Способ лечения воспалительных состояний с помощью полипептида, содержащего собственные и чужеродные аминокислотные сегменты

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Способ предусматривает введение млекопитающему композиции, содержащей адъювант и полипептид, в условиях, которые индуцируют выработку анти-С5-ответа. Полипептид содержит собственный аминокислотный сегмент С5а и связывающийся с мальтозой белок. Способ позволяет лечить воспалительные состояния. Изобретение может быть использовано в области медицины. 6 з.п. ф-лы, 11 ил.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 60/430278, поданной 2 декабря 2002.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам и средствам для лечения воспалительных состояний.

Предшествующий уровень техники

Ревматоидный артрит (РА) представляет собой аутоиммунное воспалительное заболевание, которое поражает периферические суставы. Животные модели коллаген-индуцированного артрита позволили выявить определенные гены, ассоциированные с РА-состояниями. Был идентифицирован ген главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса II (Aq у мыши), который играет важную роль в инициации и поддержании РА-состояний. По своим функциям этот ген соответствует гену HLA-DR, DR*0401, человека, что дает основание предполагать, что это заболевание ассоциируется с Т-клеточно-опосредованным аутоиммунным распознаванием суставо-специфических антигенов.

Кроме того, было обнаружено, что гены, присутствующие в областях, находящихся за пределами ГКГ, также играют важную роль в инициации и поддержании РА-состояний. Одна из таких областей генов локализована на хромосоме 2 мыши и содержит ген, кодирующий фактор С5 комплемента. Одним из активных компонентов С5 является С5а, который высвобождается в процессе связывания комплемента с иммунными комплексами. Высвобождение С5а запускает несколько различных механизмов, которые приводят к ревматоидному воспалению. С5а, локально продуцируемый в воспаленном суставе, может связываться с рецепторами на макрофагах и нейтрофильных гранулоцитах, что приводит к инфильтрации воспалительных клеток в суставы. С5 играет также важную роль в комплемент-опосредованных процессах, таких как сепсис, ишемия миокарда/реперфузионное повреждение, респираторный дистресс-синдром взрослых, нефрит и отторжение трансплантата, а также в комплемент-опосредованных воспалительных состояниях, таких как ревматоидный артрит, астма, воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, артериосклероз и васкулиты.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и к средствам для лечения воспалительных состояний, таких как сепсис, ишемия миокарда/реперфузионное повреждение, респираторный дистресс-синдром взрослых, нефрит, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, астма, воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, артериосклероз и васкулиты у млекопитающих. В частности, настоящее изобретение относится к полипептидам, к выделенным нуклеиновым кислотам, к клеткам-хозяевам и к способам лечения воспалительных состояний. Полипептиды согласно изобретению могут быть иммуногенными. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к иммуногенным полипептидам, содержащим как собственные, так и чужеродные аминокислотные сегменты. Так, например, настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему собственный аминокислотный сегмент С5а и один или несколько чужеродных Т-клеточных эпитопов. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим иммуногенные полипептиды, которые могут быть использованы для лечения млекопитающего, страдающего воспалительным состоянием. Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные здесь полипептиды. Такие клетки-хозяева могут быть использованы, например, для продуцирования больших количеств кодируемых полипептидов.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к композиции, включающей в себя полипептид, где указанный полипептид содержит собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент и где длина указанного чужеродного сегмента составляет менее 350 аминокислот (например, менее 300 аминокислот; менее 250 аминокислот или менее 200 аминокислот). Введение полипептида млекопитающему может индуцировать выработку анти-С5-антитела у этого млекопитающего, причем геном указанного млекопитающего может включать в себя нуклеиновую кислоту, кодирующую собственный аминокислотный сегмент С5. Чужеродным аминокислотным сегментом может быть бактериальный аминокислотный сегмент (например, аминокислотный сегмент МВР). Чужеродным аминокислотным сегментом может быть аминокислотный сегмент С5. Такой чужеродный аминокислотный сегмент С5 может не встречаться в природе. Указанный чужеродный аминокислотный сегмент С5 может содержать по меньшей мере два Т-клеточных эпитопа. Указанным чужеродным аминокислотным сегментом может быть аминокислотный сегмент С5 позвоночных (например, млекопитающих). Этот чужеродный аминокислотный сегмент С5 позвоночных может содержать по меньшей мере два Т-клеточных эпитопа. Таким чужеродным аминокислотным сегментом может быть аминокислотный сегмент, вирусный аминокислотный сегмент или грибковый аминокислотный сегмент.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения млекопитающего (например, человека), страдающего воспалительным состоянием. Такой способ может предусматривать введение млекопитающему полипептида, способного индуцировать выработку анти-С5-антитела у млекопитающего, то есть полипептида, содержащего собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент, где геном указанного млекопитающего содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую собственный аминокислотный сегмент С5. Указанным воспалительным состоянием может быть сепсис, ишемия миокарда/реперфузионное повреждение, респираторный дистресс-синдром взрослых, нефрит, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, астма, воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, артериосклероз и/или васкулиты. Указанным полипептидом может быть МВР-С5а. Собственный аминокислотный сегмент С5 может содержать часть последовательности С5а. Чужеродный аминокислотный сегмент может содержать часть последовательности С5. Чужеродным аминокислотным сегментом может быть вирусный, бактериальный или грибковый аминокислотный сегмент, аминокислотный сегмент млекопитающего и/или аминокислотный сегмент, не встречающийся в природе. Чужеродный аминокислотный сегмент может содержать по меньшей мере два Т-клеточных эпитопа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей в себя полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент С5. Введение полипептида млекопитающему может индуцировать выработку анти-С5-антитела у этого млекопитающего, причем геном указанного млекопитающего может включать в себя нуклеиновую кислоту, кодирующую собственный аминокислотный сегмент С5. Чужеродным аминокислотным сегментом С5 может быть сегмент, не встречающийся в природе. Такой чужеродный аминокислотный сегмент С5 может содержать по меньшей мере два Т-клеточных эпитопа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей в себя полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент позвоночных. Введение такого полипептида млекопитающему может индуцировать выработку анти-С5-антитела у этого млекопитающего, при этом геном такого млекопитающего может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую собственный аминокислотный сегмент С5. Чужеродным аминокислотным сегментом позвоночных может быть аминокислотный сегмент млекопитающих. Чужеродный аминокислотный сегмент позвоночных может содержать по меньшей мере два Т-клеточных эпитопа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей в себя полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент, где длина такого чужеродного сегмента составляет менее чем 350 (например, менее чем 300, менее чем 250 или менее чем 200) аминокислотных остатков. Введение такого полипептида млекопитающему может индуцировать выработку анти-С5-антитела у этого млекопитающего, причем геном такого млекопитающего может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую собственный аминокислотный сегмент С5. Чужеродным аминокислотным сегментом может быть вирусный, бактериальный или грибковый аминокислотный сегмент, аминокислотный сегмент млекопитающего и/или аминокислотный сегмент, не встречающийся в природе. Такой чужеродный аминокислотный сегмент млекопитающих может содержать по меньшей мере два Т-клеточных эпитопа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей полипептид и адъювант, где указанный полипептид содержит собственный аминокислотный сегмент С5 и бактериальный аминокислотный сегмент. Указанным бактериальным аминокислотным сегментом может быть МВР.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей в себя полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и грибковый аминокислотный сегмент.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей в себя полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и вирусный аминокислотный сегмент.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент С5.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент позвоночных.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент, где длина такого чужеродного аминокислотного сегмента составляет менее чем 360 (например, менее чем 300, менее чем 250 или менее чем 200) аминокислотных остатков.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и бактериальный аминокислотный сегмент, где в указанном полипептиде между аминокислотным сегментом С5 и бактериальным аминокислотным сегментом отсутствует рестрикционный сайт фактора Ха. Указанным чужеродным бактериальным аминокислотным сегментом может быть МВР.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и грибковый аминокислотный сегмент.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и вирусный аминокислотный сегмент.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей (1) выделенную нуклеиновую кислоту, где указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент С5; (2) выделенную нуклеиновую кислоту, где указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент позвоночных; (3) выделенную нуклеиновую кислоту, где указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент, где длина такого чужеродного аминокислотного сегмента составляет менее чем 350 (например, менее чем 300, менее чем 250 или менее чем 200) аминокислотных остатков; (4) выделенную нуклеиновую кислоту, где указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный бактериальный аминокислотный сегмент; (5) выделенную нуклеиновую кислоту, где указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный грибковый аминокислотный сегмент; и/или (5) выделенную нуклеиновую кислоту, где указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный вирусный аминокислотный сегмент. Указанная клетка-хозяин может экспрессировать такой полипептид.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции для введения млекопитающему. Эта композиция может включать в себя полипептид, который содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5. Введение такого полипептида млекопитающему может индуцировать выработку анти-С5-антитела у этого млекопитающего, где геном указанного млекопитающего содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую собственный аминокислотный сегмент С5. Чужеродным аминокислотным сегментом С5 может быть сегмент, не встречающийся в природе. Чужеродный аминокислотный сегмент млекопитающих может содержать по меньшей мере два Т-клеточных эпитопа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции для введения млекопитающему, где указанная композиция включает в себя полипептид, который содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный для млекопитающего аминокислотный сегмент позвоночных. Введение этого полипептида млекопитающему может индуцировать выработку анти-С5-антитела у этого млекопитающего, где геном указанного млекопитающего содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую собственный аминокислотный сегмент С5. Чужеродным аминокислотным сегментом позвоночных может быть аминокислотный сегмент млекопитающих. Чужеродный аминокислотный сегмент позвоночных может содержать по меньшей мере два Т-клеточных эпитопа.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции для введения млекопитающему. Эта композиция может включать в себя полипептид, который содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный для млекопитающего аминокислотный сегмент, где длина такого чужеродного сегмента составляет менее чем 350 (например, менее чем 300, менее чем 250 или менее чем 200) аминокислотных остатков. Введение этого полипептида млекопитающему может индуцировать выработку анти-С5-антитела у этого млекопитающего, где геном указанного млекопитающего содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую собственный аминокислотный сегмент С5. Чужеродный аминокислотный сегмент может происходить от вируса, бактерии, грибка или млекопитающего. Таким чужеродным аминокислотным сегментом С5 может быть сегмент, не встречающийся в природе. Чужеродный аминокислотный сегмент млекопитающих может содержать по меньшей мере два Т-клеточных эпитопа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции для введения млекопитающему, включающей в себя полипептид и адъювант, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и бактериальный аминокислотный сегмент (например, МВР).

