Биореактор с экспонированием в жидкой и газовой фазах для культивирования клеток

Изобретение относится к способу и устройству для посева клеток и для культивирования клеток с высокой плотностью, при этом подлежащие культивированию клетки находятся в половолоконных мембранах и попеременно вводятся в жидкую питательную среду и находящуюся над ней газовую фазу. Устройство является биореактором с экспонированием в жидкой и газовой фазах, содержащем снабжающее пространство, в котором находятся половолоконные мембраны с внутренним диаметром не более 5 мм, внутренние объемы которых образуют камеры для культивирования. После введения клеток в камеры для культивирования примерно половину снабжающего пространства заполняют питательной средой, а другую половину - газовой смесью. После включения перфузии среды и газа начинается циклическое экспонирование половолоконных мембран и находящихся в них клеток в газовой и жидкой фазе. Изобретение позволяет обеспечить возможность эффективного непрерывного культивирования клеток с большой плотностью и получения продуктов из этих клеток при одновременном удерживании клеток. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.

 

Изобретение относится к способу и устройству для выращивания клеток и для культивирования клеток с высокой плотностью, при этом подлежащие культивированию клетки находятся в полых нитевых мембранах и попеременно вводятся в жидкую питательную среду и в находящуюся над ней газовую фазу.

Уровень техники

Культивирование клеток млекопитающих для получения биофармацевтических лекарственных средств выполняют в большинстве случаях в реакторах с мешалкой. Реже используют аэролифтные реакторы и очень редко используют половолоконные реакторы для снабжения рынка основанными на клетках млекопитающих лекарственными средствами. Для увеличения объемного выхода продуктов в реакторах с мешалкой увеличивают плотность клеток и эффективное время производства клеток посредством оптимирования среды и специфичных для линий клеток режимов подпитки в так называемых способах периодического питания. Производственную технологию выполняют в виде группы реакторов с тремя-четырьмя котлами с мешалками, объем которых каждый раз примерно в пять раз превышает объем предшествующего биореактора. Самый большой доступный реактор с мешалкой для культивирования клеток млекопитающих имеет в настоящее время объем 20000 литров. Процессы периодического питания в реакторах с мешалкой являются устойчивыми, с возможностью увеличения масштаба вплоть до указанных объемов, и давно официально допущены для изготовления лекарств. Недостатком являются длительное пребывание продуктов в культуральном пространстве, необходимость отделения клеток от супернатанта, возникающие за счет многократного использования затраты на очистку и стерилизацию, а также высокие инвестиционные и производственные затраты для снабженных этой технологией производств.

Для склонных к деградации белков, получение которых предусматривает небольшое время пребывания в биореакторе, например фактора VII, разработаны устройства и системы, которые обеспечивают перфузию культурального пространства и тем самым непрерывную работу реакторов с мешалкой. Для этого необходимо эффективное удерживание клеток при непрерывной подаче среды и сборе продукта. В этом случае во внутреннем пространстве котлов с мешалкой применяют осадительные фильтры, а в случаях, когда образующиеся клетки могут приклеиваться к поверхностям, используют несущие материалы в способах с псевдоожиженным слоем или неподвижным слоем. Непрерывный режим работы котлов с мешалкой можно реализовать также с помощью наружных систем удерживания клеток, как, например, седиментация клеток, непрерывные клеточные центрифуги или ультразвуковые отделители клеток. Преимуществами непрерывной работы являются короткое время пребывания в биореакторе, равномерное качество продукта во время изготовления, повышение объемной производительности и гибкость изменения объема партий за счет задаваемого времени культивирования. Недостатками являются загрязнение полученных клеток остатками клеток, возникающие за счет многократного использования затраты на очистку и стерилизацию, а также высокие инвестиционные и производственные затраты для соответствующих производств.

