. Согласно такому расчету более высокое %-значение свидетельствует о более низком (= более хорошем) значении KM.

Идентифицировали следующий мутант:

ФерментM/G (30 мМ сахар в %)Активность 1,9/30 мМ глюкозы в %Аминокислотные замены
WT10570%-
мутант25-30%21%T348G

Пример 4

Секвенирование мутантного гена s-GDH, полученного в результате сайт-направленного мутагенеза

Выделяли плазмиду, содержащую ген мутанта s-GDH T348G, при этом мутант обладал 25-30% перекрестной реактивностью мальтоза/глюкоза (набор для выделения высокоочищенной плазмиды, Roche Diagnostics GmbH, No. 1754785) и секвенировали, используя набор для секвенирования с мечеными красителем терминаторами ABI Prism и секвенатор ABI 3/73 и 3/77 (Amersham Pharmacia Biotech).

Использовали следующие праймеры:

Смысловая нить:

GDH 1: 5'-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3' (= SEQ ID NO:5)

GDH 2: 5'-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC -3' (= SEQ ID NO:6)

Результат:

Получена требуемая мутация на уровне ДНК и аминокислот, приводящая к замене T на G в положении 348 (зрелый фермент). Дополнительной мутации в гене не обнаружено.

Пример 5

Создание инсерционных вариантов на основе мутанта T348G

Инсерционные варианты создавали, используя набор для сайт-направленного мутагенеза QuickChange (Stratagene, No. в каталоге 200518). Конструировали подходящие праймеры для инсерции между положениями аминокислот 428 и 429 (смотри последовательность ID NO: 2) и осуществляли ПЦР с использованием мутанта s-GDH (мутант T348G, смотри пример 4) согласно описанию производителя.

Для праймеров соответствующий кодон в положении инсерции синтезировали случайным образом, получая все возможные замены 20 аминокислотами. Указанные нуклеотиды кодона фланкировали 11-13 нуклеотидами на каждом конце.

Смысловая нить:

in429X_F: 5'-CTGCCGGAAATNNNGTCCAAAAAGATG -3' (=SEQ ID NO:7)

Антимысловая нить:

in429X_R: 5'-CATCTTTTTGGACNNNATTTCCGGCAG -3' (=SEQ ID NO:8)

ПЦР-реакцию и расщепление DpnI осуществляли согласно руководству. После этого 1 мкл каждой реакционной смеси использовали для электропорации клеток XL1F, как описано выше. После выращивания в 1 мл LB при 37°C в течение одного часа бактерии высевали на чашки с агаром и LB с ампициллином (100 мкг/мл ампициллина) и выращивали в течение ночи при 37°C. Мутантные клоны s-GDH подвергали описанной процедуре скрининга. Для того чтобы статистически гарантировать, что скринингу были подвергнуты варианты с 20 возможными аминокислотными инсерциями, тестировали 200 клонов. Из клонов с измененной субстратной специфичностью выделяли плазмиды и секвенировали, как описано выше.

Результаты:

ФерментM/G (30 мМ сахар) в %Активность 1,9/30 мМ глюкозы в %Аминокислотные замены
WT10570%-
мутант A25%21%T348G
A/236%33%T348G+ ins429G
A/334%21%T348G+ ins429K
A/419%23%T348G+ ins429F
A/526%24%T348G+ ins429V
A/622%24%T348G+ ins429L
A/716%17%T348G+ ins429M
A/818%31%T348G+ ins429P

Пример 6

Создание дополнительных инсерционных мутантов с высокой субстратной специфичностью по отношению к глюкозе по сравнению с мальтозой

В WO 02/34919 идентифицировано несколько аминокислотных замен в разных положениях s-GDH, чтобы повысить субстратную специфичность по отношению к глюкозе по сравнению, например, с мальтозой. Комбинации аминокислотной замены T348G с аминокислотными заменами в других положениях, например, в положениях 169, 171, 245, 341 и/или 349, еще больше повышали субстратную специфичность. Отбирали два мутанта, описанных в данной публикации, с субстратной специфичностью для мальтозы/глюкозы 3,5 и 7%, соответственно, чтобы получить инсерцию (в данном случае пролина) согласно настоящему изобретению между положениями 428 и 429. Инсерцию получали, используя праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 9 и 10.