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции для введения млекопитающему, включающей в себя полипептид, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и грибковый аминокислотный сегмент.

Настоящее изобретение также относится к композиции для введения млекопитающему, включающей в себя полипептид, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и вирусный аминокислотный сегмент.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, где указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид для введения млекопитающему и где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный для этого млекопитающего аминокислотный сегмент С5.

Настоящее изобретение также относится к выделенной нуклеиновой кислоте, где указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид для введения млекопитающему и где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный для этого млекопитающего аминокислотный сегмент позвоночных.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, где указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид для введения млекопитающему, содержащий собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный для этого млекопитающего аминокислотный сегмент, где длина такого чужеродного аминокислотного сегмента составляет менее чем 350 (например, менее чем 300, менее чем 250 или менее чем 200) аминокислотных остатков.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид для введения млекопитающему, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и бактериальный аминокислотный сегмент и где в указанном полипептиде между аминокислотным сегментом С5 и бактериальным аминокислотным сегментом отсутствует рестрикционный сайт фактора Ха. Указанным бактериальным аминокислотным сегментом может быть МВР.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид для введения млекопитающему, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и грибковый аминокислотный сегмент.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид для введения млекопитающему, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и вирусный аминокислотный сегмент.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей (1) выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид для введения млекопитающему, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный для этого млекопитающего аминокислотный сегмент С5; (2) выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид для введения млекопитающему, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент позвоночных; (3) выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид для введения млекопитающему, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный для этого млекопитающего аминокислотный сегмент и где длина такого чужеродного аминокислотного сегмента составляет менее чем 350 (например, менее чем 300, менее чем 250 или менее чем 200) аминокислотных остатков; (4) выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид для введения млекопитающему, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный бактериальный аминокислотный сегмент; (5) выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид для введения млекопитающему, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный грибковый аминокислотный сегмент; и/или (6) выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид для введения млекопитающему, где указанный полипептид содержит собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный вирусный аминокислотный сегмент. Указанная клетка-хозяин может экспрессировать такой полипептид.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции для введения млекопитающему. Такая композиция может содержать полипептид, имеющий собственный для млекопитающего аминокислотный сегмент С5 и чужеродный для этого млекопитающего аминокислотный сегмент, где указанный собственный аминокислотный сегмент С5 по меньшей мере на 90% идентичен последовательности С5 млекопитающего.

Если это не определено особо, то все используемые здесь технические и научные термины имеют общепринятые значения, известные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя для осуществления и для проведения тестов согласно изобретению могут быть использованы способы и материалы, аналогичные и эквивалентные описанным здесь способам и материалам, однако подходящие способы и материалы будут описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие цитируемые здесь работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В случае возникновения конфликтной ситуации она может быть урегулирована в соответствии с представленным описанием, включая определения. Кроме того, описанные здесь материалы, способы и примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение изобретения.

Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего описания графического материала, подробного описания и формулы изобретения.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 представлена ДНК-последовательность мышиного про-С5 (SEQ ID NO:1).

На фиг.2 представлена аминокислотная последовательность мышиного про-С5, включая сигнальный пептид (SEQ ID NO:2).

На фиг.3 представлена диаграмма, где схематически показан нуклеиновокислотный вектор, сконструированный для экспрессии гибридного полипептида, содержащего связывающийся с мальтозой белок(МВР) и мышиный С5а.

На фиг.4 представлена последовательность нуклеиновой кислоты ПЦР-продукта МВР-С5а (SEQ ID NO:3).

На фиг.5 представлена аминокислотная последовательность гибридного полипептида МВР-С5а (SEQ ID NO:4).

На фиг.6 представлен график заболеваемости коллаген-индуцированным артритом у контрольных мышей (незаштрихованные ромбы) и у мышей, вакцинированных гибридным полипептидом МВР-С5а (заштрихованные кружки). *р<0,05; ** р<0,01; *** р<0,005.

На фиг.7 представлен график средней оценки артрита у контрольных мышей с коллаген-индуцированным артритом (незаштрихованные кружки) и у мышей, вакцинированных гибридным полипептидом МВР-С5а (заштрихованные кружки). *р<0,05; ** р<0,01; *** р<0,005.

На фиг.8 представлен график средней максимальной оценки артрита у контрольных мышей с коллаген-индуцированным артритом и у мышей, вакцинированных гибридным полипептидом МВР-С5а. ** р<0,01.

На фиг.9 представлен график площади под кривой, построенной по данным оценки артрита, полученным для мышей, которым был инъецирован коллаген и которые затем были обработаны PBS (контроль) или гибридным полипептидом МВР-С5а. *** р<0,005.

На фиг.10 представлен график процента заболеваемости хроническим коллаген-индуцированным артритом контрольных мышей (заштрихованные кружки) и мышей, вакцинированных гибридным полипептидом МВР-С5а (незаштрихованные ромбы). *р<0,05; ** р<0,01.

На фиг.11 представлен график средней оценки хронического коллаген-индуцированного артрита у контрольных мышей с коллаген-индуцированным артритом (заштрихованные кружки) и у мышей, вакцинированных гибридным полипептидом МВР-С5а (незаштрихованные кружки). *р<0,05.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и материалам для лечения воспалительных состояний. Используемый здесь термин "воспалительное состояние" означает заболевание, патологическое состояние, синдром или другое состояние, приводящее к воспалению. Так, например, воспалительными состояниями являются ревматоидный артрит и астма. Другими примерами воспалительных состояний являются, не ограничиваются ими, сепсис, ишемия миокарда/реперфузионное повреждение, респираторный дистресс-синдром взрослых, нефрит, отторжение трансплантата, воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, артериосклероз и васкулиты. Настоящее изобретение относится к полипептидам, к выделенным нуклеиновым кислотам, к клеткам-хозяевам и к способам индуцирования гуморального ответа у млекопитающего против антигена, такого как С5 или С5а. Так, например, описанные здесь способы и материалы могут быть использованы для подавления эффектов С5а у млекопитающего путем снижения общего количества С5а и/или С5а, связанного с рецептором.

Полипептиды

Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые могут быть использованы для лечения воспалительного состояния. Такие полипептиды могут быть иммуногенными. "Иммуногенный" полипептид представляет собой любой полипептид, который эффективно индуцирует гуморальный ответ у млекопитающего. Так, например, иммуногенным полипептидом может быть полипептид, который эффективно индуцирует выработку антитела против собственного С5 у млекопитающего.