Наряду с половолоконными биореакторами ACUSYST® X Cell Generation, которые хорошо себя зарекомендовали для получения биофармацевтических продуктов, имеются другие системы реакторов, в которых все приходящие в соприкосновение с клеточной культурой компоненты выполнены в виде одноразовых компонентов. После получения одной партии их можно пускать в отходы. Необходимость в затратных процессах очистки и стерилизации отпадает. Коммерчески доступными системами являются системы на основе мембран, как, например, Cell-Pharm(R), Cellmax^®, Technomouse^®, Celline^®, mini-Perm^® или OptiCell^®. Мембранные способы имеют ряд преимуществ. В перфузионном режиме они могут обеспечивать очень высокие плотности клеток (10⁷-10⁸ клеток на миллилитр) за счет большой поверхности мембраны на единицу объема. Кроме того, клетки защищаются мембранами от сил срезания. В принципе они основаны на одноразовом применении, так что отпадает необходимость очистки и стерилизации после применения. Для получения биофармацевтических препаратов хорошо зарекомендовали себя еще так называемые волновые биореакторы в фазах опробования. В этой системе клетки культивируют в целенаправленно подвижной для улучшения перемешивания системе мешков. Преимуществом этой реакторной техники является одноразовое применение систем культивирования. Недостатками являются невысокие достигаемые плотности клеток и ограниченная возможность увеличения масштаба.

Во всех указанных выше способах и устройствах проблемой является равномерное снабжение питательной средой и, в частности, снабжение кислородом при высоких плотностях клеток. Как попытки решения этой проблемы с помощью сложных стадий способа с приложением давления (US 4804626 A, 1989), так и непосредственное внесение кислорода в пространство культивирования клеток через дополнительную мембранную систему (DE 2431450 A1, 1986 и DE 4230194 A1, 1994) не привели к обеспечивающим возможность любого увеличения масштаба системам культивирования, в которых можно равномерно снабжать клетки. В половолоконных биореакторах, в которых клетки культивируются между полыми волокнами, а питательные вещества транспортируются во внутренних каналах волокон, увеличение масштаба ограничено длиной полых волокон. Однако длина полых волокон ограничена расходом кислорода из полых волокон. За счет этого увеличение масштаба возможно лишь за счет параллельного прохождения. Однако на практике это приводит к нерентабельным процессам, т.е. изменение масштаба половолоконных биореакторов не удается из-за невозможности адекватного гомогенного снабжения клеток свежими газообразными и жидкими компонентами питательных веществ.

В патентной заявке WO 03/064586 А2 предлагается культивировать клетки с высокой плотностью в камерах, при этом камеры в одном измерении не превышают длину 5 мм. Внутреннее пространство камер образует культуральное пространство, которое полупроницаемо отделено от снабжающего пространства. Клетки удерживаются в камерах, и обмен веществ происходит через мембраны в виде полых волокон. Снабжение клеток питательными веществами и кислородом обеспечивается с помощью переменно регулируемой смеси газа и среды культивирования клеток. Хотя устройство и способ культивирования разрешают проблемы снабжения питательным веществом и кислородом и обеспечивают изменение масштаба, однако недостатком раскрытого в WO 03/064586 А2 способа является то, что в камеры необходимо вводить клетки высокой плотности. Для устранения этого недостатка в патентной заявке WO 03/102123 А2 предлагается применять биодеградируемое желе для уменьшения плотности затравки в начале культивирования клеток.

Биореактор с экспонированием в жидкой и газовой фазах в принципе разработан фирмой Zellwerk^® и распространяется фирмой Sartorius^®. В этом биореакторе прикрепляющиеся на поверхностях клетки иммобилизируются на дисках из несущего материала. Диски расположены друг за другом на одной оси и вращаются в наполовину заполненном средой и наполовину газом цилиндре. Преимуществом этого расположения является циклическое экспонирование этих клеток в обеих фазах. Недостатками являются ограниченность системы и способа прилепляющимися клетками, оставление отсоединившихся клеток в супернатанте, а также ограниченность увеличения масштаба.

Задача изобретения

Задачей изобретения является дальнейшее улучшение описанного в WO 03/064586 А2 способа.