SEQ ID NO:9insP429_F:
5'-GATACTGCCGGAAATCCAGTCCAAAAAG -3'
SEQ ID NO:10insP429_R:
5'-CTTTTTGGACTGGTCCTCCGGCAGTATC -3'

Выделение плазмидных ДНК матриц, сайт-направленный мутагенез, ПЦР, электропорацию, скрининг, секвенирование ДНК выбранных мутантов осуществляли, как описано выше.

Результаты:

ФерментM/G (30 мМ сахар) в %Активность 1,9/30 мМ глюкозы в %Аминокислотные замены
WT10570%-
Матрица C/07%9%Y171G+E245D+M341V+ T348G
Инсерционный мутант C/14%14%Y171G+E245D+M341V+ T348G+ins429P
Матрица D/03,5%10%L169F+Y171G+E245D+M341V+ T348G
Инсерционный мутант D/12%9%L169F+Y171G+E245D+M341V+ T348G+ins429P

Из приведенных выше результатов можно легко увидеть, что субстратная специфичность мальтоза/глюкоза существенно изменена. Обнаружено, что превращение мальтозы снизилось со 105% до 2-4% по сравнению с превращением мальтозы/глюкозы s-GDH дикого типа. Мутанты C/1 и D/1 исследовали подробно.

Пример 7

Очистка и анализ ферментативной активности s-GDH дикого типа и варианта s-GDH, соответственно

Выращенные клетки (LB-ампициллин 37°C) собирали и ресуспендировали в калий-фосфатном буфере pH 7,0. Разрушение клеток осуществляли, используя Френч-пресс (700-900 бар). После центрифугирования надосадок наносили на колонку с S-сефарозой (Amersham Biosciences), уравновешенную 10 мМ калий-фосфатным буфером pH 7,0. После промывки s-GDH элюировали, используя градиент соли 0-1 М NaCl. Фракции, проявляющие активность s-GDH, объединяли, диализовали против калий-фосфатного буфера pH 7,0 и повторно хроматографировали на повторно уравновешенной колонке с S-сефарозой. Активные фракции объединяли и подвергали гель-фильтрации, используя колонку Superdex® 200 (Amersham Biosciences). Активные фракции объединяли и хранили при -20°C.

Ферментный анализ и определение белка очищенного s-GDH дикого типа и варианта s-GDH, соответственно:

Определение белка осуществляли, используя реагент для анализа белка No. 23225 из Pierce (калибровочная кривая с БСА, 30 мин, 37°C).

Образцы GDH разбавляли до 1 мг белка/мл, используя 0,0556 мМ пирролохинолинхинона (PQQ); 50 мМ Hepes; 15 мМ CaCl2 pH 7,0, и инкубировали при 25°C в течение 30 минут для разбавления или активации.

После активации образцы разбавляли 50 мМ Hepes; 15 мМ CaCl2 pH 7,0 примерно до 0,02 ед./мл и 50 мкл каждого разбавленного образца добавляли к 1000 мкл 0,2 М раствора цитратного буфера (pH 5,8; при 25°C), содержащего 0,315 мг (4-(диметилфосфинилметил)-2-метилпиразоло[1.5a]имидазол-3-ил)-(4-нитрозофенил)амина (смотри патент США 5484708)/мл в качестве переносчика и 30 мМ сахар).

Экстинкцию при 620 нм регистрировали в течение первых 5 минут при 25°C.

Одна единица активности фермента соответствует превращению 1 ммоль переносчика/мин в указанных выше условиях.

Расчет: Активность = (общий объем · dE/мин [ед./мл]): (ε · объем образца · 1).

(ε = коэффициент экстинкции; ε620 нм = 30[1· ммоль-1 · см-1]).

Анализ осуществляли с глюкозой и мальтозой (Merck, Germany), соответственно.

Результаты:

ФерментM/G (30 мМ сахар) в %Ед./мл белкаАминокислотные замены
WT105800-
C/14%106Y171G+E245D+M341V+ T348G+ins429P
D/11,5%109L169F+Y171G+E245D+M341V+ T348G+ins429P

Из указанных выше результатов очевидно, что новые варианты C/1 и D/1, содержащие инсерцию между положениями 428 и 429 s-GDH, представляют собой дальнейшие улучшения в отношении перекрестной реактивности к мальтозе/глюкозе. Несмотря на различные аминокислотные замены и несмотря на инсерцию ферментативная активность по отношению к глюкозе на мг/белка все еще составляет более 10% от соответствующей ферментативной активности дикого типа.