Полипептиды согласно изобретению могут содержать по меньшей мере один аминокислотный сегмент, рассматриваемый как чужеродный для данного млекопитающего, которому вводят такой полипептид. Так, например, полипептид, который индуцирует выработку антитела против собственного С5, может содержать собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент (например, чужеродный аминокислотный сегмент С5). Собственный аминокислотный сегмент С5 может обеспечивать специфичность гуморального ответа путем выработки антитела против собственного С5, а чужеродный аминокислотный сегмент может усиливать иммуногенность данного полипептида. Чужеродный аминокислотный сегмент (например, чужеродный аминокислотный сегмент С5) может содержать по меньшей мере два Т-клеточных эпитопа. Альтернативно, чужеродный аминокислотный сегмент может стабилизировать иммуногенный полипептид так, чтобы он индуцировал выработку специфического антитела против собственного С5. Собственный аминокислотный сегмент С5 полипептида может представлять собой часть С5, которая непосредственно взаимодействует с рецептором для С5а. Примерами таких собственных аминокислотных сегментов С5 являются, не ограничиваются ими, С5а или фрагменты С5а. Кроме того, собственным аминокислотным сегментом С5 полипептида может быть часть С5, которая опосредованно влияет на взаимодействие С5а с С5а-рецептором. Так, например, полипептид, содержащий последовательность С5, распознаваемую С5-конвертазой, может индуцировать выработку антител, которые связываются с последовательностью С5, распознаваемой С5-конвертазой, и, тем самым, ингибировать превращение С5 в С5а под действием С5-конвертазы.

Используемый здесь термин "аминокислотный сегмент" означает фрагмент полипептида из непрерывно следующих друг за другом аминокислот. Так, например, аминокислотные остатки 30-40, присутствующие в полипептиде, состоящем из 100 аминокислот, рассматриваются как аминокислотный сегмент. Аминокислотный сегмент может иметь любую длину, составляющую более чем восемь аминокислотных остатков (например, более чем примерно 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 или более аминокислотных остатков). Так, например, аминокислотным сегментом может быть С5, вся область С5а в С5 или часть С5а. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный сегмент может иметь длину менее чем 1000 аминокислотных остатков (например, менее чем 500, менее чем 400, менее чем 300, менее чем 200 или менее чем 100 аминокислотных остатков). В других вариантах осуществления изобретения аминокислотный сегмент может иметь длину примерно от 20 до 200 аминокислотных остатков (например, примерно от 30 до 180 аминокислотных остатков или примерно от 40 до 150 аминокислотных остатков).

Термин "собственный", используемый здесь по отношению к аминокислотному сегменту, присутствующему у конкретного млекопитающего, обычно означает любой аминокислотный сегмент, который является собственным для данного млекопитающего. Если аминокислотный сегмент происходит от члена одного вида и вводится другому члену того же самого вида, который по своей природе имеет этот аминокислотный сегмент, то указанный конкретный аминокислотный сегмент рассматривается как собственный аминокислотный сегмент. Так, например, аминокислотный сегмент С5, происходящий от мыши и вводимый той же самой мыши, то есть генетически идентичной мыши или генетически неидентичной мыши, которая по своей природе имеет тот же самый аминокислотный сегмент, представляет собой собственный аминокислотный сегмент С5.

Термин "чужеродный", используемый здесь по отношению к аминокислотному сегменту конкретного млекопитающего, обычно означает любой аминокислотный сегмент, который в природе не присутствует у данного млекопитающего. Если аминокислотный сегмент происходит от млекопитающего одного вида и вводится млекопитающему другого вида, который по своей природе не содержит этот аминокислотный сегмент, то указанный аминокислотный сегмент может рассматриваться как чужеродный аминокислотный сегмент для этого млекопитающего. Так, например, аминокислотный сегмент С5, происходящий от мыши, может рассматриваться как чужеродный аминокислотный сегмент С5 при его введении человеку. В другом примере, если полипептид содержит аминокислотный сегмент С5а, происходящий от мыши, и аминокислотный сегмент С5b, происходящий от человека, и если он вводится мыши, то такой аминокислотный сегмент С5а может рассматриваться как собственный аминокислотный сегмент С5а, а аминокислотный сегмент С5b может рассматриваться как чужеродный аминокислотный сегмент С5b. Альтернативно, если тот же самый полипептид вводится человеку, то аминокислотный сегмент С5а может рассматриваться как чужеродный аминокислотный сегмент С5а, а аминокислотный сегмент С5b может рассматриваться как собственный аминокислотный сегмент С5b. Если аминокислотный сегмент, происходящий от члена одного вида, считается полиморфным по отношению к другому члену того же самого вида, то указанный аминокислотный сегмент может рассматриваться как чужеродный аминокислотный сегмент для члена того вида, который не обладает таким полиморфизмом. Так, например, если аминокислотный сегмент С5, происходящий от человека, имеющего один тип полиморфизма в таком аминокислотном сегменте, вводят другому человеку, который не обладает таким конкретным типом полиморфизма, то такой аминокислотный сегмент С5 может рассматриваться как чужеродный аминокислотный сегмент для указанного другого человека. Следует также отметить, что криптические Т-клеточные эпитопы (то есть собственные пептиды, которые в нормальных условиях не экспрессируются на молекулах ГКГ на уровне, необходимом для их распознавания Т-клетками) могут рассматриваться как чужеродные.

Чужеродные и собственные аминокислотные сегменты могут происходить от одинаковых или различных природных полипептидов. Так, например, если полипептид содержит собственный аминокислотный сегмент, происходящий от человеческого С5, то чужеродный аминокислотный сегмент может происходить либо от полипептида того же самого типа (например, крысиного С5), либо от полипептида другого типа (например, крысиного альбумина). В другом примере полипептид может содержать собственный аминокислотный сегмент С5а и один или несколько чужеродных Т-клеточных эпитопов, представленных МВР. Кроме того, аминокислотный сегмент может происходить от полипептида любого типа, включая, не ограничиваясь ими, бактериальный полипептид (например, МВР), грибковый полипептид, вирусный полипептид или полипептид млекопитающего.

Собственный сегмент или сегменты описанных здесь полипептидов обычно по меньшей мере на 90 процентов (например по меньшей мере на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентов) идентичны последовательности полипептида, присутствующего у млекопитающего, которому вводят указанный полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения собственный сегмент может быть на 100 процентов идентичен последовательности полипептида, присутствующего у млекопитающего, которому вводят указанный полипептид. Таким образом, настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотный сегмент, имеющий (1) соответствующую длину и (2) определенный процент идентичности эталонной аминокислотной последовательности (например, аминокислотной последовательности, происходящей от конкретного млекопитающего) по всей длине. Настоящее изобретение также относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотный сегмент, имеющий (1) соответствующую длину и (2) определенный процент идентичности эталонной аминокислотной последовательности млекопитающего по всей длине. Обычно аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты млекопитающего называется эталонной последовательностью, а аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, которая сравнивается с этой последовательностью млекопитающего, называются целевой последовательностью. Так, например, последовательность млекопитающего может быть эталонной последовательностью, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO:2.

Длину и процент идентичности по всей длине для любой аминокислотной последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты определяют, как описано ниже. Сначала аминокислотную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты сравнивают с аминокислотной последовательностью или с последовательностью нуклеиновой кислоты млекопитающего, которому вводят указанные последовательности, с использованием программы BLAST 2 Sequence (B12seq) из автономной версии BLASTZ, в которую входят BLASTN, версия 2.0.14, и BLASTP, версия 2.0.14. Эта автономная версия BLASTZ может быть взята в Интернете на Web-сайте Fish & Richardson's (www:fr.com/blast), в Интернете на Web-сайте Государственного Национального Центра биотехнологической информации США (www:ncbi.nlm.nih.gov) или в библиотеке Old Westbury Университета штата Нью-Йорк (QH 497.m6714). Инструкции по работе с программой B12seq можно найти в файле "read me", имеющемся в BLASTZ.