Сущность изобретения

Эта задача решена, как это сформулировано в формуле изобретения. Согласно изобретению, посев и культивирование клеток выполняют в биореакторе с экспонированием в жидкой и газовой фазах, содержащем пространство снабжения, в котором находятся половолоконные мембраны с внутренним диаметром не более 5 мм, внутренние объемы которых образуют камеры культивирования. При этом выполняют следующие стадии способа:

- введения клеток в камеры культивирования;

- заполнения примерно половины пространства снабжения питательной средой и другой половины - газовой смесью;

- одновременного или смещенного включения перфузии среды и газа;

- циклического экспонирования половолоконных мембран и находящихся в них клеток в газовой, соответственно жидкой фазе.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления способа согласно изобретению половолоконные мембраны расположены в биореакторе горизонтально. После заполнения реактора половина мембран покрыта питательной средой. За счет поворота реактора на 360° в одном направлении, а затем в другом направлении обеспечивается циклическое экспонирование половолоконных мембран и тем самым клеток в газовой, соответственно, жидкой фазе.

Поворот в одном и затем в другом направлении предотвращает перекручивание соединенных с реактором шлангов.

Для обеспечения одинакового времени экспонирования в газовой, соответственно, жидкой фазе поворот после 180° согласно изобретению прерывают на определенное время. Время остановки можно переменно регулировать. За счет этого обеспечивается достаточное снабжение клеток питательными веществами во время пребывания мембран в жидкой питательной среде и достаточное снабжение кислородом во время пребывания в газовой фазе. Одновременно можно за счет изменения времени пребывания учитывать потребность отдельных обменов веществ отдельных линий клеток.

В качестве альтернативного решения циклическое экспонирование половолоконных мембран можно выполнять посредством погружения половолоконных мембран в питательную среду с последующим подниманием в газовую фазу. С помощью такого выполнения способа можно обеспечивать различное время пребывания клеток в обеих фазах.

Для осуществления способа согласно изобретению сначала вводят клетки малой плотности в культуральное пространство, и затем они вырастают в клетки высокой плотности. За счет применения гелей можно, как описано в патентной заявке WO 03/102123 А2, вводить в культуральное пространство клетки с минимальной плотностью клеток вместе с гелями из сшитых полипептидов, которые имеют большую долю глутамина, и/или с полутвердыми средами из вязких жидкостей или жидкостей из микроскопически малых частиц геля.

Введение клеток в культуральное пространство осуществляют в камерах через центральную систему подачи вне пространства снабжения, так что обеспечивается одновременное равномерное введение клеток во все камеры через одно соединение.

Способ согласно изобретению пригоден для культивирования простейших, бактерий, дрожжей, грибков, клеток растений и млекопитающих.

Способ является новым по сравнению с описанным в WO 03/064586 А2 способом, поскольку там не предусмотрено экспонирование клеток в двух различных фазах, а лишь экспонирование клеток в различно регулируемой смеси газа и питательной среды для клеток. Кроме того, там не описано движение реактора или мембран. WO 03/064586 А2 также не содержит указания на необходимость движения мембран с клетками в течение определенного времени в соответствующих фазах. Это объясняется тем, что в указанной публикации требуется устройство для создания различно регулируемой смеси газа и питательной среды для клеток, и тем самым движение мембран, прежде всего поворот, приводило бы к необходимости принятия сложных мер относительно соединений.

Устройство согласно изобретению состоит из цилиндрического или шарообразного (с возможностью подачи газа, соответственно, среды) двухфазного пространства снабжения, в котором параллельно продольной оси цилиндрической оболочки фиксированы в концевых пластинах полимерные, удерживающие клетки микрофильтровальные половолоконные мембраны с внутренним диаметром не более 5 мм, внутренние объемы которых образуют камеры культивирования, в которых находятся подлежащие культивированию клетки, при этом пространство снабжения содержит газовую фазу в виде потока газовой смеси и жидкую фазу в виде потока питательной среды, при этом каждая половолоконная мембрана имеет по длине цилиндра расстояние по меньшей мере 0,5 мм до смежной половолоконной мембраны, половолоконные мембраны расположены симметрично относительно воображаемого сечения вдоль оси вращения цилиндра, и мембраны не расположены в плоскости воображаемого сечения вдоль оси вращения цилиндра.

Мембраны является проницаемыми для всех веществ, но не для целых клеток. Культуральное пространство, состоящее из общего объема камер, отделено от снабжающего пространства мембранами. Они позволяют снабжающим веществам проходить в культуральное пространство и снабжать клетки. Разделительная система позволяет также продуктам выходить из камер с клетками в снабжающее окружение.