Пример 8

Определение глюкозы в присутствии или отсутствие мальтозы

s-GDH дикого типа и варианты s-GDH C/1 и D/1, соответственно, могут быть применены для определения глюкозы в присутствии или отсутствие мальтозы. Эталонный образец содержит 50 мг глюкозы/дл. «Тестируемый» образец содержит 50 мг глюкозы/дл и 100 или 200 мг/дл мальтозы, соответственно. Для каждого анализа используют одинаковые количества активности GDH (ед./мл; смотри ферментный анализ выше).

В кювете смешивают:

1 мл 0,315 мг (4-(диметилфосфинилметил)-2-метилпиразоло[1.5a]имидазол-3-ил)-(4-нитрозофенил)амин мл/0,2 М цитрат pH 5,8

0,033 мл эталонного или тестируемого образца

Анализ начинают добавлением в кювету 0,050 мл s-GDH (что является избыточным количеством s-GDH для превращения глюкозы). Наблюдают изменение поглощения при 620 нм. Через 2-5 минут наблюдают постоянные значения и рассчитывают dE/5 мин. Значение, полученное при измерении эталонного образца с s-GDH дикого типа, принимают за 100%. Другие значения сравнивают с данным эталонным значением и рассчитывают в %.

Результаты:

Безусловно, меньшее мешающее действие мальтозы выявлено в тестируемых образцах при использовании новых вариантов. Очевидно, что концентрация s-GDH для того, чтобы лучше всего отличить глюкозу от мальтозы в образце, может быть дополнительно оптимизирована. Слишком большое количество фермента может увеличивать превращение мальтозы, слишком маленькое количество фермента может не превращать всю глюкозу, и, следовательно, можно не достичь конечной точки поглощения.

Список литературы

Anthony C., Biochem. J. 320 (1996) 697-711.

Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727.

Anthony, C. and Ghosh, M., Prog. Biophys. Mol. Biol. 69 (1998) 1-21.

Anthony, C., Biochem. Soc. Trans. 26 (1998) 413-417.

Anthony, C., Adv. in Phot. and Resp. 15 (2004) 203-225.

Ausubel, F., et al., in "Current protocols in molcular biology" (1994), Wiley Verlag.

Cleton-Jansen, A. M., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-79.

Cleton-Jansen, A. M., et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125.

Cleton-Jansen, A. M., et al., Mol. Gen. Genet 217 (1989) 430-436.

Davidson, V. L. in "Principles and applications of quinoproteins" (1993) the whole book, New York, Marcel Dekker.

Davies, D., Perit. Dial. Int. 14 (1994) 45-50.

D'Costa, E. J., et al., Biosensors 2 (1986) 71-87.

Dokter, P., et al., FEMS Microbiology Letters 43 (1987) 195-200.

Dokter, P., et al., Biochem J. 239 (1986) 163-167.

Dokter, P., et al., Biochem J. 254 (1988) 131-138.

Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press.

Duine, J. A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23.

Duine, J. A., Eur. J. Biochem. 200 (1991) 271-284.

EP 0 620 283.

EP 1 167 519.

EP 1 176 202.

EP 1 367 120.

Feng, D. F. and Doolittle, R. F., J. Mol. Evol. 25 (1987) 351-360.

Frampton, J. E.. and Plosker, G. L., Drugs 63 (2003) 2079-2105.

Goodwin, P. M. and Anthony, C., Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80.

Hill, D. E., et al., Methods Enzymol. 155 (1987) 558-568.

Igarashi, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824.

JP 11243949.

JP2004173538.

Kaufmann, N., et al. Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinised venous blood in "Glucotrend" (1997) 1-16, Mannheim, Boehringer Mannheim GmbH.

Kim, C. H. et al., Current Microbiology 47 (2003) 457-461.

Laurinavicius, V., et al., Analytical Letters 32 (1999) 299-316.

Laurinavicius, V., et al., Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281.

Laurinavicius, V. et al, Biologija (2003) 31-34.

Leung, D. W., et al., Technique 1 (1989) 11-15.

Malinauskas, A. et al., Sensors and Actuators, B: Chemical 100 (2004) 395-402.

Matsushita, K. and Adachi, O. Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker.

Matsushita, K., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72.

Matsushita, K., et al., Biochemistry 28 (1989) 6276-6280.

Matsushita, K., et al., Bioscience Biotechnology & Biochemistry 59 (1995) 1548-1555.

Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48.

Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Biochemistry 37 (1998) 13854-13861.

Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151.

Oubrie, A. and Dijkstra, B. W., Protein Sci. 9 (2000) 1265-1273.

Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194.

Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333.

Oubrie, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96 (1999) 11787-11791.