Программа B12seq позволяет проводить сравнение двух последовательностей с использованием алгоритма BLASTN или BLASTP. BLASTN используется для сравнения последовательностей нуклеиновой кислоты, а BLASTP используется для сравнения аминокислотных последовательностей. Для сравнения двух последовательностей нуклеиновой кислоты выбирают следующие параметры: -i присваивается файлу, содержащему первую сравниваемую последовательность нуклеиновой кислоты (например, C:\seq1.txt); -j присваивается файлу, содержащему вторую сравниваемую последовательность нуклеиновой кислоты (например, C:\seq2.txt); -р присваивается blastn; -о присваивается любому нужному имени файла (например, C:\output.txt); -q присваивается -1; -r присваивается -2, а все остальные параметры используются по умолчанию. Так, например, для создания выходного файла для сравнения двух последовательностей могут быть использованы следующие команды: C:\B12seq -i с:\seq1.txt -j с:\seq2.txt -р blastn -о с:\output.txt -q -1 -r 2. Для сравнения двух аминокислотных последовательностей выбирают следующие параметры В12seq: -i присваивается файлу, содержащему первую сравниваемую аминокислотную последовательность (например, C:\seq1.txt); -j присваивается файлу, содержащему вторую сравниваемую аминокислотную последовательность (например, C:\seq2.txt); -р присваивается blastp; -о присваивается любому нужному имени файла (например, C:\output.txt), а все остальные параметры используются по умолчанию. Так, например, для создания выходного файла в целях сравнения двух аминокислотных последовательностей может быть использована следующая команда: C:\B12seq-i с:\seq1.txt -j с:\seq2.txt -р blastp -о с:\output.txt. Если целевая последовательность имеет гомологию с любой частью последовательности млекопитающего, то в созданном выходном файле эти области гомологии представлены в виде выровненных последовательностей. Если целевая последовательность не имеет гомологии с любой частью последовательности млекопитающего, то этот созданный выходной файл не будет представлять выровненные последовательности.

После выравнивания длину определяют путем подсчета числа непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов или аминокислотных остатков целевой последовательности, представленной путем выравнивания с последовательностью млекопитающего. Совпадающим положением является любое положение, где идентичный нуклеотид или аминокислотный остаток присутствует как в целевой последовательности, так и в последовательности млекопитающего. "Пробелы", имеющиеся в целевой последовательности, не подсчитывают, поскольку эти пробелы не являются нуклеотидами или аминокислотными остатками. Аналогичным образом пробелы, присутствующие в последовательности млекопитающего, не учитывают, поскольку необходимо подсчитывать только нуклеотиды или аминокислотные остатки целевой последовательности, а не нуклеотиды или аминокислотные остатки последовательности млекопитающего.

Процент идентичности по всей определяемой длине последовательностей определяют путем подсчета числа совпадающих положений по всей длине, деления этого числа на длину и умножения полученного результата на 100. Так, например, (1) если целевую последовательность, состоящую из 300 аминокислот, сравнивают с эталонной последовательностью, (2) если программа В12seq представляет 200 непрерывно следующих друг за другом аминокислот целевой последовательности, сопоставляемой с областью эталонной последовательности, и (3) если число совпадений по этим 200 выровненным аминокислотами равно 180, то целевая последовательность из 300 аминокислот содержит аминокислотный сегмент, длина которого равна 200, а процент идентичности по всей длине составляет 90 (то есть 180: 200 х 100 = 90).

При этом следует отметить, что процент идентичности последовательностей округляется в зависимости от величины ближайшего десятичного знака. Так, например, 75,11; 75,12; 75,13 и 75,14 округляется до 75,1, а 75,15; 75,16; 75,17; 75,18 и 75,19 округляется до 75,2. Следует также отметить, что длина всегда выражается целым числом.

Чужеродный сегмент или чужеродные сегменты описанных здесь полипептидов обычно менее чем на 95 процентов (например, менее, чем на 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 или 50 процентов) идентичны последовательности полипептида, имеющегося у млекопитающего, которому вводят данный полипептид.

Для получения полипептида может быть применен любой метод, включая, например, экспрессию в прокариотических системах, экспрессию в эукариотических системах и химический синтез. Для очистки полипептида может быть применен любой метод, включая, не ограничиваясь ими, фракционирование, центрифугирование и хроматографию. Так, например, полипептиды, содержащие связывающийся с мальтозой белок (МВР), может быть очищен с помощью аффинной хроматографии на амилозе.

Нуклеиновые кислоты

Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, такие как описанные здесь полипептиды (например, полипептиды, содержащие собственный и чужеродный аминокислотные сегменты). Так, например, нуклеиновая кислота согласно изобретению может кодировать полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. Альтернативно, нуклеиновая кислота может кодировать полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую часть последовательности, представленной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления изобретения описанная здесь нуклеиновая кислота может кодировать полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4. Выделенная нуклеиновая кислота также может кодировать полипептид, содержащий собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент (например, чужеродный аминокислотный сегмент С5 или чужеродный аминокислотный сегмент позвоночных, бактериальный аминокислотный сегмент, грибковый аминокислотный сегмент или вирусный аминокислотный сегмент). Собственный сегмент, кодируемый выделенной нуклеиновой кислотой, может содержать аминокислотный сегмент (например, аминокислотный сегмент С5), который по меньшей мере на 90% (например по меньшей мере на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 процентов) идентичен аминокислотной последовательности полипептида, присутствующего у млекопитающего, которому вводят данный полипептид. Чужеродный сегмент, кодируемый выделенной нуклеиновой кислотой, может содержать аминокислотный сегмент, который по меньшей мере на 95% (менее чем на 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 или 50 процентов) идентичен аминокислотной последовательности полипептида, присутствующего у млекопитающего, которому вводят данный полипептид.

Используемый здесь термин "нуклеиновая кислота" охватывает как РНК, так и ДНК, включая кДНК, геномную ДНК и синтетическую (например, химически синтезированную) ДНК. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной или одноцепочечной. Если нуклеиновая кислота является одноцепочечной, то она может иметь смысловую цепь или антисмысловую цепь. Кроме того, нуклеиновая кислота может быть кольцевой или линейной.

Используемый здесь термин "выделенный", относящийся к нуклеиновой кислоте, означает, что данная природная нуклеиновая кислота не является непосредственно смежной с одной или обеими последовательностями, с которыми она непосредственно граничит (то есть со стороны 5'-конца и со стороны 3'-конца) в природном геноме организма, от которого она происходит. Так, например, выделенной нуклеиновой кислотой могут быть, не ограничиваются ими, рекомбинантная ДНК любой длины, при условии, что одна из последовательностей нуклеиновой кислоты, обычно непосредственно фланкирующая эту рекомбинантную ДНК в природном геноме, удалена или отсутствует. Так, например, выделенной нуклеиновой кислотой являются, не ограничиваются ими, рекомбинантная ДНК, которая не связана с другими последовательностями (например, кДНК или фрагмент геномной ДНК, продуцированные с помощью ПЦР или путем обработки рестрицирующей эндонуклеазой), а также рекомбинантная ДНК, которую вводят в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду, в вирус (например, ретровирус, аденовирус или герпесвирус), или в геномную ДНК прокариота или эукариота. Кроме того, выделенная нуклеиновая кислота может включать в себя рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридной или лигированной последовательности нуклеиновой кислоты.

Используемый здесь термин "выделенная нуклеиновая кислота" также означает любую неприродную нуклеиновую кислоту, поскольку последовательности неприродной нуклеиновой кислоты не обнаруживаются в природе и не могут иметь непосредственно смежные последовательности в природном геноме. Так, например, неприродная нуклеиновая кислота, такая как сконструированная нуклеиновая кислота, рассматривается как выделенная нуклеиновая кислота. Сконструированная нуклеиновая кислота может быть получена стандартными методами молекулярного клонирования или химического синтеза нуклеиновых кислот. Выделенная неприродная нуклеиновая кислота может не ассоциироваться с другими последовательностями, либо она может быть включена в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду, в вирус (например, ретровирус, аденовирус или герпесвирус) или в геномную ДНК прокариота или эукариота. Кроме того, неприродная нуклеиновая кислота может включать в себя нуклеиновую кислоту, которая является частью гибридной или лигированной последовательности нуклеиновой кислоты.

Нуклеиновая кислота, присутствующая среди нескольких сотен, а то и миллионов других нуклеиновых кислот, например, в кДНК или геномных библиотеках или в гелевых срезах, содержащих рестрикционный гидролизат геномной ДНК, не может рассматриваться как изолированная нуклеиновая кислота.

Термин "чужеродный", используемый здесь по отношению к нуклеиновой кислоте и к конкретной клетке, относится к любой нуклеиновой кислоте, которая не происходит от конкретной клетки, существующей в природе. Таким образом, любая неприродная нуклеиновая кислота рассматривается как чужеродная для клетки после ее введения в эту клетку. Важно отметить, что неприродная нуклеиновая кислота может содержать последовательности нуклеиновой кислоты или фрагменты последовательностей нуклеиновой кислоты, встречающиеся в природе, при условии, что указанная нуклеиновая кислота в целом не существует в природе. Так, например, нуклеиновая кислота, содержащая геномную ДНК-последовательность в экспрессирующем векторе, является неприродной нуклеиновой кислотой, а поэтому она является чужеродной для клетки после ее введения в эту клетку, поскольку эта нуклеиновая кислота в целом (геномная ДНК плюс векторная ДНК) не существует в природе. Таким образом, любой вектор, автономная реплицирующаяся плазмида или вирус (например, ретровирус, аденовирус или герпесвирус), который в целом не существуют в природе, рассматриваются как неприродная нуклеиновая кислота. Из этого следует, что геномные ДНК-фрагменты, продуцируемые с помощью ПЦР или путем обработки рестрицирующей эндонуклеазой, а также кДНК, считаются неприродными нуклеиновыми кислотами, поскольку они присутствуют в виде отдельных молекул, не существующих в природе. Также очевидно, что любая нуклеиновая кислота, содержащая промоторную последовательность и полипептидкодирующую последовательность (например, кДНК или геномную ДНК) в таком порядке, в котором они не встречаются в природе, также является неприродной нуклеиновой кислотой.