Мембраны состоят из полимеров, например полисульфона, полиэфиросульфона или поликарбоната. Особенно пригодными оказались половолоконные мембраны из биосовместимого полиэфиросульфона, которые имеют толщину стенок мембраны менее 300 мкм, водопроницаемость более 6 м³/м²·ч·бар и диаметр пор от 0,1 до 1,0 мкм.

Для предотвращения образования жидкостных пленок и тем самым для равномерного экспонирования мембран в газовой фазе мембраны имеют минимальное расстояние друг от друга.

Мембраны предпочтительно расположены гексагонально. Это означает, что каждая мембрана, за исключением тех, которые находятся на самых наружных краях, окружены шестью мембранами на равном расстоянии от центральной мембраны. За счет этого обеспечивается максимально возможная плотность упаковки в снабжающем пространстве. Другие занимающие место приспособления не требуются.

Половолоконные мембраны расположены симметрично относительно воображаемого сечения вдоль оси вращения цилиндра, которое практически представляет границу раздела фаз. В плоскости воображаемого сечения вдоль оси вращения цилиндра нет мембран. Этим обеспечивается, что во время остановок все мембраны находятся либо полностью в газовой, или полностью в жидкой фазе.

Устройство согласно изобретению является новым по сравнению с описанным в WO 03/064586 А2 устройством, поскольку там не предусмотрена работа с двумя фазами. Кроме того, для устройства согласно изобретению не требуется отдельное приспособление для создания смеси из газа и питательной среды, а также для отделения жидкости из израсходованной смеси газа и питательной среды.

Каждая концевая пластина цилиндра содержит по меньшей мере два соединения для входа, соответственно, выхода газа, которые находятся выше и ниже плоскости воображаемого сечения, так что обеспечивается непрерывное снабжение газом также при вращении цилиндра вокруг его оси вращения.

Кроме того, на головных поверхностях находятся на каждой по меньшей мере одно шланговое соединение для перфузии среды и по меньшей мере один вход в культуральное пространство для посева клеток.

Дополнительно к этому, предусмотрены шланги, увлажнители газа, ловушка для среды в газовой магистрали, блок ультрафильтрации в магистрали продукта, блок аппаратного обеспечения, насосы, измерительные и регулировочные блоки, а также приводной двигатель и рама, которые обеспечивают опору и вращение устройства.

Блок ультрафильтрации в магистрали продукта служит для концентрации соответствующего продукта.

Неожиданным образом было установлено, что с помощью устройства согласно изобретению можно достигать очень высоких плотностей клеток и, тем самым, более высокого выхода клеточных продуктов, чем с помощью устройства согласно WO 03/064586 А2. Это можно объяснить, с одной стороны, оптимальным использованием пространства и, с другой стороны, улучшенным снабжением клеток посредством циклического экспонирования половолоконных мембран в двух фазах.

В качестве альтернативного решения соединения для снабжения газом могут быть расположены не на головных поверхностях, а на цилиндрическом кожухе ниже и выше плоскости воображаемого сечения.

Применение согласно изобретению устройства состоит в культивировании клеток с большой плотностью и в получении клеточных продуктов, составляющих клеток, вирусов, белков и низкомолекулярных веществ, например, лекарственных средств, а также реагентов для диагностики и исследований.

Признаки изобретения следуют из элементов формулы изобретения и описания, при этом как отдельные признаки, так и многие признаки в виде комбинаций представляют предпочтительные варианты осуществления, на которые распространяется настоящая заявка.

Суть изобретения состоит из комбинации известных (разделение культурального пространства и снабжающего пространства с помощью мембран) и новых элементов (расположение мембран в снабжающем пространстве, возможность вращения устройства, попеременное экспонирование клеток в газовой, соответственно, жидкой фазе), которые влияют друг на друга и в своем новом общем действии обеспечивают преимущество применения и желаемый успех, который состоит в том, что обеспечивается возможность эффективного непрерывного культивирования клеток с большой плотностью и получения продуктов из этих клеток при одновременном удерживании клеток.

Ниже приводится подробное описание изобретения и его функции со ссылками на прилагаемые чертежи. Чертежи служат лишь для лучшего понимания, но их не следует понимать как единственную конструкцию, с помощью которых можно реализовать формулу изобретения.

