Новая альдолаза, днк, кодирующая альдолазу, клетки, трансформированные днк, способ получения альдолазы и способ получения 4-гидрокси-l-изолейцина (варианты)

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения 4-гидрокси-L-изолейцина или его соли, включающий стадии: взаимодействия ацетальдегида и α-кетомасляной кислоты в водном растворе в присутствии по крайней мере одной альдолазы, выбранной из группы, состоящей из белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2; белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержит замену, делецию, инсерцию, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, и проявляющего активность альдолазы; и белка, который по крайней мере на 70% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2 и обладает активностью альдолазы; превращения полученной 4-гидрокси-3-метил-2-кетопентановой кислоты в 4-гидрокси-L-изолейцин при участии аминотрансферазы и/или дегидрогеназы, обладающей трансаминазной активностью по продукции 4-гидрокси-L-изолейцина из 4-гидрокси-3-метил-2-кетопентановой кислоты в присутствии донора аминогруппы; и выделения полученного 4-гидрокси-L-изолейцина. Изобретение позволяет получать 4-гидрокси-L-изолейцин с высокой степенью эффективности. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Фрагмент ДНК, кодирующий белок, проявляющий активность альдолазы, выбранный из группы, состоящей из:

(а) фрагмента ДНК, включающего нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 1;

(б) фрагмента ДНК, который гибридизуется в жестких условиях с фрагментом ДНК, имеющим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 1, и кодирующей белок, обладающий активностью альдолазы;

(в) фрагмент ДНК, кодирующий белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2;

(г) фрагмент ДНК, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность, которая содержит замену, делецию, инсерцию, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2 и обладающий активностью альдолазы; и

(д) фрагмент ДНК, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 70% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и обладающий активностью альдолазы.

2. Рекомбинантная ДНК для экспрессии альдолазы, полученная путем лигирования ДНК по п.1 в ДНК экспрессионного вектора.

3. Клетка бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированная рекомбинантной ДНК по п.2, - продуцент альдолазы.

4. Способ получения белка, обладающего активностью альдолазы, включающий: выращивание клеток по п.3. в питательной среде; и накопление белка, обладающего активностью альдолазы, в культуральной среде, в клетках, либо в них обоих.

5. Белок, обладающий активностью альдолазы, выбранный из группы, состоящей из:

(а) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2;

(б) белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержит замену, делецию, инсерцию, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, обладающего активностью альдолазы; и

(в) белка, который по крайней мере на 70% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, и обладающего активностью альдолазы;

6. Белок, выделенный из бактерии, принадлежащей к роду Arthrobacter simplex, который:

(а) обладает способностью катализировать реакцию по продукции 4-гидрокси-3-метил-2-кето-пентановой кислоты из ацетальдегида и α-кетомасляной кислоты;

(б) активность указанного белка зависит от присутствия двухвалентных катионов, включая Zn²⁺, Mn²⁺ и Mg²⁺; и

(в) молекулярный вес указанного белка, измеренный методом гель-фильтрации, составляет приблизительно 186 кДа, а молекулярный вес отдельной субъединицы, измеренный методом электрофореза в полиакриламидном геле с SDS (SDS-PAGE) составляет приблизительно 27 кДа.

7. Способ получения 4-гидрокси-L-изолейцина или его соли, включающий стадии: взаимодействия ацетальдегида и α-кетомасляной кислоты в водном растворе в присутствии по крайней мере одной альдолазы, выбранной из группы, состоящей из:

(а) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2;

(б) белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержит замену, делецию, инсерцию, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, и проявляющего активность альдолазы; и

(в) белка, который по крайней мере на 70% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2 и обладает активностью альдолазы; превращения полученной 4-гидрокси-3-метил-2-кетопентановой кислоты в 4-гидрокси-L-изолейцин при участии аминотрансферазы и/или дегидрогеназы, обладающей трансаминазной активностью по продукции 4-гидрокси-L-изолейцина из 4-гидрокси-3-метил-2-кетопентановой кислоты в присутствии донора аминогруппы; и выделение полученного 4-гидрокси-L-изолейцина.

8. Способ получения 4-гидрокси-L-изолейцина или его соли, включающий стадии: взаимодействия ацетальдегида и α-кетомасляной кислоты в водном растворе в присутствии бактерии, содержащей белок альдолазу, выбранную из группы, состоящей из:

(а) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2,

(б) белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержит замену, делецию, инсерцию, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, и обладающего активностью альдолазы; и

(в) белка, который по крайней мере на 70% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, и обладающего активностью альдолазы;

и содержащей по крайней мере один из ферментов, аминотрансферазу или дегидрогеназу, которые катализируют реакцию по превращению 4-гидрокси-3-метил-2-кетопентановой кислоты в 4-гидрокси-L-изолейцин в присутствии донора аминогруппы; и выделения полученного 4-гидрокси-L-изолейцина.

9. Способ по любому из пп.7 и 8, отличающийся тем, что донор аминогруппы выбран из группы, состоящей из L-аминокислот.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанной аминотрансферазой является аминотрансфераза разветвленных аминокислот.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что аминотрансфераза разветвленных аминокислот выделена из бактерии, выбранной из группы, состоящей из Escherichia и Bacillus.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что аминотрансфераза разветвленных аминокислот выделена из бактерии, выбранной из группы, состоящей из Escherichia и Bacillus.

13. Способ по п.8, отличающийся тем, что бактерия модифицирована таким образом, что активность по крайней мере одного из ферментов, а именно альдолазы или аминотрансферазы разветвленных аминокислот, в такой бактерии увеличена.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что активность альдолазы и аминотрансферазы разветвленных аминокислот увеличена путем усиления экспрессии альдолазы и/или аминотрансферазы разветвленных аминокислот.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что экспрессия альдолазы и/или аминотрансферазы разветвленных аминокислот усилена путем изменения последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего альдолазу и/или аминотрансферазу разветвленных аминокислот, или путем увеличения количества копий гена, кодирующего альдолазу и/или аминотрансферазу разветвленных аминокислот.

16. Способ по п.8, отличающийся тем, что бактерия принадлежит к роду Escherichia, Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Aspergillus или Bacillus.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что бактерия принадлежит к виду Escherichia coli, Arthrobacter simplex, Corynebacterium glutamicum, Arthrobaclor globiformis, Arthrobactor sulfureus, Arthrobaclor viscosus или Bacillus subtilis.

18. Способ по п.8, отличающийся тем, что бактерией является культура бактериальных клеток, бактериальные клетки или обработанные бактериальные клетки.

19. Способ по любому из п.7 или 8, отличающийся тем, что 4-гидрокси-L-изолейцин выбран по крайней мере из одного члена группы, состоящей из (2S,3S,4S)-4-гидроксиизолейцина, (2S,3S,4S)-4-гидроксиизолейцина, (2S,3S,4R)-4-гидроксиизолейцина и (2S,3R,4S)-4-гидроксиизолейцина.