Нуклеиновая кислота, встречающаяся в природе, может быть чужеродной для конкретной клетки. Так, например, вся хромосома, выделенная из клетки индивидуума Х, является чужеродной нуклеиновой кислотой для клетки индивидуума Y после введения этой хромосомы в клетку индивидуума Y.

Выделенные нуклеиновые кислоты могут быть получены любым методом, включая, не ограничиваясь ими, общий метод молекулярного клонирования и метод химического синтеза нуклеиновых кислот. Так, например, для получения выделенной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, имеющей сходство с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1, может быть использована ПЦР. ПЦР представляет собой процедуру или методику осуществления амплификации нужной нуклеиновой кислоты, описанную в патенте США № 4683195, с последующей модификацией данной процедуры, описанной в этом патенте. В общих чертах, информацию о концевых последовательностях представляющей интерес области или последовательностей, находящихся за ее пределами, используют для создания олигонуклеотидных праймеров, которые являются идентичными или аналогичными последовательности противоположных цепей потенциальной амплифицируемой матрицы. С использованием ПЦР последовательность нуклеиновой кислоты может быть амплифицирована из РНК или ДНК. Так, например, последовательность нуклеиновой кислоты может быть выделена путем ПЦР-амплификации из полноразмерной клеточной РНК, полноразмерной ДНК или кДНК, а также из бактериофаговых последовательностей, плазмидных последовательностей, вирусных последовательностей и т.п. С применением РНК в качестве источника матрицы для синтеза комплементарных ДНК-цепей может быть использована обратная транскриптаза.

Выделенные нуклеиновые кислоты могут быть также получены путем мутагенеза. Так, например, выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, может быть подвергнута мутации с использованием техники молекулярного клонирования (например, сайт-направленного мутагенеза). Возможными мутациями являются, не ограничиваются ими, делеции, инсерции и замены, а также комбинации делеций, инсерций и замен.

Кроме того, для получения выделенной нуклеиновой кислоты могут быть использованы базы данных нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей (например, GenBank®). Так, например, любая последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая определенную гомологию с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1, или любая аминокислотная последовательность, имеющая определенную гомологию с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2, может быть использована в качестве запрашиваемой последовательности для поиска в GenBank®.

Кроме того, для получения выделенной нуклеиновой кислоты могут быть использованы методы гибридизации нуклеиновых кислот. Вкратце, любая нуклеиновая кислота, имеющая определенную гомологию с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1, может быть использована в качестве зонда для идентификации аналогичной нуклеиновой кислоты путем гибридизации в условиях умеренной или высокой жесткости. После идентификации нуклеиновая кислота может быть очищена, секвенирована и проанализирована на предмет определения того, входит ли описанная здесь последовательность в объем настоящего изобретения.

Гибридизация может быть осуществлена с помощью Саузерн-анализа или Нозерн-анализа для идентификации ДНК- или РНК-последовательности, соответственно, которые гибридизуются с зондом. Этот зонд может быть помечен биотином, дигоксигенином, ферментом или радиоизотопом, таким как ³²Р. Анализируемая ДНК или РНК могут быть разделены путем электрофореза в агарозном или в полиакриламидном геле, перенесены на нитроцеллюлозную, найлоновую или другую подходящую мембрану и подвергнуты гибридизации с зондом стандартными методами, хорошо известными специалистам, такими как методы, описанные в разделах 7,39-7,52 Sambrook et al.,(1989), Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY.

Кроме того, для прямой транскрипции или трансляции конкретной выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, может быть использован любой метод. Такими методами являются, не ограничиваются ими, конструирование нуклеиновой кислоты, так, чтобы регуляторный элемент стимулировал экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Типичными регуляторными элементами являются ДНК-последовательности, регулирующие экспрессию других ДНК-последовательностей на транскрипционном уровне. Такими регуляторными элементами являются, не ограничиваются ими, промоторы, энхансеры и т.п.

Клетки-хозяева

Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим по меньшей мере одну описанную здесь выделенную нуклеиновую кислоту. Такими клетками могут быть прокариотические клетки или эукариотические клетки. Следует отметить, что клетки, содержащие выделенную нуклеиновую кислоту, входящую в объем настоящего изобретения, необязательно должны экспрессировать полипептид. Кроме того, выделенная нуклеиновая кислота может быть интегрирована в геном клетки, либо она может поддерживаться в эписоме. Таким образом, клетки-хозяева могут быть стабильно или транзитно трансфицированы конструкцией, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту согласно изобретению.

Описанные здесь клетки-хозяева могут содержать чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид. Так, например, клетки могут содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент. Кроме того, клетки-хозяева могут экспрессировать кодируемый полипептид.

Для введения выделенной нуклеиновой кислоты в клетку in vivo или in vitro может быть использован любой метод. Так, например, общеизвестными методами, которые могут быть использованы для введения выделенной нуклеиновой кислоты в клетку, являются преципитация фосфатом кальция, электропорация, тепловой шок, липофекция, микроинъекция и опосредуемый вирусом перенос нуклеиновой кислоты. Кроме того, "оголенная" ДНК может быть непосредственно доставлена в клетку in vivo методами, описанными в литературе (см., например, патенты США №№ 5580859 и 5589466 и их продолжение). Кроме того, выделенные нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетки путем генерирования трансгенных животных.

Трансгенными животными могут быть водные животные (такие как рыбы, акулы, дельфины и т.п.), сельскохозяйственные животные (такие как свиньи, козы, овцы, коровы, лошади, кролики и т.п.), грызуны (такие как мыши, морские свинки и крысы), приматы, за исключением человека (такие как павианы, мартышки и шимпанзе) и домашние животные (такие как собаки и кошки). Для введения выделенных нуклеиновых кислот животным в целях продуцирования родительских линий трансгенных животных может быть использовано несколько методов, известных специалистам. Такими методами являются, не ограничиваются ими, пронуклеарная микроинъекция (патент США № 4873191); опосредуемый ретровирусом перенос генов в зародышевые линии (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:6148 (1985)); трансфекция генов в эмбриональные стволовые клетки (Gossler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:9065-9069 (1986)); доставка генов в эмбриональные стволовые клетки (Thompson et al., Cell, 56:313 (1989)); перенос соматических ядер (в безъядерную клетку) (Schnieke et al., Science 278:2130-2133 (1997)) и электропорация эмбрионов (Lo, Mol.Cell.Biol., 3:1803-1814 (1983)). После получения трансгенных животных последние могут быть репродуцированы путем традиционного разведения или путем клонирования.

Для идентификации клеток, содержащих выделенную нуклеиновую кислоту согласно изобретению, может быть использован любой метод. Такими методами являются, не ограничиваются ими, ПЦР и методы гибридизации нуклеиновых кислот, такие как Нозерн- и Саузерн-анализы. В некоторых случаях для определения присутствия в клетке конкретной выделенной нуклеиновой кислоты путем детекции экспрессии полипептида, кодируемого конкретной нуклеиновой кислотой, могут быть использованы иммуногистохимические и биохимические методы.

Способы лечения воспалительных состояний

Полипептиды согласно изобретению могут быть использованы в целях изготовления лекарственного средства или композиции для лечения воспалительных состояний. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам лечения воспалительных состояний. Такими способами являются, не ограничиваются ими, введение композиции млекопитающему. Композиция может содержать полипептид, действующий как антиген, против которого желательно продуцировать иммунный ответ. Кроме того, композиция может содержать более чем один полипептид или любую комбинацию различных полипептидов. Так, например, композиция может содержать как вирусный полипептид, так и полипептид млекопитающего. Следует отметить, что каждый полипептид в данной композиции может иметь идентичную аминокислотную последовательность. Кроме того, полипептиды в такой композиции могут содержать различные аминокислотные сегменты, каждый из которых может действовать как определенная антигенная единица, против которой желательно продуцировать иммунный ответ. Так, например, полипептиды в такой композиции могут содержать различные аминокислотные сегменты, соответствующие любой области полипептида, включая, не ограничиваясь ими, области, связывающиеся с рецептором, области, связывающиеся с лигандом, активные центры ферментов, сайты расщепления полипептидных субстратов ферментами, антигенсвязывающие области антител и эпитопы, распознаваемые антителами. Так, например, полипептиды в такой композиции могут содержать три различных аминокислотных сегмента, каждый из которых соответствует последовательности С5, узнаваемой С5-конвертазой. Кроме того, различные или идентичные аминокислотные сегменты могут быть расположены либо тандемно, либо они могут быть разбросаны по всей длине одного и того же полипептида. Обычно введение полипептида приводит к продуцированию антител, обладающих специфичностью в отношении эпитопа или к комбинации эпитопов, образованных аминокислотными сегментами, содержащимися в одном или нескольких полипептидах, присутствующих в данной композиции.