На чертежах изображено:

фиг.1 - схема системы биореактора;

фиг.2 - продольный разрез цилиндрического снабжающего пространства с двумя фазами;

фиг.3 - концевые пластины снабжающего пространства, на виде сверху.

На фиг.1 показан вариант выполнения системы биореактора на основе цилиндрического снабжающего пространства 12. В снабжающем пространстве показана черными линиями ориентация, а не реальные размеры и действительное число расположенных в снабжающем пространстве половолоконных камер. Цилиндрический сосуд периодически приводится в движение в подходящем ритме с переменой направления движения с помощью вращающего устройства 23. Прохождение потока газовой фазы через снабжающее пространство обеспечивается с помощью газовой магистрали, которая состоит из участка 13 смешивания газов и увлажнителя 14 газа для подачи газа в цилиндр и из ловушки 15 для среды и ловушки 16 для загрязнений для отвода газов из цилиндра. Прохождение потока жидкой фазы через цилиндр обеспечивается с помощью магистрали питательной среды, которая состоит из резервуара для среды и насоса 17 для подачи среды, а также насоса 17 и сосуда 20 для собирания продукта для отвода из цилиндра. Кроме того, в магистраль отвода интегрирована линия 18 измерительных датчиков для измерения кислорода, величины рН и температуры. К сосуду 20 для собирания продукта подключен контур с насосом 21 и модулем 22 ультрафильтрации. Не содержащий продукта фильтрат из этого модуля ультрафильтрации отводится вниз и подается в отходы, в то время как концентрированный продукт подается обратно в сосуд для собирания продукта. Все элементы системы биореактора, начиная с подключения к участку смешивания газов, предпочтительно являются одноразовыми материалами. Насосы выполнены в виде шланговых насосов.

Как показано на фиг.2, цилиндрическое снабжающее пространство 12 содержит во время работы реактора в верхней зоне газовую фазу 5, а в нижней зоне - жидкую фазу 6, которые образуют поверхность 7 раздела фаз. Слева снабжающее пространство ограничено концевой пластиной 1 для подачи газа и питательной среды, а справа - концевой пластиной 2 для отвода. Газ проходит через проходы 3, 4 в концевых пластинах. Транспортировка питательной среды осуществляется через соответствующий расположенный центрально на оси вращения цилиндра проход 8, 9 в концевых пластинах. Отдельные культуральные камеры для клеток выполнены в виде одинаковых половолоконных мембран и показаны в снабжающем пространстве в виде параллельных черных линий. Введение клеточной суспензии осуществляется отдельно от снабжения газом и питательной средой через изображенные черными проходы 10 в концевых пластинах. Для равномерного посева клеток во всех половолоконных мембранах проходы заканчиваются в пространствах 11 распределения клеток, которые соединены с внутренним пространством каждой отдельной половолоконной мембраны.

На фиг.3 на виде сверху на подводящую концевую пластину 1 показана одна из использованных систем входов для газа (показаны в виде небольших кружков) и входа 8 для среды в снабжающее пространство. На виде сверху на отводящую концевую пластину 2 показаны центральный проход 9 для отвода продукта и использованная система проходов для отвода газа, которые изображены в виде небольших кружков. В этом примере в обе концевые пластины интегрированы по четыре изображенных черными точками прохода для высева клеточной суспензии, которые можно снабжать через объединенное шланговое соединение.

Для пояснения изобретения ниже приводится описание примеров выполнения, без ограничения изобретения этими примерами.