Reddy S, and Bruice, T.C., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438.

Sambrook, J., et al., in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989) -, Cold Spring Harbour, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

US 5,484,708.

US 5,997,817.

US 6,057,120.

US 6,103,509.

Wens, R., et al., Perit. Dial. Int. 18 (1998) 603-609.

WO 02/34919 WO 88/09373 Yamada, M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192.

Ye, L., et al., Anal. Chem. 65 (1993) 238-241.

1. Вариант PQQ-зависимой растворимой глюкозодегидрогеназы (s-GDH) (ЕС 1.1.99.17), где указанный вариант содержит одну инсерцию аминокислотного остатка между положениями аминокислот, соответствующим положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A.calcoaceticus (SEQ ID NO:2), и, необязательно, дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен.

2. Вариант по п.1, дополнительно отличающийся тем, что указанная встроенная аминокислота выбрана из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, метионина и пролина.

3. Вариант по п.1 или 2, в котором указанной встроенной аминокислотой является пролин.

4. Вариант по п.1, дополнительно отличающийся тем, что содержит замену аминокислотного остатка в положении аминокислоты, соответствующем положению 348.

5. Вариант по п.4, дополнительно отличающийся тем, что треонин в положении 348 заменен аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из аланина, глицина и серина.

6. Вариант PQQ-зависимой s-GDH по любому из пп.1-3, дополнительно отличающийся тем, что содержит по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка в положении аминокислоты, соответствующем положению 428.

7. Вариант PQQ-зависимой s-GDH по п.6, дополнительно отличающийся тем, что аспарагин в положении 428 заменен аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из лейцина, пролина и валина.

8. Вариант по п.1, содержащий замены в обоих положениях 348 и 428.

9. Вариант по п.1, дополнительно содержащий замену в положении 171.

10. Вариант по п.1, дополнительно содержащий замену в положении 245.

11. Вариант по п.1, дополнительно содержащий замену в положении 341.

12. Вариант по п.1, дополнительно содержащий замену в положении 169.

13. Вариант по п.1, дополнительно содержащий замену в положении 349.

14. Выделенный полинуклеотид, кодирующий s-GDH вариант белка по любому из пп.1-13.

15. Вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п.14, функционально связанный с последовательностью промотора, способного стимулировать экспрессию указанного полинуклеотида в клетке-хозяине E.coli.

16. Клетка-хозяин E.coli, содержащая вектор экспрессии по п.15, которая используется для продукции s-GDH варианта белка по любому из пп.1-13.

17. Способ получения вариантов s-GDH, включающий в себя культивирование клетки-хозяина E.coli по п.16 в условиях, подходящих для получения вариантов фермента.

18. Способ выявления, определения или измерения глюкозы в образце с использованием варианта s-GDH по любому из пп.1-13, который включает приведение в контакт образца с указанным вариантом.

19. Способ по п.18, дополнительно отличающийся тем, что указанное выявление, определение или измерение глюкозы осуществляют с использованием сенсорного устройства или устройства на основе индикаторных полосок.

20. Применение варианта s-GDH по любому из пп.1-13 в устройстве для выявления или измерения глюкозы в образце.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, а именно к способам прогнозирования гнойного менингита у обожженных. .

Изобретение относится к медицине и может быть применено для диагностики болезней оперированного желудка, выраженных демпинг-синдромом. .

Изобретение относится к медицине, в частности к хирургии и комбустиологии. .

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам оценки метаболической активности головного мозга больных, находящихся в экстремальном состоянии во время выполнения кардиохирургической операции.
Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии. .

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. .

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии. .

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторным методам исследования. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской и промышленной микробиологии. .

Изобретение относится к методу контролируемого расположения полимерной молекулы, такой как биомолекула, на подложке. .

Изобретение относится к области токсикологии и может быть использовано для определения токсичности воздуха. .

Изобретение относится к области биотехнологии и экологии. .
Изобретение относится к кардиологии, в частности к диагностике и лечению гипертонической болезни. .

Изобретение относится к акушерству и предназначено для прогнозирования преждевременных родов. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины. .

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению новых белков-стимуляторов МАР-киназ и может быть использовано в медицине. .
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выявления антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям. .

Изобретение относится к ультратонким полимерным покрытиям, широко используемым в современной технике. .

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, и может быть использовано в бактериотерапии и бактериопрофилактике инфекций разнообразной этиологии и локализаций.

Изобретение относится к биотехнологии

Наверх