Композиция может содержать выделенную нуклеиновую кислоту, сконструированную так, чтобы при введении в клетку-хозяина она экспрессировала конкретный полипептид. Так, например, выделенная нуклеиновая кислота может быть сконструирована так, чтобы она кодировала полипептид, имеющий собственный аминокислотный сегмент С5а и один или несколько чужеродных Т-клеточных эпитопов. После конструирования выделенная нуклеиновая кислота может быть введена в клетку-хозяина так, чтобы в ней экспрессировался кодируемый полипептид. Для этих целей может быть использована любая клетка-хозяин, включая, не ограничиваясь ими, прокариотические клетки (например, бактерии) и эукариотические клетки (например, клетки человека). После продуцирования данный полипептид может быть очищен и использован для вакцинации млекопитающего. Альтернативно, композиция, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту, сконструированную для экспрессии конкретного полипептида, может быть введена млекопитающему так, чтобы указанный полипептид экспрессировался in vivo.

Композиция может быть получена путем объединения любых описанных здесь полипептидов (например, иммуногенных полипептидов) или выделенных нуклеиновых кислот (например, нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногенные полипептиды) с фармацевтически приемлемым носителем. Такими носителями могут быть, не ограничиваясь ими, стерильные водные или безводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами безводных растворителей являются минеральное масло, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла и органические сложные эфиры для инъекций. Водными носителями являются, не ограничиваясь ими, вода, спирт, физиологический раствор и буферные растворы. В композициях могут также присутствовать консерванты, отдушки и другие добавки, такие, например, как противомикробные агенты, антиоксиданты, хелатобразующие агенты, инертные газы и т.п. Следует также отметить, что любой описанный здесь материал, вводимый млекопитающему, может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

Композиция может также включать в себя адъювант. "Адъювант" представляет собой иммунологическое соединение, которое может усиливать иммунный ответ против конкретного антигена, такого как полипептид. Адъюванты, например, такие как квасцы и другие соединения на основе алюминия (например, Al₂O₃), могут быть объединены с полипептидом, содержащим собственный аминокислотный сегмент (например, собственный аминокислотный сегмент С5), с получением композиции, которая при ее введении млекопитающему продуцирует антитело против собственного антигена. Соединения на основе алюминия могут быть закуплены у различных коммерческих поставщиков. Так, например, адъюванты REHYDRAGEL^® могут быть получены у Reheis Inc. (Berkeley Heights, NJ). Адъюванты REHYDRAGEL^® изготавливаются на основе кристаллического оксигидроксида алюминия и представляют собой гидратированные гели, содержащие кристаллические частицы с большой площадью поверхности (примерно 525 м²/г). Содержание Al₂O₃ в адъюванте обычно составляет примерно от 2 до 10 процентов. Так, например, регидрагель LG (Rehydragel LG) содержит Al₂O₃ в количестве примерно 6 процентов и легко растекается после мягкого помешивания. Регидрагель LG также содержит белок со связывающей емкостью 1,58 (то есть 1,58 мг альбумина бычьей сыворотки, связанного с 1 мг Al₂O₃), 0,02% натрия, 0,28% хлорида, недетектируемый сульфат, мышьяк в количестве менее чем 3 м.д., тяжелые металлы в количестве менее чем 15 м.д, рН 6,5 и имеет вязкость 1090 сП. Регидрагель LG может быть объединен с раствором полипептида (например, полипептида в PBS), с получением Al(OH)₃. Кроме того, может быть использован ALHYDROGEL^TM, гелевый адъювант, изготавливаемый на основе гидроксиалюминия (Alhydrogel 1,3%, Alhydrogel 2,0% или Alhydrogel "85") и поставляемый Brenntag Stinnes Logistics.

Кроме того, MN51 может быть объединен с описанными здесь полипептидами, с получением композиции, которая при ее введении млекопитающему продуцирует антитело против собственного антигена. MN51 (MONTANIDE^®, неполный адъювант SEPPIC (ISA)51), а также MN720, поставляются фирмой Seppic (Paris, France). MN51 содержит олеат маннида (MONTANIDE^® 80), также известный как ангидрооктадеканоат маннита, в растворе минерального масла (Drakeol 6 VR). MONTANIDE^® 80 представляет собой прозрачную жидкость, имеющую максимальное кислотное число 1, число омыления 164-172, гидроксильное число 89-100, иодное число 67-75, максимальное пероксидное число 2, содержание тяжелых металлов менее чем 20 м.д., максимальное содержание воды 0,35%, максимальную интенсивность окраски 9 и вязкость при 25°С примерно 300 мП. MONTANIDE®, ассоциированный с маслом (например, с минеральным маслом, растительным маслом, скваланом, скваленом или сложными эфирами), известен как MONTANIDE® ISA. Drakeol 6 VR представляет собой минеральное масло фармацевтической чистоты. Drakeol 6 VR не содержит ненасыщенных или ароматических углеводородов; имеет плотность А.P.I. (в градусах Американского нефтяного института) 36,2-36,8; удельный вес при 25°С 0,834-0,838; вязкость при 100°F 59-61 SSU (число секунд по универсальному вискозиметру Сейболта) или 10,0-10,6 сантистокс и показатель преломления при 25°С 1,458-1,463; имеет кислотное число, превышающее минимальное значение в тесте на кислотность; дает негативный результат в тесте на флуоресценцию при 360 нм, а также негативный результат при наблюдении на присутствие суспендированного вещества; имеет температуру застывания 0-15°F в тесте на текучесть по ASTM и минимальную температуру вспышки 295°F по ASTM; и удовлетворяет всем требованиям RN для легких минеральных масел и поглощению ультрафиолетового излучения. MN51 содержит примерно 8-12% ангидрооктадеканоата маннита и примерно 88-92% минерального масла. MN51 представляет собой прозрачную желтую жидкость, имеющую максимальное кислотное число 0,5, число омыления 16-20, гидроксильное число 9-13, максимальное пероксидное число 2, иодное число 5-9, максимальное содержание воды 0,5%, коэффициент преломления при 25°С, составляющий 1,455-1,465, плотность при 20°С примерно 0,85 и вязкость при 20°С примерно 50 мП. Проводимость смеси MN51 и физиологического раствора (50:50) составляет менее чем 10 мкСм·см^-1.

Другими адъювантами являются иммуностимулирующие комплексы (ISCOMs), которые могут содержать такие компоненты, как холестерин и сапонины. ISCOM-матрицы могут быть получены и конъюгированы с Cu²⁺ методами, описанными в настоящем заявке. Такие адъюванты, как FCA, FIA, MN51, MN720 и Al(OH)₃, коммерчески доступны и поставляются компаниями, такими как Seppic, Difco Laboratories (Detroit, MI) и Superfos Biosector A/S (Vedbeak, Demark).

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция может также содержать один или несколько дополнительных иммуностимулирующих компонентов. Такими компонентами являются, не ограничиваясь ими, мурамилдипептид (например, N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин; MDP), монофосфорил-липид-А (MPL) и трипептиды, содержащие формил-метионин, такие как N-формил-Met-Leu-Phe. Эти соединения коммерчески доступны и поставляются, например, фирмами Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) и RIBI ImmunoChem Research, Inc. (Hamilton, MT).

Описанные здесь композиции могут содержать смесь "адъювант-полипептид" в любом соотношении. Отношение "адъювант:антиген" может составлять, например, 50:50 (об./об.). Альтернативно, отношение "адъювант:антиген" может иметь, не ограничиваясь ими, следующие значения: 90:10, 80:20, 70:30, 64:36, 60:40, 55:45, 40:60, 30:70, 20:80 или 90:10.