Примеры выполнения

Пример 1: клетки высокой плотности

Были построены две биореакторные системы по показанной на фиг.1 схеме. Цилиндрическое снабжающее пространство имело общий объем 14 л. Жидкая фаза в процессе составляла 7 л. В обоих случаях в снабжающем пространстве было расположено симметрично оси 144 половолоконных мембран с длиной 500 мм каждая. Посев клеток выполняли клетками с высокой плотностью в базовой среде PBG 1.0 с добавлением 0,02% человеческого сывороточного альбумина через посевные проходы в концевых пластинах во внутренних пространствах половолоконных мембран. Клеточная линия создает человеческий белок, который изолировали из избытка культуры с помощью способа одноступенчатой хроматографии и затем точно определяли его количество. Время культивирования составляло 10 и 23 дней. В течение этого времени через снабжающее пространство проходит поток газовой фазы в виде смеси воздуха и 5% СО₂. В целом было использовано соответственно 11 л за 10 дней, соответственно 24 л за 23 дня питательной среды для снабжения клеток во время проходов. Циклы экспонирования в жидкой, соответственно, газовой среде составляли в эксперименте по 30 секунд между сменами фаз. После выполнения культивирования клетки были собраны из половолоконных мембран через проходы для посева, и была определена плотность клеток и витальность. Белок был изолирован из аликвоты не содержащего клеток урожая продукта, и определено его количество. В таблице приведены достигнутая в половолоконных камерах культивирования плотность клеток и их витальность.

	Работа биореактора 1 (10 дней)	Работа биореактора 2 (23 дня)
Общее число клеток инокулума [Клетки на 1 мл культурального пространства]	1,5Е7	1,8Е7
Витальность инокулума (%)	67	80
Общее число клеток урожая	2,4Е7	2,25Е7
Витальность урожая (%)	54	29
Общее количество белка (мг)	48	168

В системе были получены высокие плотности клеток. Кроме того, во время процесса было образовано 48 мг и 168 мг белка и собрано в не содержащем клетки избытке культуры в соответствующем сосуде для сбора продукта.

Пример 2: клетки малой плотности

Клетки с плотностью живых клеток в количестве 1,3Е5 клеток на миллилитр культурального пространства были инокулированы в двух реакторах с экспонированием в двух фазах, содержащих каждый 12 половолоконных мембран длиной 200 мм, и в течение 4 дней культивировали с вращением пластмассового котла. Клетки из инокулума смешали с микроскопически малыми частицами геля из HAS. Замену питательной среды проводили не постоянно. Избирательность обмена веществ измеряли через расход глюкозы. Плотности клеток определяли после завершения работы посредством сбора урожая геля с находящимися на них клетками и подсчета через окраску синим трипаном. Была достигнута внутри короткого времени культивирования экспансия клеток до 6Е5 живых клеток на 1 мл культурального пространства (в 4,6 раза), соответственно 5Е5 живых клеток на 1 мл культурального пространства (в 3,8 раза).

Пример 3: принцип действия систем биореактора

Принцип снабжения биореактора основывается на том, что клетки попеременно находятся в питательной среде и в газовой смеси, и тем самым улучшается снабжение клеток кислородом по сравнению с обычными системами.

Пример 4: построение системы

Сердцевину биореактора образует цилиндрический пластмассовый котел, который установлен горизонтально. В этом сосуде натянуты по длине параллельно оси вращения половолоконные мембраны, как показано на фиг.2. За счет этого в цилиндре получаются два отделенных друг от друга мембранами пространства. Это, с одной стороны, окружающее половолоконные мембраны снабжающее пространство, которое состоит из жидкой фазы и газовой фазы. Поверхность раздела между этими обеими фазами показана на фиг.2 и 3. С другой стороны, это - пространство внутри каждой половолоконной мембраны. Сумма всех внутренних пространств полых волокон образует культуральное пространство для клеток. За счет числа расположенных симметрично оси вращения половолоконных мембран можно произвольно изменять масштаб системы. Оба пространства имеют отдельные входы и отделены друг от друга. Единственное соединение между снабжающим пространством и культуральным пространством образуют поры мембран. Эти поры с предпочтительным диаметром от 0,1 до 1,0 мг на 1 мл являются проницаемыми для небольших молекул и белков, но не для клеток. Непрерывный поток через систему газа, соответственно, жидкости обеспечивается показанным на фиг.1 и описанным полным устройством.

Кроме того, к системе биореактора относится блок аппаратного обеспечения, который содержит насосы, компрессоры, а также измерительные и регулировочные блоки. Дополнительно к этому этот блок содержит приводной двигатель и вращающее устройство, которое обеспечивает опору и вращение пластмассового котла.

Пример 5: принцип действия

Пластмассовый котел поворачивается с помощью вращающего устройства с согласованным с соответствующей клеточной линией циклом поворота вокруг оси вращения. Этот цикл поворота предпочтительно непрерывно повторяется в течение всей работы биореактора. Ниже приведены в качестве примера восемь фаз цикла поворота.

Фаза: поворот вправо на 180°

Фаза: остановка

Фаза: поворот вправо на 180°

Фаза: остановка

Фаза: поворот вправо на 180°

Фаза: остановка

Фаза: поворот влево на 180°

Фаза: остановка

Фаза: поворот влево на 180°

Фаза: остановка

В результате одного цикла вращения котел совершает полный оборот в одном направлении и полный оборот в противоположном направлении и находится снова в исходном положении. Смена направления поворота позволяет подавать потоки газа и питательной среды через неподвижно интегрированные в котле проходы, на которых зафиксированы пластмассовые шланги. За счет этого система в отличие от большинства биореакторов для клеток млекопитающих обходится без подвижных, ведущих в стерильную зону снабжения, соответственно культивирования конструктивных компонентов, таких как оси импеллеров или трубки подачи питательной среды, соответственно, газа. Таким образом, не возникает связанной с этим опасности загрязнения, а также затрат на защиту соответствующих поверхностей трения, например, с помощью двойных кольцевых уплотнений скольжения.

Конструкция и принцип действия одновременно обеспечивают, что независимо от числа находящихся в системе половолоконных мембран каждая отдельная мембрана в течение всей работы биореактора подвергается идентичным условиям экспонирования в обеих фазах. Экспонирование в газовой фазе служит, прежде всего, для снабжения кислородом, в то время как экспонирование в жидкой фазе служит, прежде всего, для приема растворенных питательных веществ и для отвода продуктов обмена веществ. Как питательную среду, так и газовую смесь можно подавать непрерывно.

Преимущества/новизна:

Котел с интегрированной системой удерживания клеток в качестве одноразового изделия.

Мембрана является проницаемой для белка для не содержащего клеток урожая.

Одинаковые условия экспонирования для каждой отдельной половолоконной мембраны в системе.

Короткие пути диффузии для кислорода при экспонировании в газовой фазе.

Отсутствие образования градиента в газовой фазе реактора с экспонированием по длине реактора.

Несколько распределенных соответствующим образом на концевых крышках газовых проходов, которые обеспечивают непрерывное прохождение потока газа также во время вращения.

Определения:

Клетки высокой плотности: культура с высокой плотностью клеток достигается при плотностях клеток более 1Е7 клеток на 1 мл культурального пространства.

Клетки малой плотности достигаются, когда плотность в культуральном пространстве лежит между 1Е4 и 1Е7 клеток на 1 мл культурального пространства.

Клетки минимальной плотности: культура с минимальной плотностью клеток достигается при плотностях клеток менее 1Е4 клеток на 1 мл культурального пространства.

Питательная среда: питательная среда является водным раствором, в котором содержатся существенные для клеток питательные вещества, например глюкоза, аминокислоты и микроэлементы.

Газовая смесь: газовая смесь в используемом здесь смысле означает предпочтительно смесь из воздуха и диоксида углерода с изменяемым соотношением смешивания. Дополнительно к этому понятие газовой смеси в данном значении означает также изменяемые соотношения смешивания азота, кислорода и диоксида углерода.

Перечень позиций

1 Подводящая концевая пластина

2 Отводящая концевая пластина

3, 4 Проходы для подачи и отвода газа

5 Газовая фаза

6 Жидкая фаза

7 Поверхность раздела фаз

8 Подвод питательной среды (центральный проход)

9 Центральный проход для отвода продукта

10 Проходы для культурального пространства

11 Пространства распределения клеток

12 Цилиндрическое снабжающее пространство

13 Участок смешивания газов

14 Увлажнитель газа

15 Ловушка для питательной среды

16 Ловушка для загрязнений

17, 19, 21 Насосы

22 Модуль ультрафильтрации

23 Вращающее устройство

1. Способ посева и культивирования клеток в биореакторе с экспонированием в жидкой и газовой фазах, содержащем снабжающее пространство, в котором находятся полые нитевые мембраны с внутренним диаметром не более 5 мм, и внутренние объемы которых образуют камеры культивирования, отличающийся тем, что он включает следующие стадии:

введения клеток в камеры для культивирования;