Хозяину может быть введено эффективное количество любой описанной здесь композиции. Используемый здесь термин "эффективный" относится к любому количеству, которое индуцирует нужный иммунный ответ, не оказывая при этом какого-либо токсического действия на хозяина. Такое количество может быть определено путем оценки иммунного ответа хозяина после введения ему известного количества конкретной композиции. Кроме того, уровень токсичности, если он имеется, может быть определен путем оценки клинических симптомов хозяина до и после введения этому хозяину известного количества конкретной композиции. При этом следует отметить, что эффективное количество конкретной композиции, вводимой хозяину, может быть скорректировано в зависимости от желаемого результата, а также от ответа хозяина и уровня токсичности. Уровень токсичности может варьироваться для каждого конкретного хозяина и зависит от множества факторов, включая, не ограничиваясь ими, патологическое состояние хозяина, его возраст и переносимость боли.

Кроме того, любая описанная здесь композиция может быть введена в любую область организма-хозяина. Эта композиция может быть введена в суставы, слизистую носа, кровь, легкие, тонкий кишечник, мышечную ткань, кожу или в брюшную полость млекопитающего, а также в другие органы. Кроме того, данная композиция может быть введена путем внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной, подкожной, интратекальной или чрескожной инъекции, а также перорально или интраназально, путем ингаляции или путем постепенного непрерывного введения. В другом примере хозяину может быть введен аэрозольный препарат путем ингаляции. Лечение с использованием любой описанной здесь композиции может быть проведено в течение любого периода времени, как в течение короткого промежутка времени, например, от одного дня, так и на протяжении всей жизни пациента (например, в течение многих лет). Так, например, полипептид может вводиться от одного раза до трех раз в месяц или один раз в год в течение десяти лет. Следует также отметить, что частота введения лекарственного средства может варьироваться. Например, полипептид может вводиться один раз (или два раза, три раза и т.п.) в день, в неделю, в месяц или в год.

Индуцирование конкретного иммунного ответа может быть определено любым методом. Так, например, выработка антитела против конкретных антигенов может быть определена с помощью иммунологического анализа (например, ELISA). В таком анализе лунки микротитрационного планшета могут быть сенсибилизированы С5 и инкубированы с сывороткой млекопитающего, которому была введена композиция, предназначенная для продуцирования анти-С5-антител у данного млекопитающего, и присутствие или отсутствие анти-С5-антител может быть определено с использованием меченого антитела против крысиных IgG. Кроме того, для того чтобы определить, индуцируется ли нужный иммунный ответ, можно использовать клинические методы, которые позволяют установить тяжесть конкретного патологического состояния. Так, например, снижение степени воспаления может указывать на выработку нужного иммунного ответа у пациента, которому была введена композиция, продуцирующая анти-С5-антитела. Для подтверждения признаков продуцирования нужного иммунного ответа уровни анти-С5-антитела в пробе крови, взятой у каждого пациента, могут быть измерены с помощью ELISA-метода, описанного выше.

Промышленные изделия

Полипептиды и композиции согласно изобретению могут быть использованы для промышленного изготовления лекарственных препаратов (например, лекарственных препаратов для лечения воспалительных состояний). Кроме того, настоящее изобретение относится к промышленным изделиям, которые могут включать в себя полипептиды и композиции согласно изобретению. Компоненты и методы для получения промышленных изделий хорошо известны специалистам. Промышленный препарат может включать в себя один или несколько полипептидов, индуцирующих выработку антитела против собственного С5 (например, один или несколько полипептидов, содержащих собственный аминокислотный сегмент С5 и чужеродный аминокислотный сегмент, такой как чужеродный аминокислотный сегмент С5). Кроме того, промышленное изделие может также включать, например, буферы или другие активные реагенты для лечения или мониторинга воспалительного состояния. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие промышленные изделия могут включать этикетки или инструкции, на которых указано, что содержащиеся в этом изделии полипептиды являются эффективными для лечения воспалительного состояния.

Настоящее изобретение дополнительно описано в нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения, определяемого формулой изобретения.

Примеры

Пример 1 - Продуцирование и очистка мышиного полипептида С5а

ДНК-последовательность мышиного про-С5 (SEQ ID NO:1) показана на фиг.1, а аминокислотная последовательность мышиного про-С5, включая сигнальный пептид (SEQ ID NO:2), показана на фиг.2. Кодирующую область для мышиного С5а выделяли путем ПЦР-амплификации из полной кДНК-библиотеки мышиной печени. ПЦР-фрагмент лигировали в бактериальный экспрессирующий вектор pMAL-p2x (фиг.3; New England Biolabs, Beverly, MA) в сайте, смежном с последовательностью, кодирующей часть белка, связывающегося с мальтозой (МВР). Затем кодирующую область для гибридного полипептида МВР-С5а амплифицировали из этого вектора с помощью ПЦР. Для облегчения конечной очистки гибридного полипептида конструировали 5'-ПЦР-праймер, также кодирующий шесть гистидиновых остатков. Кроме того, этот 5'-праймер содержал EcoRI-сайт, а 3'-праймер содержал SalI-сайт для клонирования. ПЦР-продукт (последовательность показана на фиг.4) переносили в экспрессирующий эписомный вектор млекопитающего, рСЕР-Pu2, который содержал сигнальную последовательность, происходящую от вариабельной области иммуноглобулина. SalI-сайт ПЦР-продукта лигировали в XhoI-сайт вектора pCEP-Pu2, что приводило к деструкции обоих сайтов. Нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта, кодирующая гибридный полипептид, представлена в SEQ ID NO:3, а аминокислотная последовательность гибридного полипептида представлена в SEQ ID NO:4.

Пример 2- Экспрессия и очистка МВР-С5а из клеток млекопитающего

Конструкцию рСЕР-Pu2, содержащую гибридный полипептид 6His-MBP-C5a, трансфицировали в клетки 293-EBNA для сверхэкспрессии и очистки секретированного гибридного полипептида. Клетки EBNA-293 млекопитающего трансфицировали путем липофекции и культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), в которую было добавлено 5% фетальная телячья сыворотка, 0,5 мкг/мл пуромицина, 50 мкг/мл гентамицина и 100 мкг/мл генетицина. Растущие клетки размножали и кондиционированные среды собирали через каждые 4-5 дней. Клетки и дебрис удаляли центрифугированием.

Гибридный полипептид содержал шесть гистидиновых остатков, что облегчало очистку с использованием агарозы Ni-NTA. 0,75 мл-аликвоту агарозной взвеси Ni-NTA (QIAGEN GmbH, Germany), содержащей ˜0,35 мл сфер в 20% этаноле, добавляли в 500 мл кондиционированной среды. После инкубирования на шейкере в течение ночи при 4°С агарозу Ni-NTA осаждали центрифугированием в течение 10 минут примерно при 2000 х g и переносили на колонки. Сферы промывали PBS, рН 7,4, в присутствии 1М NaCl и 0,1% Твина-20 и элюировали 100 мМ имидазола (Merck, Germany) в 20 мМ Триса, рН 8,0, с 0,1М NaCl, в соответствии с инструкциями производителей. Полипептидсодержащие фракции объединяли и диализовали против PBS, рН 7,4, на мембране с отсечкой молекулярной массы 12000-14000 Да (Spectra/Por Membranes, Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA). При необходимости, образцы концентрировали с использованием центрифужного устройства Macrosep 10K (PALL Gelman Laboratory). Конечную концентрацию полипептида оценивали с помощью анализа Брэдфорда (BIO-RAD Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Клетки продуцировали гибридный полипептид 6His-MBP-C5a на уровне примерно 2 мг/литр. Для определения размера использовали маркер молекулярной массы белка Rainbow (Amersham International, Buckinghamshire, England). Полипептид мигрировал при ожидаемом размере 53 кД. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида представлена на фиг. 5.

Пример 3 - Влияние МВР-С5а на индуцированный коллагеном артрит у мышей

Очищенный полипептид 6His-MBP-C5a в PBS объединяли с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) или с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) в отношении 1:1 непосредственно перед использованием. Раствор периодически набирали в шприц Гамильтона (Hamilton Corp., Reno, NE), снабженный иглой калибра 18, а затем перемешивали до тех пор, пока не образовывалась белая эмульсия с такими же реологическими свойствами, как у мази. Иглу калибра 23 вставляли в шприц для введения смеси. Также получали контрольную смесь, содержащую равные объемы PBS и ПАФ или НАФ.

12-недельных самцов мышей QB (Balb/c X B10.Q)F1 разделяли на две группы по 14 или 16 животных в каждой, и этим мышам на день -21 подкожно между лопатками инъецировали либо 100 мкг МВР-С5а, эмульгированного в ПАФ, либо контрольную смесь. Брали также пробы крови на день -21 и сыворотку хранили при -20°С. Животным вводили бустер-инъекции либо 50 мкг МВР-С5а в НАФ, либо контрольную смесь на день -3 и на день 28. Инъекции обычно вводили в объеме 100-200 мкл.