заполнения примерно половины пространства снабжения питательной средой, и другой половины газовой смесью;

одновременного или смещенного включения перфузии среды и газа;

циклического экспонирования полых нитевых мембран и находящихся в них клеток в газовой, соответственно жидкой фазе.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полые нитевые мембраны расположены в биореакторе горизонтально, после заполнения реактора половина мембран покрыта питательной средой, циклическое экспонирование полых нитевых мембран обеспечивается за счет поворота реактора на 360° в одном направлении, а затем в другом направлении.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что вращение выполняют двумя ступенями по 180°, которые отделены друг от друга изменяемо регулируемым временем остановки, так что каждая отдельная половолоконная мембрана находится одинаковое время в жидкой фазе и в газовой фазе.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что циклическое экспонирование обеспечивают посредством погружения полых нитевых мембран в питательную среду и последующего поднимания в газовую фазу.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в пространство для культивирования вводят клетки малой плотности и выращивают в клетки большой плотности.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в пространство для культивирования вводят клетки минимальной плотности вместе с гелями из сшитых полипептидов, которые имеют большую долю глутамина, и/или с полутвердыми средами из вязких жидкостей или жидкостей из микроскопически малых частиц геля.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки являются простейшими, бактериями, дрожжами, грибами, клетками растений или млекопитающих.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что введение клеток в камеры выполняют через центральную систему подачи снаружи снабжающего пространства, и что возможно одновременное (гомогенное) введение клеток во все камеры через одно соединение.

9. Устройство для посева и культивирования клеток в цилиндрическом или шарообразном (с возможностью подачи газа, соответственно питательной среды) двухфазном пространстве снабжения, в котором параллельно продольной оси цилиндрической оболочки фиксированы в концевых пластинах полимерные, удерживающие клетки микрофильтровальные полые нитевые мембраны с внутренним диаметром не более 5 мм, внутренние объемы которых образуют камеры культивирования, в которых находятся подлежащие культивированию клетки, отличающееся тем, что

пространство снабжения содержит газовую фазу в виде потока газовой смеси и жидкую фазу в виде потока питательной среды,

каждая полая нитевая мембрана имеет по длине цилиндра расстояние по меньшей мере 0,5 мм до смежной полой нитевой мембраны,

полые нитевые мембраны расположены симметрично относительно воображаемого сечения вдоль продольной оси цилиндра,

в плоскости воображаемого сечения вдоль продольной оси цилиндра мембраны не расположены.

10. Устройство по п.9, отличающееся тем, что каждая концевая пластина цилиндра имеет два соединения для входа и выхода газа, которые находятся каждое выше и ниже плоскости воображаемого сечения, так что обеспечивается возможность вращения снабжающего пространства с полыми нитевыми мембранами вокруг продольной оси при снабжении питательной средой и газом.

11. Устройство по любому из пп.9 или 10, отличающееся тем, что соединения для снабжения газом расположены не на головных поверхностях, а на цилиндрическом кожухе выше или ниже плоскости воображаемого сечения.

12. Устройство по п.9, отличающееся тем, что полые нитевые мембраны имеют толщину стенок мембраны менее 300 мкм, водопроницаемость более 6 м³/м²·ч·бар и диаметр пор от 0,1 до 1,0 мкм.

13. Устройство по п.9, отличающееся тем, что мембраны расположены в снабжающем пространстве гексагонально.

14. Устройство по п.9, отличающееся тем, что на головных поверхностях находятся по меньшей мере одно шланговое соединение для перфузии питательной среды и по меньшей мере один доступ в пространство культивирования.

15. Устройство по п.10, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит шланги, увлажнители газа, ловушку для среды в газовой магистрали, блок ультрафильтрации в магистрали сбора урожая продукта, блок аппаратного обеспечения, насосы, измерительные и регулировочные блоки, а также приводной двигатель и раму, которые обеспечивают опору и вращение устройства.

16. Применение устройства по любому из пп.9-15 для культивирования клеток с высокой плотностью и для получения клеточных продуктов, составляющих частей клеток, вирусов, белков или низкомолекулярных веществ.

17. Применение по п.16 для получения лекарственных средств.

18. Применение по любому из пп.16 или 17 для получения диагностических средств.