Для индуцирования артрита мышам на день 0 чрескожно в основание хвоста инъецировали 100 мкг гидролизованного пепсином коллагена II (CII), эмульгированного 1:1 в ПАФ. Предполагалось, что артрит будет развиваться в период с 28-го дня до 56-го дня. Животным на 35-й день вводили бустер-инъекцию CII, эмульгированного в НАФ, и на 35-й день также брали образцы крови. Животных исследовали по меньшей мере три раза в неделю, начиная с 14-го дня и кончая 90-м днем, то есть днем завершения эксперимента. Животных оценивали слепым методом с использованием системы оценки, основанной на определении числа воспаленных суставов на каждой лапе. Воспаление определяли по опуханию и покраснению. В этой системе оценки каждому воспаленному пальцу или суставу на пальце присваивали один балл, а воспаленному запястью или голеностопному суставу присваивали пять баллов. В результате такой оценки получали 0-15 баллов для каждой лапы (5 пальцев + 5 суставов + 1 запястье/голеностопный сустав) и 0-60 баллов для каждой мыши. Этот эксперимент завершали на 90-й день или тогда, когда это считалось необходимым, исходя из наблюдений за развитием артрита. У мышей, помимо симптомов, обычно наблюдаемых при предполагаемом артритном заболевании, не наблюдалось каких-либо явных признаков аномального состояния шерсти, стереотипий или поведенческих изменений, инфекций или других тяжелых или непредсказуемых побочных эффектов. Животных анестезировали энфлураном (Forene®)/кислородом и брали кровь путем реорбитальной пункции. Сыворотку собирали и хранили при -20°С. Сыворотку, собранную в дни -21, 35 и по окончании исследований, оценивали на предмет определения уровней анти-CII антител и анти-С5а антител ELISA-методом.

Для анализа результатов оценки использовали критерий Манна-Уитни, а для анализа значимости данных заболеваемости артритом использовали величины площадей под кривой и величины "хи-квадрат". На 28-й день после первой обработки коллагеном воспаление наблюдалось у семи из 14 мышей контрольной группы (50%), тогда как у мышей, предварительно обработанных МВР-С5а, воспаление наблюдалось только у двух из 16 животных (12,5%) (фиг.6). В соответствии с критерием хи-квадрат эти данные давали величину Р=0,025. В целом развитие воспаления (на день 67) наблюдалось у 14 из 14 мышей контрольной группы и у 11 из 16 мышей в группе, предварительно обработанной МВР-С5а (Р=0,022). Таким образом, заболеваемость коллаген-индуцированным артритом значимо отличалась для этих двух групп.

Для каждой группы мышей за период времени со 1-го дня до 90-го дня строили график средних оценок артрита, исходя из числа случаев возникновения воспаления (фиг.7). Максимальная оценка для одной мыши в каждой группе составляла 60. По окончании исследований средняя величина максимальной оценки тяжести заболевания в контрольной группе составляла 38,6, а в группе, предварительно обработанной МВР-С5а, эта величина составляла 19,0 (Р=0,0085; фиг.8). Средняя величина площади под кривой составляла 485,9 для контрольной группы и 168,9 для группы, предварительно обработанной МВР-С5а (Р=0,0012; фиг.9). Полученные результаты продемонстрировали, что обработка гибридным полипептидом МВР-С5а приводила к снижению случаев заболеваемости и тяжести коллаген-индуцированного артрита у этих животных.

Пример 4 - Влияние МВР-С5а на хронический индуцированный коллагеном артрит у мышей QB-ВС

Очищенный полипептид MBP-C5a в PBS объединяли с ПАФ или НАФ, как описано выше. Также получали контрольную смесь, содержащую равные объемы PBS и ПАФ или НАФ.

8-10-недельным самцам и самкам мышей QB-ВС (В10.Q(Balb/c X B10.Q)) чрескожно в основание хвоста инъецировали 100 мкг гидролизованного пепсином коллагена II, эмульгированного 1:1 в НАФ. Через 35 дней мышам вводили вторую инъекцию 50 мкг гидролизованного пепсином коллагена II в НАФ. Затем мышей по меньшей мере 3 раза в неделю исследовали на предмет развития хронического артрита. У многих, но не у всех, мышей наблюдалось хроническое рецидивирующее течение заболевания, характеризующееся периодами рецидивов активного артрита. Эти рецидивы были непрогнозируемыми и продолжались в течение нескольких недель, отсюда был сделан вывод, что они будут появляться в течение всей жизни животных. Вариабельность в обострении артрита в данной группе была главным образом обусловлена генетической гетерогенностью (мыши представляли собой животных N2, что предусматривалось планом эксперимента, разработанного для имитации генетической ситуации у человека).

Для регуляции появления рецидивов мышей повторно иммунизовали коллагеном II (CII) во время фазы рецидивов хронического заболевания. Когда мыши достигали 12-14-месячного возраста, тех животных, у которых наблюдалось хроническое рецидивирующее заболевание, но которые в данный период не имели рецидивов активного заболевания, произвольно смешивали и разделяли на четыре группы с равным числом животных. Для индуцирования артрита с контролируемыми рецидивами мышам на день -21 (на 259-й день после первой CII-иммунизации) подкожно между лопатками инъецировали либо 100 мкг МВР-С5а в PBS (n=24), либо только PBS, каждый из которых был эмульгирован 1:1 в ПАФ (n=12). На день -3 животным вводили бустер-инъекции либо 50 мкг МВР-С5а в PBS или только PBS (каждый в ПАФ). На день 0 (280-й день после первой CII-иммунизации) животным обеих групп чрескожно в основание хвоста инъецировали 50 мкг гидролизованного пепсином коллагена II (CII), эмульгированного 1:1 в НАФ. Вторую бустер-инъекцию 50 мкг МВР-С5а в PBS или только PBS вводили на день 21 (301-й день после первой CII-иммунизации). Кроме того, пробы крови брали путем реорбитальной пункции на день -21 и на день 0.

Животных оценивали слепым методом с использованием системы оценок, описанной выше, и в соответствии с такой системой, оценка артрита в баллах для каждой мыши составляла 0-60. Этот эксперимент завершали на 358-й день после первой CII-иммунизации. Эти исследования показали, что у всех контрольных мышей обнаруживались симптомы артрита примерно на день 40, а в группе мышей, иммунизованных МВР-С5а, хронический артрит обнаруживался только у 50% животных (р<0,05; фиг.10). Кроме того, среднюю оценку артрита для двух групп животных определяли с самого начала исследования (то есть начиная с первой инъекции CII) и до конца исследования, которое продолжалось более чем 358 дней, начиная с первой инъекции, и 78 дней, начиная с повторного индуцирования или рецидива (фиг.11). Средние оценки артрита для двух групп не имели значимого отличия вплоть до проведения иммунизации МВР-С5а, после которой средние оценки артрита для обработанной группы были значимо ниже, чем средние оценки для контрольной группы (Р<0,05; фиг.11). Полученные результаты продемонстрировали, что обработка гибридным полипептидом МВР-С5а может приводить к уменьшению случаев возникновения рецидивов хронического артрита у обработанных животных.

Другие варианты осуществления изобретения

Хотя настоящее изобретение подробно изложено в представленном выше описании, однако это описание приводится лишь в иллюстративных целях и не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем нижеследующей формулы изобретения.

1. Способ лечения млекопитающего, страдающего воспалительным состоянием, предусматривающий введение указанному млекопитающему композиции, содержащей адъювант и полипептид, в условиях, которые индуцируют выработку анти-С5-ответа у указанного млекопитающего, при этом указанный полипептид содержит собственный аминокислотный сегмент С5а и чужеродный аминокислотный сегмент, где указанным чужеродным аминокислотным сегментом является аминокислотный сегмент связывающегося с мальтозой белка.

2. Способ по п.1, где указанным млекопитающим является человек.

3. Способ по п.1, где указанное воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из сепсиса, ишемии миокарда/реперфузионного повреждения, респираторного дистресс-синдрома взрослых, нефрита, отторжения трансплантата, ревматоидного артрита, астмы, воспалительного заболевания кишечника, рассеянного склероза, артериосклероза и васкулита.

4. Способ по п.1, где указанный собственный аминокислотный сегмент С5 содержит часть последовательности С5а.

5. Способ по п.1, где указанный адъювант представляет собой соединение на основе алюминия.

6. Способ по п.1, где указанный адъювант является алюминием.

7. Способ по п.1, где в указанном полипептиде между указанным собственным аминокислотным сегментом С5 и указанным аминокислотным сегментом связывающегося с мальтозой белка отсутствует сайт расщепления фактора Ха.